DE1668671A1

DE1668671A1 - 11-Hydroxy-delta?-steroide der Pregnan-Reihe und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE1668671A1
Application number: DE19681668671
Authority: DE
Inventors: Diassi Patrick A; Principe Pacifico A
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1967-02-20
Filing date: 1968-02-19
Publication date: 1971-09-23
Also published as: NL6801762A; CH491893A; FR7887M; ES350630A1; FR1555991A; BE711016A

Description

DIPL.-CHEM. DR. ELISABETH JUNG DIPL.-CHEM. DR. VOLKER VOSSIUS DIPL-PHYS. DR. JÜRGEN SCHIRDEWAHN PATENTANWÄLTE

MÜNCHEN 23.

CLEMENSSTaAS3E

TELEFON 345067

TELEGHAMM-ADBESSE: INVENT/M UNCHEN

TELEX 5-_2ββββ

P 16 68 671.8-42 u.Z.: D 158c (vdB/or) 617 O87-S

E. R. SQUIBB & SONS, INC. New York, N.Y., V.St.A.

"11-Hydroxy-/^ -steroide der Pregnan-Reihe und Verfahren zu ihrer Herstellung"

Priorität: 20. Februar 1967, V.St.A., Nr. 617 Ο87

Die Erfindung betrifft neue ll-Hydroxy-/\ -steroide der Pregnan-Reihe der allgemeinen Formeln

HO

CH₂-R

CH₂-R,

I 109839/1629 II

1668571

CH₂-R

HO

und R»

IT

in denen X ein Halogenatom, vorzugsweise ein Fluor- oder Chloratom, oder eine niedere Alkylgruppe, vorzugsweise eine Methylgruppe und zusätzlich- bei den Verbindungen II und III ein Wasserstoff atom und R ein Wasst „toffatom, eine Hydroxylgruppe oder den Acyloxyrest einer Carbonsäure mit weniger als 12 C-Atomen bedeutet. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man die entsprechenden in 11-Stellung unsubstituierten Steroide der Einwirkung der Enzyme entweder eines die IKX-Stellung hydroxylierenden Mikroorganismus aus der Gruppe Aspergillus ochraceus, Colletotrichum linicola, Colletotrichum phomoldes und Trichothecium roseum oder eines die llß-Steilung hydroxylierenden Mikro-Organismus aus der Gruppe Curvularia lunata, Cunninghamella blakesleeana, Corticium microsclefotia und Coniothyrium hellebori aussetzt.

Die erfindungsgemäß hergestellten 11-Hydroxy-^ -steroide sind wertvolle Zwischenprodukte zur Herstellung der entsprechenden 9 ex. -Halogen-1 Iß, l6<K, 17X-trihydroxysteroide, die wegen ihrer glucocorticoiden Aktivität wertvolle Arzneimittel darstellen.

In den vorstehend angegebenen Formeln t * deuten, die gsruhvmngenen Linien, dass der Substituent entweder „x- orier ß-ständlg ist.

10 3 8 3 9/1629

Die Acylcxyreste leiten aich jäoB. von niederen Carbonsäuren,, wie Essigsäure, Propionsäure und niederen olefinisch ungesättigten aliphatischen Carbonsäuren« v.'ie Propensäure und 4--HexenBäure _r monocyclischen aromatischen Carbonsäuren, wie Benzoesäure _? und durch laonocyclische aromatische Reste substituierten niederen aliphatischen Carbonsäuren, v/ie Phenylessigsäure und S'-Phenylpropionsäure, sowie Cycloalkan carbonsäuren, wie Cycloliexanearbonsäure und Cycloallr.encarbonsäuren_a wie öyolohexencarbonsäure, ab_e

Geeignete Ausgangssteroide für das erfindungsgemäsae Verfahren sind ZoB, l6~DehydroprfcseBteron_f' 21-HydroxypregnaH-fl6~^dien"" 3120«dion _t 6 ßf-i^lluor-<5:^>iiydroxypregna-4»l6~dien-3 .· 20~dlon~2X-aoetat _t S öC**Methylpregna-4-rX6™dien-3120-dion_? 6OC -Fluoropregna- 41 l6-diea-3,20-dionj" 3Q₀ 21-D.ihydroxypregna^5 ₁ 21-acetat_? 3ßp21™Dihydroxypregna.»5fl6«dien«20 pregna~5 %l6-dien"20-on, 3 (X ~Kydroxypregna-5 ₁ 1 3iB-Hydroxy-5 (V-pregr -Ιβ-βη-^Ο-οη, 3OC -Hydroxy-5Oi -pregn-16-en-2«>-on_r 5 <X-Pregn"l6-en~3 ₁ 20-dionj 3ß ₁ 21~Dihyä,roxy~5S--pregn-l6-

en-2O-on_P 3ß-Hydroxy-5ß"?regn-16~en-20-on und '^iX -Hydroxy-Sß- "

pregn-l6-en~2P-on.

