CH364503A - Verfahren zur Aufspaltung von d,l-Steroiden - Google Patents

Description

  Verfahren     zur    Aufspaltung von     d,l-Steroiden       Es ist bekannt, mit Hilfe von Mikroorganismen  in Steroidverbindungen mit der natürlichen Konfigu  ration Doppelbindungen einzuführen. Es wurde nun  die überraschende Beobachtung gemacht, dass     d,l-          Steroide    sich diesen Mikroorganismen gegenüber ver  schieden verhalten, indem im wesentlichen nur die       d-Form,    d. h. die den natürlichen Steroiden entspre  chende     enantiomorphe    Form dehydriert wird, und die       1-Form    unverändert bleibt.

   Auf dieser Beobachtung  basiert nun das Verfahren gemäss der Erfindung     zur     Aufspaltung von     d,l-Steroiden,    bei welcher neben  den dehydrierten     d-Steroiden    die bisher nur in ein  zelnen Fällen bekanntgewordenen     1-Steroide        erhalten     werden.  



  Das neue     Verfahren    ist dadurch     gekennzeichnet,     dass man auf die     d,1-Steroide        aerobe    Kulturen von       c-c-Doppelbindungen    einführende Enzyme produzie  renden Mikroorganismen oder die entsprechenden  Enzyme einwirken lässt, wobei     praktisch    nur die       d-Form    dehydriert     wird,    und dass man das unver  änderte     1-Steroid    und/oder das     d-Dehydrosteroid    iso  liert.  



  Als Ausgangsstoffe für das neue Verfahren kom  men allgemein gesättigte und ungesättigte, beliebig  substituierte     d,l-Steroide,    beispielsweise     der        Chole-          stan-,        Koprostan-,        Cholan-,        Spirostan-,        Furostan-,          Butanolid-,        Cardanolid-,        Östran-,    insbesondere sol  che der     Pregnan-,

          Androstan-    und     Testanreihe    sowie  ihre höheren und niederen Homologen beispielsweise  entsprechende     A-Nor,        D-Homo-    und     19-Nor-verbin-          dungen    in Betracht.

   Als     Substituenten    kommen be  sonders in Frage freie bzw. funktionell abgewandelte       Hydroxyl-,        Oxo-    oder     Carboxylgruppen,    wie Ester-,  Äther-,     Thioester-,        Thioäther-,        Thiol-    und     Thion-          ester-,        Acetal-,        Mercaptal-,        Ketal-,        Hydrazon-,        Semi-          carbazon-    und     Enolgruppen,    z.

   B. in 2-, 3-, 6-, 7-,  11-, 12-, 16-, 17-, 18-, 19-, 20- und     21-Stellung,     ferner Halogenatome, insbesondere     Chlor    oder Fluor,    z. B. in 9- und     17-Stellung.    Von besonderem Interesse  ist die Anwendung des neuen Verfahrens auf     d,l-Ver-          bindungen    der     Pregnanreihe,    wie z.

   B.     d,l-Progeste-          ron,        d,1-17a-Progesteron,        d,1-16a-Oxy-progesteron,          d,1-1.7a-Oxy-progesteron,        d,1-11-Oxo-progesteron,          d,1-lla-    sowie     llss-Oxy-progesteron,    d,1-9,11- oder       11,12-Dehydro-progesteron        d,1-19-Oxo-progesteron,          d,1-11-Oxo-17a-oxy-progesteron,        d,1-11a-    sowie 11ss  Oxy-17a-oxy-progesteron,     d,1-9-Chlor-    oder     9-Fluor-          11ss,17a-dioxy-progesteron,

          d,1-11ss,18-Dioxy-pro-          gesteron,        d,1-11ss,17,18-Trioxy-progesteron,        d,l-11ss-          Oxy-18-oxo-progesteron,        d,1-9-Chlor-    oder     9-Fluor-          llss-oxy-18-oxo-progesteron,        d,1-11,18-Dioxo-pro-          gesteron,        d,1-19-Nor-progesteron,        d,1-19-Nor-11fl-          oxy-18-oxo-progesteron,        d,l-        Cortexon,        d,

  1-18-Oxy-          und        18-Oxo-cortexon,        d,1-Cortison,        d,1-Hydrocortison,          d,1-17a-Oxy-cortexon,        d,l-Aldosteron    und     d,l-Pregne-          nolon.    Zu nennen sind auch die entsprechenden in       17a-Stellung        hydroxylierten    Verbindungen.  



