DD222042A1 - Verfahren zur herstellung eines pepstatins - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines niedermolekularen Inhibitors saurer Proteinasen, der unter anderem fuer die Chemotherapie von Krankheiten des Menschen, bei denen saure Proteinasen (z. B. Pepsin, Renin, Cathepsin D) ursaechlich beteiligt sind, von potentiellem Nutzen ist. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Isobutyryl-Pepstatin unter Verwendung des Mikroorganismen-Stammes ZIMET 43 719, der nach Mutagenese-Selektionsprozessen aus Populationen eines Streptomyceten gewonnen wurde. Ziel der Erfindung ist die Gewinnung eines neuen Proteinasen-Inhibitors mit potentiell chemotherapeutischem Wert mit Hilfe verbesserter Biosynthese- und Isolierungsbedingungen, um die Palette bekannter Herstellungsverfahren zu erweitern. Die Aufgabe wird dadurch geloest, dass durch aerobe Submersfermentation des Mikroorganismus ZIMET 43 719 in Medien mit geeigneten C-, N-Quellen und Mineralsalzen Isobutyryl-Pepstatin gebildet, durch Butanolextraktion angereichert, durch Ausruehren mit Natronlauge von dunklen Pigmentstoffen befreit, mit Hilfe chromatografischer Methoden gereinigt und aus Methanol umkristallisiert wird.

Description

Titel der Erfindung

Verfahren zur Herstellung eines Pepstatins

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines -enzyminhibitorisehen Pepstatins, das unter anderem bei der Chemotherapie solcher Krankheiten des Menschen von potentiellem Nutzen ist, bei denen Proteinasen ursächlich beteiligt sind. Insbesondere betrifft die Erfindung die Gewinnung eines Inhibitors für saure Proteinasen, der als Isobutyryl-Pepstatin bezeichnet wird.

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt in der pharmazeutischen und der technisch-mikrobiologischen Industrie, die Pharmaka für die Humanmedizin sowie Enzyminhibitoren u.a. für die Nahrungsgüterwirtschaft, die Biotechnologie, die Nutztierzucht bereitstellt.

Charakteristik der bekannten technischen Lösung

Pepstatine sind eine Gruppe von Pentapeptiden, die als Inhibitoren saurer Proteinasen wie Pepsin, Renin und Cathepsin D bekannt sind. Es ist auch bekannt, daß unterschiedliche, Acylreste am Pepstatin-Molekül die renin-inhibitorische Aktivität beeinflussen. Bisher sind folgende Mikroorganismen beschrieben worden, die unterschiedliche Pepstatine zu synthetisieren vermögen: ,

Streptomyces caespitosus (SUGAWARA et HATA; 1956)

, . Streptomyces parvisporogenes (LOCCI et al.; 1969 bzw.

IGNOTUS; 1969)

Streptomyces naniwaensis (MURAO et SATOI; 1970)

Streptomyces testaceus (EAMADA et OKAMI; 1970) Streptomyces argenteolus yar. toyonakensis (IMEZAWA,

DD-AP 84 449).

In der Regel werden hierbei Gemische von schwer voneinander trennbaren Oligopeptiden durch die Mikroorganismen gebildet. Ein weiterer Kachteil bei der Gewinnung strukturell modifizierter Pepstatine ist, daß zwar chemische Methoden wie Total- bzw. Partialsynthese oder biochemische Methoden zur enzymatischem Konversion bekannt sind, deren Anwendung jedoch nicht zu einer ökonomischen Produkt her stellung führt und die großtechnische Gewinnung dieser Derivate nicht gestattet.

