HU196847B - Uj eljárás 1,2-dehidro-szteroidok előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya új eljárás 1,2-telftett szteroidok 1,2-dehidfO-szteroidokká való átalakítására, olymódon, hogy az 1,2-telített szteroidokat Arthrobacter simplex vagy Bacterium cyclooxydans mikroorganizmussal egy exogén elektron átvivő anyag és aromás szénhidrogénekből álló, vízzel nem elegyedő oldószer jelenlétében alakítják át.

Description

A találmány tárgya mikrobiológiai eljárás 1,2-dehidro-szteroidok előállítására a megfelelő 1,2-telített származékaikból.

A korlikoszteroidokat először az ötvenes években használták gyógyászati célokra, amikoris a kortizon-acetátot reumás arthritis kezelésére alkalmazták. A későbbi vizsgálatok bebizonyították, hogy az 1,2-helyzetben telítetlen hidrokortizon, illetve kortizon származékok, a prednizolon és prednizon, jelentős többlethatással rendelkeznek, és kevesebb só visszatartást okoznak. Ezt követően a legtöbb szteroidot, amelyet a kortikoidok okozta betegségek kezelésére alkalmaztak, úgy állították elő, hogy az 1- és 2-helyzetben kettős kötést tartalmazzanak.

1977-ben két amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás a kortikoszteroidok szintézisére szterin prekurzorokból kiinduló eljárást javasolt, amely a kortikoszteroidok szintézisének új megközelítését jelentette. A 4 035 236. számú USA-beli szabadalmi leírás 9alfa-hidroxi-androszténdion előállítására vonatkozik szitoszterin, sztigmaszterin vagy koleszterin fermentálásával. A 4 041 055. számú USA-beli szabadalmi leírás gyógyászatilag alkalmas kortikoszteroidok ebből az androsztén-származékból való általános szintézisére vonatkozik. Az ebben a folyamatban leírt intermedierek 3-keto-ú^{4, 1} ’ konfigurációjúak lehetnek.

További, az 1,2-telített szteroidok 1,2-dehidro-szteroidokká való átalakításával foglalkozó irodalmi hivatkozások az alábbiak:

A 2 837 464. számú USA-beli szabadalmi leírás Corynebacteriummal történő dién-előállítást ír le. A leírás szerint a szteroidok 1-dehidrogenézését fermentációs úton, Arthrobacter (Corynebactcrium) simplex segítségével hajtják végre.

A 3 360 439. számú USA-beli szabadalmi leírás 1-dehidro-szteroidok előállítására vonatkozik. A szteroidok 1-dehidrogénezését úgy végzik el, hogy A. simplex sejteket rövidszénláncú alkanollal vagy alkanonnal, például acctonnal előkezelnek, majd szubsztrátummal és egy hidrogén átvivő katalizátorral összekeverik.

Charney, W. és Herzog, H.: Microbial Transformation of Steroids (Academic Press, Inc., New York,

4-9. és 236-261. oldalak /1967/) című könyvében a szteroid biokonverziókról ad történeti áttekintést, és felsorolja az 1-dehidrogénezéshez ismert és használatos mikroogranizmusokat.

Yamane, T., Nakatani, H. és munkatársai (Biotechnology and Bioengineering, 21, 2133 /1966/) 4-androsztén-3,17-dion Nocardia rhodocrous mikroorganizmussal történő 1 -delúdrogénezésének vizsgálatát végezlek el 50% benzol-heptán tartalmú elegyben. Ennek az oldószernek a biokonverziós elegyhez való hozzáadása következtében a reakciósebesség 180-szeresére növekedett. A benzol azonban rákkeltő tulajdonságú. A Nocardia rhodocrous aktivitása szempontjából az előnyös elektron-akceptor a fenazin-metoszulfát volt. Ez az elektron akceptor túl drága és instabil ahhoz, hogy a biokonverziós folyamatokban használni lehessen. A Nocardia rhodocrous enzim inaktív volt menadion, (2-metil-l ,4-naftokinon), az Artlirobacier simplex baktérium szempontjából kedvező elektron akceptor jelenlétében. A Nocardia rhódocrousban lévő enzim különbözik az A simplex által termelt enzimtől. A reakció 20% szteroid tartalmú szerves oldószerben játszódott le. Kimutatták, hogy a szteroid növekvő koncentrációjával a reakciósebesség csökkent. Az oxigén az 1-dehidrogénezési reakció nélkülözhetetlen eleme. Az alkalmazott oldószer (50% benzol-heptán) oxigén jelenlétében gyúlékony. Azt, hogy az oxigént hogy vezették be a rendszerbe úgy, hogy a gyulladást elkerüljék, nem ismertették.

