DD222042B1 - Verfahren zur herstellung von isobutyryl-pepstatin - Google Patents

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung der enzyminhibitorischen Verbindung Isobutyryl-Pepstatin, die unter anderem bei der Chemotherapie solcher Krankheiten des Menschen von potentiellem Nutzen ist, bei denen Proteinasen ursächlich beteiligt sind. Die Erfindung betrifft insbesondere die Gewinnung eines Inhibitors für saure Proteinasen. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt in der pharmazeutischen und der technisch-mikrobiologischen Industrie, die Pharmaka für die Humanmedizin sowie Enzyminhibitoren u. a. für die Nahrungsgüterwirtschaft, die Biotechnologie, die Nutztierzucht bereitstellt.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Pepstatine sind eine Gruppe von Pentapeptiden, die als Inhibitoren saurer Proteinasen wie Pepsin, Renin und Cathepsin D bekannt sind. Es ist auch bekannt, daß unterschiedliche Acylreste am Pepstatin-Molekül die renin-inhibitorische Aktivität beeinflussen. Bisher sind folgende Mikroorganismen beschrieben worden, die unterschiedliche Pepstatine zu synthetisieren vermögen:

Streptomyces caespitosus (SUGAWARA et HATA; 1956)

Streptomyces parvisporogenes (LOCCI et al.; 1969 bzw. IGNOTUS; 1969)

Streptomyces naniwaensis (MURAO et SATOI; 1970)

Streptomyces testaceus (HAMADA et OKAMI; 1970)

Streptomyces argenteolus var. toyonakensis (UMEZAWA, DD-AP 84449).

In der Regel werden hierbei Gemische von schwer voneinander trennbaren Oligopeptiden durch die Mikroorganismen gebildet.

Ein weiterer Nachteil bei der Gewinnung strukturell modifizierter Pepstatine ist, daß zwar chemische Methoden wie Total- bzw. Partialsynthese oder biochemische Methoden zur enzymatischen Konversion bekannt sind, deren Anwendung jedoch nicht zu einer ökonomischen Produktherstellung führt und die großtechnische Gewinnung dieser Derivate nicht gestattet.

Bei der bisher mit wenigen Streptomyceten-Arten möglichen Pepstatin-Gewinnung werden bevorzugt Gemische chemisch ähnlicher Oligopeptide gewonnen, bei denen als Acylreste des Pepstatins gegenwärtig Isovaleroyl-, n-Caproyl-, Isocaproyl-, n-Heptanoyl-, Isoheptanoyl-, Anteisoheptanoyl-, n-Capryloyl-, Isocapryloyl-, Butyryl-, Propionyl- und Acetyl-Gruppen bekannt sind. Das erschwert, wie erwähnt, die Trennung der chemisch ähnlichen Komponenten und bringt Standardisierungsprobleme mit sich, wenn in Abhängigkeit vom Fermentationsverlauf Verschiebungen qualitativer und quantitativer Art im Vielkomponenten-Gemisch auftreten.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung dient der Herstellung eines Inhibitors saurer Proteinasen, der zur Gruppe der Pepstatine gehört, um die aufgeführten Nachteile der bekannten mikrobiologischen Herstellungsverfahren zu vermeiden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technologisches Verfahren anzugeben, das es gestattet, einen Proteinasen-Inhibitor aus der Gruppe der Pepstatine mit Hilfe eines Mikroorganismus aus leicht zugänglichen und billigen Einsatzstoffen in guten Ausbeuten herzustellen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen in einem flüssigen Nährmedium mit Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalzen ein zur Gattung Streptomyces gehöriger Mikroorganismus gezüchtet wird.