Bei der bisher mit wenigen Streptpmyceten-Arten möglichen Pepstatin-Gewinnung werden bevorzugt Gemische chemisch ähnlicher Oligopeptide gewonnen, bei denen als Acylreste des Pepstatins gegenwärtig Isovaleroyl-, n-Caproyl-, Isocaproyl-, n-Heptanoyl-, Isoheptanoyl-, Anteisoheptanoyl-, n-Capryloyl-, Isocapryloyl-, Butyryl-, Propionyl- und Acetyl-Gruppen bekannt sind. Das erschwert, wie erwähnt, die Trennung der chemisch ähnlichen Komponenten und bringt Standardisierungsprobleme mit sich, wenn in Abhängigkeit vom Fermentationsverlauf Verschiebungen qualitativer und quantitativer Art im Vielkomponenten-Gemisch auftreten.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung dient der Herstellung eines Inhibitors saurer Proteinasen, der zur Gruppe der Pepstatine gehört, um die aufgeführten Nachteile der bekannten mikrobiologischen Herstellungsverfahren zu vermeiden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technologisches Verfahren anzugeben, das es gestattet, einen Proteinasen-Inhibitor aus der Gruppe der Pepstatine mit Hilfe eines Mikroorganismus aus leicht zugänglichen und billigen Einsatzstoffen in guten Ausbeuten herzustellen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen in einem flüssigen Nährmedium mit Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsal-

zen ein zur Gattung Streptomyces gehöriger Mikroorganismus oder seine Varianten gezüchtet werden.

Der Mikroorganismus, der in dem vorliegenden Verfahren zur Herstellung des Pepstatins verwendet wird, ist als Folge von Mutagenese- und Selektionsprozessen aus Populationen einer Streptomyceten-Art gewonnen und in der ZBiET-Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, Jena-DDR, unter der Nummer ZIMET 43 719 hinterlegt worden. Bei dem Ausgangsstamm, aus dem die Mutante ZIMET 43 719 abgeleitet ist, handelt es sich um Streptomyces spec. PS 84 382» der nach der Isolierung aus Erdproben keinerlei Differenzierung von Luftmycel und Sporen zeigte und daher von den bisher bekannten Pepstatin-Bildnern abweichende morphologische, physiologische und biochemische Gharakteristika aufweist. Im Gegensatz zum Ausgangsstamm Streptomyces spec. PS 84 382 synthetisiert; die nach Mutagenese durch Selektion erhaltene Mutante ZIMET 43 719 kein Gemisch unterschiedlicher Pepstatine, sondern überraschenderweise ein chemisch einheitliches Pepstatin.

Die Kultivierung des Pepstatin-Bildners Streptomyces spec. ZIMET 43 719 sowie seiner Varianten erfolgt unter aeroben Bedingungen. In flüssigem Stickstoff aufbewahrtes oder an Glucose-Gelatine lyophilisiertes Mycel des Stammes wird in geeignete Agarnährböden und nachfolgend in flüssige, vorher sterilisierte Nährmedien geimpft und das entstehende Mycel wird in an sich bekannter Weise bei einer Temperatur zwischen 25 ⁰C und 37 ⁰C* vorzugsweise bei 28 ⁰C, über einen Zeitraum von 2 Tagen bis 6 Tagen, vorzugsweise 4 Tagen, bei einer Acidität kultiviert, die zu Beginn des Fermentationsprozesses zwischen pH 6,8 und pH 7»0 und am Ende des Prozesses zwischen pH 7,5 und pH 8,5 liegt. Das Nährmedium besteht aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie aus anorganischen Salzen. Als Kohlenstoff quellen können Glyzerin, Glukose, Lactose, Sojaöl und Sojamehle verwendet werden. Als Stickstoff quellen eignen sich außer den oben erwähnten stickstoffhaltigen Substraten Fleischextrakte, Maisquellwasser, Aminosäuregemische, Rohglutamin, Peptone und Trokkenhefe. ·

Gute Fermentationsergebnisse werden bei Zusatz von Mineralsalzen erzielt. In Abhängigkeit von dem verwendeten Nährmedium be-

günstigen letztere den Verlauf der Fermentation. In komplexen Medien, die verschiedene Mehle enthalten, haben sich Zusätze τοπ Magnesiumsulfaten und Kaliumphosphaten als vorteilhaft erwiesen« Die Fermentation des Pepstatin-Büdners, ZIMET 43 '719, kann in Steilbrustflaschen und Rundkolben verschiedenen Inhalts, im Glasfermenter sowie in V2A-Stah.ltanks durchgeführt werden.