Die Einführung der Hydro:cylgruppe wird au besten entv/eder durch aerobe Vergärung des Ausgangssteroids in einer Kultur des Mikroorganismus oder durch Umsetzung des Ausgangssteroids in wässrigem Medium mit dem Mikroorganismus und in Gegenwart von Luft durchgeführt. Im allgemeinen sind die Bedingungen zur Züchtung des Mikroorganismus für die Zwecke der Erfindung (mit Ausnahme der Zugabe des Ausgangssteroids) die gleichen_t wie für die ZU

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Zugabe des Ausgangs steroids) die gleichen* wie für die Züchtung

"ι

verschiedener anderer Pilze zur Herstellung von Antibiotika und

bzw. oder Riboflavine

Der Mikroorganismus wird unti*>? aeroben Bedingungen in oder auf einem geeignetem?. Kahrmedium gezüchtet. Das Nährmediura enthält im allgemeinen aine stickstoffhaltige Verbindung sowie eine Quelle für Kohlenstoff *und Energie. Als länergiequellö kommen Kohlenhydrate, wie .ßohrzucker,» Melasse, Glukose _f Maltose, Stärke oder Dextrin, eine Fettsäure, ein Fett und bzw. oder das Aua~ gangssteroid in Frage. Vorzugsweise enthält jedoch das Nähriae·™

diUßi eine assimilierbare Kohlenstoff- und Energiequelle ausser dem Steroid. Die stickstoffhaltige Verbindung kann natürlicher oder synthetischer Herkunft sein_? z.B. Sojabohnenmehl, Mai3~ qüellwasser, Fleischextrakt, lösliche Rückstände der Alkoholdestillation, einfache organische oder anorganische Verbindungen, wie "Ammoniumsalze,, Alkalinitrate, Aminosäuren oder Harnstoff oder ein Gemisch dieser Verbindungen, Während der Vergärung muss für ausreichende Zufuhr steriler Luft gesorgt werden, indem man nach an sich bekannten Methoden eine grosse Oberfläche des Nährmediums belüftet oder in belüfteter Submerskultur arbeitet. Das Steroid kann der Kultur während der Inkubationszeit oder vor der Sterilisation oder Beimpfung zugegeben werden. Der bevorzugte Konzentrationsbereich des Steroids in der Kultur liegt bei etwa 0,01 bis 0,10 Gew»-^. Die Vergärungszeit kann beträchtlich schwanken, z.B. kann sie etv/a 6 bis 96 Stunden betragen. Danach wird das Steroid aus der Gärbrühe in üblicher Weise isoliert.. Zur Herstellung eines 3- und bzw. oder 21-Esters kann die ent-

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sprechende 3- und baw. oder 21-Hydraxylgruppe in üblicher -Weise acyliert werden. z.B. durch Behandlung dea Steroids mit oinem Carbonsäureanhydrid oder -Chlorid der"entsprechenden Carbonsäure. Diese Umsetzung wird vorzugsweise in Gegenwart einer organischen Base, wie' Pyridin, durchgefülirt.

Diejenigen Steroide der allgemeinen Formel I und IV, in denen der Rest X ein Halogenatüm oder eine niedrige Alkylgruppe be« deutet, sowie sämtliche Steroide der Formeln II und III sind neue Verbindungen, die wertvolle Zwischenprodukte zur Herstellung dea? entsprechenden 9oi-Halogen-llß_il6cc ,17tf-trihydroxy"l6_t17-. aoetonide darstellen.

Diese Umwandlung kann nach an sich bekannten Verfahren .durchgeführt werden, z«B. durch Behandlung mit Methansulfonsäure unter Bildung der entsprechenden 11-Methylate« Danach werden "diese

Verbindungen mit Natriuiaacetat in eiedender Essigsäure in die entsprechenden 9(ll)~D©hydroderivate umgewandelt» Diese werden mit Kaliumpermanganat in Essigsäure und anschliessend Essigsäure-

anhydrid in Pyridin in die entsprechenden 16c(-Acetoxy~170fhydroxyderivate Überführt _t die bei der Behandlung·mit Aceton das 16,17-Acetonid liefern_e Bei der Umsetzung mit K~Bromacetamid wird das entsprechende 9(X-Brom-llß-hydrox3rsteroid erhalten, das gegebenenfalls mit Kaliumcarbonat in das entsprechende 9ß,llß-Epoxyd umgewandelt wird. Sohliesslich wird die Vorbindung »lit öinor Halogenwasserstoffsäure, wie Salssäure oder Fluor-Afsäure behandölt» Hirn erhält das j^dp^oaukt.» nämlich

