DE1030828B - Verfahren zur Racematspaltung - Google Patents

Description

DEUTSCHES

Es ist bekannt, mit Hilfe von Mikroorganismen Steroidverbindungen mit der natürlichen Konfiguration zu oxygenieren bzw. dehydrieren, d. h. Hydroxyl- oder Oxogruppen bzw. Doppelbindungen einzuführen bzw. Hydroxyl- in Oxogruppen zu verwandeln. Es wurde nun die überraschende Beobachtung gemacht, daß d,l-Steroidverbindungen sich diesen Mikroorganismen gegenüber verschieden verhalten, indem im wesentlichen nur die d-Form, d. h. die enantiomorphe, den natürlichen Steroiden entsprechende Form oxydiert wird, und die 1-Form unverändert bleibt. Diese Beobachtung hat nun zu einem neuen Verfahren zur Racematspaltung geführt, wobei neben den oxydierten d-Steroiden die bisher nur in einzelnen Fällen bekanntgewordenen I-Steroide erhalten werden.

Das neue Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man auf d,l-Steroide durch aerobe Kulturen von Mikroorganismen produzierte oxydierende Enzyme einwirken läßt und mindestens eine der enantiomorphen Formen isoliert. Oxydierende Enzyme sind solche, die entweder Sauerstoff in das Steroid-Molekül einzuführen oder daraus Wasserstoff zu entziehen vermögen.

Ausgangsstoffe für das neue Verfahren sind allgemein gesättigte und ungesättigte, beliebig substituierte d,l-Steroide der Pregnan-, Androstan- und Testanreihe sowie entsprechende 19-Nor-verbindungen.

Doppelbindungen befinden sich z. B. in 1- und/oder 4-, 5-, 6-, 7-, 9-, 11-, 14-, 15- und/oder 16-Stellung. Als Substituenten kommen besonders in Frage freie bzw. funktionell abgewandelte Hydroxyl-, Oxo- oder Carboxylgruppen, wie Ester-, Äther-, Thioester, Thioäther-, Thiol- und Thionester-, Acetal-, Mercaptal-, Ketal-, Hydrazon-, Semicarbazon- und Enolgruppen, z. B. in 2-, 3-, 6-, 7-, 11-, 12-, 16-, 17-, 18-, 19-,2O- und 21-Stellung, ferner Halogenatome, insbesondere Chlor oder Fluor, z. B. in 9- und 17-Stellung. Von besonderem Interesse ist die Anwendung des neuen Verfahrens auf d,l-Pregnanverbindungen. Spezifische Ausgangsstoffe dieser Reihe sind unter anderem d,l-Progesteron, d,l-17cc-Progesteron, d,l-16a-Oxy-progesteron, d,l-17a-Oxy-progesteron, d,l-ll-Oxo-progesteron, d,l-lla- sowie 110-Oxy-progesteron, d,l-9,ll- oder 11,12-Dehydro-progesteron, d,l-19-Oxoprogesteron, d,l-ll-Oxo-17a-oxy-progesteron, d,l-llasowie llß-Oxy-^a-oxy-progesteron, d,l-9-Chlor- oder 9-Fruor-llß,17a-dioxy-progesteron, d,l-ll/9,18-Dioxyprogesteron, dJ-ll/J.^lS-Trioxy-progesteron, ά,Ι-ίίβ-Oxy-18-oxo-progesteron, d,l-9-Chlor- oder 9-Fluor-ll/J-oxy-18-oxo-progesteron, d,l-ll,18-Dioxo-progesteron, d,l-19-Nor-progesteron, d.l-l^-Nor-ll/J-oxy-lS-oxoprogesteron, d,l-Cortexon, d,l-18-Oxy- und 18-Oxo-cortexon, d.l-Cortison, d,l-Hydrocortison, d,l-17a-Oxy-cortexon, d,l-Aldosteron, d,l-Pregnenolon, die entsprechenden 1-Dehydroverbindungen, z. B. d,l-l-Dehydroprogesteron, d,l -1 - Dehydro -17 a - oxy - progesteron, d,l-l -Dehydro-11-Verfahren zur Racematspaltung

Anmelder:
CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz)

Vertreter: Dipl.-Ing. E. Splanemann, Patentanwalt, Hamburg 36, Neuer Wall 10

Beanspruchte Priorität:

Schweiz vom 20. Juli, 29. August, 14. September 1S65
und 10. Februar 1956

Dr. Albert Wettstein,, Dr. Ernst Vischer, Basel,

und Dr. Charles Meystre, Ariesheim (Schweiz),

sind als Erfinder genannt worden

0x0-, -lla-oxy- oder 110-oxy-progesteron. Als spezifische Ausgangsstoffe der Androstanreihe seien z. B. d,l-Androstendiol, d,l-17-Methyl-androstendiol, d,l-Dehydroepiandrosteron oder ihre funktionellen Derivate erwähnt. Besonders wichtige Ausgangsstoffe für die Aldosteronsynthese sind z.B. das d,l-Zl⁴-3,20-Dioxo-ll/?-oxypregnan-18-säurelakton-(18—^H), das d,l-J⁴-3,18, 2O-Trioxo-110-oxy-pregnen bzw. sein 18,11-Cyclohalbacetal und das d,l-^I⁴-3,20-Dioxo-ll^,18-dioxy-pregnen. Zu nennen sind auch die entsprechenden, in 17a-Stellung hydroxylierten Verbindungen.

