DE2461138A1

DE2461138A1 - Buttersaeurederivat

Info

Publication number: DE2461138A1
Application number: DE19742461138
Authority: DE
Inventors: Julius Berger; David Pruess; James Parnell Scannell; Arthur Stempel
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1974-01-02
Filing date: 1974-12-23
Publication date: 1975-07-10
Also published as: JPS5096523A; IT1049330B; FR2256151B3; SE7416331L; FR2256151A1; DK692074A; NL7416263A

Description

PATENTANWALT * 3.

OR FRANZ LEDERER

RAU 44-10 /88k

F. Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft,! Basel/Schweiz

Buttersäurederivat

Die vorliegende Erfindung betrifft neue substituierte Butansäurederivate und Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen. Insbesondere betrifft sie die neue Verbindung 2-Amino-4- (2-aminoäthoxy)-butansäure, d.h. die Verbindung der Formel I

1 . τ

NH₂

H₂NCH₂CH₂OCh₂CH₂CHCOOH

und die pharmazeutisch verwendbaren Säureadditionssalze dieser Verbindung.Bevorzugt ist der L-Antipo.de der Verbindung der Formel I.

Das Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I ist dadurch gekennzeichnet, dass man

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a) eine Verbindung der Formel II

H₂NCH₂CH₂O

^Xc=c II

H CH-COOH

NH₂

in Gegenwart eines Katalysators reduziert, oder

b) eine Verbindung der Formel III

R₁HN-CH₂CH₂-O-CH₂-CH₂R₂ III

worin R, eine geeignete Stickstoff-Schutzgruppe darstellt und Rp Chlor, Brom oder Iod bedeutet, mit einem Alkalimetallderivat einer Verbindung der Formel IV

COOCoHr

I iv

HC-NHR,

COOC₂H₅

worin R~ eine geeignete Stickstoff-Schutzgruppe bedeutet,

kondensiert und eine vorhandene Stickstoff-Schutzgruppe in an sich bekannter Weise entfernt, oder

c) das Racemat einer Verbindung der Formel I spaltet und den L-Antipoden in üblicher Weise isoliert, oder

d) ' den bekannten Mikroorganismus Streptomyces sp. X-11085 fermentiert, oder

e) ' eine Verbindung der Formel I mit basischen Eigenschaften in ein pharmazeutisch verwendbares Säureadditionssalz überführt.

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In einer "besonderen Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird die Verbindung der Formel I hergestellt indem man beispielsweise die bekannte Verbindung L-trans-2-Amino-4-(2-aminoäthoxy)-3-butensäure, d.h. den L-Antipoden einer Verbindung der Formel

H₂NCH₂CH₂O . ß

c=c Π

H CH-COOH

NH₂

katalytisch reduziert.

Die Verbindung der Formel II ist bekannt; die Herstellung dieser Verbindung wird in der U.S.Patentschrift Kr. 3 751 459 beschrieben.

Die Umwandlung einer Verbindung der Formel II in die gewünschte Verbindung der Formel I erfolgt mittels katalytischer Reduktion. G-eeignete Reduktionssysteme für diesen Zweck sind beispielsweise Wasserstoff in Gegenwart von 5 ^igem Palladium auf Aktivkohle oder Wasserstoff in Gegenwart von 10 ^igem Platin auf Aktivkohle. Diese katalytisch^ Reduktion wird bevorzugt in Gegenwart eines inerten Lösungsmittels wie Wasser, einem nieder-Alkanol wie Methanol, Aethanol usw. oder Gemischen bestehen aus Wasser und einem nieder-Alkanol durchgeführt. Temperatur und Druck sind nicht kritisch, die Reaktion kann bei Zimmertemperatur oder oberhalb Zimmertemperatur und bei Atmosphärendruck als bevorzugte Reaktionsbedingungen durchgeführt werden.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens erhält man die Verbindung der Formel I durch Kondensation einer Verbindung der Formel III

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R₁HN-CH₂CH₂-O-CH₂-CH₂R₂ III

worin E₁ eine geeignete Stickstoff-Schutzgruppe und Rp Chlor, Brom oder Iod "bedeutet, <

mit einem Alkalimetallderivat einer "Verbindung der Formel IV

COOC₂H₅

I iv

HC-NHR₃

COOC₂H₅

worin R„ eine geeignete Stickstoff-Schutzgruppe bedeutet.

Das Alkalimetallderivat einer Verbindung der Formel IY wird in üblicher Weise hergestellt, indem man diese Verbindung mit einem Alkalimetallalkoxyd bzw. mit Natriummethoxyd oder, einem Alkalimetallhydrid wie Natriumhydrid behandelt. Die Kondensation einer Verbindung der Formel III mit einer Verbindung der Formel IV liefert eine Verbindung der Formel V

COOC₂H₅

R₁NHCH₂CH₂OCH₂Ch₂C-NHR₃ V

COOC₂H₅

worin R, und R₃ die vorstehend angegebene Bedeutung besitzen und die gleichen oder verschiedene Schutzgruppen sein können.

Geeignete Stickstoff-Schutzgruppen für die Zwecke der vorstehend angegebenen Eondensationsreaktion umfassen Acylgruppen wie Acetyl ,SuIfony!gruppen wie Tosyl oder Mesyl, die Carbobenzoxygruppe oder den Phthalimidorest. Es ist für den Fachmann selbstverständlich, dass für den Fall, in dem R.. und R-eine Phthalimidogruppe bedeuten, die Stickstoffatome kein

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Wasserstoffatom tragen.

Die Kondensation von Verbindungen der Formel III und IY kann in Gegenwart oder Abwesenheit eines Lösungsmittelsystems erfolgen. Geeignete Lösungsmittel für diese Zwecke umfassen Alkohole wie Methanol, Aethanol usw., Aether wie Tetrahydrofuran und Dimethylformamid (DME), wobei Dimethylformamid das bevorzugte Lösungsmittel darstellt. Wenn R_? Chlor bedeutet, ist es von Vorteil AlkaüjoäLd dem Reaktionsgemisch zu zusetzen, um · so das Chlorid durch das reaktivere Iodid zu ersetzen. Diese Reaktion wird bei erhöhter Temperatur durchgeführt, wobei ein Temperaturbereich von ungefähr 120 bis ungefähr 160° bevorzugt ist.

Die Schutzgruppen, die in einer erhaltenen Verbindung der Formel V vorhanden sind, werden entfernt und man erhält D,L-2~Amino-4-(2-aminoäthoxy)-butansäure. Die Entfernung der Schutzgruppen erfolgt in an sich bekannter Weise. Beispielsweise wird eine Verbindung der Formel V, worin die Schutzgruppen Phthalimidogruppen sind, mit wässeriger Mineralsäure wie beispielsweise Chlorwasserstoffsäure behandelt, und so die Hydrolyse der Phthalimidogruppen bewerkstelligt. Sind die Schutzgruppen in einer Verbindung der Formel V beispielsweise Carbobenzoxygruppen so wird diese Stickstoff-Schutzgruppe entweder durch Hydrogenolyse oder durch Behandeln mit Bromwasserstoff in Eisessig"entfernt. Ist die Stickstoff-Schutzgruppe beispielsweise eine Tosylgruppe so lässt sich diese beispielsweise durch die reduktive Spaltung mit Natrium in flüssigem ' Ammoniak entfernen.

