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Verfahren zur Herstellung von
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11ß,17a,21-Trihydroxy-4-pregnen-3,20-dion-Derivaten.
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Die Erfindung betrifft das in den Patentansprüchen gekennzeichnete
Verfahren.
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Bekanntlich werden antiinflammatorisch wirksame 1lß-Hydroxysteroide
(wie zum Beispiel die Kortikoide: Hydrocortison, Prednisolon, Dexamethason, Betamethason,
Prednyliden, Triamcinolon, Fluocinolon oder Flurandrenolon) mittels einer sehr aufwendigen
vielstufigen Partialsynthese aus natürlich vorkommenden Steroiden (wie Diosgenin)
hergestellt Innerhalb der vielstufigen Synthese dieser Verbindungen ist die mikrobiologische
Einführung der 11ß-Hydroxygruppe in das Steroidgerüst in der Regel der aufwendigste
und wegen der dabei gebildeten Nebenprodukte, verlustreichste Syntheseschritt.
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Im Jahre 1966 wurde ein Verfahren entwickelt, mit dessen Hilfe man
die Ausbeute bei der 11ß-Hydoxylierung von 11-Desoxy-17a-Hydroxysteroiden der Pregnanreihe
wesentlich steigern kann, indem man die 17a-Hydroxygruppe verestert, dann mittels
Pilzen der Gattung Curvularia hydroxyliert und die erhaltenen 1 1ß-Hydroxy-1 7a-acyloxYsteroide
verseift (Deutsches Patent 1 618 599).
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Die für dieses bekannte Verfahren als Ausgangsverbindungen verwendeten
11-Desoxy-17a-acyloxysteroide können bekanntlich ihrerseits durch chemische Hydrolyse
von 11-Desoxysteroiden der allgemeinen Formel-II hergestellt werden.
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Im Vergleich zu diesem vorbekannten dreistufigen Verfahren hat das
erfindungsgemäße Verfahren den Vorzug, daß es als einstufiges Verfahren weniger
aufwendig ist, und daß man mit seiner Hilfe höhere Ausbeuten an Verfahrensprodukt
erzielt. Auch entfällt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
die oft
recht schwierige Hydrolyse der 11ß-Hydroxy-17a-acyloxysteroide, bei der sich meist
Nebenprodukte bilden, wodurch meist eine aufwendige und verlustreiche Aufreinigung
der erhaltenen Produkte erforderlich ist, damit diese den für Arzneimittelwirkstoffen
erforderlichen Reinheitskriterien entsprechen.
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Ferner ist bemerkenswert, daß man nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
auch sehr gut 11ß,17a,21-Trihydroxy-1,4-pregnadiell-3,20-dion-Derivate der allgemeinen
Formel I aus den entsprechenden 11-Desoxy-1,4-steroiden der allgemeinen Formel II
herstellen kann, während es nach dem bekannten Stand der Technik nicht möglich ist
11-Desoxy-81'4-steroide in guten Ausbeuten in der 1lß-Position zu hydroxylieren.
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Letztlich ist erwähnenswert, daß es für die Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens nicht erforderlich ist als Ausgangsverbindungen Reinprodukte der 11-Desoxysteroide
der allgemeinen Formel II zu verwenden, wenn man diese beispielsweise nach folgender
Methode als Rohprodukt herstellt:
Aus einer Lösung von 1 g (4 mmol)
PyridiniumtosylatX) und 10 g (28 mmol) 17a,21-Dihydroxy-steroid in 80 ml Dimethylformamid
und 700 ml Benzol werden zur Entfernung von Wasserspuren bei einer Badtemperatur
von 110 - 130 OC (Glycerinbad) 300 ml Benzol unter Anwendung eines Wasserabscheiders
abdestilliert. Anschließend kühlt man kurz ab, fügt 24 ml (110 - 140 mmol) Orthocarbonsäuretrialkylester
hinzu und destilliert innerhalb von 1,5 Stunden das restliche Benzol ab. Nach Zugabe
von 5,2 ml Pyridin wird das Reaktionsprodukt nunmehr im Hochvakuum weiter zur Trockne
eingeengt.
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Die Reaktion verläuft quantitativ. Das nach dem Einengen zurückbleibende
1 7a,21-(1-Alkoxy-alkylidendioxy)-steroid ist zunächst von öliger Konsistenz, kristallisiert
jedoch meist nach kurzer Zeit durch. Der Reinheitsgrad ist für die sich anschließende
mikrobiologische Hydroxylierung völlig ausreichend, die dem Kristallisat noch anhaftenden
Reste der verwendeten Reagenzien stören die Enzymkatalyse nicht.