Der Mikroorganismus, der in dem vorliegenden Verfahren zur Herstellung des Pepstatins verwendet wird, ist als Folge von Mutagenese- und Selektionsprozessen aus Populationen einer Streptomyceten-Art gewonnen und in der ZIMET-Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, Jena-DDR, unter der Nummer ZIMET 43719 hinterlegt worden. Bei dem Ausgangsstamm, aus dem die Mutante ZIMET 43719 abgeleitet ist, handelt es sich um Streptomyces spec. PS 84382, der nach der Isolierung aus Erdproben keinerlei Differenzierung von Luftmycel und Sporen zeigte und daher von den bisher bekannten Pepstatin-Bildnern abweichende morphologische, physiologische und biochemische Charakteristika aufweist. Im Gegensatz zum Ausgangsstamm Streptomyces spec. PS 84 382 synthetisiert die nach Mutagenese durch Selektion erhaltene Mutante ZIMET43719 kein Gemisch unterschiedlicher Pepstatine, sondern überraschenderweise ein chemisch einheitliches, neues Pepstatin (nachstehend als Isobutyryl-Pepstatin identifiziert).

Die Kultivierung des Pepstatin-Bildners Streptomyces spec. ZIMET 43719 erfolgt unter aeroben Bedingungen. In flüssigem Stickstoff aufbewahrtes oder an Glucose-Gelatine lyophilisiertes Mycel des Stammes wird in geeignete Agarnährböden und nachfolgend in flüssige, vorher sterilisierte Nährmedien geimpft und das entstehende Mycei wird in an sich bekannter Weise bei einer Temperatur zwischen 25°C und 37⁵C, vorzugsweise bei 28°C, über einen Zeitraum von 2 Tagen bis 6 Tagen, vorzugsweise 4Tagen, bei einer Acidität kultiviert, die zu Beginn des Fermentationsprozesses zwischen pH6,8 undpH7,0 und am Ende des Prozesses zwischen pH 7,5 undpH8,5 liegt. Das Nährmedium besteht aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie aus anorganischen Salzen. Als Kohlenstoffquelien können Glyzerin, Glukose, Lactose, Sojaöl und Sojamehle verwendet werden. Als Stickstoffquellen eignen sich außer den oben erwähnten stickstoffhaltigen Substraten Fleichextrakte, Maisquellwasser, Aminosäuregemische, Rohglutamin, Peptone und Trockenhefe.

Gute Fermentationsergebnisse werden bei Zusatz von Mineralsalzen erzielt. In Abhängigkeit von dem verwendeten Nährmedium begünstigen letztere den Verlauf der Fermentation. In komplexen Medien, die verschiedene Mehle enthalten, haben sich Zusätze von Magnesiumsulfaten und Kaliumphosphaten als vorteilhaft erwiesen. Die Fermentation des Pepstatin-Bildners, ZIMET 43719, kann in Steilbrustflaschen und Rundkolben verschiedenen Inhalts, im Glasfermenter sowie in V2A-Stahltanks durchgeführt werden.

Die Isolierung des Pepstatins wird in der Weise durchgeführt, daß der Proteinasen-Inhibitor bei pH4aus dem vom Mycel befreiten Kulturfiltrat mit n-Butanol oder einem anderen mit Wasser nicht mischbaren Alkohol extrahiert, der Alkoholextrakt durch Ausrühren mit Alkalilauge, vorzugsweise Natronlauge, und Wasser von dunklen Pigmentstoffen befreit und im Vakuum konzentriert, der erhaltene Sirup mit Petrolether oder einer anderen Benzinfraktion gefällt und der Rückstand mit Hilfe der Kieselgelchromatografie vorgereinigt wird, die aktiven Fraktionen konzentriert und nach Auflösen in einem niedrig siedenden Alkohol bei erhöhterTemperatur mit Aktivkohle gereinigt werden, sowie die nach Konzentrieren udn Abkühlen deralkoholischen Lösung erhaltene farblose Substanz schließlich in Alkohol, vorzugsweise Methanol, umkristallisiert und/oder mit Hilfe der Kieselgelchromatografie gereinigt und als reine farblose kristalline Substanz erhalten wird.

