DE3522578A1

DE3522578A1 - Spiroverbindung und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE3522578A1
Application number: DE19853522578
Authority: DE
Inventors: John A.L. Reinach Auden; Heinrich Dr. Binningen Peter
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1984-06-26
Filing date: 1985-06-24
Publication date: 1986-01-02

Description

Spiroverbindung und Verfahren zu ihrer Herstellung
Die Erfindung betrifft 4,lo-Dihydroxy-2-methoxy-3-methylen-6(Z)-propyliden-2-azaspiro[4,5]åec-7-en-1,9-dion der Formel I in der die absolute Konfiguration willkürlich angegeben ist, nachstehend als Verbindung I bezeichnet, in der durch Züchtung des Stammes Staphylotrichum coccosporum, der am 18.2.83 unter der Nummer DSM 2602 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Grisebachstrasse 8, D-3400 Göttingen hinterlegt worden ist, erhältlichen absoluten Konfiguration, Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung, pharmazeutische Präparate, die diese Verbindung enthalten und ihre Verwendung als Arzneimittel.
Die obengenannte Verbindung besitzt wertvolle pharmakologische Eigenschaften, insbesondere lipidsenkende Wirkung, wie z.B. in Tierversuchen, vorzugsweise an Säugetieren, z.B. an Ratten nachgewiesen werden kann. Z.B. kann man die Senkung von "very low density"-, "lowdensity"- bzw. "high density"-Lipoproteinen (VLDL, LDL bzw. IIDL) im Serum folgendermassen bestimmen: Die Experimente werden an männlichen Albino-Ratten mit einem Körpergewicht von 180-240 g durchgeführt, die freien Zugang zu Standard-Rattenfutter und Trinkwasser haben, und zwar wird Experiment I an Sprague Dawley Abkömmlingen des Stammes Tif:RAI und Experiment II an Tieren des Wistar-Stammes Iva:WI durchgeführt. Verbindung I in Polyäthylenglykol mit dem mittleren Molekulargewicht 400 wird oral an Gruppen von 8-10 Ratten verabreicht, und zwar im Falle von Experiment I einmal täglich um 8 Uhr vormittags während drei aufeinanderfolgender Tage und zweimal, nämlich um 8 Uhr und 16 Uhr, am vierten Tag, und im Falle von Experiment II täglich während 8 aufeinanderfolgender Tage. Im Experiment I werden die Tiere 16 Stunden und im Experiment II zwei Stunden nach der letzten Gabe durch Ausblutenlassen vom Hals unter leichter Anästhesie mit Ether getötet. 16 Stunden lang vor ihrem Tod erhalten die Tiere keine Nahrung. Zu dem vereinigten Serum von 2-3 Ratten fügt man eine 0,05%ige wässrige Ethylendiamintetraessigsäure-Lösung und eine 0,OlXige wässrige Thiomersal-Lösung.
Die Serumlipoproteine werden unter Verwendung einer Ultrazentrifuge durch 24stündige Zentrifugation bei 78000 g, 78 000 g bzw. 109 000 g in Salzlösungen mit den Dichten 1,006, 1,040 bzw. 1,21 getrennt.
Cholesterin und Triglyceride werden enzymatisch mit Hilfe der von den Firmen Miles (Lausanne, Schweiz) bzw. Böhringer (Mannheim, Deutschland) gelieferten Testsysteme bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I aufgeführt.

