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Verfahren zur Herstellung von Hydrocortison
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(A-Pregnen-llB, 17cx,-diol-3, 21-dion).
Es sind schon Verfahren zur direkten Herstellung von Hydrocortison aus der Reichstein'schen Substanz S durch Bildung einer ss-Hydroxylgruppe in der 11-Stellung auf mikrobiologischem Wege bekannt ; da aber die meisten Mikroorganismen, die zu einer Oxydation der Steroidverbindungen in der 11-Stellung fähig sind, die Hydroxylgruppe in die 11α-Stellung einführen, ist es verhältnismässig schwierig, Mikroorganismen zu finden, mit deren Hilfe direkt eine 118-Hydroxylgruppe in die Reichstein'sche Substanz S mit guter Ausbeute eingeführt werden kann.
Zur mikrobiologischen llss-Oxydation der Reichstein'schen Substanz S wurden in der bisherigen Literatur die folgenden wichtigeren Mikroorganismen vorgeschlagen.
Durch Anwendung eines Cunninghamella Blakesleena Stammes (vgl. USA-Patentschrift Nr. 2, 602, 769) wurde die Überführung der Substanz S in Hydrocortison mit einer Ausbeute von 35% erreicht, wobei aber gleichzeitig auch Cortison und andere unerwünschte Nebenprodukte erhalten wurden. Im Laufe der weiteren Forschungen (vgl. Appl. Mikrobiol., 3, 14,16 [1955]) konnte zwar durch Abänderung der Zusammensetzung des Nährbodens und durch Zugabe von Alkoholen papierchromatographisch eine 77% igue Konversion zu Hydrocortison bzw. eine 22% igue zu Cortison nachgewiesen werden, diese Ergebnisse konnten aber nicht eindeutig reproduziert werden.
Durch Anwendung von Curvularia lunata und Curvularia pallescens Stämmen (vgl. USA-Patentschrift Nr. 2, 658,023) wurde eine 35-bis 40loige Konversion zu Hydrocortison erreicht, das gewünschte Produkt
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Die Anwendung von Streptomyces fradiae (vgl. deutsche Patentschrift Nr. 921695) ergab nur eine Konversion von 1, 4 bis 5, 80/0 zu Hydrocortison.
Mit Hilfe eines Botrytis cinerea-Stammes (vgl. USA-Patentschrift Nr. 2, 789,940) wurde im Labora- torium durch säulenchromatographische Isolierung eine tige Ausbeute von Hydrocortison erreicht.
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entstanden ist.
Durch Fermentation mit einem, der Absidia glauca nahe stehenden Stamm (vgl. deutsche Auslegeschrift 1009627) konnte das Hydrocortison mit einer Ausbeute von etwa 30o von den Nebenprodukten isoliert werden.
Papierchromatographisch konnte auch die Fähigkeit eines Dothichiza ferruginosa Stammes (vgl.
USA-Patentschrift Nr. 2, 830,936) zu einer Oxydation der Steroide in 11B-Stellung nachgewiesen werden.
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Mit Hilfe von Stachylidium theobromae (vgl. USA-Patentschrift Nr. 2, 830,937) wurden in kleinerem
Massstab Konversionen zu Hydrocortison bis 68cho und zu 11-Epihydrocortison bis 15% erreicht ; bei der Aus- führung dieses Verfahrens in grösserem Massstab ist aber die Ausbeute von Hydrocortison auf 321o und die des 11-Epihydrocortisons auf 6% gesunken.
Ein Pycnosporium Stamm (vgl. USA-Patentschrift Nr. 2,848, 370) ermöglichte eine etwa 27% ige Kon- version zu Hydrocortison.
Mit Hilfe von Epicoccum Stämmen (vgl. USA-Patentschrift Nr. 2, 875,134) wurden 10-bis 20%oige Konversionen zu Hydrocortison, unter Bildung von verschiedenen Nebenprodukten erreicht.
Spondyloclaudium australe und Spondyloclaudium xylogenum Stämme (vgl. USA - Patentschrift Nr. 2, 876,170) ergaben etwa 200 ! oigne Konversionen zu Hydrocortison.
Es wurde schliesslich auch die Fähigkeit eines Rhodoseptoria Stammes (vgl. USA-Patentschrift Nr. 2, 936,264) zur Oxydation von Steroiden in der llss-Stellung festgestellt.
