BRPI0307349B1

BRPI0307349B1 - Process for Fermenting a Phytosterol Composition

Info

Publication number: BRPI0307349B1
Application number: BRPI0307349-1A
Authority: BR
Inventors: P. Kutney James; J. Herrington Edward; Spassov Grigor
Original assignee: Merck Sharp & Dohme B.V.
Priority date: 2002-02-01
Filing date: 2003-02-03
Publication date: 2017-10-03
Also published as: BRPI0307349B8; RU2004126437A; CA2474575A1; PL371656A1; ATE518961T1; AU2003240010B2; PL207379B1; WO2003064674A2; EP1507867B1; EP1507867A2; BR0307349A; WO2003064674A3; ZA200406090B; MXPA04007401A; NZ534342A; NO20043641L; CN1639354A

Abstract

"processos para fermentar uma composição de fitoesterol e para preparar androestadienodiona a partir da androestenodiona, fusarium solani fmi 33, e, composição". um processo de fermentação de uma composição de fitoesterol para produzir androestenodiona (androest-4-eno-3,17-diona) e subseqüentemente androestadienodiona (androest-1,4-dieno 3,17-diona) compreende a propagação de uma cultura microbiana do gênero mycobacterium em um primeiro meio de nutriente, colocando-se a cultura microbiana e a composição de fitoesterol em um biorreator por um tempo suficiente para transformar a composição substancialmente a androestenodiona (a "solução de ad"), propagação de uma cultura fúngica do gênero fusarium em um segundo meio de nutriente e, depois a injeção de um ou mais de 1) fusarium sp ou, 2) meio de cultura fúngica no biorreator por um tempo suficiente para transformar a solução de ad em androestadienodiona.

Description

“PROCESSO PARA FERMENTAR UMA COMPOSIÇÃO DE FITOESTEROL” CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção, no geral, diz respeito a processos para fermentação e, em particular à bi o conversão de composições de fitoesterol em androestenodiona e/ou androestadienodiona.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

No momento, há duas vias principais para a produção industrial de medicamentos esteróides. Uma é a via de diosgenina e a outra é a via de transformação biológica. A diosgenina é uma agücona esteroídal do tipo espiroqueta isolada de uma planta composta (Dimcorea $p„). Nos últimos anos de 1940 e no princípio de 1950 a via foi desenvolvida usando-se principalmente reações químicas: Via de Diosgenina para a Produção de Compostos Esteróides Embora, esta via permaneça importante para a produção comercial de esteróides, os métodos alternativos foram estudados nos anos de 1970. O preço de diosgenina foi significantemente aumentado particularmente pelo governo mexicano e devido, em parte ao teor diminuído de diosgenina na massa de planta seca e custo de trabalho aumentado, etc. Portanto, uma metodologia alternativa foi requerida para a produção de AD futura. r E bem conhecido, a partir de pesquisa extensiva na indústria farmacêutica nos anos de 1960 e 70, que numerosos organismos (por exemplo, aqueles do gênero Arthrobacter, Brevibacterium, Microbacterium, Protaminobacter, Bacillus, Nocardia, Streptomyces e, em particular Mycobacterium) possuem a capacidade natural de degradar naturalmente, ocorrendo 3 p-hidróxi-A5-esteróis (tais como, colesterol, β sitoesterol ou a-sitoesterol) ou uma mistura de esteróis (como mostrado abaixo) para dióxido de carbono e água e, que l,4-androesteno-3,17-diona (androestenodiona) e l,4-androestadieno-3,17-diona (androestadienodiona) são formados como intermediários durante a degradação.

Compostos de fítoesterol usados como substratos nara a biotransformacão microbiana.

Uma das fontes comerciais, presentes de fitoesteróis são óleos derivados vegetais. A conversão microbiana destes esteróis disponíveis, em AD e ADD fornece uma via altamente importante para a indústria de medicamento esteróide. ADD é uma matéria-prima essencial na fabricação de vários esteróides sintéticos incluindo agentes anti-inflamatórios, contraceptivos orais, esteróides adrenais sintéticos, agentes anabólicos (estimulante do crescimento) e outros esteróides sintéticos.

No geral, o processo de fermentação conhecido envolve a propagação de um mutante de Mycobacíerium em um meio de nutriente apropriado, a transferência da cultura a um biorreator contendo os fitoesteróis e depois, permitindo a biotransformação em AD e/ou ADD durante um período de aproximadamente 120 horas. A colheita do caldo de fermentação, a extração deste com um solvente orgânico e, subseqüente cristalização em um solvente orgânico, geralmente fornece os produtos AD e/ou ADD como pós cristalinos brancos. As referências pertinentes que debatem os processos conhecidos e resumem os estudos mais recentes são como seguem: S. Kraychy e R. D. Muir, Patente US Ns 3.684.657 (1972). W. J. Marsheck, S. Kraychy e R. D. Muir, Appl. Microbiol., 23,72 (1972). A. H. Conner, M. Nagaoka, J. W. Rowe e D. Perlman, Appl. and Environ. Microbiol., 32,310 (1976). K. Kieslich, J. Basic Microbiol., 25,461 (1985).

Um dos problemas associados com o processo de bioconversão de fitoesterol conhecido (cujo problema aflige toda a indústria de esteróide) envolve a solubilidade inferior do substrato, neste caso uma composição de fitoesterol, no meio de nutriente aquoso. A solubilidade inadequada dita a presença de concentrações apenas relativamente baixas de substrato no meio de nutriente, resultando no contato pobre com o microorganismo e geralmente leva a rendimentos baixos de produtos finais. Os tempos de fermentação longos também são tipicamente necessários para atingir qualquer grau satisfatório de bioconversão. Para produzir uma via alternativa para AD e ADD na qual o problema de solubilidade do substrato foi tratado, os requerentes presentes demonstram que os fitoesteróis (□-sitoesterol, campesterol e estigmaestanol) obtidos do “sabão”, disponíveis em quantidades de multi-tonelada métrica pela indústria florestal, podem ser solubilizados e quantitativamente biotransformados pelos mutantes de Mycobacterium em ADD (PCT/CA99/00267).