Tabelle I

Experiment Einzeldosis an Verbin- VLDL-Triglyceride LDL-Cholesterin HDL-Cholesterin

dung I [mg/kg] [mg/100 ml Serim] [mg/100 ml Serum] [mg/100 ml Serum]

I 0 (# Kontrolle) 91,1 # 6,7 6,2 # 0,8 40,8 # 1,4

15 76,3 # 9,2 3,9 # 0,6 35,1 # 3,2

50 46,7 # 3,4 3,7 # 0,4 35,8 # 1,8

II 0 (# kontrolle) 50,6 # 3,1 9,2 # 0,9 52,5 # 4,9

3 44,5 # 8,2 8,3 # 0,9 48,1 # 3,4

10 46,9 # 6,5 7,4 # 0,8 50,9 # 2,9

30 57,9 # 5,5 6,5 # 0,4 59,5 # 3,7

100 57,9 # 5,5 3,2 # 0,7 64,0 # 6,1

Aus Tabelle I ergibt sich, dass die Wirkung von Verbindung I hauptsächlich in einer ausgeprägten und dosisabhängigen Reduktion von LDL-Cholesterin liegt. Im Experiment I stellt man im Gegensatz zu Experiment II auch eine Reduktion von VLDL-Triglyceriden fest, wobei zu bemerken ist, dass die im Experiment 1 verwendeten Abkömmlinge des Sprague-Dawley Stammes eine verhältnismassig hohe Konzentration an VLDL besitzen, während VLDL bei den im Experiment II verwendeten Wistar Ratten nur in geringer Konzentration vorliegen. Die HDL-Fraktion ändert sich in beiden Experimenten nicht in signifikanter Weise.