irt, Μηάά oiaö ?g:?i»r·. iwur der all-

gemeinen formel IV verwendet v;ird_f kann diese durcch Opponauer·· Oxydation mit einem Ketallalkoholat, wie AlurainiuraicoxiropyXa·'; in Gegenwart eines Ketons, wie Cyclohexanon, in eine Verbindung der allgemeinen formel II umgewandelt werden. Die Verbindungen der allgemeinen Formel II werden hierauf durch Halogenierung, z.B«. mit Brom und anschlieaaende Enthaiogenierung mit einer organischen Base, wie Collidin, oder Rüokfluöskochen mit einem Lithiumhalogenid in einem organischen lösungsmittel, wie Dimethylformamid, in Verbindung mit der allgemeinen Formel I überführt. Verbindungen der allgemeinen Porniol III können in Verbindungen der allgemeinen Porael 1 v.irch Behandlung mit einem Keton, wie Cyclohexanonj und dem Aluminiumsal2 eines sekundären Alkohols« mit Isopropanol, überführt werden» Man erhält Verbindungen des? allgemeinen IOrmel V CH_?-R

C«0

in der R und X die obige Bedeutung haben· Biese Verbindungen sind physiologisch aktiv, sie besitzen glucocortieoids und anti« phlogistische Wirkung.

Die Beispiel® erläutern die Erfindung»

Beispiel 3.

A) Aspergillus ochraceus (HHRL-HOS) wird auf Agar schrägen kultiv kultiviert, die folgendes Ifährmedium (Α) enthaltenϊ

Gramm

Glukose	10
Hefeextrakt	2,5
K₂HPO^	1
Agar	20
Destilliertes Wasser auf	1 liter

Das Oberflächenwachstura von 2 Wochen alten Agarsohrägen wird in 5 ml 0_r01 fS-iger wässrige:?· liatriumlaurylsulfatlösuns suspendiert. 1 ml Anteile dieser Suspension werden zum Beimpfen von .fünf 250 ml fassenden Erlenrieyorkolben verwendet, die jeweils 50 ml des sterilisierten Nähmetiiums (B) enthielten:

Maisquellwasser 40

Glukose 20

!Destilliertes 'fusser auf 1 Liter f

Vor der Sterilisation wird die Lösung mit Natronlauge auf pg 6,5 eingestellt·

Nach 24 attindiger Inkub.vcion bei 25⁰G-auf einer J)rehschütteismaschine mit 280 Gyclen/Minuto und ¹J cm Hub werden 10 volum-^ige Übertragungen auf zvauaig 250 ml f/issende Erlenmeyerkolben durchgeführt, die jeweils f>) ml des fclßDnden sterilisierten Nähr«

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.„ 8 ~ mediums (C) enthielten,

MaisQ.uellwas3er

Glukose

Destilliertes Wasser auf

Gramm 10 5 1 Liter

Vor der Sterilisation wird die Lösung mit Natronlauge _rauf 6,5 eingestellt.

In jeden Kolben werden hierauf 0,25 ml einer sterilen Lösung von 100 mg/ml 16-Dehydroprogesterön in N^ET-Dimethylformamid gegebene Es werden insgesamt 500 mg des Steroids umgesetzt.

Nach etwa 24 stündiger Inkubation unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen wird der Inhalt der Kolben vereinigt und die Gärbrühe durch ein Klärfilter filtriert· Me Kolben,.das Myeel. und der Filterrückstand werden mit 100 ml Anteilen warmem Wasser gewaschen· Das vereinigte Filtrat und die Waschlösungen haben ein Volumen von 1380 ml· ' .

Das ]?iltrat wird dreimal mit 500 ml Anteilen Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformextrakte werden gründlich mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird aus einer Mischung von Aoeton und Hexan umkristallisiert. Es werden 200 mg 11 Or-Hydroxy-16-dehydroprogesteron vom Ep. 170 bis 174⁰C erhalten·

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Beispiel 2

11 ff₉ 21~Dihyd roxyprefina~4 _r I6"dien<~3 ■ 20-dion

A) Aapergillus ochracoue (WRSIr-405) wird auf Agarschrägen in folgendem Nährmedium (A) gezüchtet:

Gramm

Glukose Hefeextrakt K₂HPO₄

Agar

Destilliertes Wasser auf

10

2,5

20
1 Liter

Das Oberflächenwachstum von 2 Wochen alten Agarschrägen wird in 5- ml einer 0,01 s£~igen wässrigen Nat^iumlaurylsulfatlöaung suspendiert« 1 ml Anteile dieser Suspension werden zum Beimpfen von acht 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben verwendet, die jeweils 50 ml des sterilisierten Nährmediums (B) enthielten: '

Gramm

Maisquellwasser	auf	40	Liter
Glukose	20
Destilliertes Wasser	1

Tor der Sterilisation wird das Nährmedium mit Natronlauge auf 6,5 eingestellt.