Somoto, K., Jin, 1. és munkatársai (Agricultural Biological Chemistry, 44, 1119-1126 /1980/) a hidrokortizon A simplex-szel való 1-dehidrogénezését vizsgálták. Két egymással nem elegyedő oldószert, n-butanolt és n-amil-alkoholt használtak, de a biokonverzió nem játszódott le ezeknek az oldószereknek a jelenlétében. Vízoldható olószereket, például 10% metanol-víz és 10% propilén-glikol-víz, találtak oldószerként a legmegfelelőbbnek.

összefoglalóan megállapítható, hogy az ismert irodalmi hivatkozások nem ismertetnek vagy javasolnak találmányunk szerinti javított eljárásokat.

A találmány szerinti eljárás során az Arthrobacter simplex vagy Bacterium cycloxydans mikroorganizmus sejtek vizes sűrű szuszpenziójához aromás szénhidrogénekből álló, vízzel nem elegyedő oldószert, exogén elektron akceptort és dehidrogériezendő szteroidot adunk. A szuszpenziót keverjük, és az oxigénbevezetést úgy tesszük lehetővé, hogy a gáztérben az oxigéntartalmat kisebb értéken tartjuk, mint a robbanáshoz szükséges oxigén mennyisége, vagy a reakciót a szerves oldószer gyulladáspontja alatti hőméisékleten hajtjuk végre.

A találmányunk szerinti eljárás előnyei az ismert mikrobiológiai szteroid-dehidrogénezési eljárásokkal. !

szemben:

a) a biokonverzió végtermékében kevesebb az átalakulatlan szteroid,

b) a reakció nagyobb szteroid koncentráció alkalmazásával hajtható végre,

c) fajlagosan kevesebb mikroorganizmus sejt, például A. simplex szükséges a szteroid konverziójához,

d) az eljárás a szteroidban, a mikroorganizmus sejtjeiben vagy sejtek által a szteroidból végzett szennyeződésekkel szemben kevésbé érzékeny,

e) a redukció vagy a mikroorganizmus sejtekben jelenlévő szteroid degradáló enzimek teljes eltávolítása nagyobb kitermeléssel valósítható meg.

A találmányunk szerinti oldószeres eljárás azért is előnyösebb a más, például Nocardia rhodocrous mikroorganizmussal végzett eljárással szeben, mert az A. simplex katalizálta reakció stabilabb és olcsóbb elektron akceptorok, pélául a menadion jelenlétében hajtható végre.

A találmány szerinti eljáráshoz bármely ismert 1-dehidrogénező mikroorganizmus felhasználható.

Az 1-dehidrogénező baktériumokat Bergey: Manual of Determinative Biology (8. kiadás) szerint két j csoportra oszthatjuk. Az általunk leírt eljárás sikere- ’ sen alkalmazható az Arthrobacter és Corynebacte- !

rium fajokra, és azokra a törzsekre, amelyeket a 17. ;

rész Actinomycetes és hasonló mikroorgranizmusok címszó alatt tárgyal. Más törzsek 1-dehidrogénező fajai, mint a Nocardia, Mycobacterium, Streptomyces és Bacterium is alkalmasak az eljárás megvalósítására.