Die Isolierung des Pepstatins wird in der Weise durchgeführt, daß der Proteinasen-Inhibitor bei pH 4 aus dem vom Mycel befreiten Kult urfilt rat mit n-Butanol oder einem anderen mit Wasser nicht mischbaren Alkohol extrahiert, der Alkoholextrakt durch Ausrühren mit Alkalilauge, vorzugsweise Natronlauge, und Was-^ ser von dunklen Pigmentstoffen befreit und im Vakuum konzentriert, der erhaltene Sirup mit Petrolether oder einer anderen Benzinfraktion gefällt und der Rückstand mit Hilfe der Kieselgelchromatograf ie vorgereinigt wird, die aktiven Fraktionen konzentriert und nach Auflösen in einem niedrig siedenden Alkohol bei erhöhter Temperatur mit Aktivkohle gereinigt werden, sowie die nach Konzentrieren und Abkühlen der alkoholischen Lösung erhaltene farblose Substanz schließlich in Alkohol, vorzugsweise Methanol, umkristallisiert und/oder mit Hilfe der Kieselgelchromatografie gereinigt und als reine farblose kristalline Substanz erhalten wird.

Der aus der Kulturlösung des Streptomyces spec» ZIMBT 43 719 isolierte Inhibitor saurer Proteinasen konnte mit Hilie elementaranalytischer, gaschromatografischer, inf rarotspektroskopischer und massenspektrometrischer Methoden als Pepstatin iso-Bu (Isobutyryl-Pepstatin) identifiziert werden; er erhielt die Bezeichnung PI 43 719.

Der aus dem Stamm ZIMET 43 719 isolierte und gereinigte Inhi- ' bitor PI 43 719 besitzt einen Schmelzpunkt bei 223 ⁰C bis 227 ⁰O. Er ist optisch aktiv. Der Wert ßkj. Jp beträgt in einer 0,5%igen Methanollösung -92,7°. Die Elementaranalyse liefert folgende Ergebnisse: Berechnet für C^H^NcOq: 0=58,99%, H=9,15%, N=10,41%, Gefunden: 0=59,16%, H=9,16%, N=10,11%. ' Das Molekulargewicht beträgt 671,5.

Im ITV-Spektrum zeigt PI 43 719 nur eine Endabsorption. Das IR-Spektrum--(KBr-Preßling) zeigt folgende charakteristische Absorptionsmaxima: 1065, 1175, 1220, 1365, 1380, 1450, 1470,

1540, 1630, 1710, 2865, 2930, 2955, 3065, 3280 cm"¹. Das Molekulargewicht und die chemische Konstitution des PI 43 719 wurden durch hochauflösende Massenspektrometrie seines Methylesters ermittelt. Der Molpeak des Methylesters liegt bei 685,4614 (berechnet für C-^H^NcOq 685,4626). Die charakteristischen Fragmente sind in Tabelle 1 angegeben. Der Vergleich

der massenspektrometrisehen Fragmentierung mit der des Methylesters des Pepstatin A zeigt, daß PI 43 719 ein Pepstatin mit einer C^-Kette als Acylrest darstellt. Nach saurer Hydrolyse des Inhibitors PI 43 719 in 6n HCl bei 110 ⁰C wurde der C^- Rest mit Hilfe der Gaschromatografie als Isobutyryl-Rest identifiziert. Pepstatin A besitzt dagegen als N-terminale Gruppe den Isovaleroyl-Rest (Umezawa et al. 1970, J.Antibiotics 23., 259; Aoyagi et al. 1973, J.Antibiotics 26, 539). Sowohl frische Fermentationslösungen des Pepstatin iso-Bu-Bildners, ZIMET 43 719, als auch der aus ihnen isolierte neue Proteinasen-Inhibitor PI 43 719 besitzen enzyminhibitorische Aktivität gegen Pepsin. -

Die Aktivität des Isobutyryl-Pepstatin ist indirekt durch Bestimmen der Hestaktivität des Pepsin nach Einwirkung auf das Substrat Rinderserumalbumin ermittelt worden. Dabei dient die unter.Pepsin-Einwirkung abgespaltene Tyrosinmenge als Maß für die Restaktivität der Proteinase. Die Tyrosinmenge wird dabei photometrisch bei 280 nm bestimmt.