Das Verfahren wird vorteilhaft in der Weise durchgeführt, daß man auf den Ausgangsstoff die aerobe Kultur eines einzigen Mikroorganismus einwirken läßt. Je nach dem verwendeten Mikroorganismus erhält man z. B. das d-Steroid mit einer Oxygruppe in 60-, 7a-, 70-, 8-, Ha-, 110-, 14-, 15a-, 150-, 16a-, 17a- oder 21-Stellung, oder mit einer Doppelbindung in 1,2- und/oder 4,5-Stellung, oder mit einer J⁴-3-Keto- und/oder 17-Ketogruppierung. Es kann aber auch so vorgegangen werden, daß man in einem Arbeitsgang mehrere Kulturen auf den Ausgangsstoff einwirken läßt, wobei es sich als vorteilhaft erwiesen hat, die Einwirkung der einzelnen Kulturen zeitlich nacheinander vorzunehmen.

Alle diejenigen aeroben Kulturen von Mikroorganismen sind für das Verfahren geeignet, die Steroidverbindungen zu oxydieren, d. h. Hydroxylgruppen oder Doppelbindungen einzuführen oder Hydroxyl- in Oxogruppen zu verwandeln vermögen. Nachstehend sind z. B. einige Arten genannt, die für das Verfahren in Frage kommen.

60-Stelhmg: Trichothecium roseum, Lenzites abietina, Rhizopus arrhizus, Gliocladium catenulatum, Gliocladium deliquescens;

809 528/430

7a-Stellung: Curvularia lunata, Curvularia pallescens, Curvularia falcata, Curvularia fallax, Peziza spec; 7/S-Stellung: Rhizopus arrhizus, Proactinomycesroseus;

8-Stellung: Curvularia pallescens, Pleospora Gaeumanni, HeHcostylum piriforme;

Ha-Steilung: Rhizopus nigricans, Rhizopus arrhizus, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Penicillium notatum, Penicillium adametzi, Penicillium. janthinellum, Mucor mucedo, Lenzites sepiaria, Tilletia tritici, Neurospora sitophila, Neurospora crassa;

HjS-Stellung: Curvularia lunata, Curvularia pallescens, Curvularia fallax, Curvularia brachyspora, Cunninghamella Blakesleena, Streptomyces fradiae, Stigmina platani;

14-Stellung: Solerophoma entoxylina, Parasitella simplex, Helicostylum pirifome, Mucor griseocyanus, Mucor parasiticus;

15α-Stellung: Gibberella baccata, Nectria cinnabaiina, Hormodendrium viride;

15/3-Stellung: Lenzites abietina, Spicaria;

16α-Stellung: Didymella Vodakii, Actinomyceten ETH A 6246, A 7746, A 7747, A 7451, A 7486;

17a-Stellung: Trichothecium raseum, Cephalothecium roseum, Cucurbitaria laburni, Lepthosphaeria maculans, ab, extrahiert das Filtrat und/oder die Mycelmasse und isoliert aus dem Extrakt die d-Steroide und/oder die I-Steroide in an sich bekannter Weise, z. B. durch Entmisehungsverfahren, Adsorption, Chromatographie, Kristallisation, Überführung in funktionelle Derivate, wie Girard-Verbindungen u. dgl. Dieselben Umsetzungen lassen sich auch durchführen, indem man die wirksamen Enzyme aus entsprechenden aeroben Kulturen der genannten Organismen zuerst abtrennt und unter Ausschluß

ίο der wachsenden Kulturen verwendet. So kann man z. B. das von entsprechenden aeroben Kulturen der genannten Organismen gebildete Mycel abtrennen, in Wasser oder Pufferlösungen suspendieren, die genannten Ausgangsstoffe diesen Aufschlämmungen zugeben und inkubieren.

Sollen in einem Arbeitsgang mehrere Mikroorganismen zur Einwirkung gelangen, so kann man beispielsweise wie folgt vorgehen: Nach Entwicklung der Kulturen des ersten Organismus gibt man die genannten Ausgangsstoffe in feiner Dispersion oder Lösung, beispielsweise in

Methanol, Aceton oder Äthylenglykol, zu und inkubiert weiter, bis die maximale Reaktion erreicht ist. Dann gibt man, ohne vorher zu filtrieren oder das Oxydationsprodukt zu isolieren, zum Reaktionsgemisch eine ausgewachsene

Kultur des zweiten Organismus und nötigenfalls ent-Trichoderma lignorum, Trichoderma glaucum, Acrospeira 25 sprechende Nährsubstanzen und Wuchsstoffe zu und levis, Lophotrichus hartinii, Melanospora parasitica, fährt mit der Inkubation fort. Gegebenenfalls wird diese

Operation mit einem dritten Mikroorganismus wiederholt. Der Verlauf der einzelnen Oxydationen kann papierchromatographisch verfolgt werden.

Die Verfahrensprodukte können als Heilmittel Verwendung finden oder als Zwischenprodukte zu ihrer Herstellung dienen. Besonders wertvoll hat sich das neue Verfahren bei der Aldosteron-Synthese erwiesen. So erhält man z. B. bei der Einwirkung einer aeroben Kultur von Ophiobolus herpotrichus auf d,l-J⁴-3,18,20-Trioxo-ll^- oxy-pregnen bzw. sein lSjll-Cyclohalbacetal in einem einzigen Schritt in guter Ausbeute d-Aldosteron. Bei Anwendung rein chemischer Verfahren sind für diese Synthese, ausgehend vom gleichen Ausgangsstoff, etwa sieben Stufen erforderlich.

