DD201321A1 - Verfahren zur herstellung von epsilon-isorhodomycinon - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von epsilon-Isorhodomycinon, einer Vorstufe von Anthracyclin-Antibiotica, die fuer die Chemotherapie von Tumar-, Virus- und durch Bakterien hervorgerufenen Erkrankungen bei Mensch und Nutztier von potentiellem Nutzen sind. Der zur Herstellung des epsilon-Isorhodomycinon verwendete Mikroorganismus ist eine Mutante der Art Streptomyces violaceus und traegt die Bezeichnung ZIMET 43649. Ziel der Erfindung ist die Gewinnung einer Vorstufe eines Antibioticums mit potentiell cancerostatischen, antiviralen und antibakteriellen Eigenschaften als Ausgangssubstrat fuer Halbsynthese und Mutasynthese, um die Palette derartiger Pharmaca zu erweitern. Die Aufgabe wird dadurch geloest, dass durch aerobe Submersfermentation des Stammes ZIMET 43649 der Art Streptomyces violaceus in Medien mit geeigneten C-, N-Quellen und Mineralsalzen epsilon-Isorhodomycinon gebildet, mit geeigneten Methoden aus dem Mycel isoliert und nachfolgend gereinigt wird.

Description

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Titel der Erfindung

Verfahren zur Herstellung von epsilon-Isorhodomycinon

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von epsilon-Isorhodomycinon auf mikrobiologischem Wege_e Epsilon-Isorhodomycinon ist eine Vorstufe verschiedener antibiotisch wirksamer Substanzen die bei der Chemotherapie von Tumor-, Virus- und durch Bakterien hervorgerufener Erkrankungen bei Mensch- und Nutztier von potentiellen Nutzen sind»

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß epsilon-Isorhodomycinon von folgenden Mikroorganismen-Arten neben einer Vielzahl anderer Anthracyclinone und Anthracycline in Spuren gebildet wird. In allen Fällen sind aus den gebildeten Gemischen von Anthracyclinen und Anthracyclinonen Einzelkomponenten für detailliertere Struktur-Wirfeungsuntersuchungen gar nicht oder nur in geringsten Ausbeuten mit Hilfe großtechnisch schwer realisierbarer Trennverfahren zu gewinnen« Epsilon-Isorhodomyoinone sind bisher in Fermentationslösungen folgender Anthracyclin-Bildner identifiziert worden: Streptomyces purpurascens (Brockmann und Franck, 1955. Ohem« Beri' 88, 1792«#1818; Brock« mann und Boldt, 196I, Chem· Ber., ^Ht₉ 2174^2187)· Actinomyces roseoviolaceus A 529 (IFO 13O8I) (Yoshimoto et al*, 1980_# J₀ Antibiotics,

Ziel der Erfindung

Die Erfindung dient der ökonomisch günstigen Herstellung von epsilon-Isorhodomycinon«

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Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, epsilon-Isorhodomycinon nach einem Verfahren herzustellen, das die Nachteile der bekannten Verfahren vermeidet« Überraschend wurde gefunden, daß ein durch Mutagenese aus einer Population des Streptomyces violaceus selektierter Mikroorganismus es gestattet, epsilon-Isorhodomycinon aus leicht zugänglichen und billigen Ausgangsstoffen in guten Ausbeuten herzustellen·

Unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen wird in einem flüssigen Nährmedium mit entsprechenden Kohlenstoff-, Stickstoffquellen und Mineralsalzen der genetisch modifizierte Mikroorganismus oder seine Varianten gezüchtete Der Mikroorganismus, der in diesem Verfahren Anwendung findet, ist unter der Registriernummer ZIMBT 43 649 i& der ZIMET-Hinterlegungssteile für Mikroοrgan 1,smen, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR, 6900 Jena, Beutenbergstraße 11, hinterlegt worden«

Die Kultivierung des Stammes ZIMST 43 649 sowie seiner Mutanten und Varianten erfolgt unter aeroben Bedingungen· An Erde lyophil getrocknetes Sporenmaterial bzw* an Glucose-Gelatine (5%ig) lyophilisierte Mycelfragmente werden in geeignete Agarnährböden und nachfolgend in flüssige, vorher sterilisierte Nährmedien geimpft und das entstehende Mycel wird in an sich bekannter Weise bei einer Temperatur zwischen 23 und 37 0, vorzugsweise 28 ⁰O, über einen Zeitraum von 2 bis 6 Tagen, vorzugsweise 4 Tagen, bei einer Acidität kultiviert, die zu Beginn des Permentationsprozesses zwischen pH 6,2 und pH 7»0 und am Ende des Prozesses zwischen pH 7,5 und pH 8,3 liegt· Das Nährmedium besteht aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, sowie aus anorganischen Salzen» Als Kohlenstoffquellen können Stärke, Glukose, Glyzerin, Dextrin, Mannit, Saccharose, Sojaöl und Sojamehl verwendet werden«, Als Stickstoff quellen kommen außer den obenerwähnten stickstoffhaltigen Substraten auch" Trockenhefe, Fleischpepton und Casein in irage«