  Das Verfahren wird     vorteilhaft    in der Weise  durchgeführt, dass man auf den Ausgangsstoff die       aerobe    Kultur eines einzigen Mikroorganismus ein  wirken lässt. Es kann aber auch so vorgegangen wer  den, dass man in einem     Arbeitsgang    mehrere Kulturen  auf den Ausgangsstoff einwirken lässt, wobei es sich  als vorteilhaft erwiesen hat, die Einwirkung der ein  zelnen     Kulturen    nacheinander vorzunehmen.  



  Es sind diejenigen Mikroorganismen für das Ver  fahren geeignet, die in Steroidverbindungen Doppel  bindungen einzuführen vermögen. Nachstehend sind  z. B. einige Arten     genannt,    die in     1,2-Stellung    eine  Doppelbindung einführen.  



       Fusarium        solani          Fusarium        caucasicum          Calonectria        decora          Alternaria        passiflorae          Ophiobolus        heterostrophus          Ophiobolus        Miyabeanus              Didymella        lycopersici          Corynebacterium        simplex          Bacillus        sphaericus          Bacillus    

      subtilis          Mycobacterien     Zur Durchführung des Verfahrens kann man im       einzelnen    wie folgt vorgehen: Die Ausgangsstoffe wer  den mit Kulturen der genannten Mikroorganismen  unter an sich bekannten     Bedingungen        aerob        inkubiert.     Das Wachstum     erfolgt    in     Oberflächenkultur    oder,  technisch     vorteilhafter,        submers.,    wobei     man    schüttelt  oder     rührt.    Die Kulturen enthalten     assimilierbaren          Kohlenstoff,

      insbesondere Kohlenhydrate sowie     ge-          gebenenfalls        Wuchsstoffe,        beispielsweise        Maisquell-          wasser    oder Bierwürze, und anorganische     Salze.    Es  sind somit natürliche,     synthetische    oder halbsynthe  tische Nährlösungen brauchbar. Das praktisch ein  fachste Verfahren ist im folgenden geschildert.

   Man  züchtet die Organismen in Apparaturen und     unter          ähnlichen    Bedingungen, wie sie bei der     Antibiotika-          Fabrikation    als sog.     Tieftankverfahren    bekannt sind.  Nach     Entwicklung    der     Kuilturen    gibt man die     d,1-          Steroide    in feiner Dispersion oder Lösung, beispiels  weise in Methanol, Aceton oder     Äthylenglykol    zu und       inkubiert    weiter.

   Schliesslich trennt man vom     Mycel     ab,     extrahiert    das Filtrat und/oder die     Mycelmasse     und isoliert aus dem Extrakt die     d-Steroide        und/oder     die     1-Steroide    in an sich bekannter Weise,- z. B. durch       Entmischungsverfahren,        Adsorption,        Chromatogra-          phie,        Kristallisation,        Überführung    in funktionelle  Derivate, wie     Girard-Verbindungen    und dergleichen.

    Man kann auch die wirksamen Enzyme aus den  Kulturen der genannten Organismen     abtrennen    und  unter Ausschluss der     wachsenden    Kulturen verwen  den. So kann man z. B. das     Mycel    abtrennen, in       Wasser        oder        Pufferlösungen        suspendieren,        die     diesen     Aufschlämmungen    zugeben und     inku-          bieren.          Sollen    in einem Arbeitsgang mehrere Mikroorga  nismen zur Einwirkung gelangen, so kann man bei  spielsweise wie folgt vorgehen:

   Nach Entwicklung der  Kulturen des ersten     Organismus    gibt man die     d,l-          Steroide    in feiner Dispersion oder Lösung, beispiels  weise in Methanol, Aceton oder     Äthy'lenglykal    zu und       inkubiert    weiter, bis die maximale Reaktion erreicht  ist.