Allgemein ist die Racematspaltung nach dem neuen Verfahren besonders einfach, weil die hydroxylierten oder dehydrierten Derivate des einen Antipoden sich vom unveränderten anderen Antipoden infolge ihrer höheren Polarität leicht abtrennen lassen.

Bereits seit den klassischen Untersuchungen von Pasteur hat man zwar gelegentlich eine mikrobiologische Methode zur Gewinnung des einen Antipoden aus Racematen angewandt. Dabei wurden gewöhnlich Pilze oder Bakterien verwendet, die die Ausgangsstoffe assi-

Thielavia terricola, Dactylium dendroides;

21-Stellung: Ophiobolus herpotrichus, Sclerotinia fructicola, Wojnowicia graminis, Hendersonia rubi, Hendersonia abietus, Dilophospora spec, Phoma hibernica, Septoria aesculi, Aspergillus niger;

1,2-Dehydrierung: Fusarium solani, Fusarium caucasicum, Calonectria decora, Alternaria passiflorae, Ophiobolus heterostrophus, Ophiobolus Miyabeanus, Didymella lycopersici, Corynebacterium simplex, Bacillus sphaericus, Bacülus subtilis, Mycobacterien;

3- und/oder 17-Stellung: Proactinomyces erythropolis, Proactinomyces aquosus, Proactinomyces restrictus, Proactinomyces roseus, Azotobacter, Mycobakterien, Micrococcus dehydrogenans, Corynebacterium mediolanum, Alcaligenes faecalis, Hefe und oxydierende Bakterien, Pseudomonas, Flavobacterium androstenedionicum, FIavobacterium carbonilicum, Actinomyces albus, Aspergillus niger, Phycomyces blakesleeanus, Penicillium chrysogenum.

Wie aus obiger Zusammenstellung hervorgeht, sind die genannten Mikroorganismen Pilze oder Bakterien und gehören z. B. den Klassen der Phycomyceten, Ascomyceten, Basidiomyceten, Fungi imperfecti oder Actinomyceten an.

Zur Durchführung des Verfahrens kann man die Ausgangsstoffe mit Kulturen der genannten Mikroorganismen unter an sich bekannten aeroben Bedingungen inkubieren. Das Wachstum erfolgt in Oberfiächenkultur oder, technisch vorteilhaft, submers, wobei man schüttelt oder rührt. Die Kulturen enthalten assimilierbaren Kohlenstoff, insbesondere Kohlenhydrate, sowie gegebenenfalls Wuchsstoffe, beispielsweise Maisquellwasser oder Bierwürze, und anorganische Salze. Es sind

milierten, und zwar den natürlichen (d) Antipoden rascher als den unnatürlichen (1). Nach diesem Verfahren mußte also, um ein optisch reines Präparat zu erhalten, so lange mikrobiologisch behandelt werden, bis mindestens die eine Form, und zwar meist die biologisch interessantere, völlig zerstört war. Demgegenüber liefert das neue Verfahren auch bei nur teilweiser Umsetzung den umgewandelten Antipoden, der meist den biologisch interessanteren darstellt, in optisch reiner Form, und zwar

somit natürliche, synthetische oder halbsynthetische 60 als Derivat, das an sich oder für weitere Synthesenzwecke Nährlösungen brauchbar. Das praktisch einfachste Ver- praktisch wertvoll ist und chemische Umwandlungen fahren ist im folgenden geschildert, ohne daß die Erfindung
durch diese Angaben beschränkt sein soll: Man züchtet
die Organismen in Apparaturen und unter ähnlichen Bedingungen, wie sie bei der Antibiotikafabrikation als 65
sogenanntes Tieftankverfahren bekannt sind. Nach
Entwicklung der Kulturen gibt man die genannten
Ausgangsstoffe in feiner Dispersion oder Lösung, bei

erspart. Wird beim neuen Verfahren der eine Antipode völlig umgesetzt, so fällt auch der andere in optisch reiner Form an.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben.

Beispiel 1

spielsweise in Methanol, Aceton oder Äthylenglykol, zu In fünf Erlenmeyerkolben von 500 cm³ Kapazität

und inkubiert weiter. Schließlich trennt man vom Mycel 70 werden je 120 cm³ 70prozentige wäßrige Bierwürze