Als LDL-senkende Verbindung kann Verbindung I zur Behandlung von Hyperlipidämie, hauptsächlich der Typen IIa und tIb, und Atherosclerose bei Vorliegen von Hyperlipoproteinämie als Risikofaktor verwendet werden.
Die Erfindung betrifft auch das Verfahren zur Herstellung von Verbindung I, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man den Stamm Staphylotrichum coccosporum DSM 2602 oder eine von diesem Stamm ableitbare Kultur in einem Nährmedium züchtet und Verbindung I isoliert.
Als ableitbare Kultur im obigen Sinne gilt jede Kultur, welche noch die für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wesentlichen Merkmale der hinterlegten Kultur aufweist, d.h. eine abgeleitete Kultur, insbesondere eine Kultur, deren Mikroorganismen die gleichen Strukturgene wie die für die Bildung von Verbindung I ursächlichen Strukturgene des Stammes DSM 2602 enthalten. Als ableitbare Kultur gilt auch jede Kultur, deren Mikroorganismen ein wegen der Entartung des genetischen Codes mögliches Aequivalent der für die Bildung von Verbindung I ursächlichen Strukturgene des Stammes DSM 2602 enthalten.
Als ableitbare Kultur gilt insbesondere jede Kultur, die Mikroorganismen der Gattung Staphylotrichum, vorzugsweise der Art Staphylotrichum coccosporum, welche zur Produktion von Verbindung I befähigt sind, enthält. Der Begriff "ableitbare Kultur des Stammes DSM 2602" schliesst auch alle Mutanten dieses Stammes ein, die zur Produktion von Verbindung I befähigt sind.
Als Nährmedium verwendet man eine vorzugsweise wässrige Lösung oder Suspension, welche mindestens eine Kohlenstoffquelle (die auch als Energiequelle dient) und mindestens eine Stickstoffquelle, und vorzugsweise auch Mineralstoffe enthält. Als Kohlenstoffquelle sind beispielsweise zu nennen: Glycerin, assimilierbare Kohlenhydrate,wie Cyclitole, z.B. Mannit, Polysaccharide, z.B. Stärke, Disaccharide, z.B.
Lactose und Saccharose, und Monosaccharide, vor allem Glucose, sowie entsprechende Kohlenhydrat-haltige technische Rohstoffe, wie Zuckerrüben- oder Zuckerrohrmelasse. Als Stickstoffquelle seien genannt: Aminosäuren, insbesondere die in der Natur vorkommenden a-Aminosäuren, Peptide sowie Proteine und deren Abbauprodukte, wie Peptone und Tryptone, aber auch Ammoniumsalze und Nitrate, sowie entsprechende technische stickstoffhaltige Rohstoffe, wie Fleischextrakte, Kaseinhydrolysat sowie Hefeautolysat und -extrakt. Es kommen auch gemischte technische C- und N-Quellen in Betracht, wie verschiedene Pflanzensamen, die in Form von wässrigen Auszügen, Mehl oder Maische von Bohnen, z. B. Sojabohnen, Getreidekörnern, z.B. Weizen, und insbesondere Mais ("Corn-steep liquor"); ferner auch Baumwollsamen, sowie auch Malzextrakt verwendet werden. Neben Ammoniumsalzen und Nitraten kann das Nährmedium als anorganische Salze Chloride, Carbonate, Sulfate und insbesondere Phosphate von Alkali- und Erdalkalimetallen sowie von Spurenelementen, wie Magnesium, Eisen, Zink und Mangan, enthalten.
Das Nährmedium wird sterilisiert und mit einer Kultur des Produkttionsstammes unter Einhalten der üblichen Massnahmen eingeimpft.
Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff im Schüttelkolben oder in Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen etwa 150C und 400C, insbesondere zwischen etwa 220C und 300C, vorzugsweise etwa 250C. Die Fermentationszeit liegt bevorzugterweise zwischen 1 und 10 Tagen, z.B.
bei 3 Tagen. Vorzugsweise kultiviert man in mehreren Stufen, d.h. man stellt zunächst eine oder mehrere Vorkulturen in flüssigem Nährmedium her, die dann in das eigentliche Produktionsmedium, z.B. im Verhältnis 1:20, überimpft werden.
Die Isolierung erfolgt auf physiko-chemischem Wege mittels an sich bekannter Trennungsmethoden, insbesondere durch Zentrifugieren, Filtrieren, Lösungsmittel-Extraktion, Fällung, Kristallisieren und Chromatographie, vor allem Adsorptions- und Verteilungschromatographie.