Eljárásunkat két, mindenki által hozzáférhető szteroidokat 1-dehidrogénező hatású mikroorganizmuson mutatjuk be. Egyrészt a 3 065 146. számú USA-beli szabadalmi leírásban 1-dehidrogénezőként szereplő Bacterium cyclooxydans-t (ATCC száma 12673) vizsgáltuk. A 2 837 464. számú USA-beli szabadalmi leírásban szereplő Arthrobacter simplex (ATCC száma 6946) mikroorganizmust gyakrabban használják szteroidok 1 -dehidrogénezésére. Ezért a leírás legnagyobb részében ezt a mikroorganizmust használjuk a találmány szerinti eljárás ismertetésére. De felhívjuk a figyelmet. hogy bármely 1-dehidrogénező mikroorganizmus alkalmas a találmány szerinti eljárás végrehajtására.

A mikroorganizmusokat a következő összetételű táptalajon tenyésztettük:

a) szervetlen vegyűletek (nitrátok vagy ammónium-sók) vagy szerves nitrogéntartalmú vegyűletek (élesztő extraktum, pepton, gabonaáztatólé) a növekedéshez szükséges nitrogén biztosítására,

b) szén- és energiaforrások, például szénhidrátok és cukorszármazékok, olaj, zsírsavak és metil-észtereik, alkoholok, aminosavak vagy szerves savak,

c) ionok és nyomelemek (nátrium, kálium, magnézium, foszfát, szulfát, manganát, réz, kobalt, molibdén) olyan mennyiségben, amely a csapvízben vagy a kevésbé finomított közegként használatos anyagokban található.

A mikroorganizmusok növekedésükhöz oxigént igényelnek a felettük lévő légtérben. Az A. simplex növekedéséhez megfelelő hőmérséklet 10-45 °C, előnyösen 28-37 °C. A növekedéshez optimális pH-érték semleges körül van.

A sejteket szterold-l-dehidrogénezésére úgy aktiváljuk, hogy l,2-telített-3-keto-szteroidot, például androszta-4-én-3,17-diont vagy kortizon-acetát adunk 0,005 tömeg/térfogat%, vagy nagyobb mennyiségben a közeghez. Az indukálószer jelenlétében a sejteket 6 órán keresztül inkubáljuk, majd összegyűjtjük és szárítjuk őket.

Az indukálószer a növekedési ciklus bármely pontján hozzáadható a mikroorganizmusokhoz. A disznózsír-olajhoz (triglicerideket és szabad zsírsavat tartalmazó olaj) hasonló táptalajon tenyésztett kultúrák a szteroid-l-dehidrogenázt gyorsan kezdik szintetizálni, mig a glükózon tenyésztett mikroorganizmusok csak a szubsztrátum elfogyasztása után kezdenek enzimet termelni. Az inkubálást 6 vagy még több órán keresztül folytatjuk az indukálószer hozzáadása után, majd a sejteket begyűjtjük az oldószeres folyamatban való használat vagy szárítás céljából.

A sejteket szárítás céljából elkülönítjük a táptalajtól, és hagyományos módszerek, például centrifugálás, flokkuáltatás, szűrés vagy ultraszűrés segítségével koncentráljuk őket. Az elválasztott sejteket ezután csökkentett nyomáson 1-85 °C, előnyösen 55-75 °C hőmérsékleten meleg levegővel porlasztva, vagy forgatva szárítjuk, amíg az anyag nedvességtartalma 1-10%, előnyösen 5% nem lesz. A biokonverzióhoz használt sejteket 5 °C-on tároljuk. Aktív szárított sejteket standard módszerek segítségével állíthatunk elő a szárított sejtek immobilizálásával például úgy, hogy poliakril-amid gélbe zárjuk vagy egy polielektrolit hordozóanyaghoz kollagén vagy kovalens kötéssel kötjük őket (Methods in Emzimology, XLIV. kötet, Academic Press Inc., New York, 11-317. oldal /1976/).