Folgende Beispiele dienen dazu, die Erfindung zu erläutern, ohne sie hierauf zu beschränken.

Ausführungsbeispiele:

1.1. Zwei 500 ml-SteilbrtLstflaschen enthalten je 80 ml des folgenden Yorzuchtmedituns:

Glukose 1.5 % .

Sojamehl 1|5 %

GaCO₃ 0,1 %

NaCl 0,5 %

in Leitungswasser, pH 6,8

Sterilisierung: 35 Minuten bei 115 ⁰C

Jede. Steilbrustflasche wird mit einer Mycelsuspension des Pepstatin-Bildners Z]LMET 43 719 beimpft, welche mit steri-

ler, isotonischer Kochsalzlösung von einer im Reagenzglas auf folgendem Anzucht-Nährboden gezüchteten, 10 Tage bis 14 Tage alten Kultur des Stammes ZIMET 43 719 hergestellt wird: ·

Glukose 1,0 %

Casein-Pepton 0,4 %

Walfleischextrakt 0,4 %

NaGl 0,2%

Trockenhefe 0,02%

In Leitungswasser, pH 7,0

Sterilisierung: 20 Minuten bei 115 ⁰C* Die beimpften Vorzucht-Kulturen werden 48 Stunden bis - 96 Stunden bei 28 ?C auf einem Schüttelgerät mit einer

Frequenz von 180 U/Min, bebrütet. 8 ml einer so bebrüte~ ten Vorzuchtkultur dienen zur Beimpfung von 500 ml-Steilbrustflaschen, die je 80 ml des folgenden Produktions- χ

Mediums enthalten:

Glyzerin · 2,0 %

Fleischextrakt 0,75%

Pepton ; 0,75%

NaCl 0,3 %

MgSO₄·7Η₂0 0,1 %

K₂HPO₄ 0,1 % ,

In Leitungswasser, pH 7,0. Sterilisierung: 20 Minuten bei 115 °C· ^Die Bebrütungstemperaturen bei An-, Vorzucht und Produktion liegen bei 28 ⁰O.

1.2. Mit einer Kultur des Pepstatin-Bildners Stamm ZIMET 43 719, von einem festen Nährboden wie in Beispiel 1.1 beschrieben, beimpft man 80 ml des in Beispiele beschriebenen flüssigen Vorzucht-Mediums, welches in einer 500 ml-Steilbrustflasche enthalten ist. Man bebrütet 48 Stunden bei 28 ⁰C auf einem Schüttelgerät mit einer Frequenz von 180 U/Min. 12 ml der so erhaltenen Kultur brühe dienen zur Beimpf ung von 400 ml des gleichen Vorz ucht-Medi ums, welches in einem 2 !-Glaskolben enthalten ist. Man bebrütet weitere 24 Stunden bei 28 ⁰C bei gleicher Schüttelfreque/η,ζ, ehe die so erhaltenen 400 ml Kulturbrühe zur Beimpfung von 20 1 des im Beispielli beschriebenen Produktions-Mediums dienen können. Letzteres

ist in einem 32 1-Glasfermenter enthalten. Nach eintägiger Bebrütung und Belüftung (15 l/Min.) wird der Inhalt des 32 1-Glasfermenters als Inoculum für einen 450 1-V2A-Stahltank eingesetzt. Während der Fermentation kann die Schaumbildung durch Zusatz Kleiner Mengen von Sonnenblumenöl oder anderer, silikonhaltiger Schaumschutzmittel kontrolliert werden. Die Rührgeschwindigkeit beträgt 400 U/Min, und die Luftzufuhr 400 l/Min.