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x) Das Pyridiniumtosylat wird folgendermaßen hergestellt: 54 g p-Toluolsulfonsäure.H20
werden zur Entfernung des Wassers 3mal mit einer ausreichenden Menge Benzol im Vakuum
zur Trockne eingeengt. Den Rückstand versetzt man mit 240 ml Pyridin, rührt 1/2
Stunde nach und fällt das Produkt mit Äther aus. Das Kristallisat wird abgesaugt,
mit Äther gewaschen und 1 Stunde bei 50 OC im Vakuum getrocknet, Die 11-Desoxysteroide
der allgemeinen Formel II können als Alkylgruppen R1 und R2 verzweigtkettige oder
vorzugsweise geradkettige Gruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen besitzen.
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Geeignete Alkylgruppen R1 und R2 sind beispielsweise die
Methylgruppe,
die Äthylgruppe, die Propylgruppe, die Isopropylgruppe, die Butylgruppe, die Pentylgruppe
und die Hexylgruppe. Eine besonders bevorzugte Alkylgruppe R1 ist die Methylgruppe.
Besonders bevorzugte Alkylgruppen R2 sind die Methylgruppe und die Äthylgruppe.
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Als Alkanoyloxymethylengruppen W der 11-Desoxy-steroide der allgemienen
Formel II seien beispielsweise genannt: die Formyloxymethylengruppe, die Propionyloxymethylengruppe,
die Butyryloxymethylengruppe, die Trimethylacetoxymethwlengruppe und insbesondere
die Acetoxymethylengruppe.
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Bei den in der 6,7-Position gesättigten 11-Desoxysteroiden der allgemeinen
Formel I ist der Substituent X vorzugsweise «-ständig.
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Daß sich die 11-Desoxysteroide der allgemeinen Formel II hydroxylieren
lassen und zu den entsprechenden 11ß,17a,21-Trihydroxy-4-pregnen-3,20-dion-Derivaten
der allgemeinen Formel I gespalten werden,ist für den Fachmann überraschend.
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Noch weniger war vorhersehbar, daß bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
die erwünschten Verfahrensprodukte in sehr hohen Ausbeuten (von etwa 85 - 90 % der
Theorie) erhalten werden.
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Abgesehen von der Verwendung anderer Ausgangsverbindungen wird das
erfindungsgemäße Verfahren unter den Bedingungen durchgeführt, die man üblicherweise
zur 11ß-Hydroxylierung von Steroiden mit Pilzen der Gattung Curvularia anwendet.
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Zur Hydroxylierung geeignete Pilze der Gattung Curvularia sind beispielsweise
Curvularia falcuta QM-102 H, Curvularia genticulata IFO (6284), Curvularia ltinata
NRRL 2380, NRRL -2434, NRRL 2178, ATCC 12017 oder IFO (6286) oder Curvularia maculans
IFO (6292).
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Unter den für diese Mikroorganismen üblicherweise verwendeten Kulturbedingungen
werden in einem geeigneten Nährmedium unter Belüften Submerskulturen angezüchtet.
Dann setzt man den Kulturen das Substrat (in einem geeigneten Läsungsmittel gelöst
oder vorzugsweise in emulgierter Form) zu und fermentiert, bis eine maximale Substratumwandlung
erreicht ist.
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Geeignete Substratlösungsmittel sind beispielsweise Methanol, Athanol,
Glykolmonomethyläther, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd. Die Emulgierung des
Substrats kann beispielsweise bewirkt werden, in dem man dieses in mikronisierter
Form oder in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel (wie Methanol, Methanol,
Aceton, Glykolmonomethyläther, Dimethylformamid oder oimethylsulfoxyd) gelöst unter
starker Turbulenz in (vorzugsweise entkalktem) Wasser, welches die üblichen Emulgationshilfen
enthält, eindüst. Geeignete Emulgationshilfen sind nichtionogene Emulgatoren, wie
zum Beispiel Äthylenoxydaddukte oder Fettsäureester von Polyglykolen. Als geeignete
Emulgatoren seien die handelsüblichen Cft) () IR) (ft) Netzmittel Tegin , Tagat
, Tween und Span beispielsmäßig genannt.
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Oft ermöglicht die Emulgierung der Substrate einen erhöhten Substratdurchsatz
und somit eine Steigerung der Substratkonzentration. Es ist aber selbstverständlich
auch möglich, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren andere Methoden zur Steigerung
des Substratdurchsatzes, wie sie dem Fermentationsfachmann wohl bekannt sind, anzuwenden.
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Die optimale Substratkonzentration, Substratzugabezeit und Fermentationsdauer
ist von der Struktur des verwendeten Substrates und der Art des verwendeten Mikroorganismus
abhängig.