A biokonverziót az elkészített sejtek és a szteroid szubsztrát egymásra hatása révén érjük el. Általában a sejteket és a szteroidot egy gyengén pufferolt 6-10, előnyösen 7,25-8,5 pH-jú vizes közegben szuszpendáljuk. A sejtkoncentráció 0,1 -50 g/1, a szteroid és a sejtek tömegaránya 0,05-5. Vizes közegben 8-10 g/1 sejt-, illetve 5-10 g/1 szteroidkoncentráció előnyös a biokonverzió végrehajtásához. Katalitikus mennyiségű exogén elektron átvivő anyagot (például 5 x 10⁴ mól menadiont) is adunk a reakcióelegyhez. Katalizátorként menadion (2-metil-l ,4-naftokínon), fenazín-metoszuifátot, diklór-fenil-indofenolt, 1,4-naftokinont, menadion-biszulfitot, ubikinonokat (Koenzim Q) és K-vitamín típusú vegyületeket használhatunk. Az elegyeket 0—14 napon keresztül 5—45 C hőmérsékleten inkubáljuk. Az inkubálás alatt az elegyben felesleges mennyiségű molekuláris oxigénnek kell lennie, ezért előnyösen keverjük. Az 1 -de hidrogéné zés sebessége általában az idővel csökken. A biokonverzió 10 g/1 szubsztrát alkalmazásával kevesebb, mint 24 óra alatt 98-100%-os lehet.

Az eljárást a következő módokon hajthatjuk végre:

a) A szteroidot és a menadiont gyengén pufferolt vizes oldatban szuszpendáljuk, majd a szárított sejteket hozzáadjuk. A Tween 80-hoz hasonló felületaktív anyagok is hozzáadhatok az elegyhez 0-5% koncentrációban.

b) A sejteket vizes pufferoldatban szuszpendáljuk, majd a metanolban, etanolban, acetonban (amely térfogata nem lehet több, mint a végtérfogat 5%-a) oldott elektron átvivő anyagot adjuk hozzá. A szteroid szubsztrátot száraz porként vagy vízzel elegyedő szerves oldószerben (például dimetil-formamidban, etanolban, metanolban, acetonban, dimetil-szulfoxidban) vagy vízzel nem elegyedő szerves oldószerben (például toluolban) oldva vagy szuszpendálva adjuk hozzá.

c) A száraz sejteket kis mennyiségű pufferben rehidratáljuk további puffer vagy szerves oldószer hozzáadásával. A végleges 0-95% (tf/tf) eléréshez etanolt, acetont, xilolt, butil-acetátot, metilén-kloridot vagy toluolt adunk hozzá. A használt aromás szénhidrogén mennyisége a legjobban oldódó szteroid feloldásához szükséges oldószer felétől a legkevésbé oldódó szteroid feloldásához szükséges oldószer felétől a legkevésbé oldódó szteroid oldásához szükséges oldószer négyszerese között változhat. A reakció megindításához elektron átvivő anyagot és szteroidot adunk a reakcióelegyhez. Az aromás szénhidrogént előnyösen a szteroiddal együtt adjuk az elegyhez, bár ez egy korábbi vagy későbbi időpontban is megtörténhet.

d) A nedves sejttömeget szuszpendáljuk vagy a fermentációs levet hígítjuk gyengén pufferolt vizes oldattal, majd egy exogén elektron átvivő anyagot, a szteroidot és egy aromás szénhidrogént adunk hozzá.

A találmány szerinti reakcióban használható vegyültek a 3-keto-A⁴-androsztén és a 3-keto-A⁴-pregnén típusú szteroidokhoz tartoznak. A szteroid-l-dehidrogenáz szubsztrátjai az A gyűrű 1 -es és 2-es szénatomja között telítettek, és az A gyűrű 3-as helyzetében hidroxil- vagy ketocsoportot tartalmaznak. Az androsztén-típusú vegyűletek közé az alábbiak tartoznak:

1) androszta-4-én-3,l 7-dion,

2) androszta-4,9(1 l)-dién-3,l 7-dion és ezek 6-alfa-fluor-, 6-alfa-metil- vagy 16 metil-származékai,

3) ll-béta-hidroxi-androszta-4-én-3,l 7-dion és származékai.

A felhasználható r-keto-A⁴-pregnén-típusú vegyületek közé az alábbiak tartoznak: '

-31 .