1.3· 410 1 der nach Beispiel 1.2 gewonnenen Kulturlösung werden mit Schwefelsäure auf pH 4 angesäuert und mit 110 1 n-Butanol extrahiert. Der Butanolextrakt wird im Vakuum auf 10 1 konzentriert und mit 3 1 einer 0,1 η Natronlauge ausgerührt, wobei dunkle Pigmentstoffe in die wäßrige.Phase übergehen. Falls der pH-Wert während des Rührens unter pH 8,0 bis pH 8,5 sinkt, wird weitere Natronlauge (50%ig) zugegeben. Anschließend wird dreimal mit 1 1 Wasser gewaschen und mit Essigsäure der pH-Wert auf pH 5 eingestellt. Sach weiterem Konzentrieren unter Vakuum bis zum öl erfolgt die Zugabe der achtfachen Menge Petrolether, wobei 67 g hellbraunes Pulver (Aktivität 15%) isoliert werden. Die Substanz wird in 100 ml einer Lösungsmittelmischung aufgelöst, die aus Butanol:Butylacetat:Essigsäure:Wasser= (4:4:1:0,5) besteht, und über eine KieselgeIsäule, die 400 g Kieselgel (0,063 '- 0,2 mm) enthält, filtriert. Nach Elution mit dem gleichen Lösungsmittelsystem werden die aktiven Fraktionen vereinigt und konzentriert. Der Rückstand (32 g, Aktivität 30%) wird in 500 ml Methanol unter Erhitzen auf 50 ⁰C gelöst, mit 20 g Aktivkohle versetzt, 10 Minuten unter Rühren bei 50 ⁰C gehalten und filtriert. Die Kohle wird mit heißem Methanol dreimal gewaschen. Die vereinigten Methanollösungen werden auf 100 ml konzentriert und abgekühlt. Nach dem Abfiltrieren der ausgefallenen farblosen Substanz wird die Mutterlauge weiter konzentriert, wobei weitere Substanzmengen ausfallen. Insgesamt können 6 g des Inhibitors (Aktivität 90%) erhalten werden. Die Umkristallisation aus Methanol liefert 3,1 g feinkristalliner, farbloser Substanz.

1.4. Für analytische Zwecke wird die nach Beispiel Ι·3 erhaltene Substanz nochmals durch Kieselgelchromatografie gereinigt. Nach Auflösen von 3,1 g Inhibitorsübstanz in Methanol und Aufziehen auf 5g Kieselgel wird das mit Substanz beladene Kieselgel über 300 g Kieselgel (0,04 0,063 mm), das in einer Säule (Durchmesser 4,5 cm) gepackt und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform, Methanol und.Essigsäure (92:6:1) equilibriert ist, gelagert und anschließend wird mit diesem Lösungsmittelgemisch eluiert. Die Zusammensetzung des Lösungsmittelgemisches wird dabei stufenweise auf 86:12:1,5 verändert. Die Eluate werden jeweils in Fraktionen von 25 ml aufgefangen und mittels Dünnschichtchromatografie im System Chloroform: MethanolEssigsäure = 86:12:2 auf Kieselgelplatten analysiert. Die Fraktionen 52 bis 83, die den reinen Inhibitor enthalten, werden vereinigt, konzentriert und anschließend aus Methanol umkristallisiert, worauf 1,3 g feiner Nadeln erhalten werden (Schmelzpunkt 223 ⁰C - 227 ⁰C).

II. Man verfährt wie im Beispiel Imit dem Unterschied, daß das Produktions-Medium folgende Zusammensetzung hat:

Glyzerin 2,0 %

Maisquellwas;ser 1,5 %

NaCl ; -0,3 %

MgSO₄· 7 H₂O 0,1%

KpHPO₄ 0,1 %

In Leitungswasser, pH 7,0; 20 Minuten bei 115 ⁰G sterilisiert.