Der aus der Kulturlösung des Streptomyces spec. ZIMET 43719 isolierte Inhibitor saurer Proteinasen konnte mit Hilfe elementaranalytischer, gaschromatografischer, infrarotspektroskopischer und massenspektrometrischer Methoden als Pepstatin iso-Bu (Isobutyryl-Pepstatin) identifiziert werden; ererhielt die Bezeichnung Pl 43719.

Der aus dem Stamm ZIMET 43719 isolierte und gereinigte Inhibitor Pl 43719 besitzt einen Schmelzpunkt bei 223⁰C bis 227°C. Er ist optisch aktiv. Der Wert [а] о⁵ beträgt ineiner 0,5%igen Methanollösung -92,7°. Die Elementaranalyse liefert folgende Ergebnisse: Berechnet für C₃₃H₆₁N₅O₉: C = 58,99%, H = 9,15%, N = 10,41 %, Gefunden: C = 59,16%, H = 9,16%, N = 10,11%. Das Molekulargewicht beträgt 671,5.

Im UV-Spektrum zeigt Pl 43719 nur eine Endabsorption. Das IR-Spektrum (KBr-Preßling) zeigt folgende charakteristische Absorptionsmaxima: 1065, 1 175, 1220, 1365, 1380, 1450, 1470, 1540, 1630, 1710,2865,2930,2955,3065,3280cm"¹. Das Molekulargewicht und die chemische Konstitution des Pl 43719 wurden durch hochauflösende Massenspektrometrie seines Methylesters ermittelt. Der Molpeakdes Methylesters liegt bei 685,4614 (berechnet für C₃₄H₆₃N₅O₉ 685,4626). Die charakteristischen Fragmente sind in Tabelle 1 angegeben. Der Vergleich der massenspektrometrischen Fragmentierung mit der des Methylesters des Pepstatin A zeigt, daß Pl 43719 ein Pepstatin mit einer C₄-Kette als Acyl rest darstellt. Nach saurer Hydrolyse des Inhibitors Pl 43719 in 6n HCI bei 110⁰C wurde der C₄-ReSt mit Hilfe der Gaschromatografie als Isobutyryl-Rest identifiziert. Pepstatin A besitzt dagegen als N-terminale Gruppe den Isovaleroyl-Rest (Umezawa et al. 1970, J.Antibiotics 23, 259; Aoyagi et al. 1973, J.Antibiotics 26, 539).

Sowohl frische Fermentationslösungen des Pepstatin iso-Bu-Bildners, ZIMET 43719, als auch der aus ihnen isolierte neue Proteinasen-Inhibitor Pl 43719 besitzen enzyminhibitorische Aktivität gegen Pepsin.

Die Aktivität des Isobutyryl-Pepstatin ist indirekt durch Bestimmen der Restaktivität des Pepsin nach Einwirkung auf das Substrat Rinderserumalbumin ermittelt worden. Dabei dient die unter Pepsin-Einwirkung abgespaltene Tyrosinmenge als Maß für die Restaktivität der Proteinase. Die Tyrosinmenge wird dabei photometrisch bei 280 nm bestimmt. Folgende Beispiele dienen dazu, die Erfindung zu erläutern, ohne sie hierauf zu beschränken.

Ausführungsbeispiele

1.1. Zwei 500-ml-Steilbrustflaschen enthalten je 80ml des folgenden Vorzuchtmediums: Glukose 1,5%

Sojamehl 1,5%

CaCO₃ 0,1 %

NaCI 0,5%

in Leitungswasser, pH 6,8 Sterilisierung: 35 Minuten bei 115⁰C

Jede Steilbrustflasche wird mit einer Mycelsuspension des Pepstatin-Bildners ZIMET 43719 beimpft, welche mit steriler, isotonischer Kochsalzlösung von einer im Reagenzgl is auf folgen dem Anzucht-Nährboden gezüchteten, 10 Tage bis 14 Tage alten Kulturdes Stammes ZIMET 43719 hergestellt wird: Glukose 1,0%

Casein-Pepton 0,4%

Walfleischextrakt 0,4% NaCI 0,25

Trockenhefe 0,02%

In Leitungswasser, pH7,0 Sterilisierung: 20 Minuten bei 115³C.