196.847

1) 17-alfa-hidroxl-pregn-4-én-20-in-3-on és 16-metll-származékai,

2) ll-béta,21-dihidroxi-pregn-4,l7(20)-dién-3-on és 5

6-alfa-metit-származékai,

3) 2-klór-pregn-4,9(l l),l7(20>trién-21-al-3-on,

4) a 3,20-diketo-A⁴-pregnének számos csoportja, vagyis

a) 11,17,21-trihidroxi-vegyületek, mint például a hidrokortizon és 6-alfa-metil-származéka, ^υ

b) 9-béta,ll-béta-epoxi-l 7,21-vegyületek, mint például a 9-béta,ll-béta-epoxi-17,21-dihidroxi-16-béta-metil-pregn-4-én-3,20-dion,

c) 2,30-diketo-4,9(l l)-pregnén-diének, mint például a 17-alfa,21-dihidroxi-pregn-4,9(ll)-díén-3,20- 15 dión és ennek 16-alfa-metil-, 16-béta-metil- vagy 16-alfa-hidroxi-származékai vagy 17-alfa-acetát-észtere,

d) 3,20-diketo-4,9(ll)-, 4,9(11),16-pregnén-triének, mint például a 21 hidroxi-pregn-4,9(] l),16-trién-3,20-dion és ennek 6-alfa-fluor-származéka. 20

A 21-es helyzetben hidroxil-csoportot tartalmazó 2 és 4 pont alatti szteroidok 21-észter származékai szintén alkalmazhatók szubsztrátként. Az előnyös 21-észterek az alacsonyabb szénatomszámú zsírsavakhoz hasonló alacsonyabb szénatomászámú alkilvagy aril-csoportokat tartalmaznak, például ecetsavat 25 vagy monoriklikus karbonsavakat, például benzoésavat.

A biokonverzió terméke és az át nem alakult szubsztrát szokványos módszerekkel választható el a keverékből. A szteroidokat általában szűréssel, majd __ a szűrőn maradt lepény szerves oldószenei, mint például acetonnal vagy metilén-kloriddal való extrakciójával választják el. Egy másik alternatív módszer az, hogy az egész biokonverziós keveréket egy vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, mint például butil-acetáttal vagy metilén-kloriddal extraháljuk, majd a tér- 35 méket a szerves oldószerből különítik el.

A találmány szerinti eljárást az alábbi példákkal illusztráljuk, anélkül azonban, hogy a találmányt a példákra korlátoznánk. A példák is bizonyítják, hogy a találmány szerinti eljárás sokkal jobb az irodalomból ismert eljárásoknál. A biokonverziót a fentiekben 40 részletezett körülmények között hajtottuk végre.

1. példa

Szárított sejtek előállítása

6-6 g/1 keményftőcukrot, peptont és kukoricalekvárt tartalmazó (pH = 7,0) rázólombikba Bacterium cycloocydans-t (ATCC 12673) oltottunk. A kuttúrá- 45 kát 28 ⁶C hőmérsékleten egy rotarázógépen inkubáltuk, amjg glükóz kimerülés nem lépett fel. Ekkor 0,5 g/1 kortizon-acetátot adtunk hozzá, és a lombikot további 16 órán keresztül inkubáltuk. A sejteket centrifugálással nyertük ki, kétszer vízzel mostuk, majd gn csökkentett nyomáson 45 °C hőmérsékleten megszáritottuk.

Androszta-1,4-9(11 )-trién-3,17-dion előállítása

6-6 g/1 glükózt, kukoricalekvárt és porlasztva szárított zsíremulziót tartalmazó rázólombikokban Arth- 55 robacter szimplex (ATCC 6946) mikroorganizmust tenyésztettünk. A kultúrákat 28 °C hőmérsékleten rotációs rázóban addig inkubáltuk, amíg glükóz kimerülést nem észleltünk. Ekkor korizon-acetátot (0,15 g/1) adtunk az elegyhez, hogy megindítsuk a szteroid. -1-dehidrogenáz szintézist. Egy éjszakai inkubálás 60 után a sejteket centrifugálással gyűjtöttük össze. A sejt pelleteket 55 °C hőmérsékleten alacsony nyomáson 24 órán át szárítottuk. 24 órával később a száraz anyagot egy légmentesen záródó tartályba tettük és 5 ^cC hőmérsékleten tároltuk, amíg a biokonverzió, hoz fel nem használtuk.

