DE1913152A1

DE1913152A1 - Pregna-4,16-dien-3,20-dione,Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneipraeparaten

Info

Publication number: DE1913152A1
Application number: DE19691913152
Authority: DE
Inventors: Diassi Patrick A; Principe Pacifico A
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1968-03-20
Filing date: 1969-03-14
Publication date: 1969-10-02
Also published as: JPS4810555B1; FR2005221A1; CH491896A; US3488733A; GB1259492A

Description

DR. ELISABETH JUNG, DR. VOLKER VOSSIUS, DIPL.-ING. GERHARD GOLDEWEY

PATENTANWÄLTE 1 Q 1 Q 1 C O

8 MÖNCHEN 23 ■ S I EG E S S T R ASSE 26 . TELEFON 345087 · TELEG H AM M -ADH ESS E: I N VENT/MONCH EN

UMKLm

UoZo! E 147 (Be/Vo/kä) Case 714- 423-S

SQUIBB & SONS, IHC, New York, H₀Y₀-, ToSt₀Ao

" £regna-4,16~dlen-3,20-dione₉ Verfahren zu ihrer Herst ellung und ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneipräparaten "

Priorität» 20« März 3.3δ8* V*St·!.,., -Hr.. 714 423

Sie Erfindung betrifft neue Er@gE©,-4sl6-äien-3»2Q~diGne der allgemeinen Formeln na rso ' '

?^H2^0E OH₂OR

oder

m in denen B ein Waseeretoffatom oder eine Acylgruppe bsöautet.

ο . ■ ■ ■■■, ■■ ■^r ■ ■ ■ ■' :- ■"■■ ^:^: ^w

^ Eevor^Ugte Aoylreste E leitsn eich von Gerbonsäuren alt weniger Q ale 12 Kohlenstoffatomeri iti-, m© niGdsron alipha*isoii«3a C*rbonsäuren, aοBo Am@iS3aeäu?e_s

- T ORIQINäL tNSPEGTED

finisch ungesättigte aliphatisch Carbonsäuren, wie Acrylsäure, Methacrylsäure, Crotonsäure, 3-Butencarbonsäure und e,3-I)ii&ethylacrylsäure, monocyclisch« aromatische Carbonsäuren» wie Benzoesäure und MethyIbenzoesäuren, moaooyclisciie, arylsubstituierte aliphatieche Carbonsäuren, wie Phenylessigsäure» ß-Phenylpropibnsäure» oHEhenylbutt er säur e und 5-(P-Me thyl phenyl )~pentanoarbon~ säure» Cycloalkanoarbonsäuren» wie Cyclobutanoarboneäure, Cyelο-pentanoarboneäure und Cyclohexancarbonsäure» Gycloalkenoarbonsäuren, wie 2-Cyclobutencarb on säure und 3-CyolopentenoarbonsäUre, Cycloalkyl- und Cycloalkenylsubstituierten niederen aliphatischen Carbonsäurenj, wie Cyclohexanessigsäure, Oi-Cyclopentanbuttersäure,

2-Cyolopentöneseigsäure und 3-(3-Cyclohexen)-pentenoarbonsäure.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der Steroide der allgemeinen Formel I und bzw, oder Xl, das dadurch gekennzeichnet ist» dass laan 21-Acetoxypregna-4₉16»dien->3,2O«< dioa mit den Enzymen von Mikroorganismen der Arten ^hamnidium elegane, Synoephalaetrum racenosust oder Absidia coerulea beiiandelt und gegebenenfalls die erhaltenen Hydroxyverbindungen in an sioh bekannter Weise durch Umsetzung mit einer Carbonsäure oder ihraii reaktionsfähigen Derivat zu den entsprechenden Acy !oxoverbindungen verestert. '

Durch Synoephalaetrum racemosura bildet sich im Terfahr©&' ύ®% - Er-. findung das 15fi_t21-Dihydroxypregna-4,l6-diea-3»20»äiono - elegans bildet das - 14oC, 21-

3,20-dioß. und die Easyrne von Absiiia-©oerul©» efgelien mim. diese« beiden Steroide₀

