DE2334809C3 - Verfahren zur mikrobiologischen Reduktion von 1,3-Dioxo-2-alkylcycloalkanen - Google Patents

Description

20

O ²S

in welchen R für Methylen oder Äthylen steht; R¹ Methyl, Äthyl oder Propyl bedeutet, und R² 2-Carbalkoxyäthyl, 3-Oxo-n-butyl, 3-Oxo-n-pentyl, 3-Oxo-6-carbalkoxy-n-hexyl, 3,7-Dioxo-n-octyl, 3,7-Dioxo-n-nonyl und

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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf 21 verbessertes Verfahren zur mikrobiologischen Red)·»! xion von l^-Dioxocycloalkanen zu den entsprechende optisch aktiven Ι-Οχο-3-hydroxycycloaIkanen.

Die Verwendung von Mikroorganismen zur Durch führung der Reduktion einer Oxogruppe ist bereit beschrieben worden; vgL z.B. die US-Patentschriftei 34 32 393,34 81 974,35 62 112 und 36 16 226.

Die dort beschriebene Reduktion symmetrische 2-Alkylcydoalkan-l,3-dione, z.B. eines 13-Carbyl-8,14 seco-gona-14,71-dions, führt zu einer Mischung voi Produkten, in welcher jede 2ständige Hydroxylgruppi und erhaltene 1 ständige Hydroxylgruppe (d.h. di< Uständige Carbyl· oder erhaltene 17stär.dige Hydroxyl gruppe der 8,14-Seco-gonaverbindung) in α- unc /?-StelIung steht. Da die reduzierten Produkte ah Zwischenprodukte zur Herstellung pharmakologisdi aktiver Steroidverbindungen geeignet sind, ist das optisch aktive l/?^/?(17/J,13/i)-Reduktionsprodukt am wertvollsten und daher am meisten gewünscht. Die Ausbeuten der bekannten Verfahren waren jedoch noch nicht zufriedenstellend

Es wurde nun gefunden, daß bestimmte symmetrische Dioxocycloalkane mikrobiologisch in besseren Ausbeuten zum entsprechenden 10,20-Produkt reduziert werden können, wenn man die nachstehend genannten bekannten Stämme von Saccharomyces und Schizosaccharomyces zusammen mit bestimmten reaktionsfördernden Substanzen einsetzt

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist nun ein Verfahren zur mikrobiologischen Reduktion eines U-Dioxo^-alkylcycloalkans der allgemeinen Formel

A R

R³O

in welcher R³ einen niederen Alkyl-, Cyclopentyl- oder Cyclohexylrest bedeutet und Z", Z² und Z³ jeweils für eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Einfachoder -Doppelbindung stehen, wobei, wenn Z¹ eine Doppelbindung ist, Z² und Z³ jeweils für eine Einfachbindung stehen und wenn Z¹ eine Einfachbindung ist, Z² und Z³ jeweils eine Einfachbindung sind oder Z² und Z³ jeweils eine Doppelbindung sind oder Z² für eine Doppelbindung und Z³ für eine Einfachbindung steht, unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von etwa 3,5 bis 4,5 in Gegenwart eines Stammes von Schizosaccharomyces pombe, japonicus, malidevorans, octosporus bzw. versatilis oder von Saccharomyces cerevisiae oderuvarumbei20bis35°C, dadurch gekennzeichnet, daß man gleichzeitig Allylalkohol, Methallylalkohol, Acrylnitril, Methacrylnitril, Acrolein, a-Methyl-acrolein, Methylvinyl-, Methyläthinylketon, l-Cyclohexen-3-on oder S-Oxo-ö-carbomethoxy-n-hexan-(i) mitverwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Schizisaccharomyces pombe ATCC 2476, Schizisaccharomyces malidevorems CBS 5557, Saccharomyces cerevisiae ATCC 4097 oder Saccharomyces uvarum ATCC 10609 verwendet wird.