2. példa (1) Egy edénybe a következő anyagokat mértük be (1 1 alap):

a) 0,9 1 50 mmól-os kálium-foszfát puffer (pH«7,5)

b) 3,66 g száraz A. simplex sejt

c) 0,08 g menadion

d) 8 g 2 l-acetoxi-pren-4,9(1 l),16-trién-3,20-dion

e) 100 ml toluol (2) Keverés közben 62,8 J/l.min hőfelvételi sebességgel melegítettük.

(3) Annyi levegőt eresztettünk a lombikba, hogy a gáztérben lévő oxigén mennyisége 3-6% legyen.

(4) A hőmérsékletet 28± 1 °C-on tartottuk.

(5) 25 órás reakcióidő után a toluolos fázist elválasztottuk.

Ebben az esetben a toluolos fázis összetétele a kővetkező volt:

94,3% acetoxi-pregn-1,4,9(11 ),16 )-tetraén-3,20-dion, 4,2% 21-hidroxi-pregn-l ,4,9(11),16-tetraén-3,20dion

1,5% 21 -acetoxl-pregn-4,9(ll),16-trién-3,20-dion.

A fenti lépések a következő eltérésekkel hajthatók végre:

(1) lépés

a) A puffer pH-ja 6-10 között változhat.

b) Az A. simplex mennyisége akkorára korlátozható, amely éppen elegendő a reakció befejezéséhez. Általában 0,05-1 g sejt/1 szteroid mennyiségben alkalmazzuk. Az enzim mikrobiális forrása: Arthrobacter (Corynebacterium) szimplex (ATCC 6946) vagy Bacterium cyclooxydans (ATCC 12673).

A mikroorganizmus előállítása: Az A. simplex sejtteket a fermentlében használhatjuk, vagy összegyűlhetjük, megszánhatjuk, acetonos kezelést alkalmazhatunk vagy immobilizálhatjuk őket a szakirodalomból ismert módszerek segítségével.

c) Elektronakceptorként a következő vegyületeket alkalmazhatjuk: menadion (2-metil-l ,4-naftokinon), menadion-biszulfit,

1,4-naftoklnon és más K-vitamin típusú vegyületek.

Az elektronakceptor alkalmazott mennyisége a költségektől és a reakciósebeséggel kapcsolatos megfontolásoktól függ. A reakciósebesség lineárisan arányos a menadion koncentrációval. Általában 5-40 g elektron akceptor/kg szteroid felhasználása előnyös.

d) A szteroid koncentráció olyan magas legyen, amennyi hatékonyan át tud alakulni.

A szteroid a 3-keto-A⁴-androsztének vagy a 3-keto-Δ⁴-pregnének közé tartozzon, és a szerves oldószerben oldhatósága nagyobb legyen, mint 5 g/1..

e) Az aromás szénhidrogén toluol, benzol vagy xilol lehet. Ezeket az oldószereket együttesen, vagy más, vízzel nem elegyedő oldószenei, például hetánnal vagy metilén-kloriddal hígítva alkalmazhatjuk.

Az aromás szénhidrogén mennyisége a legjobban oldódó kiindulási vagy végtermék szteroid feoldásáfc

-A1 .

hoz szükséges oldószer fele és a legrosszabbul oldódó kiindulási vagy végtermék szteroid feloldásához szükséges oldószer négyszerese között változhat.

A fenti példában a toluolt olyan mennyiségben alkalmaztuk, hogy éppen elegendő volt a reakció befejezésekor a szteroid feloldásához.

Az aromás szénhidrogént előnyösen a szteroiddal együtt adjuk a reakcióefegyhez. Azonban az aromás szénhidrogént későbbi vagy korábbi időpontban is hozzáadhatjuk az elegyhez.

(2) lépés

Az elegyet annyira kell keverni, amennyire ez lehetséges. A reakciósebesség a keverési erőtől erősen függ.

