NO125889B

NO125889B -

Info

Publication number: NO125889B
Application number: NO16521966A
Authority: NO
Inventors: Waard W Van Der
Original assignee: Koninklijke Gist Spiritus
Priority date: 1965-10-22
Filing date: 1966-10-19
Publication date: 1972-11-20
Also published as: DK119405B; IL26679A; SE322507B; CH485689A; GB1113887A; BE688518A; NL6513718A; BR6683880D0; ES332381A1; AT267774B; DE1568932A1; IT1143556B

Description

Fremgangsmåte til fremstilling

av steroider av androstanrekken.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av steroider av androstanrekken med formelen:

med oksygenfunksjoner i 3- og 17-stillingene og uten karbonholdige substituenter i 17-stillingen t fortrinnsvis l,i|-androstadien-3,17_ dion eller 4-androsten-3,17-dion, ved mikrobiologisk omdannelse av steroider inneholdende samme grunnstruktur og med en oksygenfunksjon

i 3-stillingen og en mettet eller umettet 3-orientert alifatisk hydrokarbongruppe inneholdende minst 8 karbonatomer i 17-stillingen, og' hvis grunnstruktur angripes under den mikrobiologiske omdannelse, såfremt det ikke er en inhibitor tilstede, fortrinnsvis cholesterol, g-sitosterol, stigmasterol, 4-cholesten-3-on, eller 5ot-klorcholesta-nol, under anvendelse av mikroorganismer av slekten Mycobacterium, slik som Mycobacterium phlei eller Mycobacterium butyricum, og i nærvær av en inhibitor.

Det har lenge vært kjent at visse mikroorganismer er i stand til å fullstendig nedbryte steroider med en sidekjede ved karbonatom 17, slik som kolesterol. I 1913 fant Soehngen at bakterier av Mycobacterium-slekten kunne vokse i et medium inneholdende kolesterol som den eneste karbonkilde (Zentr.bl. Bakt. II Abt. 37 (1913) 595).

I 19^2 undersøkte Tak disse fenomenene og i løpet av denne forskning isolerte han en bakterie som han kalte Mycobacterium chole-sterolicum (Ant. van Leeuwnhoek 8 (19*12) 32). Etter dette ble det utgitt publikasjoner vedrørende omdannelsen av kolesterol hvor mikro-organismer av slektene Proactinomyces, Azotobacter, Flavobacterium, Aerobacter, Pseudomonas, Nocardia og Streptomyces er nevnt. ;I disse omdannelser nedbrytes kolesterol fullstendig til forbindelser som har lav molekylvekt, og det oppsamler seg ikke noen vesentlige mengder av mellomprodukter med steroid-karakter. 4-kolesten-3-on og 7-dehydrokolesterol påvises noen ganger i små mengder. ;I ett tilfelle nevner Tak en liten mengde av 4-kolesten-3,6-dion. ;Whitmarsh forsøkte å bremse på nedbrytelsen av kolesterol (med Nocardia arter) ved tilsetning av en organisk inhibitor, og håpet således å isolere mellomprodukter som kunne gi en indikasjon på den ruten som nedbrytningen fulgte. Den inhibitor som ble benyttet av Whitmarsh var 8-hydroksyquinolin og det var således mulig å påvise 4 o . 14 3-keto-A -bis-norkolensyre såvel som en liten mengde 3-keto-A * -bis-norkolensyre i sure ekstrakter av kulturmediet. I den nøytrale frak-sjonen ble det påvist mengder av l,4-androstadien-3)17-dion og 4-androsten-3,17-dion. (Bioch. J. 90 (1964) 23P).

Ifølge Abstracts of Papers fra det 150. møte til American Chem.Soc. (1965) 13 Q, utsatte C.J. SIH c.s. 1,3,5 (lO)-kolestatrien for virkningen av bakterier med den hensikt å få tildannet estron.