Gute Ergebnisse können bei Zusatz von Mineralsalzen erzielt werden· Letztere begünstigen den Verlauf der Fermentation in

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Abhängigkeit vom eingesetzten Nährmedium· In komplexen Medien, die verschiedene Mehle enthalten, haben sich Zusätze von Kalziumkarbonat, Na-Phosphafc bzw» Kalium-^Phosphat als vorteilhaft erwiesen* Die Fermentation des Stammes ZIMBT 43 649 ^ann in Steilbrustflaschen und Rundkolben verschiedenen Inhalts, im Glasfermenter sowie in V2A-Tanks durchgeführt werden·

Die Isolierung der Anthracyclin-Vbrstufe epsilon-Isorhodo-mycinon wird in der Weise durchgeführt, daß das Anthracyclinon aus dem Mycel mit organischen Lösungsmitteln bei pH 5 extrahiert, nach Konzentrieren der Extrakte mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln reextrahiert und aus den Extraktkonzentraten durch Versetzen mit Petroläther unter Rühren ausgefällt, vom Lösungsmittel durch KLltration befreit, mit Petrol« äther gewaschen, nachfolgend in Chloroform gelöst und säulenchromatografisch gereinigt wird·

Epsilon-Isorhodomycinon ist eine aus Benzol/Aceton auskristallisierbare, dunkelrote Substanz, die sich gut in Aceton, niederen Alkoholen, Eisessig, Benzol und Chloroform, dagegen nicht in Petroläther oder Wasser löst» Das Anthracyclinon besitzt Indikatoreigenschaften und ist in sauren Lösungen rot, in al~ kalischen blauviolett· Der Schmelzpunkt der Substanz liegt zwischen 220 und 226 ⁰O. Aus dem hochaufgelösten Massenspektrum ergibt sich die Summenformel ^ö22^H20°16· ®^&3 Molekulargewicht beträgt: gefunden 444,1148; berechnet 444,1056 (Massenspektrum)· Die dünnschichtchromatografische Charakterisierung auf Kieselgel-Polien ergab im Laufsystem Chloroform: Aceton = 10:1 einen Rf-Wert von 0>60· Dagegen erhält man einen Rf-Wert von 0,15» wenn als Trägermaterial Kieselgel 60 nach Pufferung mit 0,5 η NaHCOo und als Laufsystem Chloroform: Aceton a 1:1 verwendet werden* Die Absorptions-Maxima im ultravioletten Spektralbereich Jl ^_8x in Chloroform/Oyclohexan a 1:10 liegen bei 492 (934-5), 512 (14721), 523 (17665), 550 (17409), 565 (20354)nnu Das IR-Spektrum (in KBr) zeigt; charakteristische Maxima bei 1595 (Chinonearbonyl) und 1734 (COOCH₃) om""¹·

Hierdurch und auf Grund des hochaufgelösten Massenspektrums

mit der charakteristischen Fragmentierung m/z 444 (M⁺) sowie 428, 426, 408, 384, 376_? 355* 349* 339* 33S₉ 337* 310 wurde die aus der Bausteinaiialyse angenommen© Struktur des epsilon·» Isorhodomycinon bestätigt (Brocbmana und Boldt 1961, Ghenu ^Ber·! J2ä» 2174; Brockmami und Wimmer 1965$ Ghem« Ber», $5₉ 2797; Brookmann, Jr « et al«,₈ 1965«; Caem· Ber© $Q_S 1260; Reed und Reid 1963; Tetrahedron^ ^₈ 1817; Brockmann et al·' 1968, Tetrahedron Lett_ea 4719)5

Ausführungsbeispiele

1« Zwei 500 ml-SfceiXbrusfcflaschen enthalten je 80 ml des folgen« den Vorzuchtmediumss

Glukose '1,5 %

Sojamehl 1,5 %

Ha-Ohlorid O_S5 % Oa-Karbonat 0,1 %

Primäres K-Phosphat 0_?03 %

Xn Leitungswasser

Sterilisierung $ 35 Min_ö bei 110 ⁰Ce, Nach Sterilisierung liegt die Acidität bei pH 6_g3.©

Jede Steilbrustflasche wird mit einer Sporen-« bzw« Mycelsuspension beimpft _$ welche mit steriler^ isotonischer Kochsalzlösung von einer im Reagenzglas auf folgendem Anzucht-Nährboden ge zucht et en j, 10 bis 14 Tage alten Kultur, des Stammes ZIMEO? 43 649 hergestellt wird?