40 R²
O

zu einem l/3-Hydroxy-2j?-alkyl-3-oxocycloalkan der allgemeinen Formel

R'

R²

OH

_J

55

60 in welchen R für Methylen oder Äthylen steht; R¹ Methyl, Äthyl oder Propyl bedeutet, und R² 2-Carbalkoxyäthyl, 3-Oxo-n-butyl, 3-Oxo-n-pentyl, 3-Oxo-6-carbalkoxy-n-hexyl, 3,7-Dioxo-n-octyl, 3,7-Dioxo-n-nonyl und

R³O

in welcher R³ einen niederen Alkyl-, Cyclopentyl- oder Cyclohexylrest bedeutet und Z¹, Z² und Z³ jeweils für eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Einfach- oder Donnelhin-

dung stehen, wobei, wenn Z- eine Doppelbindung ist, Z² und Z³ jeweils für eine Einfachbindung stehen und wenn Z¹ eine Einfachbindung ist, Z² und Z³ jeweils eine Einfachbindung sind oder Z² und Z³ jeweils eine Doppelbindung sind oder Z² für eine Doppelbindung und Z³ für eine Einfachbindung steht, unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von etwa 33 bis 4,5 in Gegenwart eines Stammes von Schizosaccharomyces pombe, japonicus, malidevorans, octosporus bzw. versatilis oder von Saccharomyces cerevisiae oder uvarum bei 20 bis 35⁰C, dadurch gekennzeichnet, daß man gleichzeitig Allylalkohol, Methallylalkohol, Acrylnitril, Methacrylnitril, Acrolein, «-Methylacrolein, Me-

Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces uvarum
Schizosaccharomyces japonicus
Schizosaccharomyces malidevorans
Schizosaccharomyces octosporus

Schizosaccharomyces pombe

Schizosaccharomyces versatilis

Von besonderer Bedeutung sind die Stämme Schizosaccharomyces pombe ATCC 2476 und malidevorans CBS 5557 sowie Saccharomyces cerevisiae ATCC 4097 und uvarum ATCC10609.

Bevorzugt werden Allylalkohol, Acrylnitril, Acrolein, Methylvinylketon und S-Oxo-e-carbomethoxy-n-hex-1-en eingesetzt. Besonders bevorzugt werden Allylalkohol, Acrylnitril und Acrolein.

Besonders bevorzugt werden als Ausgangsverbindungen, in denen R²

2-Carbalkoxyäthyl,

S-Oxo-o-carbalkoxy-n-hexyl,

2-(6-Methoxy-l,23,4-tetrahydronaphth-

2-yl)-äthyl,

2-(6-Methoxy-3,4-dihydronaphth-2-yl)-äthyl

oder 2,2-(6-Methoxy-l ,2,3,4-tetrahydro-

naphth-2-yliden)-äthyl

ist.

Die ljJ-Hydroxy-2^-alkyl-3-oxocycloalkane des erfindungsgemäßen Verfahrens sind wertvolle Zwischenprodukte zur Herstellung bekannter und wertvoller Steriode.

Erfindungsgemäß erfolgt die mikrobiologische Reduktion bei Temperaturen zwischen etwa 20 — 35° C.

Die Reduktion wird vorzugsweise zwischen etwa 24 — 120 Stunden durchgeführt. Die Reduktion erfolgt zweckmäßig in einem Nährmedium, das Quellen für Kohlenstoff, Minerale, Stickstoff und Vitamine enthält Der pH-Wert des Mediums ist vorzugsweise entsprechend eingestellt. Die Bebrütung erfolgt weiterhin unter aeroben Bedingungen.

Bei der Durchführung des Reduktionsverfahrens werden Mikroorganismus, Verstärkerverbindung und Ausgangsmaterial in jeder geeigneten Reihenfolge und Weise, die für übliche Fermentationsverfahren anwendbar ist, in Berührung gebracht. Die Reaktionsteilnehmer werden in einem geeigneten Nährmedium innerhalb des angegebenen Temperaturbereiches für die zur Reduktion ausreichende Zeit umgesetzt Nach beendeter Reduktion wird die Mischung in üblicher Weise zur Isolierung und Gewinnung des Produktes behandelt. Sie

thylvinyl-, Methylvinylketon, l-Cydohexen-3-on oder 3-Oxo-6-carbomethoxy-n-hexen-{l) mitverwendet

Die erfindungsgemäße Reduktion wird mit Kulturen von Saccharomyces cerevisiae oder uvarum und Schizosaccharomyces pombe, japonicus, malidevorans, octosporus oder versatilis durchgeführt Sie sind von den bekannten Quellen, z. B. der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland; der Northern Utilization Research and Development Branch, LJ. S Department of Agriculture (NRRLX Preoria, Γΐί; unc dem Centralbureau voor Schimmelcultures (CBS) Baarn, Holland, verfügbar. Es werden folgende Spezie; verwendet:

ATCC 4097
ATCC 10609
ATCC 10660
CBS 5557
ATCC 2479
ATCC 4206
ATCC 2476
ATCC 2478
ATCC 14548
ATCC 16491
ATCC 16979
ATCC 9987

Y-147 NRRL
Y-672 NRRL
Y-1361 NRRL

Y-854 NRRL

Y-164 NRRL
Y-9 NRRL

Y-1026 NRRL

kann z. B. filtriert dekantiert extrahiert verdampft odei chromatographiert werden.