Um outro problema associado com o processo de bioconversão de fitoesterol conhecido é que o produto final da bioconversão de fitoesteróis (ou composições de fitoesteróis) tipicamente contém quantidades significantes tanto de AD quanto de ADD. Dada a estrutura química similar de AD e ADD, é difícil e caro separar subseqüentemente estes dois produtos esteróides um do outro.

Conseqüentemente, a fim de produzir ADD, o produto da fermentação inicial (AD) deve ser extraído, purificado e depois submetido a uma segunda biotransformação a fim de produzir ADD. Naturalmente, este processo é caro e consome tempo assim como envolve a interrupção da fermentação de AD e a remoção e purificação de AD antes da segunda biotransformação. É um objetivo da presente invenção para prevenir ou mitigar as desvantagens acima.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece, em um aspecto, um processo de fermentação de uma composição de fitoesterol para produzir androestenodiona (androest-4-eno-3,17-diona ou “AD”) e subseqüentemente androesta-dienodiona (androesta-l,4-dieno,3,17-diona ou “ADD”)) que compreende: propagar uma cultura microbiana do gênero Mycobacterium em um primeiro meio de nutriente; colocar a cultura microbiana e a composição de fitoesterol em um biorreator por um tempo suficiente para transformar a composição substancialmente em androestenodiona (a “solução de AD”); propagar a cultura fungica do gênero Fusarium em um segundo meio de nutriente; e depois injetar um ou mais de 1) Fusarium sp; ou 2) o meio de cultura fungica compreendendo Fusarium sp. no biorreator por um tempo suficiente para transformar a solução de AD em androestadienodiona. A presente invenção ainda compreende um processo de preparar androestadienodiona a partir de androestenodiona que compreende a fermentação de AD em um biorreator na presença de 1) Fusarium sp; ou 2) um meio de cultura fungica de Fusarium sp por um tempo suficiente para transformar o AD em ADD. A presente invenção ainda compreende composições de ADD preparada pelos processos mencionados acima.

Importantemente e, uma vantagem significante do processo da presente invenção, é que a biotransformação de AD em ADD pelo Fusarium sp ocorre no mesmo biorreator da transformação bacteriana anterior isto é, é o mesmo em que AD é produzido a partir da composição de fitoesterol. Em outras palavras, o AD produzido a partir da etapa de fermentação inicial não é removido do biorreator (assim como é conhecido e praticado na técnica) mas de preferência, o biorreator é inoculado (como descrito em mais detalhes abaixo) com 1) a cultura fungica, ou 2) o meio de cultura fungica a fim de transformar a solução de AD em ADD. Foi observado que, surpreendentemente, Fusarium sp e, em particular a cepa preferida como divulgado a seguir retém sua capacidade para transformar AD em ADD a despeito da presença da cultura bacteriana residual.

Conseqüentemente, o processo da presente invenção não envolve a interrupção da fermentação de AD inicial ou, a remoção e purificação de AD antes da segunda biotransformação. Tempo, energia e materiais significantes são salvos. A presente invenção também fornece um novo microorganismo do gênero Fusarium, a seguir referido como PTA-3947 ou FMI 33, que foi depositado no ATCC como Fusarium solani FMI 33 em 21 de dezembro de 2001.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A presente invenção é ilustrada pelos seguintes desenhos não limitantes em que: A Figura 1 é um esquema que mostra a conversão microbiana de fitoesteróis em ADD De acordo com a presente invenção; e A Figura 2 é um diagrama de fluxo que mostra o procedimento preferido para a biotransformação de AD em ADD pelo Fusarium solani de acordo com a presente invenção.

DESCRICÂO DETALHADA DA INVENÇÃO A seguinte descrição detalhada é fornecida para auxiliar aqueles habilitados na técnica na prática da presente invenção. Entretanto, esta descrição detalhada não deve ser interpretada a fim de limitar i indevidamente o escopo da presente invenção. As modificações e as variações para as formas de realização debatidas aqui, podem ser feitas por aqueles com habilidade usual na técnica sem divergir do espírito ou escopo da presente invenção.

Em uma primeira etapa da presente invenção, uma cultura microbiana do gênero Mycobacterium é propagada em um meio de nutriente. Há muitos meios e condições de cultivo adequados conhecidos e disponíveis na técnica e a presente invenção não é pretendida ser limitada a qualquer um destes. Todavia, de uma forma preferida, os Mycobacteria sp. são cultivados em um meio de semente compreendendo o melaço do refinador, nitrato de I sódio, fosfato de amônio e glicose. Os conteúdos da Patente US Nfi 6.071.714 para Kutney et al, em que o meio de cultura apropriado são descritos, é incorporado aqui, por referência.

Geralmente, o meio de nutriente requerido para o cultivo de Mycobacteria sp e de Fusarium sp deve conter nitrogênio e carbono assimiláveis e um fornecimento adequado de ar estéril mantido neste, por exemplo, pela exposição de uma superfície grande do meio para o ar ou passando-o através do meio em quantidades suficientes para suportar o crescimento submerso.

As fontes de nitrogênio adequadas são aquelas normalmente utilizadas para o propósito, incluindo farinha de soja, farinha de semente de algodão, digestão pancreática de caseína, farinha de peixe, líquido da maceração do milho, extrato de came, proteína, levedura do cervejeiro autolisado com sólidos de leite, peptona, extrato de levedura, hidrolisado de caseína, nitrato e/ou compostos de amônio. A maioria destes também podem ser usados como a fonte de carbono. Outras substâncias contendo carbono incluem carboidratos tais como, glicerol, glicose, frutose, sacarose, lactose, maltose, inositol, dextrina, melaço, amido e soro. As combinações destas fontes de carbono e de nitrogênio podem ser vantajosamente usadas. íons fosfato, magnésio e/ou ferroso podem ser incorporados como fatores de promoção de crescimento, se desejado; tampões podem ser adicionados para garantir que crescimento seja iniciado como pH substancialmente neutro. Os agentes anti-espumantes podem ser benéficos. Quando as células ou enzimas isoladas são usadas para induzir a fermentação em vez do microorganismo intacto e de desenvolvimento, nutrientes não necessitam estar presentes, mas em cada evento, usualmente, o meio é, em maior parte, aquoso.