Die auf die Anwendung der obengenannten Stämme gegründeten bekannten Verfahren zeigen also die oben schon erwähnten Nachteile, nämlich schwache Ausbeuten und die Bildung von verschiedenen unerwünschten nur schwierig abtrennbaren Nebenprodukten. Deshalb haben die meisten obenerwähnten Verfahren bloss in prinzipieller Hinsicht eine Bedeutung, aber zur industriellen Verwirklichung sind sie im allgemeinen weder technisch noch wirtschaftlich geeignet. Einen besonders schwerwiegenden Nachteil bildet die Entstehung der Nebenprodukte, von welchen das Hydrocortison meistens nur durch in betrieblichen Dimensionen nicht anwendbare feinpräparative Methoden und mit schlechten Ausbeuten isoliert werden kann.
Wir haben nun gefunden, dass der von uns isolierte und bei dem Ungarischen Volkshygienischen Landesinstitut am 20. Oktober 1961 unter Nr. 611. 020. 1 deponierte Absidia orchidis Stamm die Reichstein'sche Substanz S mit äusserst guter Ausbeute in Hydrocortison überführen kann, wobei unerwünschte Nebenprodukte nur in minimalen Mengen entstehen, so dass das entstandene Hydrocortison verhältnismässig einfach aus dem Fermentationsprodukt isoliert werden kann. Die mikrobiologische Konversion der Substanz S ergibt-auf die eingeführte Menge der Substanz S berechnet-45-bis 50% ige Ausbeuten an Hydrocortison ; bisher war überhaupt keine betrieblich anwendbare Methode bekannt, welche das Hydrocortison mit einer so guten Ausbeute und in einem so hohen Reinheitsgrad geliefert hätte.
Der von uns isolierte Absidia orchidis Stamm, mit welchem die oben geschilderte äusserst vorteilhafte mikrobiologische Herstellung des Hydrocortisons durchgeführt werden kann, ist ein Spezies der zur
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Bestandteile (z. B. Pepton, Malzextrakt u. ähnl.) enthaltenden Nährböden gezüchtet wird, die Substanz S nur mit einem 30% igen Konversionsgrad in Hydrocortison überzuführen vermag. Es ist uns auch gelungen, die Ursache dieser unerwarteten Erscheinung aufzuklären ; die Verminderung des Konversionsgrades ist in solchen Fällen darauf zurückzufuhren, dass die erwähnten natürlichen Nährböden-Bestandteile gewisse oxydationshemmende Stoffe enthalten.
Wenn man nämlich das von solchen Kulturen stammende Mycel durch Waschen mit sterilem Wasser von den anhaftenden Nährboden-Bestandteilen befreit und mit dem derart gereinigten und in sterilem Wasser suspendierten Mycel die Fermentation an die erwähnten natürlichen Bestandteile nicht enthaltendem Nährboden fortsetzt, dann zeigt sich derselbe Mikroorganismus zu einer 60% überschreitenden Konversion der Substanz S zu Hydrocortison fähig.
Auf Grund dieser Erkenntnis haben wir im Rahmen der Erfindung einen Nährboden von solcher Zusammensetzung ausgearbeitet, dass darin die oxydationshemmenden Stoffe sich während der Fermentation nicht anhäufen können. Dieser, im Sinne der Erfindung anzuwendende Nährboden besteht aus Ammoniumsulfat, Glukose und Maisquellwasser (Cornsteep-liquor) in wässeriger Lösung. Dieser Nährboden zeigt die weiteren Vorteile, dass bei seiner Anwendung einerseits die unerwünschten und das Isolieren des Hydrocortisons erschwerenden Steroid-Nebenprodukte nur in minimalen Mengen gebildet werden und anderseits sind in diesem Nährboden durch organische Lösungsmittel extrahierbare Bestandteile ebenfalls nur in minimalen Mengen vorhanden, so dass nach der Fermentation das Hydrocortison in verhältnismässig einfacher Weise isoliert werden kann.
Es wurde auch bisher schon beobachtet, dass bei der Durchführung derartiger mikrobiologischer Oxydationsprozesse auch selbst die als Ausgangsprodukte zugeführten Steroidverbindungen, wenn ihre Konzentration gewisse Grenzen überschreitet, hemmend auf den Ablauf der Oxydation wirken können. Wir
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haben gefunden, dass im Falle der Reichstein'schen Substanz S bei einer Konzentration von z. B. 160 mg/l noch keine derartige Hemmwirkung auftritt und die mit Hilfe des Absidia orchidis Stammes durchgeführte
Oxydation verhältnismässig schnell, in 4 - 6 h optimal verläuft, während bei einer Konzentration von
200 mg/l schon eine wesentlich längere Zeit, etwa 16 - 24 h zum Ablauf der Oxydation nötig sind.
