DD201322A1 - Verfahren zur herstellung von epsilon-rhodomycinon - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von epsilon-Rhodomycinon, einer Vorstufe von Anthracyclin-Antibiotica, die fuer die Chemoherapie von Tumor-, Virus-- und durch Bakterien hervorgerufenen Erkrankungen bei Mensch und Nutztier von chemotherapeutischem Wert sind. Der zur Herstellung des epsilon-Rhodomycinons verwendete Mikroorganismus ist eine antibiotica-geblockte Mutante der Art Streptomyces griseus und traegt die Bezeichnung Zimet 43 665. Ziel der Erfindung ist die oekonomische Herstellung von epsilon-Rhodomycinon als Vorstufe fuer Anthracyclin-Antibiotica mit potentiell cancerostastischen, antiviralen und antibakteriellen Eigenschaften. Die Aufgabe wird dadurch geloest, dass durch aerobe Submersfermentation des Stammes ZIMET 43 665 der Art Streptomyces griseus in Medien mit geeigneten C-, N-Quellen und Mineralsalzen epsilon-Rhodomycinon gebildet, mit geeigneten Methoden aus dem Mycel isoliert und nachfolgend gereinigt wird.

Description

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Titel der Erfindung

Verfahren zur Herstellung von epsilon-Rhodomycinon

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von epsilon-Bhodomycinon auf mikrobiologischem Wege, Epsilon-Rhodomycinon ist eine Vorstufe verschiedener antibiotisch wirksamer Substanzen, die bei der Chemotherapie von Tumor-, Virus- und von Bakterien hervorgerufenen Erkrankungen¹ bei Mensch und Nutztier von potentiellem Nutzen sind«

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß epsilon-Rhodomycinon neben einer Vielzahl anderer Anthracyclinone und Anthraoyline in 6 oder 7 verschiedenen Streptomyceten-Arten gebildet wird» In allen Fällen sind aus den gebildeten Gemischen von Anthracyclinonen und Anthracyclinen Einzelkomponenten für detaillierte Struktur-Wirkungs-Untersuchungen gar nicht oder nur mit geringsten Ausbeuten mit Hilfe großtechnisch schwer realisierbarer Trennverfahren zu gewinnen·

Epsilon-Rhodomycinone sind bisher in fermentationslösungen folgender Mikroorganismen-Arten identifiziert worden: Streptomyces purpurasoens (Brockmann und Pranck, 1955, Chem· Ber. 88, 1792)

. Str.eptomyces peucetius (DiMarco and Arcamone, 1975· Arzneimittelforsch· 25, 368-375)

Streptomyces coeruleorubidus (Blumauerova et al·, 1978» Folia Microbiol., £3, 255-260) <

Streptomyces griseoruber 4620 (Podojil et al._f.1980 Folia Mikrobiol., £5, 464)

Streptomyces violaceus (Fleck et al_os 1973« DDR-WP 100 494) Actinomyces roseoviolaceus (loshimoto et al«,' 1980«» J_e Antibiotics, 33., 1150)

Streptomyces spec. J_e 14 (Mc Guire et al», 1980«, Antimicrob. Agents Chemother. 1_8, 454~69)®

Es ist dartiberhinaus beschrieben worden, daß epsilon-Rhodomycinon als Ausgangsmaterial für Partialsynthesen (Lin et al., 1980. J₄ Med. Chem., 2J3j 1242-44) und die Mutasynthese (Matsuzawa et al», 1980« J_e Antibiotics_? ^3.5 1341-47) eingesetzt werden kann. Voraussetzung dafür ist die ökonomische Herstellung des epsilon-llhodomyeinons, die mit Hilfe der bisher bekannten Verfahren nicht möglich ist«,

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat die ökonomisch günstige Herstellung von epsilon-Rhodomyeinon zum Ziele