   Dann gibt man, ohne vorher zu     filtrieren    oder das       Dehydrierungsprodukt    zu isolieren, zum Reaktions  gemisch eine ausgewachsene Kultur des zweiten Orga  nismus und     nötigenfalls    entsprechende Nährsubstan  zen und     Wuchsstoffe    zu und fährt mit der Inkubation       fort.    Gegebenenfalls wird diese Operation mit einem  dritten Mikroorganismus wiederholt. Der Verlauf der       einzelnen        Dehydrierungen    kann     papierchromatogra-          phisch    verfolgt werden.  



  Die Verfahrensprodukte können als Heilmittel  Verwendung finden oder als Zwischenprodukte zu       ihrer    Herstellung dienen.  



  Allgemein ist die     Racematspaltung    nach dem  neuen Verfahren besonders einfach, weil die dehy  drierten Derivate des einen Antipoden sich vom un-    veränderten anderen Antipoden infolge ihrer höheren  Polarität leicht abtrennen lassen.  



  Bereits seit den klassischen Untersuchungen von       Pasteur    hat man zwar gelegentlich mikrobiologische  Methoden zur Gewinnung des einen Antipoden aus       Racematen    angewandt. Dabei wurden     gewöhnlich          Pilze    oder Bakterien verwendet, die die Ausgangs  stoffe assimilierten, und zwar den     natürlichen        (d)     Antipoden rascher als den unnatürlichen     (l).    Nach  diesem     Verfahren    musste     also,    um ein optisch reines  Präparat zu erhalten, so lange mikrobiologisch be  handelt werden, bis mindestens die     eine    Form,

   und  zwar meist die biologisch interessantere, völlig zer  stört war. Demgegenüber liefert das neue Verfahren  auch bei nur teilweiser     Umsetzung    den umgewandel  ten Antipoden, der meist den biologisch interessan  teren darstellt, in optisch reiner Form, und zwar als  Derivat, das an sich oder für weitere     Synthesenzwecke     praktisch     wertvoll    sein und chemische Umwandlungen  ersparen kann. Wird beim neuen Verfahren der eine  Antipode     völlig    umgesetzt, so     fällt    auch der andere  in optisch meiner Form an.

      <I>Beispiel 1</I>  In einem Schüttelgefäss werden 1 g     Natriumnitrat,     0,5 g     prim.        Kalium-ortho-phosphat,    0,25g     Magne-          siumsu'lfat-heptahydrat,    0,25g     Kaliumchlorid,    25 g  Rohglucose und 0,5g     Difco-Hefeextrakt    in 500     cm3     Leitungswasser gelöst, auf     pH    5 gebracht und sterili  siert.

   Diese Nährlösung wird mit     Didymella        lycopersici     beimpft und 3 Tage bei 27      geschüttelt.    Dann gibt  man unter     sterilen    Bedingungen     eine    Lösung von  120 mg     d,l-Cortison        in    5     cm-3    Methanol zu.     Man    lässt  weitere 4 Tage bei 27  schütteln,     nutscht    dann das       Mycel    ab und wäscht es mit Wasser und Essigester.  Man schüttelt die vereinigten Filtrate viermal mit je  200     cm3    Essigester aus.

   Die vereinigten Extrakte wer  den mit Wasser gewaschen, getrocknet und einge  dampft. Der Extraktionsrückstand besteht, wie die       papierchromatographische    Untersuchung     ergibt,    aus  einem Produkt, das sich wie Ausgangsmaterial ver  hält und aus     1-Dehydrocortison.    Mittels     präparativer          Papierchromatographie    (System     Propylenglykol-To-          luol)    wird das Gemisch aufgetrennt.

   Durch     Umkristal-          lisieren    aus Aceton erhält man das     d-1-Dehydro-cor-          tison    vom F. = 231-234 ,     [a]D    = + 170  (in     Dioxan).     Durch     mehrmaliges        Umkristallisieren    aus     Aceton-          Isopropyläther    wird das reine     l-Cortison    vom F. = 211  bis 2l7  erhalten.