Det ble funnet at substratet ikke ble omdannet av organismer fra slekten Nocardia og Mycobacterium. På den annen side ble 19-hydroksy- -it-kolesten-3_on raskt omdannet til estron, og 6.19-oksido-4-kolesten-3-on til 6.19-oksido-1l-androsten-3,17-dion av disse mikroorga-nismene .

Det har nå vist seg at det er mulig å gjennomføre en mikrobiologisk omdannelse av den ovenfor definerte type ved hjelp av mikro-organismer av slekten Mycobacterium, når omdannelsen gjennomføres i nærvær av visse uorganiske inhibitorer.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er således kjennetegnet ved at det som inhibitor anvendes nikkel-, kadmium-, kobolt-, bly-eller selenittioner.

Som eksempler på utgangsmaterialer kan nevnes 3-keto eller 3-hydroksysteroider med en sidekjede i 17-stillingen, f.eks. kolesterol, (3-sitosterol, stigmasterol og 4-kolesten-3-on.

Det er også mulig å bruke derivater, slik som estrene av steroler, spesielt kolesteryl-betainklorid, kolesterylacetat, kolesteryl-hemisuccinat, eller addisjonsprodukter, f.eks. 5«-klorkolestanol, eller også steroler i hvilke det har funnet sted en eller flere ytterligere substitusjoner i A-ringen. De mikro-organismer som skal brukes for omdannelsen tilhører slekten Mycobacterium, f.eks. Mycobacterium phlei og Mycobacterium butyricum. De benyttede ovenfor nevnte inhibitorer inhiberer nedbrytelsen på en slik måte at steroid-ringstrukturen og de korresponderende vinkelformede metylgrupper for-blir intakte i så vid utstrekning som mulig. Fremgangsmåten til fremstilling av steroider som har et skjelett av 19 karbonatomer som sammen danner dimetylcyklopentanoperhydrofenantren-skjelettet, og spesielt fremstillingen av l,4-androstadien-3,17-dion og 4-androsten-3,17-dion.

Keto-gruppen i 17-stilling kan lett påvises ved hjelp av Zimmerman-reaksjonen hvis ingen substituenter er tilstede ved karbonatom 16 (W. Zimmerman, Hoppe Seylers Z. Physiol. Chemie 233 (1835) 257).

Androstadiendion er et verdifullt produkt fordi det kan tjene som utgangsmateriale for fremstillingen av forbindelser med androgen, estrogen, anabolisk og anti-konsepsjonal aktivitet, f.eks. androsteron eller testosteron (androgene forbindelser), estron (estrogen forbindelse), 17cc-metyl-19-nortestosteron (anaboliske egenskaper) og 17a-etynyl-19-nortestosteron (antikonseptionelle egenskaper).

Den nye fremgangsmåten gjør det blant annet mulig å omdanne det kolesterol som finnes i naturen og som i seg- selv bare brukes ibegrenset grad, til et mellomprodukt av stor verdi, nemlig 1,4-andro-stadien-3,17-dionen.

For hensiktsmessig anvendelse av fremgangsmåten er det nød-vendig å dyrke bakterieartene av slekten Mycobacterium i et medium inneholdende en uorganisk eller organisk nitrogenkilde, slik som aminosyrer, ammoniumsalter, nitrater av alkali- eller jordalkalimetaller eller pepton. Maisstøpevæske, gjærekstrakt, bomullsfrømel, soyamel, "distillers' solubles" og lignende er også meget egnet. Mediene behøver ikke å inneholde noen assimilerbare karbonkilder slik som sukker, stivelse, flerverdige alkoholer, selv om deres nærvær ikke har noen skadelig virkning på prosessforløpet. Et egnet medium inneholder videre også den vanlige mengden av salter, slik som fosfater, sulfater og klorider av alkali- og jordalkalimetaller. Sporelementer er vanligvis tilstede i tilstrekkelige mengder på grunn av bruken av ledningsvann.