Nach 24 ßttindiger Inkubation bei 25°C und unter kontinuierlichem Schütteln auf einer DrehschUttelmaBchine mit 230 Oyelen/Minute und einem Hub von 5 cm werden 10 volum-*#iga Übertragungen auf

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fünfzig 250 ml fassende Srlenraeyerkolben durchgeführt, die jeweils 50 ml des sterilisierten Ifährmediums (G) enthielten:'

Gramm

MaisquellwaBser 10

Glukose 5

Destilliertes Wasser auf 1 Liter.

Vor der Sterilisation wird der p_ß-Wert mit Natronlauge auf 6,5 eingestellt.

Hierauf wird jeder Kolbe,«: ait 0,25 ml einer sterilen Lösung von 40 mg/ml 21-Acetoxypregna-4,l6-dien~3i20-dioB in H,if~Dimethylformamid versetzt. Es werden insgesamt 500 mg Steroid eingesetzt.

Nach etwa 26 Stunden weiterer Inkubation unter den gleichen Be-* dingungen wie vorstehend beschrieben wird der Inhalt der Kolben zusammengegossen und die Gärbrühe durch ein Klärfilter filtriert* Die Kolben» das Myeel und der Pilterrüclcstand werden nacheinander mit 100 ml Anteilen warmem Wasser gewaschen. Das vereinigte FiI-trat und die Waschlösungen besitzen ein Volumen ven 3200 ml. Das Piltrat wird mit drei 1 Liter Anteilen Chloroform extrahiert* Die vereinigten Chloroformextrakte werden mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird as Kieselgel HF plattenohromatographiert. Ale EntwieJdLungalÖsmigs-"· mittel wird ein Gemisoh gleicher Volumina. Äthylacetat und Chloroform verwendet« Die im UV-Liöht bei einem R^-Wert von 0_f^ feststellbare Bande wird mit 50 ji-ige*. Methanol in ätäylap eluiert und das Lösungsmlttsl abgedämpft« Bs hinterbleibt

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11 ο' j 21~Dihydroxypregna-4,16~dien-3,20-dion.

Beispiel 3

6 Oi- -Fluor-ll a t 21"-dihydroxypregna-4. 16-dien-»3,20-dion

a) Herstellung von 6 Cf ~Fluor--"21"-hydrpxYprefina"4_fl6~dien~3_f20" dion~21~acetat

Eine Suspension von 50 g Zinkstaub in 30 ml Wasser wird mit 2,4 s Quecksilber(II)-chiorid und danach mit 1,5 ml konzentrierter Salzsäure versetzt. Das Gemisch wird 5 Minuten kräftig geschüttelt. Danach wird die überstehende wässrige Lösung dekantiert, und hierauf werden 40 ml Wasser und 4 ml konzentrierte Salzsäure zugegeben. Das Gemisch wird unter KohlendioxydatBiosphäre portionsweise unter kräftigem Umschütteln mit 8,0g Chrom-(Ill)-chiorid versetzt, bis die Lösung sich blau färbt.

Es wird eine Lösung von 7_f8 g 6öf~Fluor~l6of,17O(-oxido-21-hyd:coxypregna-4»l6-dien~3»20-dion-21-acetat in 200 ml Essigsäure hergestellt und unter Kohlendioxyd mit der Chroe»{Il)~chloridlöaung versetzt. Nach 5 minütigein Stehen bei Raumtemperatur wird die Lösung mit Wasser verdünnt und die Fällung abfiltriert und mit Wasser ausgewaschen. Danach wird die Fällung in 150 ml Aceton gelöst, mit 1 ml konzentrierter Salzsäure versetzt und 1 Stunde in Stickstoff atmosphäre unter Rückfluss gekocht. Das Aceton wird unter vermindertem Druck abdestilliert, und die sich bildenden 'Kristalle werden abfiltriert und getrocknet. Man erhält 6 W-Fluor-21-nydroxypregna~4,16-dien-3»20~dion-21-acetat.

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b) Herstellung yon eof^Pluor-llpf _f 21-d.xixyavQxy$)xeg,na.· 4fl6~dien~· 3.20-Qion

Gemäss Beispiel 1, jedoch unter Verwendung von 6 Of-Pluor-21·- hydroxypr©sna-4_fl6-dien«5»20-diQn-21-aoei;afc anstelle von 16-Dehydroprogesteron erhält man das 6ff -Pluor-11 #, 21-dihydroxy pregna-4,16-dien-3,20-dion.

Beispiel 4 · . .