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sterilisiert und mit Ophiobolus herpotrichus beimpft. Die beschrieben. Durch Kristallisation der beiden Extrak-Kolben werden bei 27⁰C geschüttelt. Nach 4 Tagen gibt tionsrückstände aus Aceton-Isopropyläther-Gemisehen man zu den gut entwickelten Kulturen unter sterilen erhält man d-Hydrocortison vom F. =205 bis 210° C; Bedingungen je eine Lösung von 30 mg d,l-Progesteron [<z]d = +165⁰C (Äthanol) und d-Cortison vom F. = 210 (d,l-zl⁴-3,20-Dioxopregnen) in 1,5 cm³ Aceton und läßt 5 bis 216°C; [a]_D = + 195°C (Dioxan). weiter bei der gleichen Temperatur schütteln. Nach ^ . . 4 Tagen wird das Mycel abgetrennt und mit Wasser und .Beispiel 6 Essigester gewaschen. Man schüttelt die vereinigten In einem Schüttelgefäß werden 1 g Natriumnitrat, Filtrate viermal mit je 200 cm³ Essigester aus. Die ver- 0,5 g prim. Kalium-ortho-phosphat, 0,25 g Magnesiumeinigten Extrakte werden mit Wasser gewaschen, ge- ¹Q sulfat-heptahydrat, 0,25 g Kaliumchlorid, 25 g Rohtrocknet und eingedampft. Der Rückstand (160 mg) ent- glucose und 0,5 g Hefeextrakt (bekannt unter dem hält gemäß papierchromatographischer Auswertung etwa Handelsnamen »Difco«) in 500 cm³ Leitungswasser gelöst, gleiche Mengen von zwei Verbindungen, die sich wie auf pH = 5 gebracht und sterilisiert. Diese Nährlösung Cortexon (11-Desoxy-corticosteron bzw. Progesteron) wird mit Didymella lycopersici beimpft und 3 Tage bei verhalten. Er wird mittels eines präparativen Papier- 15 27⁰C geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedinchromatogramms mit dem System Bush B 3 [Bioch. gungen eine Lösung von 120 mg d,l-Cortison (zl⁴-3,ll,20-Journ., 50, 372 (1952)] aufgetrennt. Die dem Cortexon Trioxo-17cc,21-dioxy-pregnen) in 5 cm³ Methanol zu. Man entsprechenden Zonen werden ausgeschnitten und mit läßt weitere 4 Tage bei 27° C schütteln, nutscht dann das 400 cm³ 50prozentigem Methanol eluiert. Das Methanol Mycel ab und wäscht es mit Wasser und Essigester. Die wird darauf im Vakuum entfernt. Man schüttelt die 20 vereinigten Filtrate werden, wie im Beispiel 1 beschrieben, zurückbleibende wäßrige Lösung viermal mit je 50 cm³ extrahiert. Der Extraktionsrückstand besteht, wie die Chloroform aus und wäscht die vereinigten Extrakte mit papierchromatographische Untersuchung ergibt, aus Wasser, trocknet sie und dampft sie im Vakuum ein. Der einem Produkt, das sich wie Ausgangsmaterial verhält, Rückstand wird aus Aceton-Äther kristallisiert, wobei und aus 1-Dehydrocortison. Mittels präparativer Papierman das d-Cortexon vom F. = 140 bis 143⁰C in reiner 25 Chromatographie (System Propylenglykol—Toluol) wird Form erhält; [a]n = +18O⁰C (Äthanol). Die dem das Gemisch aufgetrennt. Durch Umkristallisieren aus Progesteron entsprechenden Zonen des präparativen Aceton erhält man das d,l-Dehydro-cortison vom F. =231 Papierchromatogramms werden in gleicher Weise aufge- bis 234⁰C; [<z]d = +17O⁰C (in Dioxan). Durch mehrarbeitet. Man erhält 92 mg Rohextrakt, woraus man maliges Umkristallisieren aus Aceton—Isopropyläther durch mehrmalige Kristallisation aus Aceton-Petrol- 30 wird das reine 1-Cortison vom F. = 21 Ibis 217° C erhalten; äther-Gemischen reines 1-Progesteron gewinnt. F. — 122 [a]z> = —190⁰C (Dioxan).

bis 125°C; [a]_D = -19O⁰C (Aceton).