(3) lépés

A reakció oxigénigényes. Azonban az aromás szénhidrogén jelenléte következtében a reaktor gázterében robbanásveszélyes gázelegy keletkezik. Ennek a veszélynek a leküzdése érdekében a gáztérben lévő oxigén mennyiségét a gyulladáshoz szükséges mennyiség alatt kell tartani. Benzol esetén a gyulladáshoz szükséges minimális oxigén 11,2%. Xilol esetén is lehetséges a reakciót a lobbanáspont alatt tartani. M-xilol, o-xilol és p-xilol esetén a gyulladási hőmérséklet 29,32, illetve 39 °C.

(4) lépés

A reakcióhőmérséklet 0-45 °C között változhat.

(5) lépés

A reakció általában 2 nap alatt zajlik le, de a reakcióidő néhány óra és néhány hét között változhat.

3. példa

A toluolos és vizes eljárások összehasonlítása

A (eljárás)

0,4 g A. simplex sejtet és 50 ml 50 mmól-os kálium-foszfát puffért (pH = 7,5) összekevertünk. 2 órán keresztül mozgattuk, amíg egységes fermentlevet nem kaptunk. 2-25 ml-es frakciókat vettünk ki belőlük, és 125 ml-es lombikba tettük. Mindegyik lombikba 0,25 ml 3A-alkoholban oldott 5 mmól menadiont és 0,2 g androszta-4,9(l l)-dién-3,17-diont adtunk. Az egyik lombikba 2 ml toluolt öntöttünk. 4 napon keresztül rázógépen mozgattuk. 4 nap elteltével 25 ml toluollal extraháltuk. Az extraktumokat analizáltuk. B (eredmények)

Eljárás

Vizes toluolos

Szubsztrát:

androszta-4,9(l l>di én-3,17-dion 17,7% 0,00%

Termék:

androszta-1,4,9(11 )-trién-3,l 7-dién 82,3% 100,00%

4. példa

A 2. példának megfelelő módon eljárásva a következő szteroidokat alakítottuk át 1,2-dehidro-származékaikká A. simplex szárított sejtek segítségével:

1. androszta-4-én-3,17-dion

2. 6-alfa-íluor-androszta-4,9(l 1 )-dién-3,l 7-dion

3. 6-alfa-metil-androszta-4,9(ll)-dién-3,l 7-dion

4. 16-béta-metil-androszta-4,9(l l)-dién-3,17-dion

196.847

5. l7-alfa-hidroxi-pregn-4-én-20-in-3-on 6.17-alfa-hidroxi-pregn-4,9(l l)-dién-20-ln-3-on

7.17-alfa-hidroxi-16-béta-metil-pregn-4,9(ll)-dlén.

20-on-3-on

8. 21-acetoxi-l1 -béta-hidroxl -pregn-4,í7(20)-dién-20· -in-3-on

9.20-klór-pregn-4,9(l l),17(20)-trién-21 -al-3-οη _ 10 21-acetoxi-17-hidroxi-pregn-4,9(íl)-dién-3,20W -dión

11. 21-acetoxi-17-hidroxi-16-alfa-metil-pregn-4,9(l 1)· -dién-3,20-dion

12.21 -benzoil-oxi-17 -hidroxi-16-alfa-metil-pregn-4,9(1 l)-díén-3,20-dion

13.21-acetoxi-17-hidroxi-16-béta-metil-pregn-4,9(1 l)-dién-3,20-dion

14. 21-acetoxi-pregn-4,9(l l),16-trién-3,20-dion

15. 21-acetoxi-6-alfa-fluor-pregn-4,9(l 1 ),16(17)-trién-3,20-dion.