Das Mycel wird aus der Kulturbrühe durch Filtrieren, gegebenenfalls unter Anwendung von Filtrierhilfsmitteln wie Kieselgur, abgetrennt und mit einem Alkohol, wie Methanol, extrahiert. Diese alkoholischen Extrakte werden mit dem Kulturfiltrat vereinigt und der Extraktion mit einem organischen, mit Wasser begrenzt mischbaren Lösungsmittel, insbesondere mit Aethylacetat oder einem halogenierten aliphatischen Kohlenwasserstoff, wie Methylenchlorid, Chloroform oder Trichloräthylen, in einem diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Verfahren, wie Gegenstromverfahren, unterworfen. Aus der organischen Lösung werden flüchtige Anteile, vor allem Lösungsmittel, durch Abdampfen entfernt. Der verbleibende Rückstand wird durch Extraktion mit einem unpolaren organischen Lösungsmittel, z.B. einem Kohlenwasserstoff, wie z.B. Heptan, gefolgt von den üblichen Reinigungsmethoden, vorzugsweise chromatographischer Natur, z.B. mittels Säulenchromatographie, z.B. auf Kieselgel, weiter gereinigt und schliesslich kristallisiert.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Verbindung I, dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm Staphylotrichum coccosporum DSM 2602 oder einen Mikroorganismus, der die gleichen Strukturgene enthält wie die für die Bildung von Verbindung I ursächlichen Strukturgene des genannten Stammes, in einem wässerigen, eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthaltenden Nährmedium aerob züchtet und Verbindung I isoliert.
In erster Linie betrifft die Erfindung eine Ausführungsform des obengenannten Verfahrens, die dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Mikroorganismus der Art Staphylotrichum coccosporum züchtet.
Eine bevorzugte Ausführungsform des obengenannten Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm Staphylotrichum coccosporum DSM 2602 oder eine Verbindung I bildende Mutante dieses Stammes züchtet.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des obengenannten Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm Staphylotrichum coccosporum DSM 2602 züchtet.
Vorzugsweise führt man die Fermentation unter den im Beispielteil beschriebenen Bedingungen durch.
Die Art Staphylotrichum coccosporum und ihr Vorkommen ist von J.Nicot und J.Meyer in Bulletin Trimestriel Societe Mycologique de France 72, 318-323 (1957) beschrieben und charakterisiert.
Mikroorganismen, die die gleichen für die Bildung der Verbindung I ursächlichen Strukturgene enthalten wie der Stamm DSM 2602, können z.B. durch Genmanipulation künstlich geschaffen werden, indem man die entsprechenden Strukturgene aus dem Stamm DSM 2602 isoliert und an geeigneter Stelle in das Genmaterial eines geeigneten, anderen Mikroorganismus einbaut. Geeignete Mikroorganismen sind solche, in die man die betreffenden Strukturgene nicht nur einbauen kann, sondern in denen diese Strukturgene auch ausgedrückt werden und in denen die gebildete Verbindung I nicht wieder abgebaut sowie, vorzugsweise, in die Fermentationsbrühe ausgeschieden wird.Solche geeigneten Mikroorganismen sind in erster Linie andcre Stämme der Gattung Staphylotrichum, insbesondce solclic der Art Staphylotrichum coccosporum, sofern sie die obengenannten Strukurgene nicht bereits besitzen.
Nach Aufklärung der Nucleotidsequenz der obengenannten Strukturgene können diese auch synthetisch hergestellt werden. Dabei besteht aufgrund der Entartung des genetischen Codes die Möglichkeit, bestimmte Nucleotidsequenzen aus drei aufeinanderfolgenden Nucleotiden, sogenannte Codons, gegen andere Codons auszutauschen, die für die gleiche Aminosäure codieren.