Beispiel 4

Beispiel 2 _Eine Nährlösung wird hergestellt, die auf 11 Leitungs-In einem Schüttelgefäß werden 500 cm³ sterile Bier- 35 wasser 20 g Pepton, 5 cm³ Maisquellwasser und 10 g Rohwürze mit Cunninghamella Blakesleena beimpft und glukose enthält und deren pn auf 6,3 eingestellt wird. 3 Tage bei 27°C geschüttelt. Dann gibt man zur gut Davon werden je 120 cm³ in vier Erlenmeyerkolben von entwickelten Kultur unter sterilen Bedingungen eine 500 cm³ Kapazität sterilisiert und mit Wojnowicia Lösung von 150 mg d,l-Cortexon (d,l-Zl⁴-3,20-Dioxo- graminis beimpft. Die Kulturen werden 4 Tage lang bei 21-oxy-pregnen) in 8 cm³ Aceton. Gleichzeitig beimpft 40 27° C geschüttelt, worauf unter sterilen Bedingungen man in einem zweiten Gefäß 500 cm³ sterile Bierwürze Lösungen von je 30 mg (18 ->-11 ß)-Lakton der ά,Ι-Δ*- mit Trichothecium roseum. Beide Kulturen werden 3,20-Dioxo-ll/?-oxy-pregnen-18-säure in 1,5 cm³ Me-3 Tage bei 27⁰C geschüttelt und dann unter sterilen thanol zugegeben werden. Dann läßt man weiter bei der Bedingungen vereinigt, worauf weiter bei der gleichen gleichen Temperatur schütteln. Nach 8 Tagen trennt man Temperatur geschüttelt wird. Nach 3 Tagen trennt man 45 das Mycel ab, wäscht es mit Wasser und Essigester und das Mycel ab und wäscht es mit Wasser und Essigester. extrahiert die vereinigten Filtrate, wie im Beispiel 1 be-Die vereinigten Filtrate werden, wie im Beispiel 1 be- schrieben. Der Extraktionsrückstand (140 mg) enthält schrieben, extrahiert. Der erhaltene Rückstand (165 mg) gemäß papierchromatographischer Auswertung ein dem besteht gemäß papierchromatographischer Auswertung Ausgangsmaterial ähnliches Produkt sowie das (18 -»-lljff)-zur Hauptsache aus drei Verbindungen, die dem Cortexon, 5° Lakton derA ⁴-3,20-Dioxo-l l/?,21-dioxy-pregnen-18-säure. Hydrocortison bzw. Cortison entsprechen. Es wird an 8 g Er wird mittels präparativer Papierchromatographie Kieselsäuregel nach der Durchlaufmethode chromate- (System Formamid—Benzol—Chloroform) aufgetrennt, graphiert, wobei zuerst mit Chloroform, dann mit Chloro- Die beiden Komponenten werden, wie im Beispiel 1 beform—Aceton (99 : 1) und schließlich mit Chloroform— schrieben, aus dem Papier eluiert und extrahiert. Durch Aceton (1:1) eluiert wird. Die einzelnen Fraktionen 55 Kristallisation aus Aceton-Äther erhältman das (18-^11/3) (je 20 cm³) werden papierchromatographisch untersucht. Lakton der d-Zl⁴-3,20-Dioxo-ll/3,21-dioxy-pregnen-18-Die mit Chloroform eluierten Anteile enthalten Ver- säure vom F. = 205 bis 222⁰C; [a]_o = 117⁰C (Aceton), unreinigungen, während in den Chloroform-Aceton- . . (99:1) Fraktionen eine dem Cortexon entsprechende Beispiel 5 Verbindung vorhanden ist. Diese Fraktionen werden 60 Vier Erlenmeyerkolben werden mit je 120 cm³ der im vereinigt und eingedampft. Durch Kristallisation aus Beispiel 4 beschriebenen Nährlösung beschickt und steri-Aceton-Äther-Gemischen erhält man das 1-Cortexon. lisiert. Man beimpft mit Ophiobolus herpotrichus und F. = 138 bis 142°; [a]_D = -175⁰C (Äthanol). läßt die Kulturen 5 Tage bei 27⁰C schütteln. Dann wird Die weiteren, mit Chloroform—Aceton (1: 1) eluierten zu jeder Kultur unter sterilen Bedingungen eine Lösung Anteile bestehen zur Hauptsache aus d-Hydrocortison 65 von 30 mg d,l-Zl⁴-3,18,20-Trioxo-ll/?-oxy-pregnen bzw. und d-Cortison. Sie werden vereinigt, eingedampft sein 18,11-Cyclohalbacetal in 1,5 cm³ Methanol zugegeben und mittels eines präparativen Papierchromatogramms und weiter bei der gleichen Temperatur geschüttelt. Nach (System Propylenglykol—Toluol) aufgetrennt. Die Auf- 10 Tagen trennt man das Mycel ab, wäscht es mit Wasser arbeitung der das d-Hydrocortison bzw. das d-Cortison und Essigester und extrahiert die vereinigten Filtrate, enthaltenden Papierzonen geschieht, wie im Beispiel 1 7° wie im Beispiel 1 beschrieben. Der Extraktionsrückstand

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enthält neben einem dem Ausgangsmaterial ähnlichen werden. Das d-zl⁴-3,20-Dioxo-ll/?,18,21-trioxy-pregnen Produkt eine wie Aldosteron laufende Verbindung. Dieser kristallisiert aus Aceton-Äther-Gemisch. wird mittels präparativer Papierchromatographie (System . „ .

Bush C) gereinigt, wobei die Elution und Extraktion ge- .Beispiel y

maß der Beschreibung im Beispiel 1 erfolgt. Aus Aceton— 5 In einem Schüttelgefäß werden 200 cm³ einer Nähr-Äther erhält man kristallines/)⁴-3,18,20-Trioxo-ll/?,21-di- lösung, die auf 11 Leitungswasser 10 g Rohglucose, oxy-pregnen bzw. dessen Halbacetal, d. h. d-Aldosteron, 5 g Pepton, 3 g Fleischextrakt (Oxo Lab. Lemco), F. = 162 bis 168⁰C; [a]_D = +142⁰C (Aceton). 5 g Natriumchlorid und 10 g Calciumcarbonat enthält

. . und auf p_H = 7,5 gestellt wird, sterilisiert und mit einer

Beispiel 6 ₁₀ J^₁₁ItUr eines Stammes von Streptomyces albus beimpft.

In einem Schüttelgefäß werden 300 cm³ der im Bei- Man läßt 2 Tage bei 27⁰C schütteln und gibt dann unter spiel 4 beschriebenen Nährlösung sterilisiert und mit sterilen Bedingungen eine Lösung von 50 mg d,l~a-östra-Wojnowicia graminis beimpft. Nach viertägigem Schüt- diol (d,l-3,17-Dioxyöstren in 2 cm³ Dioxan zu. Es wird teln hat sich die Kultur gut entwickelt, und man gibt weitere 3 Tage bei 27⁰C geschüttelt, worauf das Mycel unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 50 mg 15 abgetrennt und das Kulturfiltrat mit Methylenchlorid d,l-zd⁴-3,18,20-Trioxo-ll/?-oxy-pregnen bzw. sein extrahiert wird. Der Extraktionsrückstand besteht 18,11-Cyclohalbacetal in 3 cm³ Methanol zu. Gleichzeitig gemäß papierchromatographischer Untersuchung aus werden in einem zweiten Schüttelgefäß 300 cm³ sterili- a-Östradiol und Östron entsprechenden Verbindungen, sierte Bierwürze mit Trichothecinum roseum beimpft. Mittels präparativer Papierchromatographie wird das Man läßt beide Kulturen 4 Tage bei 27° C schütteln, 20 Gemisch aufgetrennt, und man erhält durch Kristallivereinigt sie dann unter sterilen Bedingungen und läßt sation aus wäßrigem Methanol einerseits 1-a-Östradiol, weiter bei der gleichen Temperatur schütteln. Nach F. = 175 bis 178°C, [d\n — —8I⁰C, und anderer-4 Tagen wird das Mycel abgetrennt und mit Wasser und seits d-Östron (d-3-Oxy-17-oxo-östren) F. = 257 bis Essigester gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden, 259⁰C, [a\n = +161°. wie im Beispiel 1 beschrieben, extrahiert. Der Extraktions- 25