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Diese Größen müssen, wie dies bei mikrobiologischen Steroidumwandlungen
allgemein erforderlich ist, im Einzelfall durch Vorversuche, wie sie dem Fachmann
geläufig sind, ermittelt werden.
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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich aus den entsprechenden
11-Desoxysteroiden der allgemeinen Formel II beispielsweise folgende 11ß,17a,21-Trihydroxy-4-pregnen-3,20-dion-Derivate
der allgemeinen Formel I herstellen.
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11ß,17z,21-Trihydroxy-4-pregnen-3,20-dion, 11ß, 17α,21-Trihydroxy-1,4-pregnadien-3,20-dion,
11ß, 17α,21-Trihydroxy-6α-methyl-4-pregnen-3,20-dion, 11ß, 17α,21-Trihydroxy-6-chlor-4,6-pregnadien-3,20-dion,
11ß, 17α,21-Trihydroxy-6-chlor-1,4,6-pregnatrien-3,20-dion, 11ß, 17α,21-Trihydroxy-6-chlor-1,4,6-pregnatrien-3,20-dion,
11ß,17a,21-Trihydroxy-16«-methyl-4-pregnen-3,20-dion, 11ß,17a,21-Trihydroxy-16a-methyl-1,4-pregnadien-3,20-dions
11ß,17« Trihydroxy-16ß-methyl-4-pregnen-3,ZO-dion, 11ß, 17α,21-Trihydroxy-16ß-methyl-1,4-pregnadien-3,20-dion,
11ß,17a,21-Trihydroxy-16-methylen-i-pregnen-3,20-dion, 11ß, 17α,21-Trihydroxy-16-methylen-1,4-pregnadien-3,20-dion,
11ß,16α,17α,21-Tetrahydroxy-4-pregnen-3,20-dion, 11ß,16α,17α,21-Tetrahydroxy-1,4-pregnadien-3,20-dion,
6«-Fluor-11ß,16a,17«,21-tetrahydroxy-4-pregnen-3,20-dion
und 6α-Fluor-11ß,16α,17α,21-tetrahydroxy-1,4-pregnadien-3,20-dion.
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Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele dienen zur Erläuterung des
erfindungsgemäßen Verfahrens:
Beispiel 1 a) 8 g Pyridiniumtosylat
und 80 g 17a,21-Dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion werden in 560 ml Dimethylformamid
gelöst und mit 3,5 l Benzol verdünnt. Danach destilliert man bei einer Badtemperatur
von 120°C über einen Wasserabscheider 1,5 1 Benzol ab. In die Heiße Reaktionslösung
läßt man langsam 192 ml Orthoessigsäuretriethylester zulaufen und destilliert anschließend
1 Stunde lang Benzol und andere leichtflüchtige Reaktionskomponenten ab. Man fügt
nun 96 ml Pyridin hinzu und engt bei einer Badtemperatur von 60 OC im Hochvakuum
im Verlauf von 2 Stunden vollständig zur Trockne ein. Der zunächst ölige Rückstand
kristallisiert schnell durch. Man erhält 113 g 17a,21-(1-Ethoxy-ethylidendioxy)-4-pregnen-3,20-dion
in Form gelber Kristalle vom Schmelzpunkt 89 - 90 OC.
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b) Ein 21-Erlenmeyerkolben, der 500 ml einer 30 Min. bei 120 OC im
Autoklaven sterilisierten Nährlösung aus 3 % Glukose, 1 % Corn steep, 0,2 % Nah03
0,1 % KH2P04, o,2 % K2HP04, o,O5 % MgS04.7H20, 0,002 % FeS04.7H20 und 0,05 % KCl
enthält, wird mit einer Lyophilkultur von Curvularia lunata (NRRL 2380) beimpft
und 60 Stunden bei 30 OC auf einem Rotationsschüttler bewegt. Diese Anzuchtskultur
(250 ml) dient zur Beimpfung eines 201-Vorfermenters, der mit 15 1 eines bei 121
OC und 1,1 atü sterilisierten Nährmediums, bestehend aus 2 % Glukose und 2 % Corn
steep, eingestellt auf pH 6,5, beschickt ist. Unter Zugabe von Silicon SH als Antischaummittel
wird nun bei 29 OC und o,7 atü Druck unter Belüftung (10 1/Min.) und Rühren (220
Min.) 24 Stunden germiniert. Danach werden 1,5 1 dieser Kultur unter sterilen Bedingungen
entnommen und damit ein 201-Hauptfermenter beimpft, der mit 14 1 eines wie oben
sterilisierten Nährmediums aus 3 % Corn steep und 0,7 so Glukose,
eingestellt
auf pH 6,5, gefüllt ist.