A konverzióval a következő termékekhez jutott20 tünk:

la. androszta-1,4-dién-3,l 7-dion 2a. 6-alfa-fluor-androszta-l,4,9(1 l)-trién-3,17-dion 3a. 6-alfa-metil-androszta-l,4,9(l l)-trén-3,17-dlon 4a. 16-béta-metil-androszta-l ,4,9(1 l)-trién-3,17-dion

5a. l7-alfa-hidroxi-pregn-l,4-dién-20-in-3-on

6a. 17-alfa-hidroxi-pregn-l ,4,9(11 )-trién-20-in-3-on 7a. 18-alfa-hidroxi-16-béta-metil-pregn-l ,4,9(11)-trién-20-in-3-on

8a. 21-acetoxi-l 1-béta-hidroxi-pregn-l ,4,17(20)-trién-3-on és 1 l-béta,21-dihidroxi-pregn-l ,4,1730 -(20)-trién-3-on

9a. 20-klór-pregn-l,4,9(l l),17(20)-trién-21-al-3-on 10a. 21-acetoxi-l 7-hidroxi-pregn-1,4,9(11 )-trién-3,20-dion és 17,21-dihidroxi-pregn-l,4,9(1 l)-trién-3,20-dion

11a. 21-acetoxi-17-hidroxi-16-alfa-metil-pregn-l,4,9-(1 l)-trién-3,20-dion és 17,21-dihidroxi-16-alfa-metil-pregn-1,4,9(11 )-trién-3,20-dion

12a. 21-benzol-oxi-17-hidroxi-16-béta-metíl-pregn-1,4,9(1 l)-trién-3,20-dion

13a. 21 -acetoxi-17-hidroxi-l 6-béta-metil-pregn-l ,4,940 -(1 l)-trién-3,20-dion és 17,21-dihidroxi-16-béta-metil-pregn-1,4,9(11 )-trién-3,20-dion

14a. 21 -acetoxi-pregn-1,4,9( 11), 16-tetraén-3,20-d ion és 21 -hidroxi-pregn-1,4,9(11 ),16-tetraén-3,20-dion

15a. 21-acetoxi-6-alfa-fluor-pregn-l,4,9(1 l),16-tetraén-3,20-dion és 6-alfa-fluor-21 -hidroxi-pregn-1,445 9(1 l),16-tetraén-3,20-dion.

Az 1,2-dehidro-szteroidok felhasználása jól ismert.

Például a 3 284 447 számú USA-beli szabadalmi leírás szerint az Δ^1,4·^¹''-pregnén-triének a 16. szénatomszámon helyettesített diuretikus kortikoszteroidok szintéziséhez használhatók fel. A 4 041 055. szá50 mű Δ^1,4-androsztén-dion származékokból, ezáltal bizonyítva azt, hogy az 1,2-dehidro-androsztének fontos intermedierek gyógyászatílag hasznos előállításában.

Claims (6)

1. ³⁵ Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás 1 ;2-te 1 ített szteroidok 1,2-dehidro-szteroidokká való átalakítására, Arthrobacter simplex vagy Bacterium cyclooxydans mikroorganizmussal, θθ a z z a 1 j e 11 e m e z v e , hogy egy exogén elektron .

   196.847 átvivő anyag is aromás szénhidrogénekből álló, vízzel nem elegyedő oldószer jelenlétében alakítjuk át.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzaljel- 5 1 e in e z v e , hogy elektron átvivő anyagként 2-metil-l,4-naftokinont, 1,4-naftokinont, 2-metil-l ,4-naftokinon-biszuintot vagy más, K-vitamin típusú vegyületet, aromás szénhidrogénként toluolt vagy xilolt alkalmazunk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzaljel- 10 le me z ve , hogy az aromás szénhidrogénekből álló, vízzel nem elegyedő oldószert a legjobban oldódó szubsztrát vagy végtermék szteroid feloldásához szükséges fele és a legkevésbé oldódó szubsztrát vagy végtermék szteroid feloldásáhőz szükséges mennyiség négyszerese közötti mennyiségben alkalmazzuk.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az átalakítást az oxidációhoz minimálisan szükséges koncentrációjú oxigén jelenlétében végezzük.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az átalakítást a szerves oldószer lobbanáspontja alatti hőmérsékleten végezzük.
6. 6. Az 1., 4. vagy 5. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vízzel nem elegyedő oldószert más, vízzel nem elegyedő oldószerrel hígítjuk.