rückstand (55 mg) enthält neben einer Verbindung, die Beispiel IU

sich wie Ausgangsmaterial verhält, d-/l⁴-3,18,20-Trioxo- Zu 200 cm³ einer gut entwickelten Schüttelkultur von

Ilj8,17a,21-trioxy-pregnen, d. h. d-17a-Oxy-aldosteron. Pseudomonas gibt man unter sterilen Bedingungen eine Dieses wird nach präparativer Papierchromatographie Lösung von 50 mg d,l-Androsteron (d,l-3a-Oxy-17-oxo-(System Propylenglykol—Toluol) in einheitlichem Zu- 30 androsten) in 2 cm³ Dioxan. Man läßt 48 Stunden bei stand erhalten, wobei die Elution und Extraktion der 27⁰C schütteln und extrahiert dann die Kultur mit Papiere gemäß den Angaben im Beispiel 1 vorgenommen Methylenchlorid. Der Extraktionsrückstand verhält sich wird. gemäß papierchromatographischer Untersuchung wie

Beispiel 7 Androsteron und 3,17-Diketo-androstan. Er wird mittels

35 präparativer Papierchromatographie aufgetrennt, und

In einem Schüttelgefäß werden 300 cm³ Bierwürze man erhält durch Kristallisation aus wäßrigem Methanol sterilisiert und mit Trichothecium roseum beimpft. Die 1-Androsteron, F. = 180 bis 182° C, [a]z> = —92° C, und Kultur wird 4 Tage bei 27⁰C geschüttelt, worauf unter d-3,17-Diketo-androstan, F. = 130 bis 132° C, [a\n sterilen Bedingungen eine Lösung von 60 mg d,l-Aldo- = +109⁰C.

steron in 3 cm³ Methanol zugegeben wird. Man läßt 40 Beispiel 11

weitere 4 Tage bei 27° C schütteln, trennt dann das Mycel

ab und wäscht es mit Wasser und Essigester. Man extra- Zu 200 cm³ einer gut gewachsenen Schüttelkultur eines

hiert die vereinigten Filtrate, wie im Beispiel 1 be- Stammes von Streptomyces fradiae gibt man unter steschrieben. Der Extraktionsrückstand, der neben Aus- rilen Bedingungen eine Lösung von 50 mg d,l-Pregnengangsmaterial d-17a-Oxy-aldosteron enthält, wird mittels 45 olon (d,l-Zl⁵-3-Oxy-20-oxo-pregnen) in 2 cm Aceton, präparativer Papierchromatographie (System Bush C) Man läßt 24 Stunden bei 27° C schütteln und extrahiert aufgetrennt. Das d-17a-Oxy-aldesteron wird durch EIu- dann die Kultur mit Methylenchlorid. Der Extraktionstion der entsprechenden Zonen der Papiere nach den rückstand verhält sich gemäß papierchromatographischer Angaben im Beispiel 1 in einheitlicher Form gewonnen. Untersuchung wie Pregnenolon und Progesteron. Er wird Es kristallisiert aus einem Aceton-Äther-Gemisch. Aus 50 mittels präparativer Papierchromatograpbie aufgetrennt, den dem Ausgangsmaterial entsprechenden Zonen erhält und man erhält durch Kristallisation aus Aceton-Petrolman durch Kristallisation aus Äther—Aceton das 1-Aldo- äther-Gemischen 1-Pregnenolon, F. = 187 bis 189° C, steron vom F. = 162 bis 168⁰C und der Drehung [a]_D [a\_D = -25⁰C, und d-Progesteron, F. = 125 bis 127° C, = -142°C (Aceton). [α]_Ώ = + 190°C.

Beispiel 8 ⁵⁵ Beispiel 12

In einem Schüttelgefäß werden 300 cm³ sterile Bier- Wird im obigen Beispiel zur Umsetzung von d,l-

würze mit Ophiobolus herpotrichus beimpft und bei 27° C Pregnenolon an Stelle der Kultur des Stammes von Streptogeschüttelt. Nach 5 Tagen gibt man unter sterilen Be- myces fradiae eine solche von Aspergillus niger verwendet dingungen eine Lösung von 60 mg d,l-./l⁴-3,20-Dioxo- 60 und wird in der angegebenen Art und Weise inkubiert 11/9,18-dioxy-pregnen in 4 cm³ Methanol zu und läßt und aufgearbeitet, so kann man ebenfalls 1-Pregnenolon, weiter bei der gleichen Temperatur schütteln. Nach F. = 185 bis 188° C, [α}π = —23° C, und d-Progesteron, Tagen wird das Mycel abgetrennt und mit Wasser und F. = 123 bis 126° C, [a]o = + 191° C isolieren. Essigester gewaschen. Die vereinigten Filtrate extrahiert

man, wie im Beispiel 1 angegeben. Der Extraktions- 65 Beispiel Io

rückstand besteht gemäß der papierchromatographischen Man bereitet eine Nährlösung, die auf 11 Leitungs-