Em uma segunda etapa da presente invenção, o substrato (uma composição de fitoesterol), dissolvido em um solvente adequado ou na forma emulsificada e, a cultura microbiana são adicionados a um biorreator. A fermentação é deixada prosseguir até que a conversão de substrato máxima (fitoesteróis para solução de AD) fosse atingida.

Qualquer agente emulsificante pode ser usado uma vez que este facilita a mistura do substrato de fitoesterol no solvente otimizando, desse modo, a disponibilidade do substrato para a cultura microbiana. Os exemplos incluem mas, não estão limitados a adutos de etilenoóxi ou ésteres de ácido graxo de poliglicóis e aqueles comercialmente disponíveis sob os nomes Tegin™, Tween™ e Span™.

Na alternativa, agentes solubilizantes podem ser usados para permitir que a composição de fítoesterol seja dissolvida para formar uma solução clara, produzindo, desse modo, excelente contato com o microorganismo utilizado na bioconversão. Estes agentes solubilizantes adequados, selecionados que incluem membros da família glicol e membros da família silicone, permitindo que altas concentrações de fitoesteróis sejam dissolvidas no meio de nutriente. Isto fornece excelente contato com o microorganismo, reduz os tempos de fermentação e, proporciona rendimentos relativamente altos de produtos finais. Agentes solubilizantes anteriormente conhecidos, tais como, óleo de girassol são preferidos.

Em uma terceira etapa da presente invenção, a cultura fungica do gênero Fusarium é propagada em um segundo meio de nutriente. Como acima, há muitos meios e condições de cultivo adequados, conhecidos e disponíveis na técnica e a presente invenção é não é pretendida ser limitada a qualquer um destes. Todavia, de uma forma preferida, o Fusarium sp. é cultivado em um meio de semente compreendendo líquido da maceração do milho e glicose.

Em uma quarta etapa da presente invenção, o biorreator que compreende a solução de AD é injetada com um ou mais de: 1) Fusarium ou, 2) meio de cultura fungica (compreendendo enzimas fungicas) a fim de transformar a solução de AD em ADD. Em uma forma de realização preferida, o biorreator é esterilizado (por exemplo, pelo aquecimento por volta de 120°C) antes desta injeção matar as bactérias.

Os caminhos mais simples e mais econômicos de proceder com esta etapa de “injeção” é inocular o biorreator esterilizado com um pouco do meio de cultura fungica. Altemativamente, entretanto, é possível separar as células fungicas do meio de cultura, por exemplo, por centrifugação e injetar justamente estas células. Além disso, as células podem ser rompidas, ultrassonicamente ou de outro modo, para facilitar o acesso às enzimas presentes, que podem ser isoladas por filtração ou extraídas com um solvente, tal como, acetona e água e depois injetada no biorreator no lugar do meio ou de células fungicas. A concentração de substrato, o tempo de adição de substrato e o período de fermentação ótimos, em cada uma das duas “fases” (fitoesteróis para AD; AD para ADD) depende do tipo de microorganismo usado e das condições de fermentação exatas. As condições precisas podem ser facilmente determinadas sem experimentação indevida por qualquer pessoa habilitada neste campo.

Em uma forma mais preferida da presente invenção, a bioconversão da composição de fitoesterol em AD é atingida pelo uso de Mycobacterium MB 3683. Em uma forma mais preferida da presente invenção, a bioconversão de AD em ADD é atingida pelo uso de Fusarium solani ou Fusarium oxysporum.

Dentro de uma forma de realização da presente invenção, a mutação de F. solani, usando-se nitrosoguanidina resultou na produção de um novo mutante que é especialmente eficaz na transformação de AD em ADD no mesmo recipiente de reação da transformação dos esteróides em AD isto é, sem a necessidade de separar AD da primeira etapa de fermentação. A este microorganismo mutante foi dada a designação de depósito de patente PTA-3941 pela American Type Culture Collection (“ATCC”), 10801 University Blvd„ Manassas VA, USA, 20110-2209, onde foi depositado em uma coleção permanente. Uma subcultura deste microorganismo está disponível na solicitação deste, entretanto, deve ser entendido que tal disponibilidade não constitui uma licença para praticar a invenção exposta. A Figura 1 resume as etapas de fermentação microbiana e fungica de uma forma de realização da presente invenção em que fitoesteróis são transformados por Mycobacterium sp. em AD e subseqüentemente o AD é transformado por Fusarium sp em ADD e boldenona. A Figura 2 ilustra uma outra forma de realização da presente invenção em que ADD é preparada diretamente de uma fonte de AD. Uma cultura de Fusarium sp. é propagada e o inóculo adicionado a um recipiente que compreende AD sob condições de fermentação. Depois disso, ADD é isolado e purificado.

Fitoesteróis/Fitoestanóis Como usado aqui, o termo “composição de fitoesterol” inclui todos os esteróis sem limitação, por exemplo: sitoesterol, campesterol, estigmaesterol, brassicaesterol (incluindo diidrobrassicaesterol), desmosterol, calinoesterol, poriferasterol, clionasterol, ergosterol, coprosterol, codisterol, isofucosterol, fucosterol, clerosterol, nervisterol, latosterol, estelasterol, espinasterol, condrilasterol, peposterol, avenasterol, isoavenesterol, fecosterol, polinastasterol, colesterol e todas as formas naturais ou sintetizadas e derivados destes, incluindo isômeros e, inclui todas as contra partes hidrogenadas (“fitoestanóis”). Os fitoestanóis incluem todos os fitoesteróis saturados ou hidrogenados e todas as formas naturais ou sintetizadas e derivados destes, incluindo isômeros. Também é para ser entendido que, quando na dúvida durante todo o relatório descritivo, o termo “composição de fitoesterol” pode abranger tanto fitoesteróis quanto fitoestanóis.