Als Kohlenstoffquellen werden die verschiedenen bekannten, üblicherweise verwendeten Materialien mit hohem Kohlehydratgehalt wie Zucker. Stärke unc niedrige organische Kohlenwasserstoffe, verwendet

Mineralien werden durch Zugabe anorganische!

Salze zugeführt Oft sind ausreichende Mengen ar

Mineralien in den anderen Bestandteilen anwesend, die zur Zusammensetzung des Fermentationsmediums füi das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden.

Als Stickstoffquellen kann man z. B. Pepton, Sojaboh nenmehl, Maiseinweichflüssigkeit Hefeextrakt Kaseir oder dessen Hydrolysat verwenden.
Als Vitaminquelle eignet sich besonders Hefeextrakt Der pH-Wert des verwendeten Mediums wird vorzugsweise mit einer Mineralsäure, wie Salzsäure, au etwa 3,4 — 4,5 eingestellt

Gewöhnlich wird die Verstärkerbindung in ausrei chender Menge verweudet um ein Verhältnis vot Verstärkerverbindung zu Ausgangsmaterial von etwi 1 :1000 bis etwa 1 :10 (Gewicht) zu ergeben.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zweckmäßif durchgeführt werden, indem man zuerst den Mikroor ganismus in einem geeigneten, ausreichend Kohlen stoff-. Mineral-, Stickstoff- und Vitaminnährstoffi enthaltenden Medium züchtet. Das Züchtungsmediun wird zweckmäßig unter sterilen aeroben Bedingung« etwa 12 — 48 Stunden auf etwa 20 — 35⁰C gehalten Während dieser Zeit wird das Medium zweckmäßif gerührt.

Anschließend wird die Kultur vorzugsweise unte sterilen Bedingungen zur Bebrütung in ein Mediun derselben oder in eines mit einer anderen Nährstoffzu sammensetzung übergeführt. Die Kultur wird Vorzugs weise in diesem Medium etwa 8 — 20 Stunden weite wachsen gelassen. Nach dieser — gegebenenfalls weiteren Wachstumszeit werden Ausgangsmaterial un< Verstärkerverbindung zugefügt, und die erhalten Mischung wird unter aeroben Bedingungen innerhall der angegebenen Temperatur- und Zeitbereiche ge

röhrt Die Verstärkerverbindung kann anteilweise oder !nriner einzigen Zugabe zugegeben werderu Danach kann das Produkt durch Kolonnenchromatographie: nut S,emTeeigneten Eluierungsmit el oder durch andere übfiche Maßnahmen isoliert werden.

_In einer Ausfflhrungsform wird &*£*JZ Aga^latteninemwieobenbeschnebenesNahnnedium

übVgefübrt. Man läßt die Kultur in dieseti Medium bei m?derselben Temperatur und *"*"££% η, am Ausraaß und Geschwindigkeit der zu bestimmen. Dabei wurde jeder Anteil mit • m halben Volumen Chloroform extrahiert Die rhSroformextrakte wurden durch Dünnschichtchro- ^«•aohie über Kieselsäuregel unter Verwendung rines i%ungsmittelsystems aus Chloroform : Aceton «0-20 VoL/VoL) und unter Besprühen mit 3% Cerisulfat in 3 μ Schwefelsäurelösung und Erhitzen auf

»„_„,, . .„ 110⁰C getrennt ...