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zn Grunde, epsilon-Rhodoraycinor nach einem Verfahren herzustellen^ das die Nachteile der bekannten Darstellungsweisen vermeidet« Überraschend wurde gefunden^ daß ein durch Mutageneae aus einer Population des Streptomyces griseus JA 3933 selektierter antibioticageblockter Mikroorganismus es gesta-tfet_s epsilon-Rhodomyeinon aus leicht zugänglichen und billigen Einsatzstoffen in guten" Ausbeuten herzustellen®

Unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen wird in einem flüssigen Nährmedium mit entsprechenden Kohlenstoff-, Stickstoffquellen und Mineralsalzen der genetisch modifizierte Mikroorganismus oder seine Varianten gezüchtet® Der Mikroorganismus, der in diesem Verfahren Anwendung findet, ist unter der Regiatriernummer ZIlET 43 665 in der ZIWEET Hinterlegungs-

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stelle für Mikroorganismen, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissensohaften der DDH, 69 Jena, Beutenbergstraße 11, hinterlegt worden.

Die Kultivierung des Stammes ZIMET 43'665 sowie seiner Varianten erfolgt unter aeroben Bedingungen. An Erde lyophil getrocknetes Sporenmaterial bzw. an Glucose/Gelatine (5#ig) lyophilisierte Mycelfragmente werden auf geeignete Agarnährböden und nachfolgend in flüssige, vorher sterilisierte Nährmedien geimpft und das entstehende Mycel wird in an sich bekannter Weise bei einer Temperatur zwischen 25 und 37 ⁰O, vorzugsweise 28 ⁰C, über einen Zeitraum von 2 bis 6 Tagen, vorzugsweise 4 Tagen, bei einer Acidität kultiviert, die zu Beginn des Fermentationsprozesses zwischen pH 6,2 und pH 7,0 und am Ende des Prozesses zwischen pH 7,5 und pH 8,3 liegt. Das Hährmedium besteht aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie aus anorganischen Salzen. Als Kohlenstoffquellen können Stärke, Glukose, Glyzerin, Dextrin, Mannit, Saccharose, Sojaöl und Sojamehl verwendet werden. Als Stickstoffquellen kommen außer den o.a. stickstoffhaltigen Substraten auch Trockenhefe, Fleischpepton und Gasein in Frage. Gute Ergebnisse können bei Zusatz von Mineralsalzen erzielt werden. Letztere begünstigen den Verlauf der Fermentation in Abhängigkeit vom eingesetzten Nährmedium. In komplexen Medien, die verschiedene Mehle enthalten, haben sich Zusätze von Kalziumkarbonat, Natrium-Phosphat bzw. Kalium-Phosphat als vorteilhaft erwiesen.

Die Isolierung der Anthracyclin-Vorstufe epsilon-Rhodomycinon wird in der Weise durchgeführt, daß das Anthracyclinon aus dem Myoel mit organischen Lösungsmitteln bei pH 5,0 extrahiert, nach Konzentrieren der Extrakte aus der wässrigen Phase mit organischen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln erneut extrahiert und aus den Extraktkonzentraten durch Versetzen mit Petroläther unter Eühren ausgefällt, vom Lösungsmittel durch Filtration befreit, mit Petroläther gewaschen, nachfolgend in Chloroform gelöst und säulenchromatografie^ gereinigt wird.

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Die auf diese Weise isolierte Substanz ist eine dunkelrote, kristalline Substanz, die sieh leicht in Aceton, Äthanol und Eisessig, mäßig in Benzol und Chloroform und wenig in Petrol» äther und Wasser löst· Der Schmelzpunkt der Substanz liegt zwischen 207 bis 211 ⁰C₈ Aus dem hochaufgelösten Massenspektrum ergibt sich die Summenformel 0₂ρ^Η2θ°9· Das Molekulargewicht beträgt: gefunden 428, 1115; berechnet 428, 1107 (Masse] spektrum). Die dünnschichtchromatografische Charakterisierung auf Kieselgelfolien ergab im Laufsystem Chloroform:Aceton = 10:1 einen Rf-Wert von 0,6O₄, Dagegen erhält man einen Rf-Wert von 0,20, wenn als !Trägermaterial Kieselgel 60 nach Pufferung mit 0,5 N NaHC0~ und als Laufsystem Chloroform:Aceton =1:1 verwendet werden. Die Äbsorptions-Maxima im sichtbaren Spektralbereich JL (E) in Chloroform/Cyclohexan = 1*10 liegen bei 471(5933), 484(6766), 496(7494), 518(5620), 534(5100) nnu Das IR-Spektrum (in KBr) zeigt charakteristische Maxima bei