Verbindung I bildende Mutanten können zum Beispiel unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von chemischen Mutagenen, z.B. N-Methyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidin, erzeugt und durch Selektion nach ihren spezifischen Eigenschaften in an sich bekannter Weise isoliert werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsgutes, das Verbindungl in nachweisbarer Menge enthält und das dadurch gekennzeichnet ist, dass man den Stamm Staphylotrichum coccosporum DSM 2602 oder eine von diesem Stamm ableitbare Kultur in einem Nährmedium züchtet und das Verfahren zur Isolierung oder Reinigung von Verbindung I an geeigneter Stelle abbricht.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Verbindung I zur medizinischen Behandlung von Krankheiten bei Warmblütern einschliesslich des Menschen, insbesondere zur Behandlung von Hyperlipidämie, hauptsächlich der Typen IIa und IIb, und Atherosclerose bei Vorliegen von Hyperlipoproteinämie als Risikofaktor, insbesondere durch die Verabreichung therapeutisch wirksamer Mengen von Verbindung I. Die Dosierung bei Verabreichung an Warmblüter von etwa 70 kg Körpergewicht, wie z.B. den Menschen, beträgt 10 bis 500 mg pro Tag. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise in Form pharmazeutischer Präparate parenteral, z.B. intraperitoneal, oder bevorzugterweise enteral, wie in allererster Linie oral.
Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Präparate, die Verbindung I, insbesondere eine effektive Dosis der Verbindung I, zusammen mit einem pharmazeutischen Trägermaterial, vorzugsweise einer signifikanten Menge Trägermaterial, enthalten.
Zur oralen Behandlung kommen insbesondere feste Doseneinheitsformen, wie Tabletten, Dragees und Kapseln, in Frage, die zwischen etwa 1 und 95%, vorzugsweise zwischen etwa 10 und 90%, Verbindung I als Wirkstoff enthalten. Zur Herstellung von Tabletten und Drageekernen kombiniert man die Verbindung der allgemeinen Formel I mit festen, pulverförmigen Trägerstoffen, wie Lactose, Saccharose, Sorbit, Maisstärke, Kartoffelstärke oder Amylopektin, Cellulosederivaten oder Gelatine, vorzugsweise unter Zusatz von Gleitmitteln, wie Magnesium- oder Calciumstearat, oder Polyäthylenglykolen von geeignetem Molekulargewicht. Drageekerne überzieht man anschliessend beispielsweise mit konzentrierten Zuckerlösungen, welche z.B. noch arabischen Gummi, Talk und/oder Titandioxid enthalten können, oder mit einem in leicht-flüchtigen organischen Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen gelösten Lack. Diesen Ueberzügen können Farbstoffe zugefügt werden, z.B. zur Kennzeichnung verschiedener Wirkstoffdosen. Weiche Gelatinekapseln und andere geschlossene Kapseln bestehen beispielsweise aus einem Gemisch von Gelatine und Glycerin und können z.B. Mischungen einer Verbindung der Formel I mit Polyethylenglykol enthalten. Steckkapseln enthalten z.B. Granulate eines Wirkstoffes mit festen, pulverförmigen Trägerstoffen, wie z.B. Lactose, Saccharose, Sorbit, Mannit; Stärken, wie Kartoffelstärke, Maisstärke oder Amylopektin, Cellulosederivate und Gelatine sowie Magnesiumstearat oder Stearinsäure.
Als Doseneinheitsformen für die rektale Anwendung kommen z.B.
Suppositorien in Betracht, welche aus einer Kombination eines Wirkstoffes mit einer SuppositorienGrundmasse auf der Basis von natürlichen oder synthetischen Triglyceriden (z.B. Kakaobutter), Polyethylenglykolen oder geeigneten höheren Fettalkoholen bestehen, und Gelatine-Rektalkapseln, welche eine Kombination des Wirkstoffes mit Polyethylenglykolen enthalten.
Ampullenlösungen zur parenteralen Verabreichung enthalten Verbindung I in einer Konzentration von vorzugsweise 0,5 bis 5 % als wässerige, mit Hilfe von üblichen Lösungsvermittlern und/oder Emulgiermitteln, sowie gegebenenfalls von Stabilisierungsmitteln bereitete Dispersion.
Die nachfolgenden Beispiele illustrieren die Erfindung, ohne sie einzuschränken. Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.