Die beimpften Vorzucht-Kulturen werden 48 Stunden bis 96 Stunden bei 28⁰C auf einem Schüttelgerät mit einer Frequenz von 180 U/Min, bebrütet. 8 ml einer so bebrüteten Vorzuchtkultur dienen zur Beimpfung von 500-ml-Steilbrustflaschen, die je 80ml des folgenden Produktions-Mediums enthalten:

Glyzerin 2,0%

Fleischextrakt 0,75%

Pepton 0,75 %

NaCI 0,3%

MgSO₄-7 H₂O 0,1%

K₂HPO₄ 0,1 %

In Leitungswasser, pH7,0. Sterilisierung: 20 Minuten bei 115°C. Die Bebrütungstemperaturen bei An-, Vorzucht und Produktion liegen bei 28⁰C.

1.2. Mit einer Kultur des Pepstatin-Bildners Stamm ZIMET 43719, von einem festen Nährboden wie in Beispiel 1.1 beschrieben, beimpft man 80 ml des in Beispiel 1.1 beschriebenen flüssigen Vorzucht-Mediums, welches in einer 500-ml-Steilbrustflasche enthalten ist. Man bebrütet 48 Stunden bei 28°C auf einem Schüttelgerät mit einer Frequenz von 180 U/Min. 12 ml der so erhaltenen Kulturbrühe dienen zur Beimpfung von 400 ml des gleichen Vorzucht-Mediums, welches in einem 2-l-Glaskolben enthalten ist. Man bebrütet weitere 24 Stunden bei 28°C bei gleicher Schüttelfrequenz, ehe die so erhaltenen 400ml Kulturbrühe zur Beimpfung von 20I des im Beispiel 1.1 beschriebenen Produktions-Mediums dienen können. Letzteres ist in einem 32-l-Glasfermenter enthalten. Nach eintägiger Bebrütung und Belüftung (151/Min.) wird der Inhalt des 32-1-Glasfermenters als Inoculum für einen 450-l-V2A-Stahltank eingesetzt. Während der Fermentation kann die Schaumbildung durch Zusatz kleiner Mengen von Sonnenblumenöl oder anderer, silikonhaltiger Schaumschutzmittel kontrolliert werden. Die Rührgeschwindigkeit beträgt 400U/Min. und die Luftzufuhr 4001/Min.

1.3. 4101 der nach Beispiel 1.2 gewonnenen Kulturlösung werden mit Schwefelsäure auf pH 4 angesäuert und mit 1101 n-Butanol extrahiert. Der Butanolextrakt wird im Vakuum auf 101 konzentriert und mit 31 einer 0,1 η Natronlauge ausgerührt, wobei dunkle Pigmentstoffe in die wäßrige Phase übergehen. Falls der pH-Wert während des Rührens unter pH 8,0 bis pH 8,5 sinkt, wird weitere Natronlauge (50%ig) zugegeben. Anschließend wird dreimal mit 11 Wasser gewaschen und mit Essigsäure der pH-Wert auf pH 5 eingestellt. Nach weiterem Konzentrieren unter Vakuum bis zum Öl erfolgt die Zugabe der achtfachen Menge Petrolether, wobei 67 g hellbraunes Pulver (Aktivität 15%) isoliert werden. Die Substanz wird in 100 ml einer Lösungsmittelmischung aufgelöst, die aus Butanol:Butylacetat:Essigsäure:Wasser = (4:4:1:0,5) besteht, und über eine Kieselgelsäule, die 400g Kieselgel (0,063-0,2 mm) enthält, filtriert. Nach Elution mit dem gleichen Lösungsmittelsystem werden die aktiven Fraktionen vereinigt und konzentriert. Der Rückstand (32g, Aktivität 30%) wird in 500ml Methanol unter Erhitzen auf 5O⁰C gelöst, mit 20 g Aktivkohle versetzt, 10 Minuten unter Rühren bei 50⁰C gehalten und filtriert. Die Kohle wird mit heißem Methanol dreimal gewaschen. Die vereinigten Methanol lösungen werden auf 100ml konzentriert und abgekühlt. Nach dem Abfiltrieren der ausgefallenen farblosen Substanz wird die Mutterlauge weiter konzentriert, wobei weitere Substanzmengen ausfallen. Insgesamt können 6 kg des Inhibitors (Aktivität 90%) erhalten werden. Die Umkristal !isation aus Methanol liefert 3,1 g feinkristalliner, farbloser Substanz.