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Nach einer Anwachsphase von 12 Stunden unter Vorfermenterbedingungen
werden 7,5 g rohes 17a,21-(1-Ethoxy-ethylidendioxy)-4-pregnen-3,20-dion, die 6,43
g Reinsubstanz enthalten, gelöst in 100 ml Dimethylformamid, unter sterilen Bedingungen
hinzugegeben und weiter gerührt und belüftet.
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Der Verlauf der Fermentation wird durch Entnahme von Proben kontrolliert,
die mittels Methylisobutylketon extrahiert und dünnschichtchromatographiert analysiert
werden.
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Nach 38 Stunden Kontaktzeit ist die Umsetzung des Substrates beendet.
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Der Fermenterinhalt wird filtriert, das Kulturfiltrat als auch das
abfiltrierte Mycel mit Methylisobutylketon extrahiert, die Extrakte vereinigt und
zunächst im Umlaufverdampfer konzentriert, anschließend bei 50 OC Badtemperatur
im Vakuum im Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt. Den Rückstand löst man in
warmem Methanol, filtriert vom ungelöst gebliebenen Siliconöl ab und dampft wieder
zur Trockne ein. Der verbliebene Rückstand (9,4 g) wird in 40 ml Essigsäureethylester
in der Wärme gelöst und zunächst bei Raumtemperatur, anschließend in der Tiefkühltruhe
kristallisiert. Das auskristallisierte Produkt wird abgesaugt, mit wenig kaltem
Essigester gewaschen und 5 Stunden bei 60 OC im Vakuumtrockenschrank getrocknet.
Man erhält 4,18 g Hydrocortison (11ß,17a,21-Trihydroxy-4-pregnen-3,20-dion) vom
Schmelzpunkt 212 -214 OC. Die Kristallisat-Mutterlauge wird mit Aktivkohle erwärmt,
filtriert und auf 15 ml Volumen konzentriert.
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Beim Abkühlen und Stehen über Nacht bei Raumtemperatur kristallisieren
weitere 0,7 g Hydrocortison vom Schmelzpunkt 208 - 210 OC aus, so daß die Gesamtausbeute
87,1 5' der Theorie beträgt.
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Beispiel 2 a) 7 g Pyridiniumtosylat und 70 g 17a,21-Dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion
werden in 560 ml Dimethylformamid gelöst und mit 4,9 1 Benzol verdünnt. Man destilliert
bei einer Badtemperatur von 130 OC 2,1 1 Benzol über einen Wasserabscheider ab und
fügt nach kurzem Abkühlen 168 ml Orthobuttersäuretriethylester hinzu. Innerhalb
von 1,5 Stunden destilliert man bei 130 0C das restliche Benzol ab. Die Lösung wird
mit 84 ml Pyridin versetzt und anschließend am Rotationsverdampfer im Hochvakuum
zur Trockne eingeengt. Man er hält 103,8 g 17a,21-(1-Ethoxy-butylidendioxy)-4-pregnen-3,20-dion
als 01.
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b) Unter den Bedingungen des Beispiels 1b werden 7,5 g rohes 17a 21-(
1 -Ethoxy-butylidendioxy)-4-pregnen-3120-dion, die 6,3 g Reinsubstanz enthalten,
mit einer Curvularia lunata - Kultur 47 Stunden fermentiert. Nach der Aufarbeitung
des Ansatzes und Kristallisation des vom Silicon befreiten Extraktrückstandes aus
Essigsäureethylester erhält man insgesamt 4,3 g Hydrocortison vom Schmelzpunkt 210
-213 OC.
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Beispiel 3 a) 5,3 g Pyridiniumtosylat und 53 g 17a,21-Dihydroxy-6amethyl-4-pregnen-3,20-dion
werden in 370 ml Dimethylformamid gelöst und mit 2,5 1 Benzol verdünnt. Danach destilliert
man bei einer Badtemperatur von 130 OC über einen Wasserabscheider 1 1 Benzol ab.
In die heiße Reaktionslösung läßt man 127 ml Orthoessigsäureethylester langsam zulaufen
und anschließend 1 Stunde lang Benzol
und andere leichtflüchtige
Reaktionskomponenten abdestilliert. Man fügt nun 63 ml Pyridin hinzu und engt bei
einer Badtemperatur von 60 OC im Hochvakuum im Verlauf von 2 Stunden vollständig
zur Trockne ein. Es hinterbleiben 66,8 g öliges 17a,21-(1-E:thoxy-ethylidendioxy)-6a-methyl-4-pregnen-3,20-dion.