Os esteróis e os estanóis para o uso na biotransformação da presente invenção podem ser conseguidos a partir de uma variedade de fontes naturais. Por exemplo, podem ser obtidos pelo processamento de óleos de planta (incluindo plantas aquáticas), tais como, óleo de milho e outros óleos vegetais, óleo de germe de trigo, extrato de soja, extrato de arroz, farelo de arroz, óleo de colza, óleo de girassol, óleo de gergelim e óleos de peixe (e outra fonte marinha). Também podem ser derivados de fungos, por exemplo, ergosterol. Consequentemente, a presente invenção não deve ser limitada a qualquer uma das fontes de esteróis. A Patente US Série N° 4.420.427 ensina a preparação de esteróis a partir de pasta de óleo vegetal usando-se solventes, tais como, metanol Altemativamente, os fitoesteróis e os fitoestanóis podem ser obtidos a partir de piche de talóleo ou sabão de formação de polpa, subprodutos de práticas de silvicultura como descrito na Patente US Série N2 6.770.749, incorporado aqui, por referência.

Durante o processo de fermentação, é preferido que a temperatura seja mantida na faixa de cerca de 30 a 37°C, mais preferivelmente de 25 a 35°C. O monitoramento do pH durante a fermentação revela que o pH pode variar na faixa de aproximadamente 7,0 no período inicial a aproximadamente 4,7 no tempo da colheita. Na conclusão do processo de fermentação ou de transformação, o ADD é recuperado por meios bem conhecidos e praticados na técnica.

Os seguintes exemplos representam os ensaios de laboratório. Entretanto, cada um pode ser extrapolado para a aplicação de escala industrial usando-se técnicas industriais conhecidas para implementar a invenção como descrito neste. EXEMPLO 1: BIOTRANSFORMAÇÃO DE FITOESTERÓIS EM ADD COM MYCOBACTERIUMSP. E FUSÀRIUMSOLANI Biotransformação com Mycobacterium sp. (Estágio 1) Preparação de Cultura de Semente de Mycobacterium sp. O inóculo para biotransformação é preparado na cultura líquida, os frascos de Erlenmeyer são inoculados de um declive de ágar (cultivados em um tubo de ensaio de vidro). Para volumes de trabalho de até 40 litros, frascos de Erlenmeyer de 1 litro, com 200 ml de meio de cultura de semente cada, foram usados, enquanto para 50 litros e volumes maiores frascos de Erlenmeyer de 2 litros, com 400 ml de meio cada, foram utilizados. A inoculação é realizada sob condições estéreis (em um Biohazard Hood). Água estéril (5 ml) é pipetado no declive de ágar. A cultura bacteriana é suavemente raspada com a extremidade da pipeta. Depois, a cultura colocada em suspensão é pipetada e liberada nos frascos de Erlenmeyer. As bactérias são propagadas em um agitador rotativo (200 rpm, curso de 1” (2,54 cm), 30°C temperatura ambiente). Depois de 72 horas de incubação a cultura de semente está pronta para a transferência ao biorreator. O armazenamento prolongado da cultura de semente antes da inoculação não é recomendado.

Um resumo do protocolo da Cultura de Semente é dado abaixo: meio: meio de cultura de semente (por litro) 54 ml de melaços de refínadores (açúcar BC) 5,4 g de NaN03 0,6 g de NH4H2PO4 6,0 g de glicose ajustar para 0 pH de 7,0 volume médio: frasco de 200 ml volume de inóculo: suspensão de células de 3 ml do declive de ágar por 200 ml novo meio recipiente: frasco de Erlenmeyer de 1000 ml agitação: agitador (curso de 1” (2,54 cm)), 200 rpm temperatura: 30°C tempo de crescimento: 72 horas de incubação Comentário: Bom desenvolvimento da cultura é indicado se um sedimento celular de cor amarela forma-se na parte inferior.

Preparação de Meio de Biotransformação para Experimentos de 3 litros com Mycobacteríum sp.

Este procedimento de preparação de meio é utilizado apenas para experimentos de volume de trabalho de 3 litros. Em uma escala maior 0 procedimento é descrito abaixo. A composição do meio de biotransformação é como segue: meio: meio de biotransformacão (para 3 litros de meio) 162 ml de melaço esterilizado (Açúcar BC) (5,4% v/v) 16,2gdeNaN03 (0,54%) i l,8gdeNH4H2P04 (0,06%) substrato: 30,0 g de fitoesterol vegetal (1,0%) emulsificador: 480 ml de óleo de girassol (16%) A quantidade necessária de melaço de refinadores (162 ml) é misturada com água (300 ml) e esterilizada (121°C por 20 minutos) em um > frasco de Erlenmeyer um dia antes do uso.

Em um frasco ou um béquer de água (2,0 litros) e os componentes do meio (exceto os fitoesteróis e o óleo de girassol) são misturados. O pH do meio é ajustado para 8,1 com solução de NaOH 1 M (40 g/1 de NaOH), o meio é transferido ao biorreator e depois aquecido de 60 a i 70°C.

Os fitoesteróis (30 g) são pesados em um béquer, óleo de girassol (480 ml) é adicionado e mistura é agitada sob aquecimento em uma placa quente até o óleo tomar-se claro. Isto é usualmente atingido a ~120°C. A solução de fitoesterol amarela clara em óleo é vertida no meio líquido já ) aquecido (de 60 a 70°C) no biorreator sem agitação. O fermentador é esterilizado (121°C por 30 minutos) e resfriado a 30°C. O procedimento de preparação de meio, acima, é utilizado apenas para volumes de trabalho de 3 litros. ! Comentários: O meio de biotransformação tem 7 % de substância seca (refractometricamente medido).

Preparação de Meio de Biotransformação para Experimentos de Maior Escala com Mycobacterium sp.

Este procedimento de preparação de meio é utilizado para 40 litros e volumes de trabalho maiores.

Tabela 1. Composição de Fitoesteróis Vegetais de acordo com o fabricante A composição do meio é como segue: meio: meio de biotransformacão (por litro de meio) 54 ml de melaço esterilizado (Açúcar BC) (5,4 % v/v) 5,4 g de NaN03 (0,54%) 0,6 g de NH4H2P04 (0,06%) substrato: 10,0 g de fitoesterol vegetal (1,0 %) emulsificador: 160 ml de óleo de girassol (16%) O volume necessário de melaço de refinadores (54 ml/1 de meio) é misturado com água (100 ml/1 de meio) e esterilizado um dia antes do uso.