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ORlGINALfNSPECTED

Die enzymatisch« Hydroxylierung wird am besten durch Zugabe dee Ausgsngssteroids zu einer aeroben Kultur des Mikroorganismus oder durch Zusammenbringen des Auegangssteroids mit Luft und dem Mikroorganismus in einem wässrigen Nährboden durchgeführt. Die ZUohtungsbedingungen'für die Mikroorganismen, die erfindungegemäss eingesetzt werden, entsprechen mit Ausnahme des umzusetzenden Steroids den an sich bekannten Züchtungsbedingungen für verschiedene andere Pilze, die zur Herstellung von Antibiotica und bzw· oder Riboflavin verwendet werden.

Der Mikroorganismus wird aerob in oder auf einem geeigneten Nährboden gezüchtete Der Nährboden enthält hauptsächlich eine Stickstoffverbindung und eine Quelle für Kohlenstoff und Energie· Als Kohlenstoff- und Energiequelle kann ein Kohlenhydrat, wie Rohrzucker, Melasse, Glucose, Maltose, Stärke oder Dextrin, eine Fettsäurej ein Fett und bzw_D oder das Steroid selbst verwendet werdenο Vorzugsweise enthält der Nährboden eine assimilierbare Kohlenstoff- und Energiequelle zusätzlich zum Steroid» Als Stickstoff quelle kommen Naturstoffe, wie Sojabohnenmehl^ Maiequell·* wasser, Fleischextrakt und/oder die löslichen Rückstände der Alkoholdestillation, oder synthetische Verbindungen, z,B« einfache organische oder anorganische Verbindungen« wie Ammoniumsalze _r Alkalinitrate, Aminosäuren oder Harnstoff in Frageο Während der Gärung muss für ausreichende Zufuhr steriler Luft gesorgt werdenο Entweder setzt man eine grosse Oberfläche des Nährmediums der Luft aus, oder man arbeitet nach dem Submereverfahren unter Belüftung· Dae Steroid kann.während der Inkubation zugesetzt werden, oder es kann dem Nährbeden vor d«mSterilisieren oder Beimpfen einverleibt werden· Der.bevorzugte Konzentrat

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tionebereich des Steroids in der Kultur beträgt etwa 0,01 bis 0,10 Gewo-$o Die Züchtungsdauer kann erheblich schwanken, Z₀B₀ etwa 6 bis 96 Stunden "betragen» Sas Steroid wird ansehliessend in üblicher Weise isoliert.

Die Hydroxylgruppen der erhaltenen Verbindungen der allgemeinen Formeln I und II, in denen H ein Wasserstoffatom ist» können danach in an sich bekannter V.'eise acyliert werden, z»B_o durch Umsetzung mit einem Säureanhydrid oder Säurechlorid und Vorzugs-» weise in Gegenwart einer organischen Base, wie Pyridino

Die erhaltenen Endprodukte der allgemeinen Formeln I oder II sind physiologisch aktive Verbindungen, die Sowohl bei oraler als auch parenteral er Verabreichung gestagene Wirkung zeigen«. Sie können als solche in der Veterinärmedizin zur Behandlung von grossen und kleinen Tieren, z,6o Hunden, Katzen, Schafen, Kühen oder Pferden eingesetzt werden, die mit einem Geetagen behandelt werden müssen« ZoBo können, die Verbindungen der Erfindung in der Tierzucht zur Verhinderung von drohendem Abort verwendet werden„ Die Tagesdosen betragen für diesen Zweck etwa 2 bis 100 mg/kg Körpergewicht* Zur Steuerung der Milchproduktion bei Kühen und zur Eier« produktion von Hühnern können die Verbindungen in TaspeadoBen von ebenfalls etwa 2 bis 100 mg/kg Körpergewicht verabfolgt werden.