Auswertung aus einer dem Ausgangsmaterial ähnlichen wasser 2,6 g Weinsäure, 2,6 g Ammoniumtartrat, 0,17 g Verbindung sowie aus d-J*-3,20-Dioxo-ll/?,18,21-trioxy- Ammoniumsulfat, 0,4 g sek. Ammoniumphosphat, 0,4 g pregnen, welche mittels präparativer Papierchroma- Kaliumcarbonat, 0,27 g Magnesiumcarbonat, 50 g GIutographie (System Propylenglykol—Toluol) getrennt 70 kose und 1 g Hefeextrakt (Difco) enthält und stellt das

9 10

Pu auf 5,0 ein. 120 cm^s dieser Lösung werden in einem sulfatheptahydrat, 0,25 g Kaliumchlorid, 25 g Roh-Erlenmeyerkolben sterilisiert, mit Rhizopus nigricans glucose und 0,5 g Difco-Hefeextrakt in 500 cm³ Leitungsbeimpft und bei 27⁰C geschüttelt. Nach 2 Tagen gibt wasser gelöst, auf p_H ⁵ gebracht und sterilisiert. Diese man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg Nährlösung wird mit Didymella lycopersici beimpft und d,l-Progesteron in 1,5 cm³ Aceton zu und läßt weitere 5 3 Tage bei 27⁰C geschüttelt. Dann gibt man unter 2 Tage bei 27° C schütteln. Dann wird das Mycel abge- sterilen Bedingungen eine Lösung von 120 mg d,l-17a-Oxytrennt und mit Wasser und Methylenchlorid gewaschen. corticosteron in 5 cm⁸ Methanol zu. Man läßt weitere Man schüttelt die vereinigten Filtrate fünfmal mit Methy- 4 Tage bei 27⁰C schütteln, nutscht dann das Mycel ab lenchlorid aus, wäscht die Extrakte mit Wasser, trocknet und wäscht es mit Wasser und Essigester. Die vereinigten sie und dampft sie ein. Die papierchromatographische *o Filtrate werden, wie im Beispiel 13 beschrieben, ex-Untersuchung des Extraktionsrückstandes zeigt, daß träniert. Der Extraktionsrückstand besteht, wie die dieser zu ungefähr gleichen Teilen aus Verbindungen papierchromatographische Untersuchung ergibt, aus besteht, die dem Progesteron bzw. dem 11 a-Oxy- einem Produkt, das sich wie Ausgangsmaterial verhält, progesteron entsprechen. Mittels präparativer Papier- und aus l-Dehydro-^a-oxy-corticosteron. Mittels präpachromatographie wird das Gemisch aufgetrennt, und man 15 rativer Papierchromatographie (System Propylenglykol— erhält durch Umkristallisation aus Aceton-Petroläther- Toluol) wird das Gemisch aufgetrennt. Durch Um-* Gemischen einerseits 1-Progesteron vom F. = 118 bis kristallisieren aus Aceton erhält man einerseits das 120° C; [α]_ΰ = —187⁰C (in Dioxan) und andererseits d.l-Dehydro-^a-oxy-corticosteron vom F. = 234 bis d-lla-Oxy-progesteron vom F. = 169 bis 171°C, 236°C, [ö]d = + 98⁰C (in Dioxan), und andererseits das [Ct]₁J = -f 176⁰C (in Chloroform). ao 1-17a-Oxy-corticosteron vom F. = 208 bis 210°C,

[a]_D = -168⁰C (in absolutem Alkohol).

Beispiel 14 Beispiel 17

Man bereitet eine Nährlösung, die auf 11 Leitungs- Wie im vorhergehenden Beispiel beschrieben, stellt

wasser 10 g Rohrzucker, 10 g Hefeextrakt (bekannt unter 25 man eine Kultur von Didymella lycopersici her und gibt dem Handelsnamen Difco-Trypton), 2 g Natriumnitrat, dann eine Lösung von 120 mg d,l-17a-Oxy-corticosteron·.· Ig sek. Kaliumphosphat, 0,5g Magnesiumsulfat, 0,5g 21-trimethylacetat in 5cm³ Aceton zu. Nach 4tägigem Kaliumchlorid und 10 mg Ferrosulfat-heptahydrat ent- Schütteln bei 27⁰C wird auf gleiche Weise aufgearbeitet, hält, stellt das p_H auf 7,0 ein und gibt dann 2,5 g Calcium- Der Extraktionsrückstand besteht auf Grund der papier·? carbonat zu. 120 cm³ dieser Lösung werden in einem 30 chromatographischen Auswertung zur Hauptsache aus Erlenmeyerkolben sterilisiert, mit Curvularia lunata zwei Produkten, die sich wie Ausgangsmaterial bzw. wie beimpft und bei 27⁰C geschüttelt. Nach 2 Tagen wird l-Dehydro-^a-oxy-corticosteron-trimethylacetat verdas Mycel abgetrennt, mit wenig Wasser gewaschen und halten. Mittels präparativer Papierchromatographie wird in 120 cm³ destilliertem Wasser suspendiert. Zu dieser das Gemisch aufgetrennt, und man erhält durch Kristalli-Suspension gibt man eine Lösung von 30 mg d,l-Cortexon 35 sation aus Essigester einerseits l-^ct-Oxy-corticosteronin 1,5 cm³ Aceton und läßt sie 30 Stunden bei 27⁰C 21-trimethylacetat vom F. = 231 bis 232°C, [α]ό schütteln. Dann wird das Gemisch viermal mit Essigester = 145⁰C (in Dioxan) und andererseits d-1-Dehydroausgeschüttelt. Die Extrakte wäscht man mit Wasser, 17a-oxycorticosteron-21-trimethylacetat vom F. = 233 trocknet sie und dampft sie ein. Der Extraktionsrück- bis 236°C, [<x]d = + 103⁰C (in Chloroform),
stand besteht gemäß papierchromatographischer Aus- 40 .