Todos os componentes (incluindo 0 volume necessário de água, mas excluindo os fitoesteróis e 0 óleo de girassol) são misturados sob agitação no fermentador para obter uma solução clara. O volume necessário de água é calculado subtraindo-se os volumes de melaço, óleo e inóculo do volume final desejado. O pH do meio é ajustado para 8,1 com solução aquosa de NaOH (20 %). Os fitoesteróis e o óleo de girassol são adicionados ao meio e o fermentador é esterilizado (121°C, de 30 a 60 minutos).

Comentários: O meio de biotransformação tem 7 % de substância seca (refractometricamente medido).

Biotransformação com Mycobacterium em um Fermentador Os experimentos de bioconversão foram realizados em fermentadores de aço inoxidável com agitação inferior eficiente. Os parâmetros principais dos fermentadores utilizados são mostrados na Tabela 2. A temperatura do meio no fermentador é ajustado para 30°C e o inóculo é ' introduzido sob condições estéreis. O processo inteiro é realizado a 30°C. O pH e a esterilidade do processo são monitorados do começo até o fim deste estágio. O monitoramento do substrato (fitoesteróis) e o produto (AD) é iniciado depois de 40 horas. Os detalhes nos procedimentos analíticos (HPLC, CG) e resultados são dados abaixo. O pH da mistura de biotransformação usualmente varia dentro de 1 unidade de pH e não é corrigido durante o processo. A biotransformação é considerada completa quando a concentração de produto (AD) máxima na camada de espuma é atingida ou quando a concentração de substrato (fítoesterol) atinge 1/20-th de sua concentração inicial. i Tabela 2. Parâmetros de Fermentação de Fitoesterol com Mycobacterium sp.

Importante: Uma agitação altamente eficiente é requerida a fim de obter o contato máximo com o microorganismo. No geral, uma aparência de “milk-shake” caracteriza uma boa emulsão Nota da morfologia (como estudado, usando-se um microscópio de luz): Em cada estágio de declive de ágar para a colheita final, a morfologia das células permaneceu a mesma, isto é, as células tinham núcleos bipolares e tinham a forma de bastão.

Biotransformação com Fusarium solani (Estágio 2) Preparação de Cultura de Fusarium solani O Fusarium solani da cultura fungica é propagado em um meio líquido (10 g/1 de líquido de líquido da maceração do milho, 10 g/1 de glicose, pH 6,5). Os frascos de Erlenmeyer (volume de 1 litro, 0,2 litro de meio) são inoculados a partir do desenvolvimento de cultura em ágar de i farinha de aveia por 120 horas e a 30°C. A cultura do meio líquido é propagada em um agitador rotativo (26°C, 120 rpm, curso de 1” (2,54 cm)) por 72 horas. O Fusarium também pode ser subcultivado a partir do meio líquido a líquido por até 4 a 5 gerações ou até a cultura seguinte tomar-se cor : de rosa. O inóculo do frasco agitado pode ser armazenado a 4°C por até 1 mês sem mudança significante em sua atividade.

Preparação para a Biotransformação com Fusarium solani O segundo estágio da biotransformação é realizado usando-se 1 o todo o caldo de biotransformação do primeiro estágio.

Na finalização da transformação dos fitoesteróis para AD (seção 2.3.1.4) os componentes necessários (10 g/1 de glicose, 10 g/1 líquido de maceração do milho) são adicionados ao caldo do estágio 1 e o pH é ajustado a 6,7 com HC1 aquoso (4 %). O caldo é esterilizado (121°C, 30 minutos) e a temperatura é levada a 30°C.

Biotransformação de AD a ADD utilizando-se o Caldo do Estágio 1 e Fusarium solani Os experimentos de bioconversão foram realizados em fermentadores de aço de aço inoxidável com agitador inferior eficiente. Os parâmetros principais dos fermentadores utilizados são mostrados na Tabela 3. A temperatura do meio no fermentador é ajustada a 30°C e o inóculo é introduzido sob condições estéreis.

Tabela 3. Parâmetros da Fermentação de Fitoesterol com Fusarium solani.

Todo o processo é realizado a 30°C. O pH e a esterilidade do processo são monitorados desde o começo até o final deste estágio. A monitoração do substrato (AD) e o produto (ADD) é iniciado após 15 horas. Os detalhes dos procedimentos analíticos (HPLC, CG) são dados na seção 4.1. Os resultados do monitoramento do processo são mostrados na seção 4.2. 0 pH da mistura de biotransformação, usualmente varia dentro da unidade de 1 pH e não é corrigido durante o processo. A biotransformação é considerada completa quando a concentração de produto máxima (ADD) na camada de espuma é atingida ou quando a concentração de substrato (AD) atinge 1/20-avos de sua concentração inicial. O processo é terminado pela esterilização (121°C, 30 minutos).

EXEMPLO 2: BIOTRANSFORMAÇÃO DE ESTÁGIO ÚNICO DE AD A

ADD COM FUSARIUM SOLANI

Preparação da Cultura de Semente de Fusarium solani O Fusanum solani da cultura fungica é propagada em um meio líquido (10 g/litro de líquido da maceração do milho, 10 g/litro de glicose, pH 6,5). Os frascos de Erlenmeyer (1 litro de volume, 0,2 litro de meio) são inoculados a partir do desenvolvimento de cultura em ágar de farinha de cereal por 120 horas e a 30°C. A cultura do meio líquido propagada em um agitador rotativo (26°C, 120 rpm, curso de 1” (2,54 cm)) por 72 horas. 0 Fusarium também pode ser sub-cultivado a partir do meio líquido a líquido para até 4 a 5 gerações ou até a cultura seguinte tomar-se cor de rosa. O inóculo do frasco agitado pode ser armazenado a 4°C por até 1 mês sem mudança significante em sua atividade.