Når naturlige nitrogenkilder bestående av en komplisert blanding, slik som maisstøpevæske, benyttes, kan ofte tilsetningen av mineralsalter sløyfes.

Mediene steriliseres på konvensjonell måte og etter denne behandling kan de ha en pH-verdi på 4.0 til 8.5, idet en surhetsgrad på ca. 7«0 er vanlig.

Når cellene har vokst tilstrekkelig i mediet under konstant gjennomlufting, kan steroidet, f.eks. kolesterol eller g-sitosterol, tilsettes enten oppløst i et egnet oppløsningsmiddel slik som N,N-dimetylformamid eller i form av en fin suspensjon i vann.

Mengden av inhibitoren som skal tilsettes avhenger av for-holdene. Hvis konsentrasjonen er for lav vil steroidet som tilsettes nedbrytes fullstendig til stoffer som har lav molekylvekt. Hvis konsentrasjonen er for høy vil omdannelsen av steroidet sterkt inhiberes og mikro-organismen vil noen ganger også bli drept. Hvis NiSO^^HgO brukes er en konsentrasjon på 10 - 1000 mg per liter tilstrekkelig, skjønt betingelsene hvorved en lavere eller høyere konsentrasjon er ønsket, er tenkelig. Hvis koboltklorid, blyacetat, kadmiumsulfat eller natriumselenit anvendes, faller konsentrasjonen fortrinnsvis også innen det ovenfor nevnte området.

Det tidspunkt hvorved steroidet tilsettes, ligger mellom 0 og 72 timer etter podning, skjønt rimelige resultater også oppnåes med en senere tilsetning. Tilsetningen foretaes imidlertid fortrinnsvis 24 til 48 timer etter podning av kulturen, når bakteriene har vokst tilstrekkelig. En meget tidlig tilsetning f.eks. umiddelbart etter podning, er mulig. Inhibitoren vil i alminnelighet bli tilsatt sam-tidig med steroidet, fordi bakteriene ikke drepes når inhibitoren tilsettes i en egnet konsentrasjon. Dette kan lett slåes fast ved å henvise til kulturer som er oppnådd ved å stryke kulturen, etter tilsetning av steroid og inhibitor, på et egnet kulturmedium.

Omdannelsen av steroidet finner sted med konstant gjennon-lufting ved en temperatur som varierer mellom 20° og 45°C, skjønt prosessen også vil finne sted ved en lavere eller høyere temperatur. Reaksjonen utføres fortrinnsvis ved 30°C, enskjønt det ikke er nød-vendig for temperaturen under dyrkningsfasene og nedbrytningsprosessen å være den samme. Bakterien kan først dyrkes i 24 timer ved 26°C etter hvilket temperaturen kan heves til 30°C etter tilsetning av steroid og inhibitor.

Omdannelsen av det tilsatte steroidet tar 1 til 7 dager, men som regel stiger ikke mengden av det ønskede endeprodukt videre etter 3 dager. Et viktig hovedprodukt som dannes når det gjelder steroler når ingen ytterligere substituering har funnet sted i A-ringen, er l,4-androstadien-3,17-dion, med mindre mengder av 4-androsten-3,17-dion i tillegg, idet utbytteforholdene blant annet er avhengig av gjennomluftingen. De beskrevne betingelser leder til en ønsket over-vekt av l,4-androstadien-3,17-dion over 4-androsten-3,17-dion. De tildannede steroider kan oppnåes fra kulturvæsken ved ekstraksjon med en væske som ikke er blandbar med vann, slik som metylisobutylketon, etylacetat, metylenklorid, eller kloroform. Disse ekstrakter inndampes til tørrhet; resten ekstraheres med et organisk oppløsnings-middel for å fjerne ikke-omdannet substrat, slik som kolesterol eller stigmasterol.

Det resterende faste stoffet kan deretter renses videre og separereB i dets to komponenter ved kromatografi og omkrystallisering.