Da eine solche Hemmung der Oxydation und die dadurch nötig werdende wesentlich längere Fermentations- dauer bei der praktischen Durchführung des Verfahrens unerwünscht ist, wird im Sinne der Erfindung die als Ausgangsstoff dienende Substanz S stufenweise, in solchen Mengen der Fermentationsflüssigkeit zuge- setzt, dass dabei die Konzentration der in der Kultur anwesenden, noch nicht oxydierten Substanz S jeder- zeit unter dem erwähnten kritischen Grenzwert von 200 mg/l bleiben soll. Durch eine derartige stufen- weise Zugabe des zu oxydierenden Ausgangsstoffes wird der schnelle, ungehemmte Ablauf der Oxydation des Ausgangsstoffes zu Hydrocortison in optimaler Weise gewährleistet. Die Fermentation kann in dieser
Weise so lange mit gutem Erfolg fortgesetzt werden, bis auf 11 Kulturflüssigkeit gerechnet etwa 600 bis
800 mg Substanz S oxydiert werden.
Es wurde weiters gefunden, dass die Fermentation zu wesentlich höheren Ausbeuten an Hydrocortison führt, wenn die zu oxydierende Substanz S in einem niederen Alkohol vorteilhaft in Methanol oder Ätha- nol gelöst und in dieser Lösung der Fermentationsflüssigkeit zugeführt wird.
Die Reichstein'sche Substanz S wird also im Sinne der Erfindung derart zu Hydrocortison oxydiert, dass man einen Absidia orchidis Mikroorganismen-Stamm an einem Ammoniumsulfat, Glukose und Maisquell- wasser enthaltenden Nährboden züchtetund die Substanz S in einem niederen Alkohol gelöst, stufenweise, in solchen Mengen der Kulturflüssigkeit zusetzt, dass die Konzentration der Substanz S in der Kulturflüssigkeit während der ganzen Fermentation unter 200 mg/l bleiben soll.
Der erfindungsgemäss anzuwendende Mikroorganismen-Stamm Absidia orchidis zeigt auch den praktisch wichtigen Vorteil, dass das Wachstum dieser Mikroorganismen bei den erfindungsgemäss angewendeten Fermentationsbedingungen in der Form von kleinen Knollen erfolgt, so dass das entwickelte Mycel nach der Beendigung der Fermentation sehr leicht unter sterilen Bedingungen abfiltriert werden kann. Das gesamte gebildete Hydrocortison ist unter solchen Umständen in dem erhaltenen klaren Filtrat vorhanden und kann daraus in an sich bekannter Weise isoliert werden. Man kann aber auch derart vorgehen, dass man das durch mikrobiologische Oxydation gebildete Hydrocortison aus dem Filtrat der Kultruflüssigkeit nicht isoliert, sondern, ebenfalls auf mikrobiologischem Weg, direkt zu Prednisolon weiterverarbeitet.
Zu diesem Zweck wird das Filtrat der Kulturflüssigkeit mit einer Corynebacterium simplex Kultur versetzt und die Fermentation mit diesem Mikroorganismus in an sich bekannter Weise fortgesetzt. In dieser Weise kann durch Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens die Reichstein'sche Substanz S direkt, unter Vermeidung des mühsamen und die Endausbeute vermindernden Isolierens des Hydrocortisons, in Prednisolon übergeführt werden.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemässen, unter Anwendung des Mikroorganismen Stammes Absidia orchidis durchgeführten Fermentationsverfahrens liegt darin, dass das nach der Beendigung der Fermentation durch Filtrieren isolierte Mycel wiederholt zu weiteren Oxydationen, also zur Überführung von weiteren Mengen Substanz S in Hydrocortison verwendet werden kann. Wenn man nämlich das abfiltrierte Mycel in sterilem Wasser suspendiert, wird es wieder zu weiteren Fermentationen vollkommen brauchbar, so dass man bei den weiteren Fermentationsoperationen die Arbeit und die Kosten der separaten In- oculum-Züchtung ersparen kann.
Die praktische Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird durch die nachfolgenden Beispiele näher veranschaulicht : Beispiel l : Je 100 ml eines aus 2% Malzextrakt und 1% Pepton mit Leitungswasser bereiteten und auf PH = 5, 5 gestellten Nährbodens wurden in 15 Erlenmeyer Kolben 500 ml) eingetragen und bei 1210 C 15 min sterilisiert. Dann wurden die Nährböden mit je 1 ml Sporensuspension des Stammes Absidia orchidis eingeimpft (die Sporensuspension wurde aus einer in Roux-Flaschen an Kartoffel-Agar gezüchtete Kultur mit 100 ml destilliertem Wasser bereitet). Die beimpften Kulturen wurden bei 250 C 24 h geschüttelt, dann wurde der Inhalt von je 3 Erlenmeyer Kolben vereinigt und mit dem derart erhaltenen Inoculum wurden in 5 Fermentern je 5 l des obigen Nährbodens eingeimpft.