Die Verbindungen der Erfindung besitzen auch eine mineralcortica-Ie Wirkung« Sie können daher anstelle von Desoxyoortioosteron zur Behandlung der verschiedensten Säugetiere, wie Hunde, Katzen, Rinder oder Pferde verwendet werden, die an Nebenniereninsufficiens leiden, »oB» an Urämie oder Stoffwechselstörungen mit einer Verschiebung des Elektrolytgleichgewiohts. Zu diesem Zweck können

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sie Hunden in Sagesdosen von etwa. 2,5 bis 5,0 mg und Hindern in Tagesdosen von etwa 20 bis 25 mg verabfolgt werden«

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Steroide der Erfindung zur Herstellung von lokal ₉ enteral oder parenteral applizierbaren Arzneipräparatenc Diese Arzneipräparate werden nach üblichen Methoden und unter Verwendung üblicher Hilfestoffe hergestellte

Die Steroide der Erfindung sowie ihre Zwischenprodukte haben oberflächenaktive Eigenschaften» sie können deshalb als Emulgatoren verwendet werdene Ausserdem absorbieren die Verbindungen der Erfindung UV-Licht und¹ sie können daher als Lichtschutzmittel verwendet werden_o

Die Beispiele erläutern die Erfindung^

Beispiel 1 *

14 Df. 21-Dihydro3S,ypregna-4 _rl6-aiea-»3 _? 20-qLion Ihamnidium elegans (ATGC - 18 191) wird auf folgendem Nährboden

(A) gezüchtet»

Glucose 10 Hefeextrakt 2₉5

K₂HPO₄ 1

Agar 20

mit destilliertem Wasser auf 1 Liter auffülle**..,

Bas Oberflächenwae&stuii von swei 2 Wochen alten Schräs^garkultü ren wird tu 5 ml einer O₉Ol ^»ig@n wässrig®», ilatriuralavryleulfatlSsung suspendierte Von dieses Suspension «©ifd.eis ä®^'Sii8: Han gen von 1 ml aur Beimpfung von aeiat 250 ml fa©9©s#Qa

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ORIGINAL* iNSFECTÖi

I -

Kolben verwendet, die jeweils 50 ml des folgenden sterilisierten Nührmediums (B) enthalten;

Gramm -

Maisquellwasser 6

HH₄H₂PO₄ 3

Hefeextrakt 2,5

Glucose 10

Calciumearbonat 2,5

mit destilliertem Wasser auf 1 Liter auffüllen.

Hach 24-stündigem Bebrüten bei 25⁰C unter kontinuierlichem Schütteln auf einer Drehschüttelmaschine mit einem Hub von etwa 5 om und 280 U/Min» werden 10 Vol₀~#ige Übertragungen auf vierzig 250 ml fassende Erlenmeyer-Kolben durchgeführt, die jeweils 50 ml des frisch sterilisierten Nährmediums (B) enthaltenο Zu jedem Kolben wird eine sterile lösung von 21-Acetoxypregna°4,l6~ dien-3»2O-dion in N₉ N-Di methyl formamid, einer Konzentration von 40 mg/ml in einer Menge von 0,25 ml gegeben, so dass die Steroidkonzentration in-jedem-Kolben 200 f/wl beträgt» Es werden insgesamt 400 mg des Steroids fermentiert.

H&oh etwa 28-stündigem weiterem Bebrüten unter den genannten ^Bedingungen wird der Inhalt der Kolben susammengegossen und Si© Crärmaisohe durch ein Klarfilter filtriert» Ma Kolfeen ₉ das %@@1 und das Filter werden nacheinander mit jeweils 100 ml waxmem< Wasser gewaschen» 23as Volumen des Piltr&ts und άπτ Wa&@hflü@§igJg@£t b«tKägt'2C00 ssl» Bits© flüissigkeit wird^:-d2p®iraal mit 3© 4W ml- i Chloroform extrahiert« Si·*-Üxivekte-werden Tf»Gialßt, gut.mit ; Wasser gewaschen und unter vearmiincleartesi S^aels eingedampft _θ D@e· . ^: Rilokataaä von 267 mg, 'wird .dorcei BteaschicliteteQmatograplji© m.