—1 1598 (Chinoncarbonyl) und 1735 em , (Carbomethoxy-G-ruppe).

Hierdurch und auf Grund des hochaufgelösten Massenspektrums mit der charakteristischen Fragmentierung m/z 428;41Oj(M⁺) sowie 392;376;368;36O;357;35O;339;334;333 wurde die aus der Bausteinanalyse angenommene Struktur des epsilon-Rhodomycinon bestätigt (Brookmann und Boldt, 1961» Chem_aBer., 94, 2174; Brockmann und Wimmer, 1965«. Ch.em.Ber*, 98., 2797; Brookmann Jr. et al., 1965. Chem_eBer_e, 98* 1260; Reed and Reid, 1963« Tetrahedron, 1_9, 1817; Brockmann et al», 1968. Tetrahedron Lett., 4719)·

Ausführungsbeispiele

1. Zwei 500-ml-Steilbrustflaschen enthalten je 80 ml des den Vorzuoht-Mediumsi

G-lukose 1 ,50 *

Sojamehl 1,50 ί> natriumchlorid 0,50 % Calciumkarbonat 0,10 % primäres Kaliumphosphat 0^03'% in Leitungswasser

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Sterilisierung: 35 Min. bei 110 ⁰C. Nach der Sterilisierung liegt die Acidität bei pH 6,3.

Jede Steilbrustflasche wird mit einer Sporen- und/oder Mycelsuspension beimpft , welche mit steriler, isotonisoher Kochsalzlösung von einer im ßeagenzglas auf folgendem Anzucht-Nährboden gezüchteten 10 bis 14 Tage alten Kultur des Stammes ZIMET 43 665 hergestellt wird:

Saccharose	0,300 %
Dextrin	1,500 $
Harnstoff	0,010 $
Hefeextrakt	0,100 Ί»
Pepton (bakt.)	0,500 %
Natriumchlorid	0,050 #
Eisensulfat	0,001 #
primäres Kalium-	0,050 #
Phosphat
Agar-Agar (gewaschen)	2,000 %
in Aqua destillata

Sterilisierung: 40 Min. bei 116 ⁰C. Nach der Sterilisierung liegt die Acidität zwischen pH 6,5 und pH 7,0. Die beimpften Vorzucht-Kulturen werden 48 Stunden bei 28 ⁰C auf einem Schütteltisch mit einer Frequenz von 180 U/Min, bebrütet. 8 ml einer so bebrüteten Vorzucht-Kultur dienen zur Beimpfung von 500 ml-Steilbrustflaschen, die je 80 ml des folgenden Produktions-Mediums enthalten:

Glukose 2,0 $

Sojamehl 2,0 $

Natriumchlorid 0,5 %

Caleiumkarbonat 0,3 #

in ι Leitungswasser

Sterilisierung: 35 Min. bei 110 ⁰C. Die Acidität beträgt nach dem Sterilisieren pH 6,3»

Die Temperatur während der Fermentation liegt bei 28 C und die Schüttelfrequenz bei 180 U/min. Nach 72 bis 96 stündiger Fermentation wird die höchste Ausbeute an epsilon-Ehodomycinon erreicht (10,5 mg Rohprodukt pro Liter Kulturflüssigkeit)*