       [a]D    = -190      (Dioxan).       <I>Beispiel 2</I>    In     einem        Schüttelgefäss    werden 1 g     Natriumnitrat,     0,5 g     prim.        Kalium-ortho-phosphat,    0,25     Magnesium-          sul'fatheptahydrat,    0,25g     Kal'iumchlorid,    25g     Roh-          glucose    und 0,5g     Difco-Hefeextrakt    in 500     cm3    Lei  tungswasser gelöst, auf     pH    5 gebracht und sterilisiert.

    Diese     Nährlösung    wird     mit        Didymella        lycopersici        be-          impft    und 3 Tage bei 27  geschüttelt. Dann gibt man       unter    sterilen Bedingungen     eine        Lösung    von 120 mg       d,1-17a-Oxy-corticosteron    in 5     cm3    Methanol     zu.         Man lässt weitere 4 Tage bei 270 schütteln, putscht  dann das     Mycel    ab und wäscht es mit Wasser und  Essigester. Die vereinigten Filtrate werden, wie in Bei  spiel 1 beschrieben, extrahiert.

   Der Extraktionsrück  stand besteht, wie die     papierchromatographische    Un  tersuchung ergibt, aus einem Produkt, das sich wie  Ausgangsmaterial verhält und aus     1-Dehydro-17a-          oxy-corticosteron.    Mittels     präparativer        Papierchro-          matographie    (System     Propylenglykol-Toluol)        wird    das  Gemisch aufgetrennt.

   Durch     Umkristallisieren    aus  Aceton erhält man einerseits das     d-1-Dehydro-17a-          oxy-corticosteron    vom F. = 234-236 ,     [a]D    = +980  (in     Dioxan)    und anderseits das     1-17a-Oxy-corticoste-          ron    vom F. = 208-210 ,     [a]D    = -168  (in     .abs.    Al  kohol).  



  <I>Beispiel 3</I>  Wie im vorhergehenden Beispiel beschrieben,  stellt man     eine    Kultur von     Didymella        lycopersici    her  und gibt dann eine Lösung von 120 mg     d,1-17a        Oxy-          corticosteron-21-trimethyl-acetat    in 5     cm3        Aceton        zu.     Nach 4tägigem Schütteln bei 270 wird auf gleiche  Weise aufgearbeitet.

   Der Extraktionsrückstand be  steht auf Grund der     papierchromatographischen    Aus  wertung zur Hauptsache aus 2 Produkten, die sich  wie Ausgangsmaterial,     resp.    wie     1-Dehydro-17a-oxy-          corticosteron-trimethylacetat    verhalten.

   Mittels     prä-          parativer        Papierchromatographie    wird das Gemisch  aufgetrennt und man     erhält    durch     Kristallisation    aus  Essigester einerseits     Z-17a-Oxy-corticosteron-21-trime-          thylacetat    vom F. = 231-232 ,     [a]D    = -145      (in          Dioxan)    und anderseits     d-1-Dehydro-17a-oxy-corti-          costeron-21-trimethylacetat    vom F.

   = 233-236 ,       [a]D    = +103  (in     Chloroform).       <I>Beispiel 4</I>  Eine     Nährlösung    wird hergestellt, die auf     einen     Liter Leitungswasser 20 g     Pepton,    5     cm3    Maisquell  wasser     (Comsteepliquor)    und 10 g Rohglucose ent  hält und deren     pH    auf 6,3 eingestellt wird. 120     cm3     dieser     Lösung    werden mit     Didymella        lycopersici        be-          impft    und 2 Tage bei 270 geschüttelt.

   Dann gibt man  unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg       d,1-Aldosteron    in 1,5     cm3    Aceton zu und     schüttelt     weiter bei der gleichen Temperatur. Nach drei Tagen  trennt man das     Mycel    ab und wäscht es mit Wasser  und Essigester. Man schüttelt die vereinigten     Filtrate     viermal mit je 200     cm3    Essigester aus. Die vereinig  ten Extrakte werden mit Wasser gewaschen, getrock  net und eingedampft.

   Wie die     papierchromatogra-          phische    Untersuchung zeigt, besteht der Extraktions  rückstand aus einem Produkt, das sich wie     Aldosteron     verhält und aus     1-Dehydro-aldosteron.        Mittels        prä-          parativer        Papierchromatographie    (System Bush C)  werden die beiden     Substanzen    getrennt und hierauf  aus einem     Aceton-Äther-Gemisch    kristallisiert.