Oppfinnelsen illustreres ved henvisning til følgende eksempler:

Eksempel I

En podningskultur av Mycobacterium phlei, KNQSF 70 stamme, fremstilles ved podning av en kultur av denne bakterie på agar, og in-kubering i 3 dager ved 30°C i et medium bestående av en oppløsning av 10 g gjærekstrakt (DIFCO) i 1 liter ledningsvann av pH = 6.8, som for-ut var sterilisert i 30 minutter ved 110°C. Mediet er plasert i 2-liters kolber. • Hver kolbe inneholder 500 ml av mediet.

Kulturen rystes i 48' timer ved 30°C i et rystningsapparat

av rotasjonstypen med en hastighet på 250 omdreininger per minutt og en slaglengde på 2.5 cm, etter hvilket bakterien har vokst tilstrekkelig til videre å bli podet.

Hovedfermenteringsmediet prepareres ved i hvert tilfelle å fortynne 5 g av væskeuttrekk fra mais (beregnet som tørrstoff) med ledningsvann til 1 liter og deretter bringe væsken til en pH-verdi på 7.0 med en fortynnet natriumhydroksydoppløsning. Dette mediet steriliseres i tre kolber i 30 minutter ved 110°C. Hver av de benyttede tre 2-liters kolbene inneholder 1 liter medium. Kolbene podes nå med den podningskulturen som er beskrevet ovenfor, idet 50 ml tilsettes til hver av kolbene. Podningen er derfor 5 %. Kolbene rystes i 48 timer ved 30°C på samme måte som beskrevet ovenfor.

Til hver av kolbene tilsettes 1 g kolsterol i form av en suspensjon i vann, tilveiebragt ved pulverisering av steroidet i en morter med tilsetning av vann inneholdende 0.1 % "Tween-80". Videre tilsettes en steril oppløsning av 750 mg NiS0^.7H20 i vann til hver kolbe, hvilket beløper seg til 157 mg nikkelioner. Kolbene rystes nå videre under de samme betingelser. Allerede 12 timer etter tilsetning av kolesterol vises tilstedeværelsen av l,4-androstadien-3,17_ dion ved hjelp av tynn-sjiktskromatografi. Til dette brukes silisium-dioksydgel G ifølge Stahl; elueringsmidlet består av en blanding av kloroform og etylacetat i et volumforhold på 10:1.

Etter tre dagers rysting kombineres innholdene i de tre kolbene og blandingen ekstraheres tre ganger med 1/5 av dets volum av metylisobutylketon. Ekstraktet inndampes til tørrhet under forminsket trykk og resten ekstraheres med 20 ml kokende metanol. Som en følge av dette fjernes det uomdannede kolesterol. Fra resten kan 1.6 gram kolesterol gjenvinnes. Metanolekstraktet inneholder det ønskede produkt. Etter inndampning til tørrhet taes det opp i 8 ml benzen hvor-etter denne oppløsning kromatograferes i en søyle inneholdende 30 g -aium-i-n-i-umoksyd (-Al^O-■ i-følge Woelms,- nøytral aktivitet III). Søylen - elueres med en blanding av benzen og aceton (10:1), mens det påvises ved hjelp av tynnsjiktskromatografi at fraksjoner av 1,4-androstadien-3,17-dion er tilstede. De omtalte fraksjoner oppsamles og inndampes.

Resten omkrystalliseres fra en blanding, av aceton og heptan (1:3). På denne måten oppnåes l60 mg krystaller, fra hvilket det til slutt oppnåes, etter fornyet omkrystallisering 138 mg rent produkt. Dette beløper seg til et utbytte på 13.4 % basert på forbrukt kolesterol .

Smeltepunktet er 137.5° - 139°C og smeltepunktet til en prøve av androstadiendion av analyttisk kvalitet er 137° - 138°C. En blanding av de to krystallinske produkter viser ingen senkning av smeltepunktet. Prøvenes infrarøde spektra er identiske.