In einer weiteren Ausführungsform wird die racemische Verbindung, die beispielsweise nach den vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, einer Racematspaltung unterworfen. Zu diesem Zweck wird das Racemat zuerst diacyliert. Man behandelt lie D,L-2-Amino-4-(2-aminoäthoxy)-butansäure mit konventionellen

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Acylierungsmitteln wie beispielsweise Essigsäure-Anhydrid, Acetylchlorid, Chloracetylchlorid usw. Das diacylierte Produkt, das man so erhält wird mit einer geeigneten Acyläse wie beispielsweise Schweinenieren-Acylase, die die racemische Verbindung in ein Gemisch von D und L Verbindungen spaltet, behandelt. Die L-Verbindung der Formel I und der entsprechende L-Antipode lassen sich dann gewinnen, indem man die D und L-Verbindungen aus dem Gemisch, das infolge der Acylase-Inkubation erhalten wurde, abtrennt. Die Acy!gruppen werden dann' durch Säurehydro- · lyse, indem man beispielsweise wässerige Chlorwasserstoffsäure verwendet, entfernt. Schliesslich wird die L-Verbindung der Formel I kristallisiert und man erhält die Verbindung dann als Zwitterion oder als entsprechendes ein- oder zweisäuriges Salz, beispielsweise als Mono- oder Dihydrochlorid.

In einer weiteren Ausfuhrungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird der L-Antipode einer Verbindung der Formel I durch Fermentation des bekannten Mikroorganismuses-Streptomyces sp. X-11085 hergestellt.

Dieser Streptomyces-Stamm wurde in einer Bodenprobe in Arlington, Californien gefunden. Eine virulente Kultur dieses im Laboratorium mit Streptomyces sp. X-11085 gekennzeichneten Stammes wurde bei dem Northern Utilisation Research and Development Division, Agriculture Research Service, United States Department of Agriculture in Peoria, Illinois hinterlegt und unter der No. MRRL 5331 registriert. Die hier beschriebene als Streptomyces sp. X-11085 bezeichnete Streptomyces"Spezies, umfasst alle Streptomyces-Stämme, die die Verbindung der Formel I produzieren und nicht eindeutig von dem Stamm HRRL 5331, seinen Subkulturen, Mutanten und Varianten unterschieden werden können. Unter Mutanten werden mutierte Stämme verstanden, die 'ausgehend von· dem beschriebenen Mikroorganismus auf vielerlei Wegen, z.B. durch Behandeln mit chemischen

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Mutationsmitteln, mit ultravioletten Strahlen, mit Röntgenstrahlen, mit Phosgen usw. erhalten werden. Die Kenntnis der nachstehend beschriebenen Eigenschaften der Verbindung der Formel I erlauben es, diejenigen Stämme, die diese Verbindung produzieren, in einfacher Weise von anderen Stämmen zu unterscheiden.

Die Kultivierung der Mikroorganismen Streptomyces sp. X-11085 zur Produktion der gewünschten Verbindung der Pormel I kann mit Hilfe verschiedener Fermentationsmethoden durchgeführt werden. Im allgemeinen können folgende Standardmethoden bei der Flaschen-wie auch Tank-Gärung angewendet werden:

Bei der Flaschengärung- werden mit einer Platindrahtöse Sporen von einer Schrägagarkultur in einen 500 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml Nährlösung üb erimpft und 3 Tage bei 28⁰C auf einer Drehschüttelvorrichtung bebrütet. Die Fährlösung enthält eine Stickstoffquelle, vorzugsweise ■ ein mit Hilfe einer Säure oder eines'Enzyms hydrolysiertes Protein z.B. auf enzymatischem Wege hydrolysiertes Milchpulver oder Bohnemehl, eine Kohlenstoff quelle wie z.B. Glucose, sowie ferner anorganische Salze wie Phosphate, Natriumchlorid und andere. Ein mit Trypsin behandeltes Soyamehl [Trypticase Soy Broth;15g/l mittels Pankreas verdautes Casein, 2,5 g/l enzymatisch verdautes Soya-Di-kaliumphosphat, Dextrose, 2,5 g/l Bohnenprotein und 5 g/l Natriumchlorid], hergestellt von den Baltimore Biological Laboratories' ist ein bevorzugtes Medium für das Inokulum. Nach einer Inkubationszeit von bis zu 3 Tagen werden kleine Proben der Vorkultur auf die .Nährlösung übertragen und auf einer Rotationsschüttelvorrichtung 1 bis 5 Tage bei 28⁰C bebrütet. Anjedem 2. Tage werden unter sterilen Bedingungen Durchschnittsproben für die in vitro Versuche entnommen.

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Für die Herstellung von grosservolumigen G-äransätzen wird das Inokulum zunächst in 6 1 Erlenmeyerkolben oder in 19 1 Pyrexflaschen, ausgerüstet mit einer Belüftungsvorrichtung, Probenentnahmestutzen etc. vorkultiviert. Diese Vorkultur wird dann in Tankfermenter übertragen. Das Gärmedium wird im Glaskolben wie im Tank durch Einblasen steriler luft belüftet. Der Gäransatz in einem Tankfermenter wird zusätzlich durch ein mechanisch betriebenes Rührwerk in Bewegung gehalten. Um das Schäumen zu unterbinden werden Antischaummittel wie z.B. Schweineschmalz, Soyabohnenöl oder Silikonöl zugesetzt.

Streptomyces sp. X-11085 kann in den verschiedenartigsten flüssigen Medien kultiviert werden. Besonders bewährt haben sich Medien, die eine assimilierbare Kohlenstoff quelle, z.B. Stärke, Glucose, Melasse, eine assimilierbare Stickstoffquelle z.B. Protein, Proteinhydrolysat, Polypeptide, Aminosäuren, Maisquellwasser, Ammoniumsalze, sowie allgemein die Kationen und Anionen von anorganischen Salzen, z.B. das natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesiumion und das Sulfat- und Chlorid-ion/T Spurenelemente wie Kobalt, Kupfer, Eisen, Molybdän, Bor etc. sind zwangsläufig als Verunreinigungen vorhanden.

Bevorzugte Gärmedien und die damit in der Glasschüttelflasche erreichbaren Antibiotikumausbeuten sind in der Tabelle 5 zusammengestellt. Die in dieser Tabelle aufgeführten Daten zeigen, dass komplexe, von verschiedenen Quellen stammende, stickstoffhaltige Stoffe die Bildung der Ii-Porm der Verbindung der Formel I fördern, insbesondere z.B. Pflanzenmaterialien wie Sojabohnenmehl, tierische Stoffe wie Fleischmehlextrakte, sowie mikrobiologisches Zellmaterial wie Hefe.