Die Vorteile des vorliegenden Verfahrens zur Gewinnung des Isobutyryl-Pepstatins PI 43 719, dieses neuen Pepstat'in-Vertreters, werden darin gesehen, daß

- ein Mikroorganismus eingesetzt werden konnte, der PI 43 719 als gut isolierbare Einzelkomponente zu bildenvermag;

- ein Auf arbeit längsverfahren entwickelt worden ist, bei dem die im Fermentationsprozeß anfallenden dunklen Pigmente aus dem Alkohol-Extrakt' des Produkts durch Aus-

-- ' . rühren mit Alkalilauge entfernt werden können und

ein anwendungsrelevanter Enzym-Inhibitor mit potentiellen Applikationsgebieten nicht nur in der Humanmedizin, sondern auch in der Nutztierzucht (Fertilitätskontrolle) und in der Nahrungsgüterindustrie (neuartiges Konservierungsmittel) verfügbar wird»

Tabelle 1

Massenspektrometrie des Isobutyryl-Pepstatin-Methy Ie st er im Vergleich zuIsovaleryl-Pepstatin (Pepstatin A)-Methylester. (Hochauflösendes Massenspektrometer ASI MS 902, 70 eV, 240 ⁰C)

Fragment	(a)	Isobutyryl-Pepstatin-Methylester	ber.	Summenformel	Isovalery1-Pepstatin-Methylester	•	ber.	Summenformel
	(a)	gef.	,4626	C34H63N5O9	gef			C35H65N5O9
M + .	(a)	685,4614	,4520	C34H61N5O8 Λ	699			C35H63N5O8
M - 18	(a)	667,4509	,4442	°33Η60Ν5°8	681			C34H62N5O8
M - 31	Ca)	654,4437	,4309	C30H56N5O6	668			C31H58N5°6
M - 102	(a)	583,4296	,3339	C25H45N4O6	597	,3534	,3495	C26H47N4O6
U - 188	(a)	497,3320	,3390	C24H45N4O5	511	,3576	,3546	C25H47N4O5
M - 216	(a)	469,3374	,2968		483			C23H42N3O5
M'~ 259	(b)	426,2957	,2835	C19H37N3O3	440	,3014	,2991	C2OH39N3°3
M - 330	355,2823	,1869	C15H27N2O6	369
M - 354	331,1866

(a) = Fragment mit Acylrest, (b) = Fragment ohne Acylrest

Tabelle 1 (Fortsetzung)

Fragment	(b)	Isobutyryl-Pepst at in-Methyle ster	ber.	Summenformel	I s o vale ryl-Pep st at in-Met hyle st er	ber.	Summenf or me 1
	(b)	gef.			gef.		C15H27N2O6
M - 368	(a)		,1763	C15H25N2O5	331	,1763	C15H25N2°5
331 - 18	(a)	313,1756	,1865	C14H25N2O3	313,1760	,2022	C15H27N2O3
M - 416	(a)	269,1863	,1994	C13H26N2O2	283,2050	,2151
M- 443	(a)	242,1985	,1191	C9 H16N O2	256,2177	,1337	C10H18N O2
M - 515	(b)	170,1178	,1232	C8H16NO	184,1353	,1388	C9 H18N 0
M - 543	(b)	142,1231	,0970	°5 H12N	156,1405		C5H12N
86	86,0969	,0813	0,H10H	86		C4H10N
72	72,0823	72

(ä) = Fragment mit Acy Ire st, (b) = Fragment ohne Acylrest

Claims (1)

1. Erfindungsanspruch

   Verfahren zur Herstellung eines Pepstatins auf mikrobiellem Wege, gekennzeichnet dadurch, daß der Mikroorganismus Strepto- myces spec. ZIMET 4-3 719 unter aeroben Bedingungen in flüssigen Nährmedien, die eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten, bei einer Temperatur zwischen 25 ⁰C und 37 ⁰C während'eines Zeitraumes von 2 Tagen bis 6 Tagen kultiviert wird und der gebildete neue Proteinasen-Inhibitor, Isobutyryl-Pepstatin (iso-Bu) oder PI 43 7^9 genannt, aus dem Kulturfiltrat mit einem mit Wasser nicht mischbaren Alkohol extrahiert wird, die alkoholischen Extrakte durch Ausrühren mit Alkalilauge gereinigt, konzentriert, in alkoholischer Lösung mit Aktivkohle behandelt und mittels an sich bekannter chromatografischer Methoden gereinigt werden. Hierzu 2 Seiten Tabellen.