Eksempel II

Analogt med den prosessen som er beskrevet i eksempel I, fremstilles en kultur av Mycobacterium phlei, KNGSF 75-3/53 stamme.

Hovedfermenteringen finner sted i tre 500 ml kolber, hver

av hvilke inneholder 100 ml medium. Også i dette tilfelle brukes en podningskultur på 5 i? i forhold til mengden av hovedfermenteringsmediet. Kolbene rystes på den vanlige måten og 48 timer etter podning tilsettes 200 ml kolesterol til hver kolbe og også 50 mg NiSO^. 7H~20, og etter dette fortsettes rystingen. Etter tre dager inneholder kolbene tilsammen mengder av 1,4-androstadien-3,17-dion som varierer mellom 188.9 og 236 mg, vanligvis med små mengder av 4-androsten-3,17-dion i tillegg.

Utbyttet varierer fra 42.8 til 53.6 % basert på tilsatt kolesterol.

Eksempel III

I overensstemmelse med prosessen i eksempel II benyttes en kultur av Mycobacterium phlei, KNGSF 70 stamme.

Til hver av kolbene tilsettes 400 mg kolesterol og etter fire dager kan 93 mg 1,4-androstadien-3,17-dion isoleres ved hjelp av den metode som er beskrevet i eksempel I. Mengden av uomdannet substrat beløper seg til 230 mg i hver av kolbene. Følgelig har maksimum 170 mg kolesterol blitt omdannet i hver kolbe fra hvilket man teore-tisk kan oppnå 124 mg l,4-androstadien-3,17-dion. Disse data tyder på at omdannelsen har funnet sted i et utbytte på 75 % basert på omdannet kolesterol og på 31.6 % basert på tilsatt kolesterol.

Eksempel- IV -

Mycobacterium butyricum ATCC 11.314 behandles analogt med eksempel II. Isolering og rensing ifølge eksempel I gir 30 mg 1,4-androstadien-3j17-dion i hver kolbe etter tre dagers rysting. Utbyttet

er 20.4 % basert på tilsatt kolesterol.

Eksempel V

Mycobacterium phlei, KNGSF 70 stamme behandles ifølge eksempel II. Istedenfor kolesterol tilsettes imidlertid 400 mg g-sitosterol til hver av kolbene. Etter fire dager isoleres 37 mg 1,4-androstadien-3,17-dion fra hver av kolbene ifølge eksempel I. Dette beløper seg til et utbytte på 3.5 % basert på tilsatt 3-sitosterol.

Eksempel VI

Fremgangsmåten er den samme som i eksempel III-med den for-, skjell at 400 mg stigmasterol tilsettes til hver av kolbene. Etter tre dager kan tilstedeværelsen av l,4-androstadien-3,17-dion vises ved hjelp av tynnsjiktkromatografi, som beskrevet i eksempel I.

Eksempel VII

En kultur av Mycobacterium phlei, KNGSF 70 stamme lages som beskrevet i eksempel III, men istedenfor 50 mg nikkelsulfat tilsettes

en like stor mengde koboltklorid til hver av kolbene. Etter to dagers rysting ved 30°C kan tilstedeværelsen av l,4-androstadien-3,17-dion og 4-androsten-3,17-dion vises ved hjelp av tynnsjiktkromatografi.

Eksempel VIII

Eksempel VII gjentaes med den forskjell at istedenfor nikkelsulfat tilsettes 5 rag kadmiumsulfat til hver av kolbene. Etter en dags rysting er tilstedeværelsen av mengder av l,4-androstadien-3,17-dion såvel som 4-androsten-3,17-dion tydelig fra tynnsjiktkromato-grammer. I tillegg er to andre ukjente flekker synlige, som viser en positiv Zimmerman-reaksjon. Mengden av produktet bestemmes ved ekstraksjon av væsken med metylisobutylketon og kromatografi av ekstraktet på papir i et system av benzen og heptan (5:4) mettet med formamid, eluering av den respektive flekk med metanol og måling av ekstinksjonen ved en bølgelengde på 244 my i et Unicam-spektrofotometer.