   Man       erhält        l-Aldosteron    (F. = 1100/l58-1650,     [a]D    =  -1410 [Aceton]) und     d-1-Dehydro-aldosteron        (IR-          Banden        in    Chloroform u. a.

   bei<I>2,82</I> 2,95     ,u,     5,87     ,u,        6,01,u,    6,17     ,u,   <I>6,24</I>     ,u,    6,91     ,lc,        7,15,u,          7,31,u,        7,77,u,        9,42,u,    10,68     ,u    und 11,28     ,u).            d-1-Dehydro-aldosteron    wird in     üblicher    Weise  mit     Pyridin-Acetanhydlrid        acetyliert.        Man    erhält ein  Gemisch zweier Produkte,

   die im     Papierchromato-          gramm    mit dem System     Propylenglykol-Toluol    RF =  Werte von 0,70     resp.    von 0,15 zeigen und das     d-l-          Dehydro-aldosteron-18,21-diacetat,        resp.    das     d-1-          D@ehydro-aldosteron-21-monoacetat        darstellen.    Das       letztere    erhält man     in    reiner     kristallisierter    Form,  wenn man das rohe Gemisch der Acetate mit     abs.     Äther behandelt.

   F. = 182-185 ,     IR-Banden    in     Me-          thylenchlorid    u. a. bei 2,81     ,u,        5,74,u,        6,01,u,    6,16     p,     6,23     ,u,        7,31,u,        8,17,u,    8,93<I>,u,</I>     8,82,u,   <I>9,72</I>     ,u,     <B><I>1</I></B>0,03     ,u,    10,22     /c,        10,62,u,    11,32     ,u    und     12,29,a.       <I>Beispiel 5</I>  Eine Nährlösung wird hergestellt,

   die auf     einen     Liter Leitungswasser 20 g     Pepton,    5     cm3    Maisquell  wasser     (Cornsteepliquor)    und 10 g Rohglukose ent  hält und deren     pH    auf 6,3 eingestellt wird. 120     cm3     dieser Lösung werden mit     Didymella        lycopersici        be-          impft    und 2 Tage bei 270 geschüttelt. Zu dieser Lö  sung werden unter     sterilen    Bedingungen     eine    Lösung  von 25 mg     d,1-Cortison    in 1,5     cm3    Methanol gegeben.

    Man lässt 3 Tage bei 270 schütteln und trennt dann  das     Mycel    ab. Dieses     wird    mit Wasser und Essig  ester gewaschen. Man schüttelt die vereinigten Filtrate  viermal mit je 200     cm3    Essigester aus. Die     vereinig-          ten    Extrakte -werden mit Wasser gewaschen, getrock  net und eingedampft. Der Extraktionsrückstand be  steht gemäss     papierchromatographischer    Untersuchung  aus     1-Dehydro-cortison    und aus     einem    Produkt, das  sich wie     Cortison    verhält.

   Diese beiden Substanzen  werden mittels     präparativer        Papierchromatographie     aufgetrennt. Man erhält einerseits     d-1-Dehydro-cor-          tison    (F. = 231-234 ,     [a]D    = + 1690     [Dioxan])    und  anderseits     l-Cortison    (F. =<B>2150,</B>     [a]D    = -2010     [Di-          oxan]).  

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Racematspaltung von d,l-Steroiden, dadurch gekennzeichnet, dass man auf d,1-Steroide aerobe Kulturen von c-c-Doppelbindungen einfüh rende Enzyme produzierenden Mikroorganismen oder die entsprechenden Enzyme einwirken lässt, wobei praktisch nur die d-Form dehydriert wird, und dass man das unveränderte Z-Steroid und/oder das d- Dehydrosteroid isoliert.

   UNTERANSPRüCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man Mikroorganismen oder ent sprechende Enzyme verwendet, die in 1,2- und/oder 4,5-Stellung eine Doppelbindung einzuführen vermö gen. 2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge- kennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff d,l-Cortison verwendet. 3.

   Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge- kennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff d,l-Aldo- steron verwiendet.