ciw* derselben Temperatur und ^f^^jTl _I0 Nach 24 Stunden zeigte ein wie oben aufgestelltes Rühren wachsen. Anschließend wird die Kultur ate » j^^dtfchromatogramm, daß *e Ausbeute an Impfmedium für das Nähnnedium oder einer davon in ljj« _2a^3._OXo-6-carbo-meAoxy-n-hexyl)-2ßder Zusammensetzung verschiedenen Lösung verwen- P f^xocydopentan unter Verwendung von det Nach dem Beimpfen läßt man die Kultur "J^^bomemoxy-n-hex-l-enum^- 50% höher vorzugsweise im neuen Medium weiter wachsen. _war als ohne diesen Verstärker.
Nachdem ein befriedigendes Wachstumsstadiuaa 15 ^w* _{m Stunden} zeigte ein ähnliches Dünn- <--■-■—«~«—Hoc Ansranesma- "«- . _ „:„«, Ausbeute von 85 - 90%

an lfl-HyaroxyvcruiiiuuuB. "&s °$ ^mS ^der obengenannten Verstärkerverbindung mitverwendet wurde bzw. eine Ausbeute von 95%, wenn 0,25 mg Verstärker verwendet wurden. Ohne den genannten Verstärker war die Menge an Nebenprodukten wesentlich erhöht (Ausbeute nur 50-60%).

Beispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt «mhei folgende Verbindungen in den angegebenen

bindung, vorzugsweise als Lösung in einem orgam Lösungsmittel, zugegeben, und die Bebrutung fortgesetzt Geeignete Lösungsmittel sind Aceton, » Methanol, Äthanol Propanol, Dioxan, Tetrahydrofuran, Dimethylsulfoxid oder Dimethylformamid oder Mischungen derselben. Die Umwandlung des_Ausgangsmaterials und Produktbildung kann durch »«£*; oder Papierchromatographie aliquoter Proben verfolgt werden. Die Kolonnenchromatographie wird vorzugsweise zur Trennung und Reinigung des Produktes am Reaktionsende angewendet

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung.

WODei lOlgvuut » wi ^n.-.-ο- 0-0 —■

Mengen zu jeweils 50 ecm Medium an Stelle der oben verwendeten Menge an S-Oxo-ö-carbomethoxy-n-hex-1-en zugefügt wurden:

Beispiel 1

Zellen einer 13 - 14 Tage Kultur von Schizosaccharomyces pombe (ATCC 2476) wurden aus einem Malzextrakt-Pepton-Agar-Medium geerntet und zum Beimpfen von 250-ccm-Kolben verwendet die jewei s 50 ecm einer Nährbrühe der folgenden Zusammensetzung enthielten:

Medium-

anteil

Nr.

Zugefügte Verbindung

Menge; mg in Aceton

% Ausbeutener- höhung bei 48 Std.

Rindfleischextrakt
Pepton
Cerelose
Dest Wasser

3,0 g

5,0 g 20,0 g 1000 ecm

Die Kulturen wurden in einer Rotationsschüttelvorrichtung 30 Stunden bei 23⁰C bebrütet Danach wurden 5-ccm-Anteile des Kulturmediums zum Beimpfen von 50-ccm-Anteilen eines getrennten Nährbrühe-Cerelose-Mediums derselben Zusammensetzung verwendet Nbch dem Beimpfen ließ man die Kultur aerob weitere 18 Stunden wachsen. Danach wurden 26 mg 13-Dioxo-2-(3-oxo-6-carbomethoxy-n-hexyl)-2-methy!cyclopentan in 0,2 ecm Aceton und eine zweite Menge von 25 mg in Aceton nach 4 — 5 Stunden sowie eine dritte von 25 mg in Aceton nach 10-12 Stunden jedem Mediumsanteil zugegeben, während die Bebrütung unter ständigem Schütteln bei 22 — 24°C wie vorher fortgesetzt wurde.

Gleichzeitig zur ersten Zugabe wurde auch 3-Oxo-6-carbomethoxy-n-hex-1-en in Konzentrationen von 0,5 mg und 0,25 mg pro 50 ecm Medium als Acetonlösungen (10 μΐ und 20 μΐ) zugefügt Zwei 50ccm-Mediumsanteile erhielten 10 μΐ bzw. 20 μΐ Aceton, jedoch kein S-Oxo-ö-carbomethoxy-n-hex-l-en und dienten als Kontrolle.