Hafermehl 1,0 %

Haferflocken^

gemahlen 1₈.0 %

Agar-Agar . 2,0 %

is Leitungswasser Sterilisierungs 35 Min© bei 120 °0_s natursauer* Die beimpften Vorzuchfc-Kultuxen werden 48 Std_e bei 28 ⁰G auf einer Schüttelmaschine mit einer Frsquena von 180/Min« bebrütetο 8 ml einer so Gebrüteten VorzuchtkuTbur dient

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zur Beimpfung von 500 ml-Steilbrustflaschen, die je 80 ml des folgenden Produktionsmediums enthalten;

Glukose 2^0 %

Sojamehl 2,0 %

Na~0hlorid 0,5 %

Oa-Karbonat 0,3 %

in Leitungswasser

Sterilisierung: 35 Min* bei 115 ⁰O, pH 6,3* Die Temperatur während der Fermentation liegt vorzugsweise bei 28 ⁰O und die Schüttelfrequenz bei 180/Min·

Nach 96stündiger Fermentation wird der höchste Gehalt an Anthracyclinon erreicht (80 mg/1)·

2» Man verfährt wie im 1. Beispiel mit dem Unterschied, daß das Produktionsmedium wie folgt zusammengesetzt ist:

Glukose	1,0 %
Stärke	1,0 %
Sojamehl	1,0 %
Bäckerhefe	0,5 %
Na-Ohlorid	0,5 %
Oa-Karbonat	0,3 %

in Leitungswasser Sterilisierung: 40 Min· bei 116 ⁰O, pH 6,2«

Mit einer Kultur des Stammes ZIMET 43 649 von einem festen Nährboden wie im 1# Beispiel beschrieben, beimpft man 80 ml des in Beispiel 1 angeführten flüssigen Vorzucht-Mediums, welches in einer 500 ml-Steilbrustflasche enthalten ist» Man bebrütet 24 Std· bei 28 ⁰O auf einem Schüttelgerät mit einer Frequenz von 180 U/Min» 12 ml der so erhaltenen Kulturbrühe dienen zur Beimpfung von 400 ml des gleichen Vorzucht-Mediums, welches in einem 2 1-Glaskolben enthalten ist. Man bebrütet weitere 24 Stdi bei 28 ⁰O und bei einer Schüttelfrequenz von 180 U/Min» , ehe die so erhaltenen 400 ml Kulturbrühe zur Beimpfung von 20 1 des im Beispiel 1

beschriebenen Produktionsmediuais dienen« Letzteres ist in einem 32 l«~Glasfermenter enthalten« Während der Fermentatio die mit einer Rührgesehwindigkeit von 400 U/Min® und mit einer Luftzufuhr von 15 i/Min_e ausgeführt wurde, wird die Schaumbildung durch Zusafcs kleiner Mengen von Sonnenblumenöl oder anderer^ silikonnaltlger Sehaumschutzmittel kontrolliert© 20 1 Kulturlösung werden mit Salzsäure auf einer pH-Wert 5_?0 eingestellt und nach Separieren des Mycels wird das erhaltene Kulturfilfcrat verworfene Das Mycel wird 4 mal mit Methanol extrahiert_s im Vakuum bis.zur wässrigen Phase eingeengt_$ mit Wasser verdünnt und nachfolgend mit Chloroform erschöpfend reextrahiert© Der R.eexferakt wird nach Trocknen über Na₂SO,, im Vakuum eingeengt₉ nachfolgend in wenig Chloroform aufgenommen und mit einem 10- bis 20*. fachen Überschuß an Petroläther präsipitiert» Das ausgefallene Rohprodukte wird abgesaugt und mit Petroläther gewaschen« Das gewonnene Rohprodukt isfe von 87%iger Reinheit bei einer Ausbeute von 92₈8 mg/Liter Fermentationslösung» Es enthält ein Gemisch von epsilon-jRhodomycinon und epsilon-Isorhodomycinon im Verhältams 1s1₀ Gehalt des Rohproduktes und die prozentuale Zusammensetzung des AgIykongemisches wurden UV-spektroskopisch bestimmt«, Einmalige Säulenchromatografie an gepuffertem (saurem oder alkalischem) Kieselgel mit Chloroform 'bsw» Chloroform/Methanol im Verhältnis 20g1 bis 1s1 ergibt 60 mg epsilon-Ehodomycinon/epsilon«"Isorhodomycinon~Gemisoh pro Liter Kulturlösunge, Beide Aglykone liegen in dem Gemisch zu je 50 % vorβ Die Isolierung von reinem epsilon-Isorhodomycinon aus dem Gemisch gelingt durch Abtrennen von epsilon-Rhodomycinon durch mehrmalige Säulenchromatografie an NaHCO..««gepuffertem Kieselgel mit Chloroform/Methanol im Verhältnis 1sO bis 1s1_o