Preparação de meio de Biotransformação para Fusarium solani Este processo é realizado utilizando-se ADD já isolado. A composição do meio de biotransformação é como segue: meio: meio de biotransformação (por 3 litros de meio) 30 g de glicose (10 %) 30 ml de líquido da maceração do milho (10% v/v) substrato: 30,0gdeAD (1,0%) emulsificador: 480 ml de óleo de girassol (16%) Em um frasco ou béquer, água (2,5 litros) e os componentes de meio (exceto o AD e o óleo de girassol) são misturados. O pH do meio é ajustado a 6,6 com solução de NaOH 1 M (40 g/litro de NaOH), o meio é transferido ao biorreator e depois aquecido de 60 a 70°C. O AD (30 g) é pesado em um béquer, o óleo de girassol (480 ml) é adicionado e a mistura é agitada sob aquecimento em uma placa quente até o óleo tomar-se claro. A solução de AD amarela clara em óleo é vertida no meio líquido já aquecido (60 a 70°C) no biorreator sem agitação. O fermentador é esterilizado (121°C por 30 minutos) e resfriado a 30°C.

Biotransformação de AD para ADD em um fermentador de Aço Inoxidável Os experimentos de bioconversão foram realizados em fermentadores de aço inoxidável com agitação inferior eficiente. Os parâmetros principais dos fermentadores utilizados são mostrados na Tabela 4. A temperatura do meio no fermentador é ajustada a 30°C e o inóculo é introduzido sob condições estéreis. Todo o processo é realizado a 30°C. O pH e a esterilidade do processo são monitorados desde o começo até o final deste estágio. O monitoramento do substrato (AD) e do produto (ADD) é iniciado após 15 horas. Os detalhes dos procedimentos analíticos (HPLC, CG) e os resultados são dados abaixo. O pH da mistura de biotransformação usualmente varia dentro da unidade de pH 1 e não é corrigido durante o processo. A biotransformação é considerada completa quando a concentração do produto máximo (ADD) na camada de espuma é atingida ou quando a concentração de substrato (AD) atinge 1/20 de sua concentração inicial. O processo é terminado pela esterilização (121°C, 30 minutos).

Tabela 4. Parâmetros de Fermentação de Fitoesterol com Fusarium solani.

EXEMPLO 3: EXTRAÇÃO DO CALDO DE FERMENTAÇÃO O caldo de fermentação é colhido em um funil separador. Acetato de etila (6,0 litros) é adicionado ao caldo e agitado por 2 a 3 minutos. Após 15 minutos, a mistura é separada em duas camadas (camada superior de acetato de etila e camada inferior aquosa). A camada de acetato de etila é removida e transferida a um outro recipiente. A camada aquosa inferior é extraída com a segunda porção de acetato de etila (4,0 litros), depois, a camada superior (acetato de etila) é removida e combinada com o primeiro extrato de acetato de etila. Os extratos combinados de acetato de etila são concentrados em um evaporador rotativo para dar um óleo espesso vermelho (-450 ml) que é usado para uma purificação adicional.

Cada extrato de acetato de etila e o resíduo aquoso são analisados quanto a esteróides por HPLC. Os resultados para o processo de dois estágios são mostrados na Tabela 5 e os resultados para o processo de um estágio são mostrados na Tabela 6.

Divisão de ADD do Óleo O resíduo oleoso (-450 ml) é misturado bem com os hexanos (1,25 litros). A solução de óleo-hexanos é extraída com MeOH (2,0 litros x 2). Os dois extratos de metanol são combinados e evaporados até secar para dar um resíduo oleoso bege. O resíduo é secado a vácuo, cada uma das camadas de hexanos e de metanol é analisada por HPLC para controlar a finalização da divisão. A) Cristalização de ADD a partir da Fermentação de Dois Estágios de fitoesteróis para ADD Primeira cristalização Em alguns experimentos, o resíduo após a evaporação do metanol é secado a vácuo. Sendo assim, este resíduo (~40 a 50 g, teor de ADD de 17 a 18 g, pureza de 30 a 40 % por HPLC) é dissolvido em acetato de etila (100 ml).

Se o resíduo, após a evaporação do metanol, não for secado a vácuo, depois, este resíduo é dissolvido em acetato de etila (260 ml), secado em Na2S04 e concentrado a um volume menor (100 ml).

Carvão (4,0 g) é adicionado e a mistura é submetida ao refluxo por 1 hora. Após o resfriamento, a mistura é filtrada em um funil de vidro sinterizado e o filtro é lavado com acetato de etila. Altemativamente, a solução pode ser filtrada através de uma almofada de celite e lavada com acetato de etila. O filtrado é concentrado em um evaporador rotativo até secar. Hexanos (200 ml) são adicionados, a mistura é agitada sob refluxo por 20 minutos, resfriada até a temperatura ambiente e deixada por 30 minutos para separar. A camada superior de hexanos é transferida a um outro recipiente e deixada e repousar durante a noite para cristalização. Os cristais de ADD da solução de hexanos são filtrados, lavados com hexanos/EtOAc (3/1) e secados sob pressão reduzida para dar cristais de ADD brancos (0,23 g). O óleo espesso é dissolvido em acetato de etila (8 ml) e agitado sob aquecimento por 10 minutos. A solução é resfriada até a temperatura ambiente e deixada repousar durante a noite. Os cristais de ADD são filtrados, lavados com hexanos/EtOAc (3/1) e secados sob pressão reduzida para dar cristais de ADD brancos (2,51 g). Os cristais e o líquido principal são analisados pela HPLC. Segunda Cristalização O líquido principal deixado após a primeira cristalização é concentrado em um evaporador rotativo. O acetato de etila (4 ml) é adicionado, a mistura é agitada sob refluxo por 10 minutos, resfriada até a temperatura ambiente e deixada durante a noite para cristalização. Os cristais de ADD são filtrados, lavados com hexanos/EtOAc (3/1) e secados sob pressão reduzida para dar cristais de ADD brancos (1,25 g). O produto e o líquido principal são analisados por HPLC.