Zahlreiche Kohlenstoffquellen z.B. Glucose, Glycerin, Dextrin, und Maisstärke gewährleisten ein gutes Wachstum' und eine

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gute Bildung der Ii-Form der Verbindung der Formel I. Es kann "bisweilen förderlich, sein, der Gärlösung zusätzlich zu den in den natürlichen Zusätzen "bereits vorhandenen anorganischen Salzen, Salze wie Kaliumphosphat, Calciumcarbonat, Magnesiumsulfat, sowie ferner Spurenelemente Zuzusetzen und damit das Wachstum und die Bildung der L-Form der Verbindung der Formel I zu steigern. Bin "bevorzugtes, für grosse Gärbehälter besonders geeignetes G-ärmedium für die Herstellung der L-Form der Verbindung der Formel I setzt sich wie folgt zusammen:

10,0 g/l Glucose

5»0. g/l enzymatisch hydrolysiertes Protein [z.B. Bacto Pepton der Fa. Difco]

3,0 g/l Hefeextrakt

[z.B. Bacto Hefeextrakt der Fa. Difco]

sowie 0,031 g/l Fe(W. ) _g(SO )_2<6.H₂O. .

Die L-Form der Verbindung der Formel I kann nach Beendigung der Gärung auf verschiedene Weise isoliert und gereinigt werden. Geeignete Isolierungs- und Reinigungsmethoden sind die Ionenaustauscherchromatographie, die Verteilungschromatographie und die Absorptionschromatographie,

Nach einem bevorzugten Verfahren erhält man die Verbindung der Formel I aus dem Kulturmedium dadurch, dass man das Mycel und die unlöslichen Feststoffe in üblicher Weise z.B. Filtration oder Zentrifugieren von der Gärlösung trennt, und die L-Form der Verbindung der Formel I aus der klaren Gärlösung mit Hilfe der Ionenaustauscher- oder Absorptions-Chromatographie isoliert. Durch die Absorptionschromatographie an einer Aktivkohle z.B. an Norit A werden in vorteilhafter Weise alle Verunreinigungen entfernt. Für die Ionenaustauscherchromatographie können saure wie basische, insbesondere Natriumionen enthaltende Ionenaustauscher verwendet werden. Die Verteilungschromatographie wird vorteilhaft an Silicagel [Elutionsmittel: Alkohol, Wasser, Ammoniak] vorgenommen. Die vorstehend beschriebenen Methoden zur

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- ίο -

Isolierung und Reinigung der Verbindungen der Formel I können auch kombiniert werden.

Die !-Form der Verbindung der Formel I kann nach Filtrieren oder Zentrifugieren der Gärlösung mit Hilfe der Dünnschicht- oder Papierchromatographie analysiert werden. Die charakteristischen Flecken dieser Verbindung können auf den Platten durch Besprühen mit Nlnhydrin sichtbar gemacht werden. Auch die Bioautographie kann zur Identifizierung mit Vorteil zusätzlich herangezogen werden. Die Chromatographie kann mit Filterpapieren durchgeführt werden. Mit Vorteil verwendet man aber mit Silicagel oder Cellulose beschichtete Glasplatten. Für die Entwicklung des Diinnschichtchromatogrammes kommen folgende Lösungsmittelgemische in Frage: Aethanol/Wasser/ Ammoniak 49:49:2 bei Silicagelplatten, und Phenol/Wasser 80:20 bei Celluloseplatten. Die L-Form der Verbindung der Formel I fällt bei der Endkristallisation in Form eines Zwitterions oder als mono- oder di-Säureadditionssalz, z.B. als mono- oder di-Hydrοchlorid an.

Die neue Verbindung der Formel I bildet mit anorganischen und organischen Säuren pharmazeutisch verwendbare Säureadditionssalze. Von den anorganischen Säuren geeignet sind u.a. die Halogenwasserstoff säuren, z.B. die Chlor- und Bromwasserstoffsäure, ferner auch Mineralsäuren wie Schwefelsäure, Phosphorsäure. Von den organischen Säuren kommen u.a. die Ameisen-, Essig-, Zitronen-, Wein-, Berstein- und Maleinsäure in Frage.

Die Verbindung der Formel I ist entweder allein

oder in Kombination mit Ascorbinsäure in der Lage, die Aethylenbildung in Früchten zu verstärken und kann aus diesem Grunde als Pflanzenwachstumsregulator,insbesondere als Fruchtfällmittel, Verwendung 'finden.

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- ii -

Die Rolle des Aethylens in der Fruchtreifung ist seit mehr als 30 Jahren "bekannt. Es ist dem !Fachmann geläufig dass die Bildung von Aethylen in reifenden Früchten verstärkt wird, insbesondere, wenn sich, die Frucht vom Stiel trennt. Diese Kenntnis kann dazu benutzt werden, um die Wirksamkeit eines Fruchtfallmittels zu demonstrieren, und zwar im Hinblick auf dessen Einfluss in Früchten die Bildung von Aethylen zu beschleunigen und zu verstärken. Da Orangen als typische Frucht bezeichnet werden müssen, die auf die Behandlung mit chemischen Fruchtfallmittelta. ansprechen, wird die Wirkung der Verbindung der Formel I als Fruchtfallmittel an diesen Früchten illustriert.

Die Fähigkeit der Verbindung der Formel I die Aethylenbildung zu verstärken wird in der nachtehenden experiementellen Anordnung aufgezeigt. Ganze frische grüne Orangen und halbreife gelbe Orangen werden mit einer 0,1 ^igen lösung einer Verbindung der Formel I besprüht. Die Eontroll-Orangen werden mit destillierten Wasser behandelt. Alle Sprühmittel enthalten 0,1 $ Aerosol OT (Natriumdioctylsulfosuccinat, SDS) als Netzmittel. SDS bewirkt als Bestandteil der lösungen, dass die wachsartige Haut der Orangen mit einer dünnen filmartigen Schicht überzogen wird, wobei die Oberfläche zur Absorption des aktiven Materials vergrössert wird. Die behandelten Früchte werden dann'in PdIyäthylenbeutel, Glastöpfe oder Aluminiumbüchsen verbracht und verschlossen. Periodisch werden aus diesen Behältern Luftproben entnommen, um auf das Verhandensein von Aethylen geprüft zu werden. Hierfür werden gasdichte Injektions-Spritzen verwendet.

■ Die Aethylenbildung in den Reaktionsgefässen wird mittels Gaschromatographie bestimmt. Ein Hewlett Packard, Serie 575OB, zweiflämmen Detektor Reasearch Gas Chromatograph wird mit einer 10' χ 1/8" rostfreien Stahlkolonne, die mit Aluminiumoxyd (5$ Wasser auf neutralem Aluminiumoxyd) bestückt ist,versehen, um das Aethylen zu bestimmen. Der Gaschromatograph wird bei 45⁰C

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betrieben, und das Trägergas, Helium, wird mit einer FlussgeBchwingkeit von 25 ml pro Minute hindurchgeleitet.