Die Bebrütung wurde in dieser Weise fortgeführt 2 ccm-Anteile wurden periodisch aus der Beimpfungsmischune nach der letzten Zugabe des Ausgangsmaterials

10

keine (Kontrolle) —

Methylvinylketon 0,50

desgl. 0,75

Acrolein 1,25

desgl. 0,25

Allylalkohol 0,25

desgl. 0,125

Acrylnitril 1,25

Cyclohex-l-en-3-on 2,50

desgl. 0,50

Methylvinylketon 0,125

130-150

175-200

130-150

75-100

175-200

90-110

50- 60

100-125

50- 75

70- 90

Beispiel 3

Beispiel 1 wurde wiederholt wobei an Stelle der dreimaligen Zugabe sieben 25-mg-Zugaben von Ausgangsmaterial in Aceton zu den 50-cm-Anteilen gemacht wurden. Die erste Zugabe erfolgte 18 Stunden

ss nach der Bebrütung, die weiteren Zugaben erfolgten 5, 12,24,32,48 und 56 Stunden nach der ersten Zugabe.

Bei'diesem Verfahren erhielt ein Anteil (Nr. 1) nur das Ausgangsmaterial, während Nr. 2 mit jeder Zugabe 0,25 mgS-Oxo-ö-carbomethoxy-n-hex-l-en erhielt.

' Die 120 Stunden nach der ersten Zugabe gemachten Chromatogramme zeigten im Fall von Nr. 2 eine 250 300%ige Erhöhung der Ausbeute an gewünschtem lJJ-Hydroxy-2/3-methyl-produkt gegenüber der Kontrolle.

B e i s ρ i e I 4

Beispiel 3 wurde wiederholt, wobei Allylalkohol an Stelle von 3-Oxo-6-carbomethoxy-n-hex-l-on verwen-

det wurde. Ein Anteil enthielt nur Ausgangsmaterial (Kontrolle), der andere 0,50 mg Allylalkohol mit jeder der jeweils 7 Zugaben von jeweils 40 mg Ausgangsmaterial. Bei jedem Test wurde jeder Zugabe nach der dritten 0,6 ecm der folgenden Nährbrühe-Cerelose-Lösung zugesetzt:

Rindfleischextrakt
Pepton
Cerelose
Dest. Wasser

30,0 g

50,0 g

200,0 g

10000 ecm

Die 24, 48 und 120 Stunden nach der ersten Substanzzugabe gemachten Chromatogramme zeigten eine verbesserte Umwandlung in das gewünschte ljJ-Hydroxy^jS-methyl^a-p-oxo-e-carbomethoxy-nhexyl)-3-oxocyclopentan im Vergleich zur Kontrolle. Die Ausbeuten sind vergleichbar mit denen in Beispiel 1.

Beispiel 5

Beispiel 4 wurde unter Verwendung von sieben Paaren von Gärkolbcn wiederholt, die alle jeweils 50 ecm Nährbrühe und 2% Cerelose enthielten. Weitere Zugabe an Nährbrühe und Cerelose erfolgten wie in Beispiel 4. Eines der sieben Paare erhielt Allylalkohol (10 μg/c:cm Medium) nur mit der ersten der sieben Zugaben von jeweils 40 mg Substanz. Das zweite Paar erhielt Allylalkohol (10μg/ccm Medium/Zugabe) mit den ersten beiden von sieben Zugaben von jeweils 40 mg Siubstanz und so weiter bis zu sieben Zugaben von Allylalkohol mit den sieben Substanzzugaben bei denselben Konzentrationen.

Es wurde ein Chromatogramm wie oben beschrieben 120 Stcl. nach der ersten Zugabe des Ausgangsmaterials gemacht. Dieses zeigte, daß die Umwandlung des Ausgangsmaterials und Ausbeute an gewünschter l/?-Hydroxy-2/?-methylverbindung sich zwischen der ersten und siebenten Zugabe von Allylalkohol um 200 bis 250% erhöht hatte. Außerdem konnte eine Erhöhung der Ausbeute an gewünschtem lß-Hydroxy-2/?-methylprodukt gegenüber der Kontrolle in Abhängigkeit von der Allylalkoholzugabe festgestellt werden.

Beispiel 6

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei 0,50 mg Allylalkohol als Verstärker mit jeweils drei Substanzzugaben erfolgten und an Stelle von Schizosaccharomyces pombe ATCC 2476 die folgenden Mikroorganismen verwendet wurden:

% Ausbeuterhöhung') nach 48 Stunden

Saccharomyces cerevisiae ATCC 4097 60—7 5
Saccharomyces uvarum ATCC 150—200

10609

Schizosaccharomyces CBS 5557 150-200
malidevorans

*) An gewünschtem l^-Hydroxy-2ix-(3-oxo-<>-carbomethoxyn-hexyl)-20-methyi-3-oxo-cyclopentan

Beispiel 7

Beispiel 5 wurde unter Verwendung von 13-Dioxo-2-(2-carbomethoxy-ithyl)-2-methylcyclopentan wiederholt und lieferte verbesserte Mengen an gewünschtem l|J-Hydroxy-2ft<2-carbomeAoxyäthyl)-2P-methyl-3-oxocyclopentan im Vergleich zur Kontrolle.