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Eine Probe des öligen Rückstandes wird mit dest. Wasser intensiv
gerührt, wobei das Öl langsam in den kristallinen Zustand übergeht. Schmelzpunkt
75/92-95 °C.
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b) Unter den Bedingungen des Beispiels 1b werden 6 g rohes 17a,21-(1-Ethoxy-ethylidendioxy)-6«-methyl-4-pregnen-3,20-dion,
die 4,8 g Reinsubstanz enthalten, mit einer Curvularia lunata - Kultur 51 Stunden
fermentiert. Nach der Aufarbeitung des Ansatzes und Kristallisation des Extraktrückstandes
aus Diisopropyläther erhält man 3,4 g 6a-Methyl-hydrocortison vom Schmelzpunkt 217
- 219 OC.
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Beispiel 4 a) 4 g Pyridiniumtosylat und 40 g 17a,21-Dihydroxy-1,4-pregnadien-3,20-dion
werden in 280 ml Dimethylformamid gelöst und mit 2 1 Benzol verdünnt. Danach destilliert
man bei einer Badtemperatur von 120 OC über einen Wasserabscheider 600 ml Benzol
ab. In die heiße Reaktionslösung läßt man 96 ml Orthoessigsäuretriethylester langsam-
zulaufen und destilliert anschließend weiter Benzol und andere leichtflüchtige Reaktionskomponenten
ab. Man fügt nun 48 ml Pyridin hinzu und engt bei einer Badtemperatur von 60 OC
im Hochvakuum im Verlauf von 2 Stunden vollständig zur Trockne ein. Man erhält 58
g 17a,21-(1-Ethoxy-ethylidendioxy)-1,4-pregnadien-3,20-dion als gelbliches Kristallisat.
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Eine Probe kristallisiert man nach Behandlung mit A-Kohle aus Äther
mit 1 % Aceton um und erhält ein Reinprodukt vom Schmelzpunkt 153 - 154 OC.
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b) Ein 21-Erlenmeyerkolben, der 500 ml einer 30 Min. bei 120°C im
Autoklaven sterilisierten Nährlösung aus 3 % Glukose, 1 % Corn steep, o,2 % NaN03,
0,1 % KH2P04, 0,2 % K2HP04, 0,05 % MgS04.7H20, 0,002 % FeS04.7H20 und 0,05 5' KCl
enthält, wird mit einer Lyophilkultur von Curvularia lunata (NRRL 2380) beimpft
und 60 Stunden bei 30 OC auf einem Rotationsschüttler bewegt. Diese Anzuchtskultur
(250 ml) dient zur Beimpfung eines 201-Vorfermenters, der mit 15 l eines bei 121°C
und 1,1 atü sterilisierten Nährmediums, bestehend aus 2 °% Glukose und 2 % Corn
steep, eingestellt auf pH 6,5, beschickt ist. Unter Zugabe von Silicon SH als Antischaummittel
wird bei 29 OC und 0,7 atü Druck unter Belüftung (10 1/Min.) und Rühren (220 U/Min.)
24 Stunden germiniert. Danach werden 1,5 1 dieser Kultur unter sterilen Bedingungen
entnommen und damit ein 201-Hauptfermenter beimpft, der mit 14 1 eines wie oben
sterilisierten Nährmediums aus 3 5' Corn steep und 0,7 % Glukose, eingestellt auf
pH 5,5, gefüllt ist.
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Nach einer Anwachsphase von 12 Stunden unter Vorfermenterbedingungen
werden 7,5 g 17a,21-(1-Ethoxy-ethylidendioxy)-1,4-pregnadien-3,20-dion, gelöst in
100 ml Dimethylformamid, unter sterilen Bedingungen hinzugegeben und weiter gerührt
und belüftet. Der Verlauf der Fermentation wird durch Entnahme von Proben kontrolliert,
die mittels Methylisobutylketon extrahiert und dünnschichtchromatographisch analysiert
werden. Nach 36 Stunden Kontaktzeit ist die Umsetzung des Substrates beendet.
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Der Fermenterinhalt wird filtriert, das Kulturfiltrat als auch das
abfiltrierte Mycel mit Methylisobutylketon estrahiert, die Extrakte, vereinigt und
zunächst im Umlaufverdampfer konzentriert, anschließend bei 50 OC Badtemperatur
im Vakuum im Rotationsverdampfer auf 100 ml eingeengt und bei Raumtemperatur kristallisieren
lassen.
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Das Produkt wird abgesaugt, im Vakuum getrocknet und man erhält 5,7
g Prednisolon vom Schmelzpunkt 229 - 231 °C.