Beispiel 1: Zur Herstellung des Impfmaterials für die eigentliche Produktionsfermentation überführt man den Pilz Staphylotrichum coccosporum DSM 2602 unter aseptischen Bedingungen aus einer Lyoampulle, in der Stamm aufbewahrt wird, in 5 ml eines Nährmediums (NL 153) mit der folgenden Zusammensetzung, das sich in einem sterilen Reagenzglas befindet: Hefeextrakt (Difco) 10 g/Liter Pepton (Difco) 20 g/Liter Glucose 20 g/Liter Mit der erhaltenen Suspension des Mycels impft man fünf Schrägagarkulturen ("Mycophil Agar" zu der Firma BBL [Baltimore Biological Laboratories]) an und inkubiert 5-7 Tage lang bei 250C. Diese Agar-Kulturen haben die folgende Zusammensetzung: Phyton Pepton (erhältlich durch Einwirkung des 10 g/Liter Enzyms Papain auf Sojabohnenmehl) Glucose 10 g/Liter Agar 16 g/Liter Der Inhalt einer dieser fünf Schrägagarkulturen wird anschliessend in einen 500 ml Erlenmeyer Kolben mit einer Schikane überführt, in dem sich 100 ml des obengenannten Mediums NL 153 befinden. Dieser Kolben wird auf einer Schüttelmaschine mit 250 Umdrehungen pro Minute und 50 mm Amplitude (Auslenkung) bei 25"C 48 Stunden lang bebrütet, wonach der pH-Wert der Kulturbrühe bei etwa 5,0-5,5 liegt und das zentrifugierbare Mycelvolumen ("packed mycelial volume", Zellvolumen, das durch zeh.lminütige Zentrifugation bei 1690 g bestimmt wird) etwa 10-15 % beträgt. Anschliessend werden 25 ml der Kulturbrühe unter aseptischen Bedingungen in einen 2 Liter Erlenmeyer Kolben mit 4 Schikanen überführt, der 500 ml des obengenannten Mediums NL 153 enthält. Dieser Kolben wird auf einer Schüttelmaschine mit 120 Umdrehungen pro Minute und 50 mm Amplitude bei 250C 48 Stunden lang bebrütet, wonach der pH-Wert der Kulturbrühe bei etwa 5,0-5,5 liegt und das zentrifugierbare Mycelvolumen 10-15 % beträgt.
Die auf diese Weise hergestellte Kultur eignet sich zur Animpfung der ersten 30-Liter-Vorkulturstufe. Man bereitet unter Zuhilfenahme der restlichen vier der obengenannten Schrägagarkulturen auf die vorstehend geschilderte Art genügend Kulturbrühe, um anschliessend damit einen Kleinfermenter mit 50 Liter Fassungsvermögen, der 30 Liter des obengenannten Mediums NL 153 enthält, so zu beschicken, dass die Konzentration der als Impfmaterial verwendeten Kulturbrühe darin 2,5 % (V/V) beträgt. Der Kleinfermenter ist mit 4 Schikanen und einem sechsblätterigen Turbinenrührer mit einem Durchmesser von 115 mm ausgerüstet, der sich mit 750 Umdrehungen pro Minute dreht. Während 24 Stunden werden die folgenden Fermentationsbedingungen eingehalten: Ueberdruck im Fermenter = 1 Bar, Temperatur = 250C, Belüftung = 1 Liter Luft pro 1 Liter Kulturbrühe in der Minute. Danach hat die Kulturbrühe einen pH-Wert von etwa 5 und weist ein zentrifugierbares Mycelvolumen von 15 Volumenprozent auf. 1,5 Liter dieser Vorkultur werden unter aseptischen Bedingungen in einen anderen 50-Liter-Fermenter überführt, der 30 Liter des obengenannten Mediums (NL 153) enthält, in dem die Fermentation unter den gleichen Bedingungen wie in dem ersten 50-Liter-Fermenter durchgeführt wird.
Anschliessend werden 15 Liter der Vorkultur in einen 500-Liter-Fermenter überführt, der 300 Liter eines Nährmediums (NL 19r) mit der folgenden Zusammensetzung enthält: Sojamehl (15% Fettgehalt) 40 g/Liter Mannit 40 g/Liter SAG 471 (Silicon Antischaummittel 0,1 g/Liter von Union Carbide) Dieser 500-Liter-Fermenter ist mit einem sechsblätterigen Turbinenrührer mit einem Durchmesser von 23 cm und mit 4 Schikanen ausgerüstet. Die Fermentation wird 78 Stunden lang unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Temperatur = 250C, Belüftung = 1 Liter Luft pro 1 Liter Kulturbrühe in der Minute, Ueberdruck = 1 Bar. Danach weist die Kulturbrühe einen pH-Wert von 5,7 und ein zentrifugierbares Mycelvolumen von 37 Volumenprozent auf.