Es wurden folgende Versuche durchgeführt:

Durch Bebrüten von l,3-Dioxo-2-(3-oxo-n-butyl)-2-äthylcyclohexan mit Schizosaccharomyees pombe (ATCC 16491) und 0,5 mg Allylalkohol in einem Nährmedium der in Beispiel 1 gezeigten Zusammensetzung erhielt man verbesserte Ausbeuten an Ilj3-Hydroxy-2a-(3-oxo-n-butyl)-2j3-äthyl-3-oxocyclopentan im Vergleich zu einer Kontrolle, die keinen Allylalkohol ίο erhalten hatte.

Durch Bebrüten von l,3-Dioxo-2-(3-chlorbut-2-enyl)-2-n-propyl-cyclopentan mit Schizosaccharomyces japonicus (ATCC 10 660) und 1,25 mg Acrolein in einem Nährmedium der in Beispiel 1 gezeigten Zusammensetzung erhielt man verbesserte Ausbeuten an l/?-Hydroxy-2&-(3-chlorbut-2'-enyl)-2ß-n-propyl-3-oxocyclopentan im Vergleich zu einer Kontrolle ohne Acrolein.

Durch Bebrüten von 3-Methoxy-8,14-secoöstral,3,5(10).9(ll)-tetra-en-14,17-dion mit Schizosaccharomyces octosporus (ATCC 2479) und Methyläthinylketon erhielt man verbesserte Ausbeuten an 3-Methoxy-8,14-secoöstra-l,3,5(10),9(ll)-tetraen-17j3-ol-14-on im Vergleich zu einer Kontrolle, die kein Methyläthinylketon erhielt.

Durch Bebrüten von 8,14-Secoöstra-l,3,5(10),8-tetraen-3-ol-14,17-dion mit Schizosaccharomyces pombe (ATCC 2476) und Acrylnitril in einem Nährrnedium der in Beispiel 1 gezeigten Zusammensetzung erhielt man verbesserte Ausbeuten an 8,14-Secoöstra-i,3,5(10),8-tetraen-3^,17j3-diol-14-on-produkt im Vergleich zu einer Kontrolle ohne Acrylnitril.

Durch Bebrüten von S-Äthoxy-e.H-secoöstra-I,3,5(l0)-trien-l4,17-dion mit Schizosaccharomyces pombe (ATCC 2478) und Methyläthinylketon in einem Nährmedium der in Beispiel 1 gezeigten Zusammensetzung erhielt man verbesserte Ausbeuten an 3-Äthoxy-8,14-secoöstra-l,3,5(10)-tnen-17/?-ol-14-on im Vergleich zu einer Kontrolle ohne Methyläthinylketon.

Durch Bebrüten von 13-Dioxo-2-(2-carbopropoxyäthyl)-2-äüiylcyclohexan mit Schizosaccharomyces pombe (ATO3 14548) und Allylalkohol in einem Nährmedium der in Beispiel 1 gezeigten Zusammensetzung erhielt man verbesserte Ausbeuten an lj?-Hydroxy-2<x-(2-carbopropoxyäthyl)-2j?-äthylcyclohexan im Vergleich zu einer Kontrolle ohne Allylalkohol.

Die in den obigen Beispielen angegebenen verbesserten Ausbeuten liegen in der Größenordnung der ir Beispiel 1 angegebenen Werte. Nach dem obiger Verfahren wurden folgende Verbindungen hergestellt: so

l|S-Hydroxy-2a-(3-oxo-n-buryl)-2/?-methyI-

3-oxocyclopentan

10-Hydroxy-2a-(3-oxo-n-butyI)-2ß-äthy1-

3-oxocyclopentan
l/?-Hydroxy-2«-(3-oxo-n-butyl)-20-äthyl-

3-oxocyclohexan.