Tabela 5. Os resultados da Extração e Divisão do Produto (ADD) do Processo de dois Estágios.

Terceira Cristalização O líquido principal deixado após a segunda cristalização é concentrado em um evaporador rotativo. Uma mistura de acetato de etila (2 ml) e hexanos (1 ml) é agitado sob refluxo por 10 minutos, resfriado até a temperatura ambiente e deixado durante a noite para a cristalização. Os cristais de ADD são filtrados, lavados com hexanos/EtOAc (3/1) e depois secados sob pressão reduzida para dar cristais de ADD brancos (0,16 g). O produto e o líquido principal são analisador por HPLC. A quantidade total de ADD cristalizado é de 4,25 g.

B) Isolamento de ADD da Fermentação de Estágio Único de AD para ADD

Primeira Cristalização Se o resíduo após a evaporação de metanol for secado a vácuo, depois este resíduo (~40 a 50 g, teor de ADD de 17 a 18 g, pureza de 30 a 40 % por HPLC) será dissolvido em acetato de etila (150 ml).

Se o resíduo, após a evaporação do metanol não for secado a vácuo, depois disto, o resíduo será dissolvido em acetato de etila (250 ml), secado em Na2S04 e concentrado a um volume menor (150 ml).

Carvão (4,0 g) é adicionado e a mistura é submetida ao refluxo por 1 hora. Após resfriar, a mistura é filtrada em um funil de vidro sinterizado e o filtro é lavado com acetato de etila. Altemativamente, a solução pode ser filtrada através de uma almofada de Celite. O filtrado é concentrado em um evaporador rotativo até secar, depois o resíduo é dissolvido em acetato de etila (6 ml) sob aquecimento e resfriamento até a temperatura ambiente para a cristalização. Após o repouso durante a noite os cristais de ADD são filtrados, lavados com hexanos/EtOAc (3/1) e secados sob pressão reduzida para dar cristais de ADD brancos. Os cristais e o líquido principal são analisados por HPLC.

Segunda Cristalização O líquido principal deixado após primeira cristalização é concentrado em um evaporador rotativo. Hexanos (50 ml) são adicionados, a mistura é agitada sob refluxo por 1 hora, resfriada até a temperatura ambiente e deixada por 30 minutos para se separar. A camada superior de hexanos é transferida a um outro recipiente e deixada repousar durante a noite para cristalização. O óleo espesso é misturado com acetato de etila (2 ml), hexanos (1 ml) e agitado sob aquecimento por 10 minutos. A solução é resfriada até a temperatura ambiente e deixado repousar durante a noite. Os cristais de ADD são filtrados, lavados com hexanos/EtOAc (3/1) e secados sob pressão reduzida para dar cristais de ADD brancos. A camada de hexanos também deu uma porção de cristais de ADD. Os cristais e o líquido principal são analisados por HPLC.

Terceira Cristalização O líquido principal da segunda cristalização é concentrado em um evaporador rotativo. O óleo espesso é misturado com acetato de etila (1 ml), hexanos (3 ml) e agitados sob aquecimento por 10 minutos. Após o resfriamento, a solução é deixada repousar durante a noite para cristalização. Os cristais de ADD são filtrados, lavados com hexanos/EtOAc (3/1) e secados sob pressão reduzida para dar cristais de ADD. Os cristais e o líquido principal são analisados por HPLC.

Os resultados da cristalização de ADD são mostrados na Tabela 6.

Tabela 6. Resultados da Extração, Divisão e Cristalização de ADD do Processo de estágio Único. EXEMPLO 5: ANÁLISE QUALITATIVA (TLC) E QUANTITATIVA (HPLCECG) Análise Qualitativa Por TLC

Amostras de caldo (aproximadamente 40 ml cada) são retiradas do fundo do fermentador. A amostra de caldo (0,5 ml) é extraída com EtOAc (0,5 ml). A análise por TLC foi realizada em placas pré-revestidas com gel de sílica (60 F254, espessura de 0,2 mm) usando-se 0,050 ml do extrato de EtOAc. A fase móvel: hexanos/EtOAc = 3:1; clorofórmio/acetona = 3:1; ou cloreto de metileno/acetona = 9:1 foram utilizados após 0 desenvolvimento da placa, um dos seguintes reagentes de pulverização (ou imersão) foram usados.

Reagente de cério contendo (para 100 ml): água (94 ml), sulfato de cério (IV) (1,0 g), ácido fosfomolíbdico hidratado (2,5 g), ácido sulfurico (6 ml). Os componentes são dissolvidos em ordem de listagem. O reagente pode ser armazenado por mais de 1 ano. O reagente de molibdato contendo (para 100 ml): água (90 ml), molibdato de amônio (10,85 g), ácido sulfurico (6 ml). Os componentes são dissolvidos em ordem de listagem. O reagente pode ser armazenado por mais do que 1 ano.

Depois, a placa foi aquecida por 3 minutos a 150°C. os pontos azuis resultantes significaram a presença dos seguintes compostos (hexanos/EtOAc = 3/1): Rf = 0,75 - óleo de girassol; Rf = 0,63 - fitoesterol;

Rf = 0,47 - androestenodiona (AD) e Rf = 0,02 - androestadienodiona (ADD).

Monitoramento de AD, ADD e sub-produtos por HPLC

Uma amostra (2 g de espuma ou 2 ml de líquido ou 10 mg de cristais) foi diluída a 50,0 ml com metanol, misturada bem e deixada por 10 minutos para precipitar as proteínas e os fitoesteróis. Uma alíquota da solução foi filtrada (filtro Millipore tipo HV 0,45 pm). a análise de HPLC foi realizada usando-se coluna radialpack (fase estacionária Ci8 5 pm, 4 x 100 mm, Waters). Fase móvel: água / metanol = razão 4:6 (isocrática). Fluxo de 1 ml/minuto. Detecção a 280 nm.

Curva padrão para AD (mg) = (Área 8,39 + 2033) x 10-5 em que a área varia de 0 a 30000.

Curva padrão para ADD (mg) = (área 7,43 + 72,22) x 104; em que a área varia de 0 a 100000.