3S₉Il Cf _P21-Trihydroxy-5g~pregn">l6~en^20"ön Gemäss Beispiel 3, jedoch unter Ven^endung von 3ßi21-Diaoetoxy-16 (X,17Oi~osido~5ß-pregnan~20-on anstelle von 6P("3?luor~16£(p 17(yⁱ*oxld.o-21-hydroxypregn~4-Än-3i20-dion-21-acetat in Stufe a) erhält man das 33^11 of_f 21-G}rihydroxy-5J3-pregn-16-en~20-on.

Wenn man im Verfahren gemäss Beispiel 1 bis 3 Colletotrichum linicola, Colletotrichum phomoides und Triohothecium roseum anstelle von Aspergillus ochraoeus verwendet, werden die gleichen Verbindungen erhalten« In ähnlicher Weise können aus den nachstehend genannten Ausgangscteroiden gemäss Beispiel 1 die angegebenen llÄ-Hyd^oxystsroide erhalten werden.

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Auegangssteroid (Substrat) ' Produkt

yypg 16-dien~5,20-dion

6 ß"3?luor-~21~hydr oxypregna~4i l6-»dien-3»- 20~dion-21~acetat 3 j 2C-.-=4.1on

,16--dien

4,l6~diön-3,20-dion

6 ct«Methylpregna-4;!6- 6 oi-Metiiyl-llC^-hydroxypregna-4,16-dien-3f20-dion dien~3,20-dlon

6 α ~ELuorpregna-4,16- 6 (X- -Fluor-11 Oi -hydroxypregna-4«16-

dlen«3_?20-dion

3ß i-11 Of, 21-3}rihydroxypregna-"5»16-

3ß _?

pregt

20-on~21-acetat

j 21-Dihydroxypregna-51l6-dien-20-on

3ß-Hydroxypregna~5 ?- 16-dien-20-on

3 OC-Hydroxypregjm-5-62

3ß 911 & 121-aJrihydro2:ypregna~5 * 16-di20

3ß ?110( -Dihydroxypregna-5 _r 16~dien~ 20»oa

3 Of j 11 & -Dihydroxypregna-5»16-dien-20-on

3ß~Hydroxy~5 Oi -pregn-I620

3 oc-Hydroxy-5 tf-pregn 16-en~2O~on

5 o(-Prega-16-en~3 ₉ 20-dion

3ß-Hydroxy-5ß~pregn« l6-en-20-on

3 0<~llydroxy-5ß-pregn~ 16-on-20-on

5ß~Pregn-l6~en-3,20-dlon

? <X-Dihydroxy~
20-on

3 &111 oc -Dihydroxy-5c< 20

11 ex »Hydroxy-5 o< -pregn-l6-en-3»- 2di

3ßρ11CX -Dihydroxy-5ß-pregn-l6-en-20-on ·

3 Oi j11ctf-Dlhydroxy-5ß"pregn~l6-en 2Q-On

1 crf~Hydroxy-5ß~pregn~l6-en-3 » 20-dion.

pregn-l6-en-20-on 3 ₅ ^
l6-on~20-on

1 098JO/ 1 629

Beispiel 5

lQ.&-Hydrp:«:.y~lS"dehydroproges/fceron

A) Curvularia lunata (QM-120-L; Army Quartermaster, Nätick, Mass ο V.StoÄ.) wird auf Agarschrägen in folgendem Nahrinedium

(A) gezüchtet:

Gramm

Glukose 10

. Hefeextrakt * 2,5

K₂HPO₄	V/asser	auf	1	Liter
Agar		20
Destilliertes		1

Oberflächenwachstum von 2 Wochen alten Agarschrägen wird in 5 ml einer 0,01 j£-igen wässrigen Natriumlaurylsulfatlösung suspendiert. 1 ml Anteile dieser Suspension wer,den zum Beimpfen von ftnf 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben verwendet, die jeweils $0 ml des sterilisierten Nähriaediums (B) enthielten:

Gramm Glukose

· So^abohnenmehl Sojabohrienöl CaOO»
Destilliertes Wasser auf

Nach etwa 67 stündiger Inkubation bei 25⁰C unter kontinuierlichem Sohütteln auf einer Drehschüttelmasohine mit 280 Cyclen/Mlnute und 5 cm Hub werden 10 volum~$~ige Übertragungen auf zwanzig 250 ml fassende Erlenraeyerkolben durchgeführt, die je~

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30	2
20	5
2,	Liter
2,
1

veils 50 ml des sterilisierten Nähruediutns (C) enthielten:

Gramm

Maisquellwasser	6
NH₄H₂PO₄ .	3
Hefeextrakt	2,5
Glukose	10
CaCO₅	2,5
Destilliertes Wasser auf	1 Liter.