Die Ueberprüfung, dass das gemessene G-as tatsächlich Aethylen ist, erfolgt durch Bestimmung der Retentionszeit im Verhältnis zu reinem Aethylen und durch Reaktion mit Mercuri-Perchlorat [Hg(ClO. )„]. Ferner wird das G-as: massenspektrometrisch untersucht. Mercuriperchlorat absorbiert Aethylen während Salzsäure das absorbierte G-as wieder frei setzt. Das Verschwinden und das Wiederauftreten der Aethylenkomponente im Gas wird in Proben festgestellt, die zuerst mit 1 bis 2 ml 0,2M Hg(ClOJ₂. und danach mit 1 ml 2N HCl behandelt werden.

Das Massenspektrum von reinem Aethylengas erwies sich als vergleichbar mit demjenigen der Komponente die als solche gemessen und in den Reaktionsgefässen produziert wurde.

Die Ergebnisse, die in dieser Versuchsanordnung für die grünen Orangen erziehlt wurden, sind in Tabelle I wiedergegeben. Diese Resultate zeigen,dass in der Kontrollprobe eine geringe Menge Aethylen gebildet wurde während die Aethylenbildung in denjenigen Orangen., die mit einer Verbindung der Formel I behandelt wurden, stark verstärkt war. Die Menge Aethylen_ydie gebildet wird, ist in der nachstehenden Tabelle in Mikroliter Aethylen pro ml (μΐ E/ml) ausgedrückt.

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Tabelle 1

Aethylenbildung in grünen Orangen,die mit 1-1,3 g/Orange besprüht und in Polyäthylenbeutel 14 Tage "bei Zimmertemperatur inkubiert wurden: .

Probe μΐ Ε/ml

Orange + destilliertes Wasser 0,0008

Orange + 0,1 fo Ii~2-Amino-4-

(2-aminoäthoxy)-butansäure 0,0050

Die Ergebnisse in dieser Versuchsanordnung für die halbreifen gelben Orangen sind in Tabelle 2 zusammengestellt. Diese Resultate zeigen, dass wiederum die Verbindungen der Formel I die Aethylenbildung in den Orangen verstärkt. (Vergleiche Tabelle 1 und Tabelle 2).

Tabelle 2

Aethylenbildung in gelben Orangen, die mit 1-1,3 g/Orange in Metalldosen bei Zimmertemperatur inkubiert, wurden:

Ul E/ml

Probe 10 Tage 18 Tage

Orange + destilliertes Wasser 0,0009 0,0007 Orange + 0,1^ L-2-Amino-4-

(2-aminoäthoxy)-butansäure 0,0015 . 0,0044

Die Ergebnisse in der vorstehend geschilderten Versuchsanordnung zeigen,dass die Verbingung der Formel I als Fruehtreifemittel oder als Fruchtfallmittel Verwendung finden kann. Die diskutierten Ergebnisse zeigen dass die Verbindung der Formel I auch dann die Aethylenbildung verstärkt, wenn sie alleine zur Anwendung gelangt. Zusätzlich ist zu sehen, dass die 'Kombination einer Verbindung der Formel I mit Ascorbinsäure eine

!Synergisierung des Fruchtfalleffektes bewirkt, Dieser synergistische

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Effekt lässt sich zeigen, wenn man in der gleichen vorstehend beschriebenen Versuchsanordnung grüne Orangen verwendet und diese wie nachstehend beschrieben behandelt:

Behandlung l/destilliertes Wasser Behandlung 2/0,1$ L-2-Amino-4-(2-aminoäthoxy)butansäure

Behandlung 3/Formulierung A (58,9 % Ascorbinsäure, 4»1 f° Dinatriumphosphat, 33,9 $ Mono-Natriumphosphat, 0,1 $> Kupfersulfat; und 3, O^ Aerosol OT [Gewichtsprozent] bei 4 70 Ascorbinsäure

Behandlung 4/Formulierung A bei 4$ Ascorbinsäure und 0,1 fo L-2-Amino-4- (2-aminoäthoxy) -butansäure.

Die Ergebnisse dieser Versuchsanordnung, sind in Tabelle 3 wiedergegeben. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein synergistischer Effekt dann erhalten wird, wenn man die Verbindung der Formel I und Ascorbinsäure kombiniert und die erhaltenen Mischungen als Fruchtfallmittel verwendet.

Tabelle 3

Aethylenbildung in grünen Orangen, die mit 1-1,3 g/ Orange besprüht und in Polyäthylenbeutel bei Zimmertemperatur Tage inkubiert werden,

Probe ul E/ml

Behandlung 1 0,0008

Behandlung 2 0,0050

Behandlung 3 0,0032

Behandlung 4 0,0225

Der synergistisohe Effekt einer Mischung bestehend aus einer Verbindung der Formel I und Ascorbinsäure im Hinblick auf den Fruchtfall, bei Citruafrüchten wird durch die folgenden FeldYersuche bestätigt. Diese Versuche wurden in Vero Beach, Florida, durchgeführt und die Anwendung des Versuchsmaterials

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erfolgte anfangs Mai. Ausgewählte Zweige mit Valencia-Orangen wurden "besprüht, wobei jede Behandlung 2mal wiederholt wurde indem Zweige verschiedener Bäume jeweils verwendet wurden. Die Behandlung erfolgte durch Anlegen eines lückenlosen Spritzbelages bis zum Abtropfen der Sprützbrühe indem man einen Kohlendioxyd-Sprüher benützte, der mit einer, einzelnen 8002 Tee Jet Düse versehen war und mit einem Druck von 2,3 Atm. Zur Herabsetzung der Oberflächenspannung wurde allen Sprühlösungen 0,5$ nicht-toxisches Surfaktant X-77 (Colloidol Products Corp., Saulsalito, California)- zugesetzt. Die Zusammensetzung des Sprühmittels, das auf die einzelnen Zweige verteilt wurde, war wie folgt;

Behandlung 1-0, 4$-Ii-2-Amino-4- (2-aminoäthoxy) -butansäure Behandlung 2-1,0$ Ascorbinsäure

Behandlung 3-0,l$-L-2-Amino-4-(2-aminoätho xy)-butansäure +0,1$ Ascorbinsäure

Behandlung 4-0,2$-l-2-Amino-4-(2-aminoäthoxy)-butansäure + 0,2$ Ascorbinsäure

Während der 14 Tage andauernden Versuchszeit fiel lediglich am 9· Tag Regen. Die Regenmenge betrugt 1,96 cm. Während der Versuchsdauer waren die maximal und minimal Temperaturen wie folgt:

Tag	Maximum(⁰F)	Minimum (⁰P)
1	78	73
2	79	75
3	80	72
4	80	73
5	79	73
6	77	60
7	80	72
8	83	76 "
9	86	76
10	85	76
11	⁸⁶ «	73
	509828/1027

-LG- .

Maximum (⁰F)	Minimum(⁰F)
90	75
88	78
90	76

Tag
12

13
14

Die Zahl der Früchte wurde jeweils zu Versuchst)eginn und am 7· und am 14· Tag nach der Behandlung gezählt. Die Resultate des Fruchtfalls am 7. und am 14. Tag nach der Behandlung sind in .der Tabelle 4 zusammengefasst.