120 Liter der erhaltenen Kulturlösung werden unter Zusatz von Dicalite als Filtrierhilfsmittel filtriert. Das feuchte Mycel wird mit 55 1 Methanol verrührt und filtriert. Das Mycel wird mit frischem Methanol nachgewaschen und verworfen. Der methanolische Extrakt wird konzentriert und mit dem oben erhaltenen Kulturfiltrat vereinigt. Nach Erhöhung des pH-Wertes von 5,5 auf 7,0 wird das Filtrat in einer Gegenstromextraktionsapparatur (WESTFALIA Typ EG 1006) im Verhältnis von 1:1 mit Essigester extrahiert. Die teilweise emulgierte wässerige Phase wird bei pH 4,5 mit Essigester nachextrahiert und verworfen. Die organischen Extrakte werden konzentariert, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und weiter eingeengt, worauf ein rotbraunes zähflüssiges Oel zurückbleibt, welches mehrmals mit Heptan digeriert wird. Der heptanunlösliche Rückstand wird in Aether gelöst und am Rotationsverdampfer erneut zur Trockne eingedampft, wobei ein braunes Pulver erhalten wird, welches im Dünnschichtchromatogramm auf Kieselgel (Schichtdicke 0,25 mm, Lieferfirma der DC-Platten: Merck, Darmstadt, Deutschland) einen Hauptfleck mit den Rf-Werten 0,4 (Methylenchlorid/2-Propanol = 9/1) oder 0,45 (Chloroform/Methanol = 9/1) aufweist.
105 g des braunen Pulvers werden auf eine Säule (10 x 120 cm) mit 4,2 kg Kieselgel MERCK aufgetragen. Die Elution erfolgt mit Methylenchlorid mit steigenden Konzentrationen von 2-Propanol (2-10 %) wobei Fraktionen zu je 1 Liter gesammelt und mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie bewertet werden. Die vereinigten Fraktionen 19-29 enthalten Verbindung I in dünnschichtchromatographisch fast reiner Form. Das orange-gelbe Pulver wird in der 6fachen Menge (G/V) Ether/ Methylenchlorid = 9/1 unter leichtem Erwärmen aufgelöst und nach Einsetzen der Kristallisation über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt. Die feinen beigefarbenen Kristalle werden abgenutscht, mit kaltem Ether gewaschen und getrocknet. Durch Wiederholen der analogen Behandlung mit den Mutterlaugen können weitere Mengen Verbindung I in kristalliner Form erhalten werden. Die beiden Kristallfraktionen werden nochmals umkristallisiert und im Hochvakuum bei Raumtemperatur über Nacht getrocknet.
Smp. = 102,5 (Beginn des Sinterns) -108°C, 20 tu] = +90+ 1 (Chloroform: c = 1,261), C14H17N05 (279,294) Ber. C 60,21 H 6,14 N 28,7 0 5,002 Gef. C 60,2 H 6,1 N 28,7 0 5,1 IR (Methylenchlorid): 2,81, 2,89, 3,48, 5,75, 5,94, 5,99 (Schulter), o,18, 6,32, 7,30, 7,84, 8,00, 8,17, 8,80, 9,05, 9,42, 10,18, 11,78µ.
IR (KBr): 2,95, 2,90 (Schulter), 3,35, 3,39, 3,46, 3,51, 5,80, 5,95, 6,02, 6,20, 6,30, 7,01, 7,07, 7,18, 7,23, 7,78, 7,96, 8,11, 8,22, 8,81, 9,00, 9,22, 9,35, 10,05, 10,22, 11,97, 11,84, 13,21 µ 13 (CDCl3): 6= 13,3 (CH2-CH3), 23,1 (CH2-CH3), 57,2 (C-5), 62,2 (O-CH3), 64,6 (C-4), 73,7 (C-10), 86,4 (=CH2), 120,6 (C-8), 128,2 (C-6), 143,7 (C-3), 151,1/152,6 (C-7 bzw. = CH-CH2-CH3), 167,6 (C-1), 197,2 (C-9).
Beispiel 2: 250 g Verbindung I wird mit 550 g Lactose und 292 g Kartoffelstärke vermischt, die Mischung mit einer alkoholischen Lösung von 8 g Gelatine befeuchtet und durch ein Sieb granuliert.
Nach dem Trocknen mischt man 60 g Talk, 10 g Magnesiumstearat und 20 g kolloidales Siliciumdioxid zu und presst die Mischung zu 10'000 Tabletten von je 119 mg Gewicht und 25 mg Wirkstoffgehalt, die gewünschtenfalls mit Teilkerben zur feineren Anpassung der Dosierung versehen sein können.
Beispiel 3: Aus 100 g Verbindung I, 379 g Lactose und der alkohol lischen Lösung von 6 g Gelatine stellt man ein Granulat her, das man nach dem Trocknen mit 10 g kolloidalem Silicumdioxid, 40 g Talk, 60 g Kartoffelstärke und 5 g Magnesiumstearat mischt und zu 10'000 Drageekernen presst. Diese werden anschliessend mit einem konzentrierten Sirup aus 533,5 g krist. Saccharose, 20 g Schellack, 75 g arabischem Gummi, 250 g Talk, 20 g kolloidalem Siliciumdioxid und 1,5 g Farbstoff überzogen und getrocknet. Die erhaltenen Dragees wiegen je 150 mg und enthalten je 10 mg Wirkstoff.
Beispiel 4: 25 g Verbindung I und 1975 g fein geriebene Suppositoriengrundmasse (z.B. Kakaobutter) werden gründlich gemischt und dann geschmolzen. Aus der durch Rühren homogen gehaltenen Schmelze werden 1000 Suppositorien von 2 g gegossen. Sie enthalten je 25 mg Wirkstoff.