Jeder Kolben wird mit 0,25 ml einer sterilen Lösung von 100 mg/ml 16-Dehydroprogesteron in Ν,Ν-Dimethylformamid versetzt. Insgesamt werden 500 mg Steroid eingesetzt_o

Nach etwa 48 Stunden weiterer Inkubation unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend beschrieben wird der Inhalt der Kolben zusammengegossen und die Gärbrühe durch ein Klärfilter filtriert. Die Kolben, das ftycel und der Filterrückstand werden mit 100 ml Anteilen warmem Wasser gewaschen. Das vereinigte PiItrat und die Waschlösungen haben ein Volumen von 1500 ml* Das Filtrat wird dreimal mit 500 ml Anteilen Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformextrakte werden mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck eingedampft. Nach Umkristallisation des RUckstands wird llß-Hydroxy-16-dehydroprogesteron erhalten. '

Beispiel 6

le^Dehydrocorticosteron

A) Cunninghamella blakesieeana (ATCC-8688b) wird in Agarschrägen im Nährmedium (A) gezüchtet:

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Gramm

Glukose 10

Hefeextrakt .2,5

K₂HPO₄ . 1 -

Agar 20

Destilliertes Wasser auf 1 Liter

Oberfläohenwachstum von 2 'Wochen alten Agarsohrägen wird in 5 ml 0,01 $~iger wässriger liatriumlaurylsulfatlösung suspendiert. 1 ml Anteile dieser suspension werden zum Beimpfen von acht 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben verwendet, die jeweils 50 ml des sterilisierten Nährmediums (B) enthielten:

. Gramm

Haisquellwasser	6
NH₄H₂PO₄	3
Hefeextrakt	2,5
Glukose	10
CaOO^	2,5
.Destilliertes Wasser auf	1 Liter

Nach 67 stündiger Inkubation bei 25°C unter kontinuierlichem Schütteln auf einer Drehschtittβlmaschine mit 280 Cyolen/Minute und 5 cm Hub werden 10 volum-jSige Übertragungen auf fünfzig 250 ml fassende Erlenmeyerkolben durchgeführt, die jeweils 50 ml dos frisoh sterilisierten Nährmediums (B) enthielten.

Anschliessend wird 3«der Kolben mit 0,25 ml einer sterilen Lösung von 40 mg/ml 16-Dehyclrocortexon~21~acetat in N/,N-Dimsthylformamid

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versetat. Es werden insgesamt 500 mg Steroid eingesetat.

flach, etwa 30 stündiger weiterer Inkubation unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend beschrieben wird der Inhalt der Kolben zusammengegossen und die Gärbrühe durch ein Klärfilter filtriert. Die Kolben, das Mycel und der -Sllterrückstand werden mit 100 ml Anteilen warmem Wasser gewaschen. Das vereinigte Piltrat und die WasehlÖBungen haben ein Volumen von etwa 3000,ml« Das Piltrat wird dreimal mit jeweils 1 Liter Chloroform extrahiert. Die verr einigten Chloroformextrakte werden mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck eingedampft. Each Umkristallisation des Rückstands erhält man lS-Dehydrocorticosteron.

Auf ähnliche Weise wie in Beispiel 6 werden die nachstehend genannten Ausgangssteroide umgesetzt, wobei die aufgeführten Produkte erhalten werden·

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Ausgangssteroid (SitbBtrat)

6 (X -Pluor-21«hydro:iy·» pregna-4,16~di3n-3,20-dion-21-acetat

6 Oi -Me-thylpregna-4 _f 16-dien-3,20-dion Produkt

6 O'« Pluor-llß _s 21-dih,ydroxy· pregaa-4-, 16-dien-3,20-dion

6 Ci ^"iethyl-llß-hydroxypregna-4,16"dien~3,20-dion

dien-3,20~dion

3Q, 21~Diliydroxypregna-5,16»dien-20-on-21~ acetat

3ß,21-DIhydroxypregna-16l20

3ß"-Hydroxypregna~5 ? 16-dien-20-on

3 ⁰^ -Hydr oxypregna-5»16-dien-20-on

3ß~Hydroxy-5 οζ -pregn-16 βη-20-οη EO-uor-llß-hydroxypregna-4 r16 ~di en-3,20-dion