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OR(GiMALiNSPECTED

Kieeelgel HF₂EA ¹^ ^{mit einem} Gemisch, gleicher Volumteile Äthylacetat und Chloroform als Lösungsmittel gereinigt. Die im UV-Licht sichtbare Bande bei einem fi^-Wert von etwa 0,4 wird mit 20 tigern Methanol in Äthylaoetat ausgewaschen und eingedampft. Nach Umkristallisation des Rückstandes aus einer Mischung aus Aceton und Hexan werden 134 mg 14Ä ₉21~Dihyaroxypregna-4fl6-dien~ 3,20-dion vom P₀ 184 bis 185⁰C erhaltene

¹¹²° (Chloroform);, Λ JJj^ 240 ψ (£ = 24 000), ²»⁰⁸* ²»90, 6,00, 6,06, 6,20, 6,31 Ji, ^^Α ⁸'⁸⁶ (BAe-CH₅), 8,76 (β,19-0Η₃)_ρ 5,48 (m,21-CH₂),

4,25 (s_t4-H)p 3,25 (t_t16-H·)· .

CH C₂₁H₂₈O₄ (344,44)? ber.: 73,22; 8,19j

gef.s 73»15j 8,18o

Beispiel 2

14 OjL _f 21^Di^.ydroxypregna-4 _f l6-dien-3«20»di on^21->ace tat Eine Lösung von 31 mg 14 Of,21-Dihydroxypregna-4,l6-dien~3_s20-dion in 0>5 ml wasserfreiem Eyridin und 0,25 ml Essigsäureanhydrid wird 16 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen· Danach wird das Keaktionsgemisch unter vermindertem Druck eingedampft, der Rückstand in Chloroform gelöst und die Chloroformlösung mit Viasser gewaschen» Sie Chloroformlösung wird unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand aus einer Mischung von Aceton und Hexan umkristallisiert. Ausbeute 17,1 mg 14üf,21-Dihydroxypregna-4,16-dien^3,20-dion-21-acetat vom F« 215 bis 217⁰Co l⁵ °

+ 102° (Chloroform), J(*j*; 240 κμ (ί = 24 600)j 2»9⁸» 5_S72, 5„97, 6,08, 6,20_f 6,30 μί

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U 8,89'(8,18-QH,), 8_P78 (s,19-CH,), 7,83 (e_s21-0Ac)_c 5,04 (t3,21~CH₂)p 4,30. (e_t4-H), 3*27 (t,16-H).

C H C₂₃H₃₀O₅ (386,47)? ber.i71f48| 7,82j

gef.:7Op51» 7_P66_e

Beispiel 5

15ß. 21~Dihydrox.ypre%na-4. l6-dien-3.20~dion Syncephalastrum recemosum (ATCC-18 192) wird auf folgendem Nährboden (A) gezüchtet:

Gramm

Glucose 10

Hefeextraict 2,5

K₂HPO₄ 1

Agar 20

mit destilliertem Wasser auf 1 Liter auffüllen₀

Bas Oberflächenwachetum von zwei 2 Wochen alten Schrägagarröhrchen wird in 5 ml einer 0,01 gß-igen wässrigen Hatriumlauryleulfatlösung suspendiert» Yon dieser Suspension werden jeweils 1 ml zur Beimpfung von acht 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben verwendet, die jeweils 50 ml des folgenden sterilisierten Hährmediums (B) enthalten?

Gramm

Maisquellwasser 6

EH₄H₂PO₄ 3

Hefeextrakt 2,5

Glucose .10

CaCOs 2 *5 '

mit destilliertem Wasser auf 1 Liter auifüllen_o

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Hach 24-stündiger Inkubation bei 23⁰C unter kontinuierlichem
Schütteln auf einer Drehachttttelmasehine mit einem HuI) von etwa 5 om und 230 U/Hin« werden 10 vol,-?6ige Übertragungen auf vier» zig 250 ml fassende Erlenmeyer-Kolben durchgeführt, die jeweils 50 ml frisch sterilisiertes Nährmedium (B) enthaltene Zu jedem Kolben wird eine sterile Lösung von 21-Aeetoxypregna-4,l6-dien-3,2C~i.ion in Ν,Ν-Dimethylformamid einer Konzentration von 4-0 mg/ ml in einer Menge von 0_p25 ml gegeben, so dass die Steroid&on— zentration in jedem Kolben 200 ^/ml beträgt, Bs werden insgesamt 400 mg des Steroids fermentiert»