Claims

Ansprüche: 1. 4slo-Dihydroxy-2-methoxy-3-methylen-6(z)-propyliden-2-azaspiro[4s5] dec-7-en-1,9-dion der Formel I, in der die absolute Konfiguration willkürlich angegeben ist, in der durch Züchtung des Stammes Staphylotrichum coccosporum DSM 2602 erhältlichen absoluten Konfiguration.
2. Die Verbindung nach Anspruch 1 zur Verwendung in einem Verfahren -zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.
3. Die Verbindung nach Anspruch 1 zur Verwendung als lipidsenkendes Mittel.
4. Pharmazeutische Präparate, die die Verbindung der Formel I nach Anspruch 1 zusammen mit einer signifikanten Menge eines pharmazeutischen Trägermaterials enthalten.
5. Verwendung der Verbindung der Formel I nach Anspruch 1 zur Behandlung von Hyperlipidämie oder Atherosclerose.
6. Verwendung der Verbindung der Formel I nach Anspruch 1 zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten.
7. Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm Staphylotrichum coccosporum DSM 2602 oder eine von diesem Stamm ableitbare Kultur in einem Nährmedium züchtet und die Verbindung der Formel I isoliert.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm DSM 2602 oder eine Kultur, die die für die Durchführung des Verfahrens wesentlichen Merkmale des Stammes DSM 2602 aufweist, züchtet und die Verbindung der Formel I isoliert.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als ableitbare Kultur eine Kultur verwendet, die Mikroorganismen der Gattung Staphylotrichum, welche zur Produktion der Verbindung der Formel I befähigt sind, enthält.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Kultur verwendet, die Mikroorganismen der Art Staphylotrichum coccosporum, welche zur Produktion der Verbindung der Formel I befähigt sind, enthält.
11. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm Staphylotrichum coccosporum DSM 2602 oder einen Mikroorganismus, der die gleichen Strukturgene wie die für die Bildung der obengenannten Verbindung der Formel I ursächlichen Strukturgene des genannten Stammes oder ein wegen der Entartung des genetischen Codes mögliches Aequivalent dieser Strukturgene enthält, in einem eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthaltenden Nährmedium züchtet und die Verbindung der Formel 1 isoliert.
12. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm Staphylotrichum coccosporum DSM 2602 oder einen Mikroorganismus, der die gleichen Strukturen enthält wie die für die Bildung der Verbindung der Formel I ursächlichen Strukturgene des genannten Stammes, in einem wässerigen, eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthaltenden Nährmedium aerob züchtet und die Verbindung der Formel I isoliert.
13. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm Staphylotrichum coccosporum DSM 2602 oder eine zur Produktion der Verbindung der Formel 1 befähigte Mutante dieses Stammes züchtet.
14. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm Staphylotrichum coccosporum DSM 2602 züchtet.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 7-10 und 13-14, dadurch gekennzeichnet, dass man in einem wässerigen, eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthaltenden Nährmedium aerob züchtet.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass man das Nährmedium bei einer Temperatur zwischen 15QC und 400C kultiviert.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass man bei einer Temperatur zwischen 220C und 300C kultiviert.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 16-17, dadurch gekennzeichnet, dass man die Nährlösung 1 bis 10 Tage lang kultiviert.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass man 3 Tage lang kultiviert.
20. Die nach dem Verfahren des Anspruchs 19 erhältliche Verbindung.