3ß 11Lß γ 21~Trihydroxypregra· 5»16 ~dien-20-on

3ß r 1 Iß ? 21-Trihydroxypregii.a 5,16-aien-20~on

3ß,1Iß-Dihydroxypregna-5,lödien-20-on

3 or _f llß~Dihydroxypregna-5 »J-6-dieu-20-on

3ß,llß"Dihydroxy->5 <X -pregn

-5 c< -pregn-16- 3 ex _t llß-Diliydroxy-5 # -preg-i-lo-

-lö-en^,

y
βη-20-οη

5 «
dion

3ß,21-Dihydroxy-5ß-pregnl6~en-2O-on

3ß-Hydroxy-5ß-pregn-16-en-2O-on

3 cV-Hydroxy-Sß-pregnl6-en-2O-on

-l6-en-3,20-llß-HiycIroxy-5 Oc -pregn-l6-e:a-3,2C~dion

3ß > 1 iß _P 21-Trihydroxy-5ß-"pr«3gnl6-ea-20-on -

3ß, 1 lß"DIhydroxy-5ß-pregiA~ 16-ea-20-on

3 oc _P llß-Dihydroxy-5ß-prefe,n 6

dion

3 Of ρ 21-Dihydroxy-5ß~pregn l6-en-20-on 3,2C-dion

3 CX ,Ilß^l-Trihyd preg a-lo-en-20-on

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Bei Verwendung, von Corticiuia microsclerötia oder Coniothyriura hellebori anstelle von Curvularia lunata oder Gunninghamella blakesleeana in den Beispielen 5 und 6 werden die gleichen Produkte erhalten.

Die nachstehenden Beispiele erläutern das Verfahren, nach dem die erfindungsgemässen ll^Hydrcxj^io-dehydrosteroide, die eine 3- und baw. oder 21~Hydroxygruppe enthalten, verestert werden können,

Beispiel 7

Eine Lösung von 10 mg 16-Dehydrooorticosteron in 5 ml wasserfreiem Pyridin und 2 ml Essigsäureanhydrid v/ird bei Raumtemperatur 16 Stunden stehengelassen. Danach wird das Gemisch mit Eiswasser verdünnt und mit Chloroform extrahiert. Der Chlorcformextrakt wird mit 2 η Salzsäure, V/asser, 5 $-iger v/ässriger Natriumbicarbonatlösung und nochmals V/asser gewaschen und unter vermindertem Druck eingedampft. 2Jaeh TJmkristallisation des Rückstands aus einem Geiaisch von Aceton iuid Hexan erhält man das lö-Dehydrocorticosteron-^l-acetat.

In ähnlicher Weise können die 11 (tf-Kydroxysteroide selektiv in der 21 -Stellung mit einem Moläquivaleiit eines Carbonsäureanhydride verestert werden.

Die nachstehenden Baispiele erläutern das allgemeine Verfahren, nach dem die erfindungsgemäsa erhaltenen ll-Hydroxy-lo-dehycro-

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steroide in 9 CX-Halogen-llß_?16o( _? 17 Cl "4rihydr oxy steroide' umgewandelt v/erden können» Die angegebenen Verfahren sind auf alle erfindungsgemäsa hergestellten 11-Hydroxy-l6-*dehydro steroide anwendbar.

Beispiel 8 * ';

11 CX --Hydroxy-lo-dehydroprogesteron-ll-mesylat Zu einer Lösung von 50 mg _t110(~-Hydroxy~16~dehydroprogesteron in einem Gemisch aus 1 ml Chlcroforni und 1 ml Pyridin werden unter Kühlung in einem Eisbad und unter Rühren 1 ml einer Lösung von 0,1 ml Methansulfonylchlorid in 5*0 ml Chloroform gegeben. Das Gemisch wird 16 Stunden bei 0° stehen gelassen, danach mit 5 ml Chloroform und 3 ml Eiswasser verdünnte Die Chloroformlösung wird abgetrennt, mit 2 η Salzsäure, 5 #~»lger wässriger Natriuntbicarbonatlösung und Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Nach Umkristallisation des Rückstands aus einer Mischung von Aceton und Hexan wird 11 QS-Hydroxy-I6~dehydroprogesteron«-ll-mesylat erhalten*

Beispiel 9

9(11)-I6~getradehydroprogesteron

Eine Lösung von 200 mg ll<X~Mesyloxy~l6-dehydroprogesteron in 6 ml Eisessig, der 190 mg Natriumacetat enthält, wird 2 Stunden ' unter Rückfluss gekocht. Die Essigsäure wird unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand sswischen Chlorcf^ri; uad . Wasser verteilt» Die Chloroformlösung wird mit verdünnter wässriger liatriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird aus einem Gemisch von Aceton und Hexan umkriatalliaier*. Hierbei erhäli;man

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das 9(ll)jl6~Ietradehydroprogssteron.

Beispiel 10

16 (X ,17 0f~Dihydroxy~9(ll)~dehydroproge3terou Eine Lösung von 750 mg 9(ll)_fl6-(L^letradehydroprogeßteron und 4j6 ml Ameisensäure in 60 ml Aceton wird in gleichmässiger Geschwindigkeit tropfenweise mit einer Lösung von 380 mg Kalium-» permanganat in 60 ml 50 ^-igem wässrigem Aceton bei O⁰C versetzt. Danach, wird das Gemisch mit einer 10 %~igen wässrigen Hatriumbisulfitlösung behandelt, um überschüssiges Kaliumpermanganat zu reduzieren« Hierauf werden die anorganischen Salze abfiltriert. Das Piltrat wird teilweise eingedampft, mit Wasser verdünnt und di© Kristalle werden abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält das 16 (X _i170("'Dihydroxy~9(ll)-dahydroprogesterono