Die Isolierung von reinem epsilon-Rhodomycinon aus dem Gemisch ist demgegenüber äußerst schwierig und gelingt durch entsprechende Säulenchromateogrs,fie nur mit erheblichen AusbeuteverlusteHö

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4· Das Verfahren unterscheidet sich von demjenigen des 3· Beispiele dadurch, daß der Stamm ZIMBT 43 649 nach Vorzucht in einem 2 1-Glaskolbeh anstatt in einen 32 1-Glasfermenter in einen 400 1 V2A-Tank überimpft wird, der das im 1· Beispiel beschriebene Produktionsmedium enthält· Die Rührgeschwindigkeit beträgt 280 U/Min· und die Luftzufuhr wird auf 400 1/Min, eingestellt. Aus 350 1 Kulturlösung werden nachdem im 3· Beispiel beschriebenen Verfahren 80 mg reines epsilon-Rhodomycinon/epsilon-Isorhodomycinon-Gremisch pro Liter gewonnen, aus dem das epsilon-Isorhodomycinon in der im 3· Beispiel beschriebenen Weise abgetrennt werden kann»

Die Vorteile des Herstellungsverfahren für epsilon-Isorhodo« mycinon bestehen in

- der einfachen Gewinnung einer Vorstufe von potentiell cancerostatisch wirksamen Anthracyclin-Antibiotioa, die mit Hilfe von Partialsynthese und Mutasynthese zu neuen Anthracyelin-Antibiotioa führen kann, die bisher einer therapeutischen Wirkungsprüfung bzw· der Struktur-Wirkungs-Untersuchung nicht zugängig waren

- der Erweiterung der Palette von Mikroorganismen-Mutanten, die bevorzugt, eine Vorstufe (Anthracyclinon) von Anthracyolin-Antibiotica als Einzelkomponente synthetisieren und im Mycel akkumulieren können

- der Anwendung einer durch Mutagenese erhaltenen, Mutante des Streptomyoes violaoeus. Stamm ZIMET 43 649, die bevorzugt ein Gemisch von epsilon-Bhodomycinon und epsilon-Isorhodomyoinon zu bilden vermag, aus dem die Einzelkomponente epsilon-Isorhodomycinon leicht und in überraschend hoher Ausbeute rein abgetrennt werden kann, so daß sich der sonst bei Isolierung von Anthracyclinen und Anthracyclinoneη übliche Aufwand bei Trenn- und Reinigungsoperationen stark verringert

im dem Verfügbarmachen einer bisher nicht auf mikrobiologischem Wege in ausreichendem Maße produzierbaren Vorstufe jßür unterschiedliche epsilon-Isorhodomycinon-Gly·· koside, deren Erprobung in der Krebschemotherapie bisher

infolge feialender Herstellungsverfahren nicht möglich war

dem Verfügbarmachen eines Msher für die Mutasynthese, die Biokonversion und/oder Halbsynthese nicht vorhandenen An«· thracyclinonSf mit dessen Hilfe weitere₈ biomodifizierte Strukturderivafce der Anthra©y®llo.«Antibiotica hergestellt und bezüglich, ihrer therapeutisch^toxikologisohen Wirkungen untersucht werden können

der überraschend hohen Ausbeute an Anthracyclinon im Vergleich zu anderen bekannten Anthracyolinon—Herstellungsver-» fahren bei gleichzeitigem Einsatz billiger Binsatzstoffe für die Fermentation«»·

Claims (1)

1. 9-·. 234896 O

   Erfindungsanspruch

   Verfahren zur Herstellung von epsilon^Isorhodomycinon auf mikro«* biologischem Wege, gekennzeichnet dadurch, daß eine Mutante des Streptomyces violaceuA« Stamm ZIMBG? 43 649, unter aeroben Bedingungen in flüssigen Nährmedien, die eine Kohlenstoff«· und Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten, bei einer lempe« ratur zwischen 25 und 37 ⁰O, während eines Zeitraumes von 2 bis 6 Tagen kultiviert wird und das gebildete epsilon-Isorhodo«* mycinon aus dem Myoel bei einer Acidität zwischen pH 3 und pH 9» mittels üblicher Lösungsmittel extrahiert wird, nachfolgend mit üblichen Methoden konzentriert, ausgefällt und chromatografisch gereinigt wird·