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2, Man verfährt wie im 1, Beispiel mit dem Unterschied, daß das Produktions-Medium folgende Zusammensetzung hat:

Glukose 3,000 %

Sojamehl 3,000 #

Galciumkarbonat 0,300 %

Natriumchlorid 0,300 %

Eisenchloridhydrat 0,025 %

in Leitungswasser

Sterilisierung: 35 Min. bei 110 °G_e Die Acidität liegt nach der Sterilisierung bei pH 6_S5»

3· Man geht wie im 2· Beispiel vor mit dem Unterschied, daß de:

Anzucht-Agar, das Vorzucht- und das Produktions-Medium folgende Zusammensetzung haben:

Anzucht-Agar Saccharose 2,0 %

Trockenhefe 0,1 <fo

Natriumnitrat' 0,2 %

Magnesiumsulfat 0,2 %

sekundäres Kaliumphosphat 0,2 ί>

Agar-Agar 1 ,5 ⁰Io

in Leitungswasser

Sterilisierung: 40 Min. bei 116 ⁰C. Die Acidität liegt nach de Sterilisieren bei pH 7_?0®,

Vorzucht-Medium

Bacto-Pepton 0,60 <$>

Trockenhefe 0,30 # Calciumnitrat-

hydrat 0,05 % in Leitungswasser

Sterilisierungt 30 Min* bei 120 ⁰Cj pH'7,2 nach Sterilisieren,

Produktions-Medium

Glukose 4,00G> #

Trockenhefe 1,500 <$>

Natriumchlorid 0,200 #

Galciumkarbonat 0,100 f>

sek.Kaliumphosphat 0-100 #

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Magnesiumsulfat	0,010 la
Eisensulfat	0,001 #
Zinksulfat	0,001 #
Kupfersulfat	0,001 %
in Leitungswasser

Sterilisierungi 30 Min. bei 120 ⁰C, Glukose wird separat 20 Min. bei 110 ⁰C sterilisiert. Die Acidität liegt danach bei pH 7,0.

4. Man verfährt wie im 3. Beispiel mit dem Unterschied, daß das Vorzucht- und Produktions-Medium folgende Zusammensetzung aufweist:

Vorzucht-Medium Dextrin 3,00 #

Maisquellwasser 0,40 % Calciumkarbonat 0,30 % Ammoniumsulfat 0,10 % Casein 0,50 %

sek.Kaliumphosphat 0,01 % in Leitungswasser Sterilisierung: 35 Min. bei 120 ⁰C. Acidität nach dem Sterili

sieren: pH 7,0.	Dextrin	3,00
Produktions-Medium	Calciumkarbonat	0,60
	Maisquellwasser	0,80
	Casein	0,50
	Ammoniumsulfat	0,10
	sek.Kaliumphosphat	0,01
	in Leitungswasser

Sterilisierung:- 35 Min. bei 120 ⁰C, Acidität nach dem Sterilisieren: pH 7,0»

5. Das Verfahren unterscheidet sich von demjenigen des 2· Beispiels dadurch, daß die zu beimpfende Kultur auf folgendem halbfesten Nährboden entwickelt wird:

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Hafermehl 2,0 Agar-Agar 2_s0

in Aqua destillata

Die Sterilisierung wird in üblicher Weise durchgeführt und die Acidität liegt bei pH 7,0. Anschließend beimpft man das in Beispiel 2 beschriebene Vorzucht-Medium und mit dem so erhaltenen Impfmaterial werden 500 ml-Steilbrustflaschen beimpft, die 80 ml des wie folgt zusammengesetzten Produktions-Nährmediums enthalten:

Glukose 1,0%

Kartoffelstärke 1,0% Sojamehl 1,0 #

Trockenhefe 0,5 ί Natriumchlorid 0,5 % Calciumkarbonat 0,3 # in Leitungswasser

Sterilisierung: 40 Min. bei 110 ⁰G, Wach dem Sterilisieren liegt die Acidität bei pH 7,0,