Nach weiterer 44-stündiger Bebrütung unter den vorgenannten Bedingungen wird der Inhalt der Kolben susammengegossen und die
Gärmaische durch ein Klärfilter filtriert. Die Kolben, das Myeel und das Filter werden mit jeweils 100 ml. warmem Wasser hintereinander gewaschen« Sas ¥g1?jsish, des Filtrate und der Waschflüseigkeiten beträgt insgesamt 2utX» §dU Dies® Flüssigkeit wird dreimal mit je 600 ml Chloroform extrahiex't'· Die Chloroformextrakte werden vereinigt, zweimal mit jeweils 900 ml Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck ©ingedampft₀ Bar Rückstand von 196 mg wird aus einer Mischung von Aceton und Hexan umkristallisierte Ausbeute 51 mg 15ß»21-Dihydro3cypregna-4»16-dien~3,20-dione
Po 219 bis 221°, fO(J^ + 48,6° (Chloroform),
λ £ai^e 238 rnu (£ - 23 150) Λ Sax"¹ 2,90, 5,99-6,02 Ji₈
6,20, 6,30/χ, rcl^^^ 8,68 (_8ρ18-0Η₅)_ρ 8,72 (
5,48 (0,21-CH₂-), 5,28 (o,W_H»i2 Ha, 150C-H); 4,25 (

3,27 (d,J-3, 16-H)

OH °21^H28°4 (544,44); ber_#i 73_s22j 8,19?

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Beispiel 4

3.5JB« 21-Dihydroxypregna-4.l6-dien-3.20-dion-15.21~diaoetat Eine lösung von 25 mg 15ß,21-Dihydroxypregna-4,l6-dien-3,20-dion in 3 ml trockenem Pyridin und 1 ml Essigsäureanhydrid wird 16 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen» ansehlies&end mit Eiswasser verdünnt und mit Chloroform extrahiert» Die Chloroformlösung wird nacheinander mit 2n Salzsäure, 5 9&-iger wässriger NatriuBibiearDonatlösung und Wasser gewaschen und danach unter vermindertem Druck eingedampfte Der Rückstand wird an Kieselgel HP254 ixB-te* Verwendung eines Gemisches gleicher Volumteile Äthylaoetat und Chloroform ale Löaungemittel chromatographierto Die im UV-Iicht sichtbare Bande mit einem R^-Wert von etwa 0,6 wird abgetrennt und mit einer Lösung von 20 %> Methanol in Äthylacetat eluierto Das Kluat wird eingedampft und nicht kristallines ISO,21-Dihydroxypregna-4,l6-dien~3 »20-di on-15,21-diacetat erhalten,

^} 8,74 <e,18-CH₅), 8,74 (e_f19-0H₃), 7,92 (s,15~0Ac)₉

7,83 (s_f21-0Ao), 4,56 (m,Wj^>9 Hz, 15«-H), 4,27 (s,4-H), 3_S28 (d,J*2,5

Beispiel 5

..21-Dihydroxypregna~4.

14 CX121-Dih.vdroxypregna-4. l6«-dien-3 .

Acsidia ooerulea wird auf einem Nährboden (a) folgender

••tsirag geeüchtet j

■■■-■■■■ "" ■ SrjjffijjEf.

Gluooee 10

Hdfeextr*kt . ':- 2,5

20 »it dtetilliörtea Wasser auf 1 liter auffüllen«

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■ « = ■■--■■:,-„-.■■■.'« . _:. ;■:-"-ORIGINAL-INSRECTED

Bas Oberflächenwachstum von zwei 2 Wochen alten Schrägagarröhrchen wird in 5 ml einer 0,01 jC-i^en wässrigen Natriutalaurylsulfatlösung suspendiert. Von dieeer Suspension werden jeweils Mengen von 1 ml zur Beimpfung von acht 250 ml fassenden Erlen· meyerkolben verwendet» die jeweils 50 ml des folgenden Bterilieierten Nährmediums (B) enthalten*

Gramm

Maisgjiellwasßer 6

NH₄H₂PO₄ ,3 .