En blanding av l,4-androstadien-3,17-dion og 4-androsten'«3,17-dion er tilstede i hver av flaskene i en mengde på 29.4 mg (utbyttet på 10 X beregnet ut fra tilsatt kolesterol). Eksempel IjC j

Det forsøk som er beskrevet i eksempel VII gjentaes, men j istedenfor nikkelsulfat tilsettes 50 mg blyacetat til hver av kolbene.

Etter to dager finnes «llsmde en betraktelig dannelse av 1,4-andro-stadien-3f17-dion ved hjelp av tynnsjiktkromatografi.

Eksempel X

Det forsøk som er beskrevet i eksempel VII gjentaes, men istedenfor nikkelsulfat tilsettes 50 mg natriumselenit til hver av kolbene. Ved hjelp av tynnsjiktkromatografi etter to dager kan dann-elsen av l,il-androstadien-3,17-dion påvises. 4-androsten-3,17-dion er også tilstede.

Eksempel XI

Fremgangsmåten er analog med den i eksempel IIIjmed den forskjell at istedenfor kolesterol tilsettes 200 mg 4-kolesten 3-on til hver .av kolbene. Etter tre dagers rysting kan man ved hjelp av den metoden for måling av ekstinksjon som er beskrevet i eksempel VIII påvise en mengde på 25 - 30 mg av 1,4-androstadien-3317-dion_(utbytte på 16.9 - 20.2 %) basert på tilsatt kolesterol).

Eksempel XII

Fremgangsmåten er analog med den i eksempel III, med den forskjell at istedenfor kolesterol tilsettes 200 mg av lett vannopp-løselig kolesterylbetainklorid til hver av kolbene. Etter fire dagers rysting isoleres reaksjonsproduktet og renses på den måten som er beskrevet i eksempel I. Således tilveiebringes 20 - 25 mg 1,4-andro-stadien-3,17-dion såvel som små mengder av 4-androsten-3,17-dion (utbytte på 18.3 - 22.9 % basert på tilsatt kolesterylbetainklorid). Eksempel XIII

Fremgangsmåten er analog med den i eksempel IV, med den forskjell at 200 mg 5a-klorkolestanol nå tilsettes til hver av kolbene. Isolering og rensing ifølge eksempel I, gir l6.7 mg 1,4-androstadien-3,17-dion og 3.9 mg 4-androsten-3j17-dion, et totalt utbytte på 15.3 % basert på tilsatt kolesterol. De dannede produkter inneholder 18.9 % 4-androsten-3,17-dion.

Claims

Fremgangsmåte til fremstilling av steroider av androstanrekken med formelen:

me,d oksygenfunksjoner i 3- og 17-stillingene og uten karbonholdige substituenter i 17-stillingen, fortrinnsvis l,4-androstadien-3> 17- dion eller 4-androsten-3,17-dion, ved mikrobiologisk omdannelse av steroider inneholdende samme grunnstruktur og med en oksygenfunksjon i 3-stillingen, og en mettet eller umettet 3-orientert alifatisk hydrokarbongruppe inneholdende minst 8 karbonatomer i 17-stillingen, og hvis grunnstruktur angripes under den mikrobiologiske omdannelse, såfremt det ikke er en inhibitor tilstede, fortrinnsvis kolesterol, 3-sitosterol, stigmasterol, 4-kolesten-3-on, eller 5a-klorkolestanol, under anvendelse av mikroorganismer av slekten Mycobacterium, slik som Mycobacterium phlei eller Mycobacterium butyricum, og i nærvær av en inhibitor, karakterisert ved at det som inhibitor anvendes nikkel-, kadmium-, kobolt-, bly- eller selenittioner.