1.4. Für analytische Zwecke wird die,nach Beispiel I.3 erhaltene Substanz nochmals durch Kieselgelchromatografie gereinigt. Nach Auflösen von 3,1 g Inhibitorsubstanz in Methanol und Aufziehen auf 5g Kieselgel wird das mit Substanz beladene Kieselgel über 300 g Kieselgel (0,04-0,063 mm), das in einer Säule (Durchmesser 4,5cm) gepackt und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform, Methanol und Essigsäure (92:6:1) equilibriert ist, gelagert und anschließend wird mit diesem Lösungsmittelgemisch eluiert. Die Zusammensetzung des Lösungsmittelgemisches wird dabei stufenweise auf 86:12:1,5 verändert. DieEluate werden jeweils in Fraktionen von 25 ml aufgefangen und mittels Dunnschichtchromatorgrafie im System Chloroform:Methanol:Essigsäure = 86:12:2 auf Kieselgelplatten analysiert. Die Fraktionen 52 bis 83, die den reinen Inhibitor enthalten, werden vereinigt, konzentriert und anschließend aus Methanol umkristallisiert, worauf 1,3g feiner Nadeln erhalten werden (Schmelzpunkt 223°C-227°C).

II. Man verfährt wie im Beispiel I mit dem Unterschied, daß das Produktions-Medium folgende Zusammensetzung hat:

Glyzerin 2,0%

Maisquellwasser 1,5%

NaCl 0,3%

MgSO₄ -7 H₂O 0,1%

K₂HPO₄ 0,1 %

In Leitungswasser, pH 7,0; 20 Minuten bei 115°C sterilisiert.

Die Vorteile des vorliegenden Verfahrens zur Gewinnung deslsobutyryl-PepstatinsPI 43719, dieses neuen Pepstatin-Vertreters, werden darin gesehen, daß

— ein Mikroorganismus eingesetzt werden konnte, der Pl 43719 als gut isolierbare Einzelkomponente zu bilden vermag;

— ein Aufarbeitungsverfahren entwickelt worden ist, bei dem die im Fermentationsprozeß anfallenden dunklen Pigmente aus dem Alkohol-Extrakt des Produktes durch Ausrühren mit Alkalilauge entfernt werden können und

— ein anwendungsrevelanter Enzym-Inhibitor mit potentiellen Applikationsgebieten nicht nur in der Humanmedizin, sondern auch in der Nutztierzucht (Fertilitätskontrolle) und in der Nahrungsgüterindustrie (neuartiges Konservierungsmittel) verfügbar wird.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von Isobutyryl-Pepstatin auf mikrobiellem Wege, wobei die Kultivierung unter aeroben Bedingungen in flüssigen, vorher sterilisierten Nährmedien, die eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten, bei einer Temperatur zwischen 25⁰C und 37°C während eines Zeitraumes von 2 Tagen bis 6 Tagen durchgeführt wird, gekennzeichnet dadurch, daß zur Kultivierung der Mikroorganismen Streptomyces spec. ZIMET 43719 eingesetzt wird und das gebildete Isobutyryl-Pepstatin aus dem Kulturfrltrat mit einem mit Wasser nicht mischbaren Alkohol extrahiert wird, die alkoholischen Extrakte durch Ausrühren mit Alkalilauge gereinigt, konzentriert, in alkoholischer Lösung mit Aktivkohle behandelt und mittels Kieselgelchromatographie gereinigt werden.