Tabelle 4

Durchschnittsprozent (a) des Fruchtfalls von Valencia-Orangen .

Muster
Unbehandelt Behandlung 1 Behandlung 2 Behandlung 3 Behandlung 4

(a) Durchschnitt von 2 Wiederholungen

Die erfindungsgemässen Mittel können auf die fruchttragenden Bäume in flüssiger oder fester Formulierung aufgebracht werden. Die Anwendung kann über die Wurzeln, die Stämme, die Zweige, die Blätter oder die Früchte erfolgen. Beispielsweise können die Fruchtfallmittel gemäss vorliegender Erfindung aus dem Flugzeug auf die Bäume aufgesprüht oder aufgestäubt werden, oder an der Basis der Bäume angebracht werden, damit diese Mittel durch die Wurzeln absorbiert werden. Eine bevorzugte Anwendungsmethode und auch die wirksamste besteht im Aufbringen der Mittel in Form einer wässrigen Sprühlösung. Erwünschtenfalls kann eine Formulierung, die auf einem ge-

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7 Tage	14 Tage
O	0
0	0
11	22
0	25
43	57

eigneten organischen Lösungsmittel basiert, wie beispielsweise eine ölige Sprühlösung, verwendet werden.

TJm die grösste Wirkung bei der Verwendung der Fruchtfallmittel gemäss vorliegender Erfindung zu erzielen, wird vorzugsweise das Mittel eine bis zwei Wochen vor der Fruchternte - in Abhängigkeit von der Temperatur - verwendet. In Gegenden wo mit Regen gerechnet werden muss, und zwar im Zeitraum zwischen der Anwendung des Mittels und der Ernte, wird zweckmässigerweise ein übliches Haftmittel den Formulierungen zugemischt. liebliche Beispiele derartiger Haftmittel umfassen beispielsweise Leim, Casein, Salze.der Alginsäuren, Cellulosegummi und entsprechende Derivate, Polyvinylpyrrolidon, Invertsyrup, Kornsyrup usw.

Die erfindungsgemässen Fruchtfallmittel können konventionelle, inerte Materialien, wie sie in der Landwirtschaft benützt werden, enthalten , insbesondere wenn die betreffenden Mittel zur Behandlung von Bäumen dienen. Sie können auch in Verbindung mit Wirkstoffen bekannter Fruchtfallmittel zur Verwendung gelangen. Sie können zusätzlich Ascorbinsäure, ein wasserlösliches Cu-II-salz wie Cupfersulfat, Cupferchlorid usw., einen Puffer und oberflächenaktive Mittel· enthalten.

Zur Herstellung einer bevorzugten Sprüh-Formulierung, · die das Fruchtfallmittel gemäss vorliegender Erfindung enthält, wird der Wirkstoff oder ein Salz davon in einem Sräger wie Wasser dispergiert oder gelöst. Der flüssigen Spraylösung ·. können 0,1$ bis ungefähr 0,5# (Gewichtsprozent) bezogen auf das Gewicht des Trägermaterials, an oberflächenaktivem Stoff zugesetzt werden. Die oberflächenaktiven Mittel können den Charakter von Diionen oder Kationen besitzen oder nicht-ionir⁵ .: scher Natur sein. Typische oberflächenaktive Stoffe sind Alkylsulfonate, Alkylarylsulfonate, Alkylsulfate, Alkylamid sulfonate, Alkylarylpolyätheralkohole, Fettsäureester von

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Polyalkoholen, Aethylenoxyd-Additionsprodukte an solche Ester ; Additionsprodukte von langkettigen Mercaptanen und Aethylenoxyde ; Natriumalkylbenzolsulfonate, die 14-"bis- 18 Kohlenstoffatome besitzen, Alkylphenyläthylenoxyde, beispielsweise p-Nonylphenol _f das mit 10-Aethylenoxydeinheiten kondensiert ist, oder p-Isoocty!phenol,- das mit 10-Aethylenoxydeinheiten kondensiert ist, oder solche Verbindungen, die mit 2-Aethylenoxydeinheiten oder mit 16-Aethylenoxydeinheiten kondensiert sind, Seifen,beispielsweise Natriumstearat und Natriummaleat. Typische oberflächenaktive Stoffe sind: das Natriumsalz von propylierten Naphthalinsulfonsäurenj Aerosol 0T_y das von der American Cyanamide Co. New York, New York hergestellt wird; X-77 Spreader hergestellt von Colloidal Products Corp., Saulsalito, California; dasr· Natriumsalz von modifiziertem Alkoholsulfat aus Kokosnussfettsäuren; das Natriumsalz von sulfonierten Monogliceriden der Kokosnussfettsäuren; das Natriumsalz von sulfonierten Butyl-bis-phenyl-sorbitan-sesquioleaten; I&uryltrimethylammoniumchlorid; Octadecyltrimethylammoniumchlorid; Polyäthylenglykollaurylather; Dexad No. 11, hergestellt von Dewey und Almy Chemical Co., Cambridge, Mass. (Natriumsalz von polimerisierter Alkyllaurylsulfonaäure); Natriumoleatsulfat; Natriumlaurylsulfat; Bthofats, hergestellt von Armour & Co-Chicago, III. (Polyäthylenester von Fettsäuren oder Rosinsäure); Ethomeens, hergestellt von Armour & Co., Chicago, III. (PoIyäthylenglykolderivate langkettigerAlkylamine). Tritons, hergestellt von Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pa. (Alkylarylpolyätheralkohole, Sulfonate und Sulfate des nicht-ionischen, cationischen und anionischen Types) usw.

Die erfindungsgemässen Fruchtfallmittel können eine ganze Aiizahl Früchte zur Loslösung vom Stiel und damit zum Abfallen vom Baum bringen. Typische Früchte, in welchen die Mittel wirköam sind,umfassen Orangen, Oliven^ Aepfel, Kirschen ußw. Die Mittel sind besonders wirksam bei Citrusfrüchten_y beispielsweise Orange, Grapefruit usw.

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Wenn unter besonderen Applikationsbedingungen eine Einstellung des pH des Iruchtfallmittels wünschenwert ist, kann dies in üblicher Weise erfolgen. Beispielsweise können Puffer wie Di-natriumphosphat, Mononatriumphosphat, dibasisches Natriumphosphat-monohydrat usw. oder Gemische dieser Verbindungen in das Fruchtfallmittel eingearbeitet werden, um so den gewünschten pH-Bereich einzustellen.

Die nachstehenden Beispiele illustrieren die Erfindung. Wenn nicht anderweitig angegeben sind die Temperaturen in ⁰C definiert.