As curvas padrão foram obtidas a partir dos resultados de amostras puras de androestenodiona (AD) e androestadienodiona (ADD). Os tempos de retenção são dados como segue.

Composto Tempo de retenção (minuto) AD 8,73 ADD 13,20 Monitoramento dos substratos e dos produtos por CG A amostra (50 mg de cristais) é dissolvida em EtOAc e diluída a 60,0 ml em um frasco volumétrico. Altemativamente, 2 ml da mistura de biotransformação são extraídos com 50 ml de EtOAc. A solução de EtOAc é depois analisada quanto a Fitoesteróis, AD e ADD por CG.

Condições: coluna SAC-5, temperatura do fomo 278°C, temperatura do injetor 300°C, detector FID. Os tempos de retenção dos produtos são como seguem.

Composto Tempo de Retenção (minuto) AD 8,06 ADD 9,21 Brassicasteral 20,53 Campesterol 23,20 Campestanol 23,66 Estigmasterol 24,70 β-Sitoesterol 27,71 Sitoestanol (Estigmaestanol) 28,27 Resultados da Biotransformação de Fitoesteróis e AD para ADD

Tabela 7. Sumário do Monitoramento de Processo de Biotransformação de Dois Estágios.

Tabela 8. Sumário do monitoramento do processo de biotransformação de dois estágios._______________________________________________________ EXEMPLO 6: IDENTIFICAÇÃO DE NOVO MUTANTE F. SOLANIFMl 33 O protocolo foi usado para gerar os dados de sequência de gene (LSU)rRNA de subunidade grande. Aproximadamente 300 pares de base do gene LSU rRNA começando na posição 3344 foi foram amplificados por PCR a partir da forma isolada do DNA genômico das colônias fungicas FMI 33. Os produtos de amplificação foram purificados a partir de iniciadores em excesso e dNTPs usando-se membranas cortadas de peso molecular de Microcon 100 (Amicon) e verificados quanto a qualidade e a quantidade por corrida de uma porção dos produtos em um gel de agarose. O seqüenciamento do ciclo dos produtos de amplificação de LSU-rRNA foi realizado usando-se AmpliTaq FS DNA polimerase e os terminadores de pigmento de dRhodamine. Os terminadores rotulados por pigmento em excesso foram removidos a partir das reações de seqüenciamento usando-se coluna giratória s Sephadex G-50. Os produtos foram coletados por centrifugação, secados sob vácuo e congelados a -20°C até estarem prontos para carregar. As amostras foram recolocadas em suspensão em uma solução de formamida/dextrano azul/EDTA e desnaturados antes do carregamento. As amostras foram submetida à eletroforese em um seqüenciador de DNA ABI Prism 377. Os dados foram analisados usando-se o software PE/Applied Biosystems DNA Editing and Assembly.

As comparações foram feitas entre a amostra FMI 33 e outros microorganismos no banco de dados MicroSeq usando-se o software de análise microbiana. A FMI 33 foi observada ter uma distância genética do par mais próximo, F. solani, de 0,94 %, que é o indicativo de um mutante fungico separado. DADOS DA SEQÜÊNCIA DE FMI 33: AGACCGATAGCGAACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAÀGAACTTTGAAAAUAG

AGTTA

AACAGTACGTGAAÀTTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGTGACCAGACTTGGGCTTGGTT

GATC

ATCCGGGGTTCTCCCCGGTGCACTCTTCCGGCCAGGCCACfCATCAGTTCGCCCTGGG

GG

ACAAAGGCATCGGGAACGTGGCTCTCTCCGGGGAGTGTTATAGCCCGTTGCGTAAT

ACCC

TGCGGCGGACTGAGGTTCGCGCATTCGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCAICAGTG

ACCC

GTCTTGAAACACGGACCAAG

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Processo para fermentar uma composição de fitoesterol para produzir androestenodiona (androst-4-eno-3,l 7-diona) e subseqüentemente androestadienodiona (androsta-1,4-dieno-3,17-diona) caracterizado pelo fato de que compreende: propagar uma cultura microbiana do gênero Mycobacterium em um primeiro meio nutriente; colocar a cultura microbiana e a composição de fitoesterol em um biorreator por um período suficiente para transformar a composição em androst-4-eno-3,17-diona; propagar uma cultura fúngica do gênero Fusarium em um segundo meio nutriente; injetar um ou mais de 1) Fusarium sp\ e 2) o meio de cultura fúngica no biorreator por um período suficiente para transformar androst-4-eno-3,17-diona em androsta-1,4-dieno-3,17-diona.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cultura fúngica é Fusarium solam.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cultura fúngica é Fusarium oxyspontm.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cultura microbiana é Mycobacterium MB 3683, depositada no ATCC como PTA-352.

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cultura fúngica é Fusarium soiani FMI 33, depositada no ATCC como PTA-3947.

6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição de fitoesterol é derivada de piche de talol ou sabão de despolpamento.

7. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição de fitoesterol é derivada de um óleo vegetal adequadamente selecionado.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o óleo vegetal é selecionado do grupo que compreende soja, colza, milho, semente de algodão, girassol, oliva, linhaça ou farelo de arroz.

9. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição de fitoesterol compõe um ou mais dos seguintes: sitoesterol, campesterol, estigmaesterol, brassicaesterol, desmoesterol, calinoesterol, poriferaesterol, clionaesterol, todas as contrapartes hidrogenadas e todas as formas naturais ou sintetizadas e derivados destes, incluindo isômeros.

10. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro meio nutriente compreende melaços de refinaria e sais inorgânicos.

11. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o segundo meio nutriente compreende glicose e líquido da maceração do milho.

12. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as fermentações são realizadas aerobicamente.

13. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição de fitoesterol é dissolvida em uma solução usando-se um agente solubilizante e depois adicionada ao biorreator.

14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o agente solubilizador é um membro da família do glicol.

15. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o agente solubilizador é polipropileno glicol.

16. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o agente solubilizador é um membro da família de silicone.

17. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o biorreator é esterilizado e depois resfriado antes da injeção de 1) cultura fúngica ou 2) de meio de cultura fungica.