6· Mit einer Kultur des Stammes ZIMET 43 665 von einem halbfeste Nährboden, wie im 5· Beispiel beschrieben, beimpft man 400 ml des im 1, Beispiel angeführten flüssigen Vorzucht-Mediums, welches in einem 2 1-Glaskolben enthalten ist. Man bebrütet 48 Std, bei 28 ⁰C auf einem Sehüttelgerät mit einer Frequenz von 180 U/Min, Die so erhaltenen 400 ml Kulturbrühe dienen zur Beimpfung von 20 1 des im 1« Beispiel beschriebenen Produktions-Mediums, das in einem 32 l~Glasfermenter enthalten ist· Während der Fermentation, die mit einer Sührgeschwindigkeit von 400 U/Min, und mit einer !luftzufuhr von 15 1 je Min. ausgeführt werden kann, wird die Schaumbildung durch Zusatz kleiner Mengen von Sonnenblumenöl oder anderer silikonhaltiger Schaum-Schutzmittel kontrolliert»

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7· Als Anzucht-Agar wird der im 5. Beispiel beschriebene eingesetzt, die Vorzucht in dem im 1_# Beispiel aufgeführten Medium zunächst für 24 Stunden in einer 500 ml-Steilbrustflasche mit 80 ml Inhalt und daran anschließend für weitere 24 Stunden im gleichen Medium in einem 2 1-Glaskolben mit 400 ml Inhalt durchgeführt wird,, ehe ein 400 1-V2A-Tank beimpft werden kann, der das im 1, Beispiel beschriebene Produktions-Medium enthält* Die ßührgeschwindigkeit wird auf 280 U/Min, und die Luftzufuhr auf 400 l/Min, eingestellt.

Wach Ansäuern der Kulturlösung auf pH 5,0 vermittels HCl sowie nach Abtrennen der festen von der flüssigen Phase (Kultur— filtrat/Mycel) wird das Kulturfiltrat verworfen und das Mycel 4 mal mit Methanol extrahiert, im Vakuum bis zur wässrigen Phase eingeengt, mit Wasser verdünnt und nachfolgend mit Chloroform erschöpfend reextrahiert· Der Reextrakt wird nach Trocknen über Na₂SO. im Vakuum eingeengt, nachfolgend in wenig Chloroform aufgenommen und mit einem 10 bis 20 fachen Überschuß an Eetroläther präzipitiert· Das ausgefallene Rohprodukt wird abgesaugt und mit Eetroläther gewaschen« Die Ausbeute beträgt 10,5 mg/1 Kulturflüssigkeit· Der Gehalt des Rohproduktes und die Zusammensetzung des im Rohprodukt vorliegenden Anthracyelinon-Gemisches wurden UV-spektroskopisch bestimmt· Einmalige Säulenchromatografie an gepuffertem üeselgel mit Chloroform bzw* ChloroformiAceton im Verhältnis 10:1 ergibt 4,3 mg reines epsilon-Rhodomycinon/1 Permentationsflüssigkeit» '

Claims (1)

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   Erfindungsanspruch

   Verfahren zur Herstellung von epsilon-fihodomycinon auf mikrobiologischem Wege, gekennzeichnet dadurch, daf^eine antibioticageblockte Mutante der Art Streptomypes grisens, Stamm ZIlSET 43 665, unter aeroben Bedingungen in flüssigen Nährmedien, die eine Kohlenstoff-, eine Stickstoff-Quelle sowie Mineralsalze enthalten, bei einer Temperatur von 25 bis 37 ⁰C, während eines Zeitraumes von 2 bis 6 Tagen, kultiviert und das gebildete epsilon-Shodomycinon aus dem Myoel bei einer Aoidität von pH 3 bis pH 9, 5, mittels üblicher Lösungsmittel extrahiert, nachfolgend mit üblichen Methoden konzentriert, ausgefällt und chromatografisch gereinigt wird»