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Beispiel 1

Herstellung von L-2-Amino-4-(2-aminoäthoxy)l)utansäurehydrochlorid

Eine Lösung von 125 mg L-trans-2-Amino-4-(2-aminoäthoxy)-3-butensäure in 50 ml 90$igem Methanol-Wasser wird mit Wasserstoff bei einer Atmosphäre und 25° in Gegenwart von 150 mg 5$igem Palladium auf Aktivkohle reduziert. Der Katalysator wird abfiltriert, das Piltrat teilweise unter reduziertem Druck eingedampft und das zurückbleibende Konzentrat auf einen Kationen-Austauscher in der Wasserstoffionenform (5 ml Biorad AG-5OX4 [passierbar durch ein Sieb mit 50-100 Maschen/cm ] verbracht ). Der Ionenaustauscher wird, nacheinander mit einer lO^igen wässerigen Pyridinlösung und einer 1 molaren Ammoniumhydroxydlösung eluiert. Die Eluate werden unter reduziertem Druck eingedampft.

Die Dünnschichtchromatographie des Pyridineluates zeigt, dass die hauptsächlich vorliegende Ninhydrin positive Komponente 2-Aminobuttersäure ist. Der Rückstand aus der Ammoniumhydroxydelution wird in einem kleinen Volumen Wasser aufgenommen, der pH auf 3,8 mit IF Salzsäure eingestellt, und der Rückstand zur Trockene eingedampft. Das l-2-Amino-4-(2-aminoäthoxy)butansäurehydrochlorid wird aus 2 ml Methanol umkristallisiert, Fp.: 205-207°.

Beispiel 2

Herstellung von L-2-Amino-4-(2-aminoäthoxy)butansäurehydrochlorid

Eine lösung von 125 mg L-trans-2-Amino-4-(2-aminoäthoxy)-3-butensäure in 50 ml Wasser wird mit Wasserstoff bei Atmos-

509828/102 7.

phärendruck und 25° in Gegenwart von 75 mg !Obigem Platin auf Aktivkohle hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert, das Piltrat teilweise unter reduziertem Druck eingedampft und das zurückbleibende Konzentrat auf einen Kationenaustauscher in der Wasserst of fiohenform· (Biorad AG-50X4 [passierbar durch ein Sieb mit 50-100 Maschen.pro cm ]) verbracht. Der Rückstand wird nacheinander mit lO^iger Pyridin/Wasser-lösung und 1 molarer. Ammoniumhydroxydlösung eluiert. Die Eluate werden unter reduziertem Druck zur Trockene eingedampft. Dünnschichtchromatographie des Pyridineluates zeigt" dass der Hauptanteil an Ninhydrin possitivem Material 2-Aminobutansäure ist. Der Ammoniakelüatrückstand wird in einem kleinen Volumen Wasseraufgenommen, der pH auf 3,8 mit 1 U Salzsäure eingestellt und der Rückstand zur Trockene eingedampft. Man erhält L-2-Amino-4-(2-aminoäthoxy)-butansäure-hydrochlorid_/das aus 2 ml Methanol kristallisiert wird. Pp.: 205-207°.

Beispiel 5

Herstellung von Ir-2-Amino-4-(2-aminoäthoxy)-butansäurehydroehlorid

. Eine lösung von 7,85 g L-trans-2-Amino-4-(2-aminoäthoxy)-3-butensäure (40 mMol) in 200 ml Wasser wird in einem Parr-Hydrierapparat bei einer Atmosphäre und 25° 2 Stunden lang mit Wasserstoff in Gegenwart von 1 g 5$igem Palladium auf Aktiv- , kohle hydriert. Die lösung wird dann filtriert und das Produkt an 70 ml AG5OWX4 (Kationenaustauscher Harz in der Wasserstoffionei-

form, der durch ein Sieb mit 50-100 Maschen pro cm passierbar ist) absorbiert. Das Harz wird mit lO^iger wässeriger Pyridinlösung eluiert und das Eluat unter reduziertem Druck bis zu " einem Rückstand von 24 mg eingedampft. Das Harz wird dann mit 1 molarer Ammoniumhydroxydlösung eluiert und die Eluate teili weise unter reduziertem Druck eingedampft. Der pH des Rüok-

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Standes wird auf 5,0 mit 18 ml 2 N Salzsäure eingestellt und das verbleibende lösungsmittel unter reduziertem Druck abgedampft. Der Rückstand wird in heissem Methanol aufgenommen und nach Zugabe von Aethanol kristallisiert L-2-Amino-4-(2-aminoäthoxy)-butansäure-hydrochlorid aus. Fp.: 208-211°.

Beispiel 4

Herstellung von D,L-2-Amino-4-(2-aminoäthoxy)-butansäurehydrochlorid

2-Chloräthy1-2'-phthalimidoäthyläther. (37,5 mMol , 9,4 g), Natriumdiäthyl-phthalimidomalonat (25 mMol,. 8,2 g) und Kaliumiodid (2,5 mMol, 0,4 g) werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung bei 153° 4 Stunden belassen. Eine kleine Probe der Mischungen wird titriert -und das Resultat zeigt, dass nach 4 Stunden bereits 99$ des Malonats umgesetzt sind r Man erhält Diäthyl-2-phthalimido-2- (phthalimidoäthoxyäthylj-malonat, das aus Aethanol kristallisiert wird. !Fp.: 96-98°. Eine weitere einfache Möglichkeit besteht darin, dass man das rohe Kondensationsprodukt durch Zusatz der 4-fachen Volumenmenge an Wasser ausfällt und den Niederschlag zweimal mit 40 ml. Wasser trituriert.

Das rohe Kondensationsprodukt aus 4/5 der ursprünglichen Reaktionsmischung wird in 20 ml Aethanol gelöst, danach mit 40 ml wässeriger Lösung von 5 N Natriumhydroxyd versetzt und die Lösung 1 Stunde am Rückfluss erhitzt. Man dampft dann das Aethanol ab, kühlt die Lösung und stellt den pH mit 6 N Salzsäure auf 1 ein. Die wässerige Phase wird von der gebildeten öligen Phase abdekantiert und das QeI in 120 ml 6 N Salzsäure 90 Minuten'am Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen und Filtrieren wird das Lösungsmittel durch Abdampfen unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in Wasser gelöst. Diese

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Lösung wird auf einen Eat ionenaustauscher in der Wasserstoffionenform gebracht (100 ml Bio-Rad AG50X4, passierbar durch ein

ρ
Sieb mit 50-100 Maschen pro cm ). Das Harz wird zuerst mit 100 ml 20$iger wässeriger Pyridinlösung und danach mit 200 ml wässeriger 1 H Natriumhydroxydlösung eluiert. Das zuletzt genannte Bluat wird teilweise unter vermindertem Druck eingedampft und das pH dann mit 22 m-Aequivalenten Salzsäure auf 3»5 eingestellt. Das Wasser wird durch Abdampfen unter reduziertem Druck entfernt, der Rückstand in einer kleinen Menge Methanol gelöst und nach Zugabe von Aethanol bis ein Gesamtvolumen von 50 ml erreicht ist, beginnt das D, Ir-2-Amino-4-( 2-aminoäthoxy)-butansäure-hydrochlorid beim Stehen bei 0° auszukristallisieren. Fp,: 175^177°.