Hefeextrakt 2,5

Glucose 10

Calciumcarbonat 2_e5

mit destilliertem Wasser auf 1 Liter auffüllen«

Nach 24—etündiger Inkubation bei 25⁰C unter kontinuierlichem Schütteln auf einer Drehschüttelmasehine mit einem Hub von etwa 5 cm und 280 ü/Min₀ werden 10 vol_e-$ige Übertragungen auf vier» unddreissig 250 ml fassende Erlenmeyer-Kolben durchgeführt» die jeweils 50 ml des frisch sterilisierten Kährmediums (3i) enthalten. In jeden Kolben wird eine sterile Lösung von 21-Acetoxypregna~4_el6-dien-3(20-dicn in Ν,Ν-Dimethylformamid einer Konzentration von 60 mg/ml in einer Menge von 0,25 ml gegeben, so daee die Steroidkonzentration 3OC /"/ml in jedem Kolben betragt. Bs werden insgesamt 510 mg des Steroids fermentiert.

Hach weiterer 30-stündiger BebrUtung unter den vorgenannten Bedingungen wird der Inhalt der Kolben zusammengegossen und die Gärmaische durch ein Klärfilter filtrierte Die Kolben, das Myoel und das Filter werden nacheinander mit jeweils 100 ml warmen Wasser gewaschene Das Volumen dee Filtrate und der Waschflüssig-

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keit beträgt 1700 ml«, Die Lösung wird -dreimal mit jeweils §0b ml Chloroform extrahiert;«, Die Ciiloroformextrakte werden vereinigt, sweJmal mit % ereile 700 ml Waeser gewaschen und unter vermindertem Druok eingedampft ο Es werden 260 mg Mcketand erhalten, IAirail ümkriatallieation werden 97 «ng ISß^l-^jLliydroxypregna-itlö-dien-3,20-dion erhaltene

Die Mutterlauge wird ßemäss Beispiel 4 tci liaumtemperatur 16 Stunden acetylierto Durch DUnnechlchtchromatographie an Kieielgel HF₂Cj verden zwei im UV-Licht sichtbare Banden erhalten«, Die wt-₍ niger polare Bande ergibt 15e»21«Dihydroxypre£Ha-4»l6-aien-?_r2O~ dion-15,21-diaoetat und die stärker polare Banäc d*e 14 Ä,21-Di-

"9 09 8 A-O/1 70 2

Claims

Patentanspruch e

1. , Pregna~4,16-dien~3,20-aionverbinaungen der allgemeinen Formeln

CH₂OR

CeO

In denen B ein Wasserstoffatom oder eine Aoylgruppe bedeutet_o

2. 19_v21-Diaydroxypsegna-4i>l6»dien'»3{_l20"dion nach Anspruch Ic.

3 ο 13 t 21-Dihydroxypregna-4 ?16«dien-3,2O-dion-15»21-diaoetat nach Ansprueh 1.

4c 14,21*Dihydroxypregna-4_Bl6-dien-3_f20-dion nach Anspruch Io

5o 14_iai«Dihydroxypregna-4f_>l6-diön»3_P20«dion«21-acetat naoh Anspruch 1.

6_e Verfahren sur Herstellung der Pregna-4»16-dien-3,2O«dionverbindungen der allgemeinen Formeln I und/oder XI nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet« dass man ' 21~Acetoxypregna-4>16-dien«3,20-dion der enzyniatiaehen Blnvd.rkung von Mikroorganieiaen der Arten Thamiiidium elegans, Syncephalactrum raotmoüum und Absidia ooerulea auseetzic und die erhalten·» Dihydroxysteroidverbindun&en gegebenenfalls in an eich bekannter Weise aoylierto

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