lj3-Hydroxy-2«-(3-oxo-n-pentyl)-2j?-methyl-

3-oxocyclopentan,

10-Hydroxy-2«-{3oxo-6'-carboäthoxy-n-hexyl)-2jJ-methyl-3-oxo-cyclopentan,

l/?-Hydroxy-2<x-(3-oxo-6'-carboäthoxy-n-hexyl}-

2ß-äthyl-3-oxocydopentan,

l^-Hydroxy-2«-{3-oxo-6'-carboäthoxy-n-hexyJ)-

2ß-methyl-3-oxo-cyclohexan,
lß-Hydroxy-2a-(carbomethoxyäthyl)-2#-methyl·

3-oxocydopentan,

l/}-Hydroxy-2a-(carboäthoxyathyl)-20-üthyl-

3-oxocyclopentaa

709608/7

*■*

ίο

lj3-Hydroxy-2«-(carboäthoxyäthyl)-2j3-äthyl-3-oxocyclohexan,

3-oxocyclopentan,

10-Hydroxy-2a-(3,7-dioxo-n-octyl)-20-methyl-

3-oxocyclohexan,

lj8-Hydroxy-2<x-(3,7-dioxo-n-nonyl)-2j3-methyl-

3-oxocyclopentan,

lj3-Hydroxy-2«-(3,7-dioxo-n-nonyl)-2j3-methyl-

3-oxocyclohexan und

l/?-Hydroxy-2«-(3,7-dioxo-n-octyl)-2/?-äthyl-

3-oxocyclopentan.

Beispiel 8

Es wurde eine Subkultur von Schizosaccharomyces pombe ATCC 2476 auf Schrägagar mit folgender Zusammensetzung hergestellt:

Maltose

Proteose Pepton
Agar
Deionisiertes Wasser

40 g
115 g

20 g
1000 ecm

Nach 12tägigem Bebrütungen bei 28° C wurde das Oberflächenwachstum mit etwa 3,0 ecm sterilem O,067m-Natriumphosphatpuffer (ph 7,0) geerntet. Dann wurde die Zellsuspension mit Puffer so eingestellt, daß eine 1 :15-Verdünnung der Suspension eine Trübung von 85 Klett-Einheiten (photoelektrischer Klett-Summerson-Colorimeter mit einem Filter Nr. 66 und mit Puffer auf Null eingestellt) hatte. 0,5 ecm der Suspension wurden zum Beimpfen von 50 ecm Nährbrühe vei wendet, die mit 2% (Gew7Vol) Cerelose (praktisch Glucosemonohydrat) ergänzt und in einem 300 ccm-Nephelokulturkolben enthalten war. Der Kolben wurde dann auf einer Rotationsschüttelvorrichtung (300 Umdrehungen/Minute mit einem Ausschlag von 1,85 cm) bei 23° C 29 Stunden bebrütet (Trübung = 276 K. U.; Filter Nr. 66, mit Medium auf Null eingestellt). Dann wurden je 3,5 ecm dieser Kultur zum Beimpfen von vier 300-ccm-Nephelokulturkolben verwendet, die jeweils 50 ecm frisches Medium derselben Zusammensetzung enthielten. Die Trübungsmessungen der vier Kolben (AI, All, BH und BII) wurden festgehalten und die Bebrütung wie vorher fortgesetzt Nach lS\5stündiger Bebrütung wurden die Trübungsmessungen erneut festgestellt (sie lagen zwischen 191 und 205 K. U.), und jeder Kolben erhielt 40 mg 13-Dioxo-2-(3-oxo-6-carbomethoxyhexyl)-cyclo-pentan in 0,2 ecm Aceton gelöst Dieselbe Substanz wurde jedem Kolben wiederum nach 5, 12, 24,32,48 und 56 Stunden nach der ersten Zugabe zugefügt (Gesamtzugabe 5,6 g/l). Weiterhin erhielten zwei der vier Kolben (BI und BII) 0,5 mg Allylalkohol, in 0,02 ecm Aceton gelöst, mit jeder der 7 Substanzzuga-

s ben. Alle vier Kolben erhielten auch 0,6 ecm einer ergänzenden Cerelose-Nährbrühe (25 g Cerelose und 10 dehydratisierte Nährbrühe/125 ecm) mit jeder der letzten vier Substanzzugaben.