Die Fermentation war bei 250 C unter mechanischem Rühren (300 Umdr/min) und unter Belüftung mit 5 l/min steriler Luft 48 h fortgesetzt, dann wurden die erhaltenen Kulturflüssigkeiten vereinigt und abfiltriert. Die auf diese Weise erhaltene Mycelmasse wurde in 5 Teile geteilt und in je 5 l sterilem Leitungswasser suspendiert. Diese Suspensionen wurden dann in 5 Fermentern eingetragen und unter den oben angegebenen Bedingungen fermentiert.
Zum ersten Fermenter wurden 500 mg, zum zweiten 600 mg, zum dritten 700 mg, zum vierten
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800 mg und zum fünften 1000 mg Reichstein'sche Substanz S, in je 100 ml Äthanol gelöst, am Anfang der Fermentationszeit auf einmal zugegeben. Der Verbrauch der Substanz S wurde in herausgenommenen
Proben der Kulturflüssigkeit durch die Chromogen-Bestimmungsmethode (vgl. A. Mizsei und A. Szabo,
J. Biochem. Microbiol. Techn. Eng., 3,21 [1961]) in gewissen Zeitabständen bestimmt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I angegeben ; die Zahlen bedeuten die Menge der inder
Kulturflüssigkeit anwesenden Substanz S in mcg/ml) :
Tabelle I
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<tb>
<tb> 0 <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 6 <SEP> 8 <SEP> 10 <SEP> 12 <SEP> 14 <SEP> 16 <SEP> h
<tb> Ferm. <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 98 <SEP> 51 <SEP> 16 <SEP> 7 <SEP> 7
<tb> Ferm. <SEP> 2 <SEP> : <SEP> 114 <SEP> 78 <SEP> 26 <SEP> 11 <SEP> 6
<tb> Ferm. <SEP> 3 <SEP> : <SEP> 123 <SEP> 79 <SEP> 30 <SEP> 6 <SEP> 3
<tb> Ferm. <SEP> 4 <SEP> : <SEP> 147 <SEP> 88 <SEP> 34 <SEP> 7 <SEP> 7
<tb> Ferm. <SEP> 5 <SEP> :
<SEP> mu <SEP> 129 <SEP> 88 <SEP> 44 <SEP> 26 <SEP> 15 <SEP> 12 <SEP> 12 <SEP> 8
<tb>
Aus der Tabelle I ist es ersichtlich, dass die Überführung der gesamten Menge der zugesetzten Substanz S in Hydrocortison im Fallevon Zugabe von 500 bis 800 mg Substanz S etwa 6 h in Anspruch nimmt, während im Falle von Zugabe von 1000 mg die Oxydation etwa 16 h dauert.
Beispiel 2 : In 3 Glasfermentern von je 10 1 Inhalt wurden je 5 1 eines aus l% techno Glukose, ouzo Ammoniumsulfat und 21o Maisquellwasser-Konzentrat (50go Trockensubstanz) mit Leitungswasser bereiteten und vor der Sterilisierung mit 10n-Natronlauge auf PH = 6,5 eingestellten sterilen Nährbodens mit den nach Beispiel 1 gezüchtete Schüttelkulturen eingeimpft. Die Fermentation wurde nach Beispiel 1 durchgeführt. Die erhaltenen Kulturflüssigkeiten wurden nach 48h Fermentationszeitvereinigt und je 2, 5 I der vereinigten Kulturflüssigkeit werden in 3 Fermentern, die je 2,5 l steriles Leitungswasser enthielten, eingetragen.
Die derart zweifach verdünnten Kulturflüssigkeiten wurden dann mit je viermal 800 mg Substanz S versetzt, wobei die Substanz S in den nachstehend angegebenen verschiedenen Lösungsmitteln in die 3 Fermenter eingetragen wurde :
Fermenter 1 : in 4 x 80 ml Äthanol
Fermenter 2 : in 4 x 8 m1, 10% CaCl enthaltenden Methanol
Fermenter 3 ; wie bei Fermenter 2, aber unter gleichzeitigem Zusatz von 4 x 72 ml Äthanol.