Beispiel 11

9(ll)-Dehydro~l6 CX ,17#-dihydroxyprogesteron-lS,, 3.7-aoet.onld Eine Lösung von 100 mg 9(H)'-Dehydro'-l6iy ,17Of -dihydroxyprogesteron in 10 ml Aceton, das 0,025 ml 70 jS-ige Perchlorsäure enthält, wird 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen, dann mit verdünnter wässriger Natriumbicarbonatlösung neutralisiert. Die sich abscheidenden Kristalle werden abfiltriert und getrocknet. Man erhält das entsprechende Acetonid.

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« 22 -

12

9'#-Brom-llfl«16

Eine Lösung von 100 mg 9(ll)-Dehydro-l6oc ,17a-dihydroxyprogesteron-l6,17-acetonid in 10 ml Dioxan, das 1,3 ml einer 0,5 η Perchlorsäure enthält, wird mit-90 mg N-Bromacotamid versetzt, und das erhaltene Gemisch wird 30 Hinuten bei Raumtemperatur im- dunkeln stehengelassen. Danach wird Überschüssiges N-Bromacetamid durch Zugabe von wässriger Natriumbisulfitlösungzerstört. Beim Verdünnen mit Wasser scheidet sich kristallines 9 (X -Brom-llß, 16 OC, 17 CX -trihydroxyprogesteron-16,17-acetonid aus das abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet wird«

Beispiel *3

9ü, 11ü-Epoxy-16a,17«-dihydroxyprogesteron«»16.17»acetonid Eine lösung von 1,0 g 9 Oi-Brom-llß_el6 a,17ff-trihydroxyprogesteron-l6,17-acetonid und 2,0g Natriumacetat in 50 ml Aceton wird 6 Stunden unter Rückfluss gekocht. Danach wird das Aceton unter vermindertem Druck teilweise abdestilliert, das Gemisch mit Wasser verdünnt und mit Chloroform extrahiert. Der Chloroformextrakt wird mit Wasser gewaschen und eingedampft. Nach Uakristallisation des Rückstands aus einer Mischung von Aceton und Hexan wird das 9ß,Hß-Epoxy-l6 0i_f17(y-dihydroxyproge3teron-16, 17-aoetonid erhalten.

Beispiel 14

9 Cf -Fluor-11.16 Oi ₀ 17 Of -trihydroxyprofteateron-16.17-acotonid . Eine lösung von 100 mg 9ß.llß-Epoxy-l6<* ,^Gr-dibydroxyprogesteron -16,17-ace tonid in 10 eil Chloroform und 1,2 al Tetrahydrofuran In einer Flasche aus Polyäthylen wird auf -60⁰O abgekühlt und mit 1,0 si Pluerwaewttrötoff veceetst» danach wird das Heaktions-

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40 Stunden bei O⁰C stehengolc.ssen* hierauf in ein Becher-

glas aus Polyäthylen eingegossen» mit Chloroform imd Wag.ser verdünnt und mit gesättigter wässriger k'atriumbicar'bonatlijsv.ng neutralisiert. Dis Chioroforralösung wird abgetrennt, mit Vvaf.ser gevaechen und eingedampft. Ber Rückstand liefert nach ümkrietallisation 9 0{-Fluor-llß,l6 (XilTCi-trihyc.roxyprogeeteron-lG» 17-acG-tonid.

Patentanspruch

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BAD ORtGiNAL

Claims

- 24 Patent ansprüche

1. 11-Hydroxy-^Aj -steroide der Pregnan-Reihe der allgemeinen Formeln

■β*

0-0

0*0

und

(II)

(in)

in denen X ein Halogenatom oder eine niedere Alkylgruppe und zusätzlich bei den Verbindungen (II) und (2X1) ein Wasserstoff atorn und K ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe oder den Aoyloxyrest einer Carbonsäure mit weniger als 12 Q-Atomen bedeutet·

2» ll-Hydroxy-^ -.gfteroide naoii Ansprueh I, dadurch gekennzeichnet* dass bei der Verbindung (J) Il die Hydroxygruppe ist und X ti« Oi-Fluorato« bedeutet.

5. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass, man die entsprechenden in 11-Stellung unsubstituierten Steroide der Einwirkung der Enzyme entweder eines die Herstellung hydroxylierenden Mikroorganismus aus der Gruppe Aspergillus ochraceus, Colletotrichum linicola, ColIetotrichum phomoides und Trichotheeium roseum oder eines die llß-Stellung hydroxylierenden Mikroorganismus aus der Gruppe Curvularia lunata, Cunninghamella blakesleeana, Coiticium microsclerotia und Coniothyrium hellbori aussetzt.