Das Fermentationsverfahren wurde überwacht, indem man 1-ccm-Proben aus jedem Kolben nach 24, 48, 72 und 120 Stunden nach der ersten Substanzzugabe entnahm und jede Probe mit ! ecm Chloroform extrahierte. Anteile der Chloroformextrakte (125 μΐ = 24-Std-Probe; 75 μΙ = 48^.-Probe und 50μ1 = 72-

is +120-Std.-Proben) wurden dann auf Kieselsäuregel-Platten gegeben und mit einem Chloroform : Aceton-Gemisch 80 :20 entwickelt. Die Flecken wurden durch Besprühen mit 3% CeSO₄ in 3,,H₂SO* und anschließendes Erhitzen sichtbar gemacht

Nach Entnahme der 120-Std.-Proben wurde die Bebrütung unterbrochen, der Inhalt der Doppelkolben vereinigt und 3mal mit einem halben Volumen Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte aus entsprechenden Kulturen wurden vereinigt und über NaSO₄ getrocknet Die getrockneten Extrakte wurden dann zur Trockne eingedampft. Die Rückstände wurden gewogen, in 10,0 ecm flüssiger beweglicher Phase aufgenommen und einer Hochdruckchromatographie (HPLC) unterworfen. Ein Bezugsstandard (Kontrolle) des gewünschten ljS-Hydroxy-2j9-methylproduktes wurde in derselben Weise hergestellt und lieferte eine Lösung bekannter Konzentration im angenähert selben Gewichtsbereich wie die Probe des Rückstandes, nämlich 50 mg/ccm.

HPLC-Bedingungen

Kolonne: »Varian MicroPak Sl-10« (10 μ Kieselsäuregel),

Länge: 50 cm; Durchmesser 2,1 mm. Bewegliche Phase: Äthylacetat-Hexan (1 :1), Probengröße: 20 μΐ,
Probeninhalt: etwa 50 mg/ccm, Fließgeschwindigkeit: 110 ccm/Std.; Druck 52,5 at. Injektor: Valco Schlaufen-Typ, Detektor: Lab. Data Control Reflexionsindex, Annäherung: 8.

35

40

45 Die Berechnung der prozentualen Umwandlung des Substrates in gewünschtes Produkt beruhte auf der so folgenden Formel

(Gew.KontroUe) (%Reinh.Kontrol!e"") {Spitzengebiet der Kontrolle«*»)

fSpitzengebiet der Kontrolle) (theoretisches Gewich!derfiireineToÖ%ige

Umwandlung gewünschten Produktes·'¹) Umwandlung

*) Theoretisches Gewicht des für eine I00%ige Umwandlung gewünschten Produktes.

"' Bestimmt durch Gebietsnornvlisienmg = 93%.

"" Spitzengebiet (Durchschnitt von 2 Bestimmungen) = Spitzenhöhe χ -breite bei ¹Z₁ Sniuecnhöhe.

"' Nimmt an, daß 10% des Materials aufgrund der zum Oberwachen der Fermentationen notwendigen Probenentnahmen verlorengehen.

Daraus ergibt sich folgende Berechnung:

jlOmg
Zugabe-Kolben (7 Zugaben) <2 Kolben) (0,9) = 504 mg

Die erzielten Daten zeigen, daß die Umwandlung der unbehandelten Kontrollproben (Kolben AI und All) 28,4% gegenüber 94,8% in den mit Allylalkohol behandelten Kolben (Bl und BIII) betrug. Dies zeigt, daß

die Ausbeute an gewünschtem Produkt in dem mit Allylalkohol versetztem System etwa 3,3mal größer als bei der unbehandelten Kontrollprobe war. Die HPLC-Daten entsprechen den Daten der Dünnschichtchromatographie der Probe.

Beispiel 9

Das Verfahren von Beispiel 8 wurde im wesentlichen unter Verwendung anderer Promotoren an Stelle von Allylalkohol wiederholt; es wurden die folgenden Ergebnisse erzielt:

Verbindung

Konzentr. pro
Zugabe; mg

% Umwar lung

Keine (Kontrolle) - 24,7

Acrolein 0,25 66

Keine (Kontrolle) — 19

Methyläthinylketon 0,0625 79

Keine (Kontrolle) - 22

Cyclohex-l-en-3-on 2,5 97

Keine (Kontrolle) — 24

Methylvinylketon 0,5 71 2-Oxo-6-carbo-

methoxy-n-hex-1-en 0,75 71

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur mikrobiologischen Reduktion eines lß-Dioxo^-alkylcycloaJkans der allgemeinen Formel

IO

zu einem l^-Hydroxy^-alkyl-S-oxocycloalkan der allgemeinen Formel