Die Zugaben erfolgten am Beginn der Fermentation, dann nach 6,12 und 18 h. Der Verbrauch der Substanz S wurde wie im Beispiel 1 in gewissen Zeitabständen bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle II zusammengefasst : Tabelle II
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<tb>
<tb> 0 <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 6 <SEP> 8 <SEP> 10 <SEP> 12 <SEP> 14 <SEP> 16 <SEP> 18 <SEP> 20 <SEP> 22 <SEP> 24 <SEP> h
<tb> Ferm. <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 144 <SEP> 37 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 64 <SEP> 19 <SEP> 11 <SEP> 120 <SEP> 44 <SEP> 25 <SEP> 130 <SEP> 97 <SEP> 57
<tb> Ferm. <SEP> 2 <SEP> : <SEP> 150 <SEP> 32 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 35 <SEP> 24 <SEP> 13 <SEP> 40 <SEP> 16 <SEP> 13 <SEP> 127 <SEP> 26 <SEP> 13
<tb> Ferm. <SEP> 3 <SEP> :
<SEP> 150 <SEP> 44 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 44 <SEP> 22 <SEP> 16 <SEP> 81 <SEP> 32 <SEP> 18 <SEP> 96 <SEP> 53 <SEP> 40
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Diese Ergebnisse zeigen, dass bei einer derartigen Dosierung der zu oxydierenden Substanz S die Oxydation schneller abläuft, als unter den im Beispiel 1 angegebenen Bedingungen.
Werden aus den erhaltenen Fermentationsprodukten je 100 ml entnommen und dreimal mit je 30 ml Essigester extrahiert, dann der Extrakt eingeengt und im Konzentrat der Hydrocortisongehalt papierchromatographisch quantitativ bestimmt, so kann es festgestellt werden, dass die Bildung von Hydrocortison (auf die Menge der eingesetzten Substanz S berechnet) im ersten Fermenter 62%, im zweiten Fermenter
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44%, und im dritten Fermenter 651o der theoretischen Menge erreichte. Neben dem Hydrocortison kann die Anwesenheit einer kleinen Menge von nicht umgesetzter Substanz S, ferner von drei weiteren Steroidprodukten festgestellt werden.
Die letztgenannten drei Steroide sind polarer als das Hydrocortison ; die Identität eines dieser, am Papierchromatogramm nur kaum sichtbare schwache Flecken zeigenden Nebenprodukte konnte als eine Epi-F-Verbindung festgestellt werden.
Die obenerwähnte papierchromatographische Bestimmung wurde an mit Äthanol gewaschenem Macherey-Nagel-Papier Nr. 214 durchgeführt ; die stabile Phase war eine 30% igue methanolische Lösung von Äthylenglykol, als mobile Phase war ein Gemisch von Tetrachlorkohlenstoff und Dichloräthan (l : l) angewendet. Die Laufzeit war 4 h an 50 cm Papier, in absteigender Richtung. Nach Trocknen bei 700 C wurde die Lage der Steroid-Flecke im Lichte einer bei 253 mf. emittierenden UV-Lampe festgestellt ; die Flecke wurden ausgeschnitten, mit 10 ml Äthanol bei 370 C eluiert und die Absorption des Eluats bei 242 mj-t im Unicam-Spektrophotometer gemessen. Der dem abgelesenen Extinktionswert entsprechende Steroidgehalt wurde auf Grund der Standardkurve berechnet.
Beispiel 3 : Die Fermentation wurde in 60 l des im Beispiel 2 beschriebenen Nährbodens durchgeführt, welcher mit dem gleichen Inoculum eingeimpft wurde. Die Fermentation wurde unter 0,2 atm Überdruck, bei 250 C, unter Rühren (200 Umdr/min) und unter Belüftung (0,5 Vol/min) 48 h fortgesetzt, dann wurden unter sterilen Bedingungen 30 l der Fermentationsflüssigkeit entnommen und durch 30 l steriles Wasser ersetzt.
Zu dieser, zweifach verdünnten Kulturflüssigkeit wurden in Zeitabständen von 4 h viermal 9,6 g Substanz S, in je 960 ml Äthanol gelöst, zugesetzt. Die in der oben beschriebenen Weise ermittelte Konzentration der Substanz S hat sich im Fermenter folgendermassen geändert :
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<tb>
<tb> Nach <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 6 <SEP> 8 <SEP> 10 <SEP> 12 <SEP> 14 <SEP> 16 <SEP> 18 <SEP> h <SEP>
<tb> 143 <SEP> 64 <SEP> 19 <SEP> 56 <SEP> 23 <SEP> 71 <SEP> 30 <SEP> 96 <SEP> 69 <SEP> 40 <SEP> mcg/ml <SEP>
<tb>
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