Beispiel 5
Spaltung der D,L-2-Amino-4-(2-aminoäthoxy)-butansäure

Eine Lösung von D,L-2-Amino-4-(2-aminoäthoxy)-butansäure ■ (1 g, 5 mMol) in 5 ml 2 IT Natronlauge wird bei 5° mit 1,25 ml (11 mMol) ChloracetyD-chlorid behandelt und, durch Zugabe von 2 N Natronlauge der pH-Wert bei 10,2 gehalten. Nach 45.Minuten wird der pH auf 1,0.mit 2 N Salzsäure eingestellt. Das Produkt kristallisiert nicht aus, aber wird mit 5 x 10 ml Aethyläther aus der Lösung extrahiert. Die kombinierten Extrakte werden mit 10 ml Wasser gewaschen und die organische Phase unter reduziertem Druck bis zu einem Sirup von 1,6 g eingedampft. Der.Sirup wird in Aethanol aufgenommen und eine gesättigte Lösung von Lithiumhydroxyd wird bis zu einem pH von 7 zugefügt. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgedampft und man erhält das Lithiumsalz von D,L-2-Chloracetylamino-4-(2-chloracetyl-aminoäthoxy)-butansäure, das aus 5 ml 50^igem Aether-Aethanol kristallisiert wird, Pp.: 201-203°.

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Eine Lösung von 642 mg des so erhaltenen di-acylierten Produktes in 20 ml deionisiertem Wasser wird mit 30 mg Schweinenierenacylase bei 37° und einem pH von 7,2 21.Stunden lang inkubiert. Die Lösung wird dann auf einen Kationenaustauscher in der Wasserstoffionenform verbracht (10 ml Biorad

2 AG5OWX4 passierbar durch ein Sieb von 50-100 Maschen pro cm ). Das Eluat wird zusammen mit 50 ml Waschwasser auf ein Volumen von· 20 ml eingeengt, das pH auf 7,2 mit Lithiumhydroxydlösung eingestellt, weitere 30 mg Acyläse hinzugefügt und erneut 8 Stunden lang inkubiert. Die Lösung wird danach auf dieselbe Kolonne gebracht und das Eluat und Waschwasser werden erneut in der gleichen Art und Weise behandelt. Im letzten Eluat und Waschwasser wird das Lithiumsalz hergestellt und D-2-Chloracetylamino-4-(2-chloracetylaminotähoxy)-butansäure kristallisiert nach Entfernen der Acyläse durch Filtration aus einer wässerigen alkoholischen Suspension. Nach Umkristallisation zeigt das Produkt einen Schmelzpunkt von 210°.

Der vorstehend beschriebene Ionenaustauscher wird dann mit 100 ml lQ^iger wässeriger Pyridinlösung eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck konzentriert und 1-2-Amino-4-(2-chloracetylaminoäthoxy)-buttersäure wird aus Aethanol Wasser kristallisiert. Nach Umkristallisation schmilzt das Produkt bei 139-141°.

Die Chloracetylgruppen werden sowohl von der D-2-Chloracetylamino-4-(chloracetylaminoäthoxy)--butansäure als auch von der L-2-Amino-4-(2-chloracetylaminoäthoxy)-butansäure durch 2-stündiges Erhitzen von jeweils 0,8 mMol am Rückfluss in 10 ml 2 N Salzsäure entfernt. Nach Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wird jedes Präparat in Wasser aufgenommen und auf einen Kationenaustauscher in der Wasserstoffionenform (5 ml Biorad AG5OWX4 passierbar durch ein Sieb mit 50-100 Maschen pro cm ) verbracht.. Nach Waschen der Kolonnen mit

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wässeriger Pyridinlösung werden die Produkte mit 50 ml 1 Ή Ammoniumhydroxydlösung eluiert. Das Lösungsmittel wird teilweise unter vermindertem Druck entfernt, der pH mit 1 N Salzsäure auf 4,5 eingestellt und die Produkte aus Aethanol-Wasser kristallisiert. So erhält man aus D-2-Chloracetylamino-4-(2-chloracetylaminoäthoxy)-buttersäure das D-2-Amino-4-(2-aminoäthoxy)-buttersäure-hydrochlorid, Fp.: 206° und aus L-2-Amino-4-(2-chloracetylaminoäthoxy)-buttersäure das L-2-Amino-4-(2-aminoäthoxy)-buttersäure-hydrochlorid, Fp.: 204-206°.

Beispiel 6
Fermentierung von Streptomyces sp.X-11085

Eine Sporensuspension von Streptomyces sp^X-11085 wird von einer Mhragarschrägkultur in einen 6' 1 Erlenmeyerkolben abgeschwämmt, der 2 1 einer von den Baltimore Biological Laboratories hergestellten Trypticase-Soya-Nährlösung enthält. Die beimpfte Nährlösung wird auf einer Rotationsschüttelvorrichtung 72 Stunden bei 28° bebrütet. Danach werden 4 1 des Inokulums in eine 227 1 betragende Nährlösung folgender Zusammensetzung

B/l

Glucose 20,0

Bacto-Pepton [Fa. Difco] 5,0 ' ■ ·

Bacto-Hefeextrakt . 3»0 ·

Eisenammoniumsulfat· 6HpO 0,03

übertragen. Das pH des Gäransatzes wird durch Zugabe von Natronlauge vor der Sterilisierung auf 6,8 eingestellt. Der Gäransatz wird in einem 380 1 Fermenter bei 28° unter Rühren und Belüften [Luftmenge 1 Lpm] bebrütet. Die Schaumbildung wird, durch Zugabe von Dow Corning AF, einem Antischaummittel auf Siliconbasis, unter Kontrolle gehalten. Die Gärlösung wird nach 41

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Stunden mit Infusorienerde versetzt und durch Zentrifugieren plank filtriert.

Beispiel 7

Bestimmung der L-2-Amino-4-(2-aminoäthoxy)-butansäure in der Fermentationsbrühe

Die rohe Fermentationbrühe, die man gemäss der in Beispiel 6 angegebenen Vorschrift erhält·, wird zentrifugiert und danach ultrafiltriert, indem man eine"Millipore-Pilter-ZentrifugenröhreJ'die· mit einem Amicon PM-10-Membrane ausgerüstet ist,.verwendet. Das pH des Filtrates wird mit 1 N Salzsäure auf 2,1 eingestellt.

Die unverdünnte Brühe (pH 2-2,2) (10·μΐ)· wird in einen fluorometrischen Aminosäure-Analysator (l) verbracht und mit den Standardpuffern eluiert:

Puffer 1 Natriumeitrat pH 3,28jO,2M[Na⁺] t=0 bis 66 Puffer 2 " pH 4,24;0,2M[Na⁺] t=66 bis 120 Puffer 3 " pH 5,5;1,OM[Na⁺] t=120 bis Ende

t = Durchflussgeschwindigkeiten des Puffers in Minuten.

Andere Bedingungen: Einzelkolonne 5.0 χ 0,28 cm; Mantelkolonne (Temperatur = 59,5°) enthaltend Durrum DC4A Harz,

Flussgeschwindigkeit des Eluates 9,2 ml/Stunde Flussgeschwindigkeit des Borates 25,2 ml/Stunde Flussgeschwindigkeit des Fluraminacetongemisch.es (300 mg/Hter) 19,6 ml/Stunde

Detektoreinheit: Aminco Fluoro Microphotometer

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Die einzelnen Peaks sind gut aufgelöst und die meisten der Standard-Aminosäuren werden entdeckt. Zusätzlich zeigten sich Peaks bei

165. Minuten
167,2 Minuten
169,5 Minuten
175,0 Minuten

In dem zweiten Experiment wird ein Gemisch von 1 ml der unverdünnten Brühe mit 1 ml einer Standardlösung (pH 2,2), die L-2-Amino-4-(2-aminoäthoxy)-butansäure (50 μΜ) enthält, vermischt und die fluorometrische Aminosäureanalyse unter denselben Bedingungen wie vorstehend beschrieben wiederholt.

Eeine neuen Peaks werden beobachtet. Jedoch derjenige Peak, der t=173,0 Minuten entspricht, vergrössert sich inbezug auf die relative Intensität. Dieser Peak muss deshalb der L-2-Amino-4-(-2-aminoäthoxy)-butansäure zugeschrieben werden.

Die anderen Kachbar-Peaks (t=l67,2 Minuten und 169,5 Minuten) werden dem Ornithin (Om) und Lysin (Lys) zugeschrieben. In diesem Pail wird die unverdünnte Brühe (l ml) mit 0,5 nMol Ornithin und 2,5 nMol Lysin vermischt" und die fluorometrische Aminosäureanalyse unter den vorstehend 'beschrieben Bedingungen wiederholt. Die Peaks bei t=167,2 und 169,5 Minuten vergrösserten sich inbezug auf die relative Intensität und werden dem Ornithin und dem Lysin zugeschrieben«

(1) A. Felix und G. Terkelsen, Arch. Biochem. Biophys.. 157,177(1973). .. ■■···■'·■,-*.-

5 0 9 8 2 8/10 2 7

	Tabelle 5
	Nährlösungen
Bestandteile:
BB-Nährlö sung
Glucose	2,0
E₂HPO₄	7,0
KB₂PO₄	3,0
lTa„..Citrat.2H₂0	0,5
MgSO₄.7H₂O	0,1
(BH₄)₂.SO₄	1,0
CB-Nährlösun,s;

Antibiotische Wirksamkeit in γ/ml

1,0

G-lucose 10,0 0,1

N-Z-Amine A [Sheffield] 10,0 MgCl₂.6H₂O 0,2

0,025

0,001

0,0005

CaCl₂.	0
PeCl,,	0
ZnCl₂
CuCl₂.	0
MnCl₂.	0
,2H₂	CC-Nährlö sung
,6H₂

.2H₂
,2H₂

Mono-Natriumglutamat 10,0 0,1

Glucose 10,0

K₂HPO₄ 4,0

KH₂PO₄ 2,0

MgCl₂.6H₂O 0,2

CaCl₂.2H₂O 0,025

PeCl₃.6H₂O 0,001

ZnCl₂ 0,0005

.2H₂O 0,0005

.2HO 0.0005

^d 5 09828/1027

CD-Fähr lösung	10,0
Soyalose [Central Soya]
Iiösliehe Stärke [Nutritional	10,0
Biochemica]	0,5
Maisquellwasser [Com Products]	0,5
E₂HPO₄	0,5
CaC 0™
pH eingestellt auf 7,5
CE-Nähr lö sung	10,0
Glucose [Corn Products]	5,0
Bacto Pepton [Difco]	3,0"
Bacto Hefeextrakt [Difco]	0,031
Pe(HH₄)₂(SO )₂.6H₂.0

10,0

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel

H₂NCH₂CH₂OCH₂Ch₂CHCOOH I

und pharmazeutisch verwendbarer Säureadditionsalze davon, dadurch gekennzeichnet, dass man

a) eine Verbindung der Formel

H₂NCH₂CH₂O ß

C=C II

H CH-COOH

NH₂

in Gegenwart eines Katalysators reduziert, oder

b) eine Verbindung der Formel

R₁HN-CH₂CH₂-O-CH₂-CH₂R₂ HI

worin R, eine geeignete Stickstoffschutzgruppe darstellt und R_ Chlor, Brom oder Jod bedeutet,

mit einem Alkälimetallderivat einer Verbindung der Formel COOC₉Hc

HC-NHR₃

COOC₂H₅

worin R₃ eine geeignete Stickstoffschutz-509828/1027

gruppe bedeutet,

kondensiert und eine vorhandene Stickstoffschutzgruppe in an sich bekannter Weise entfernt, oder

d) den bekannten Mikroorganismus Streptomyces sp. X-11085 fermentiert, oder . .

e) eine Verbindung der Formel I mit basischen Eigenschaften in ein pharmazeutisch verwendbares Säureadditionssälz über- führt.

2. Verfahren nach Anspruch la, dadurch gekennzeichnet, dass Palladium auf Aktivkohle als Katalysator zur Verwendung

gelangt.

3. Verfahren nach Anspruch Id, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces sp. X-11085 NRRL 5331 in einer wässerigen Nährlösung, die eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthält, unter aeroben Bedingungen submers kultiviert, und die L-Form der Verbindung der Formel I aus der wässerigen Nährlösung isoliert. "..■■-. ,

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die L-Form der Verbindung der Formel I in der Weise isoliert, dass man die ■Gärlösung filtriert, die im Filtrat vorliegende Verbindung an einen Kationenaustauscher adsorbiert und von diesem zurückgewinnt.

5. Fruchtfallmittel, dadurch gekennzeichnet, dass es neben üblichen Hilfsstoffen eine wirksame Menge einer Verbindung der Formel

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NH₂

H₂NCH₂CH₂OCH₂Ch₂CHCOOH

oder ein pharmazeutisch verwendbares Säureaddxtionssalz oder Salze davon enthält.

6. Fruchtfallmittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Aktivstoff L-2-Amino-4-(2-aminoäthoxy)-butansäure ist.

7. Verfahren zur Herstellung eines in den Ansprüchen

5 und 6 definierten Mittels, dadurch gekennzeichnet, dass man eine hinreichende Menge wenigstens einer Verbindung wie sie in Anspruch 5 und 6 definiert sind, mit inerten, festen oder flüssigen Hilfsstoffen, wie sie in derartigen Mitteln üblich sind, vermischt.

8. Verfahren zur Regulation der Pflanzenwachstums und Einleitung des Fruchtfalls, dadurch gekennzeichnet, dass man die zu regulierenden Pflanzen mit einer hinreichenden Menge von mindestens einer Verbindung wie sie in den Ansprüchen 5 und 6 definiert sind, behandelt.

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9. Verbindung der allgemeinen Formel

NH₂

H₂NCH₂CH₂OCh₂CH₂CHCOOH I

und pharmazeutisch verwendbare Säureädditionssalze davon.

10. L-2-Amino-4-(2-aminoäthoxy)-butansäure.

11. D,L-2-Amino-4-(2-aminoäthoxy)-butansäure.

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12. Verwendung eines in den Ansprüchen 5 und 6 definierten Mittels zur Einleitung des Fruchtfalles.

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