Wertung zur Hauptsache aus zwei Substanzen, die dem Beispiel

Cortexon bzw. dem Corticosteron entsprechen. Mittels 120 cm³ der im Beispiel 16 beschriebenen Nährlösung

präparativer Papierchromatographie und anschließender werden mit Didymella lycopersici beimpft und 2 Tage bei Kristallisation aus Aceton-Petroläther-Gemischen erhält 27° C geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Beman 1-Cortexon vomF. = 138bis 141°C, [α]χ> = —175°C 45 dingungen eine Lösung von 30 mg d,l-Aldosteron in (in absolutem Alkohol) und d-Corticosteron (d-z4⁴-3,20- 1,5 cm³ Aceton zu und schüttelt weiter bei der gleichen Dioxo-ll,21-dioxypregnen) vom F. = 178 bis 181⁰C, Temperatur. Nach 3 Tagen trennt man das Mycel ab und [a]r> — +22O⁰C (in absolutem Alkohol). wäscht es mit Wasser und Essigester. Die vereinigten

Filtrate werden, wie im Beispiel 13 beschrieben, extraBeispiel 15 5° hiert. Wie die papierchromatographische Untersuchung

zeigt, besteht der Extraktionsrückstand aus einem Pro-

Gibt man zu einer Mycelsuspension von Curvularia dukt, das sich wie Aldosteron verhält, und aus 1-Dehydrolunata in 120 cm³ destilliertem Wasser, die wie im obigen aldosteron. Mittels präparativer Papierchromatographie Beispiel erhalten wurde, eine Lösung von 30 mg (System Bush C) werden die beiden Substanzen getrennt d,l-17a-Oxy-cortexon in 1,5 cm³ Methanol, und arbeitet 55 und hierauf aus einem Aceton-Äther-Gemisch kristalliman, wie beschrieben, nach 2tägigem Schütteln bei 27°C siert. Man erhält 1-Aldosteron (F. = 110°C/158 bis 165°C; auf, so enthält der Extraktionsrückstand gemäß papier- [α]ο = —141⁰C [Aceton]) und d,l-Dehydro-aldosteron chromatographischer Auswertung zur Hauptsache zwei (IR-Banden in Chloroform unter anderem bei 2,82 μ, Substanzen, die dem 17a-Oxy-cortexon bzw. dem 2,95 μ, 5,87 μ, 6,01 μ, 6,17 μ, 6,24 μ, 6,91 μ, 7,15 μ, 17ct-Oxy-corticosteron entsprechen. Das Gemisch wird 60 7,31 μ, 7,77 μ, 9,42 μ, 10,68 μ und 11,28 μ),
mittels präparativer Papierchromatographie aufgetrennt, d,l-Dehydro-aldosteron wird in üblicher Weise mit

und man erhält einerseits l-17a-Oxy-cortexon vom Pyridin—Acetanhydrid acetyliert. Man erhält ein Ge-F. = 210 bis 214⁰C, [a]a = —14O⁰C (in absolutem misch zweier Produkte, die im Papierchromatogramm Alkohol) und andererseits d-17a-Oxy-corticosteron mit dem System Propylenglykol—Toluol R_F-Werte von (d-Hydrocortison) vom F. = 209 bis 212⁰C, [ö\d — 65 0,70 bzw. von 0,15 zeigen und das d.l-Dehydro-aldosteron- + 171°C (in absolutem Alkohol). ' 18,21-diacetat bzw. das d,l-Dehydro-aldosteron-21-mono-

. . acetat darstellen. Das letztere erhält man in reiner

Beispiel 16 kristallisierter Form, wenn man das rohe Gemisch der

In einem Schüttelgefäß werden 1 g Natriumnitrat, Acetate mit absolutem Äther behandelt. F. = 182 bis

0,5 g prim. Kalium-ortho-phosphat, 0,25 g Magnesium- 7c 185⁰C, IR-Banden in Methylen.chlorid unter anderem

11 12

bei 2,81 μ, 5,74 μ, 6,01 μ, 6,16 μ, 6,23 μ, 7,31 μ, 8,17 μ, Untersuchung aus einem Produkt, das sich wie Ausgangs-* 8,93 μ, 8,82 μ, 9,72 μ, 10,03 μ, 10,22 μ, 10,62 μ, 11,32 μ material verhält, und aus Aldosteron. Mittels präpara- und 12,29 μ, tiver Papierchromatographie werden die beiden Sub

Beispiel 19 stanzen getrennt, und man erhält l-4⁴-3,18,20-Trioxo=

. 5 lljS-oxypregnen bzw. dessen 18,11-Cyclohalbacetal und

Man bereitet, wie im Beispiel 18 beschrieben, 120 cm³ d-Aldosteron ([α]ζ> = + 142° C).

einer Kultur von Didymella lycopersici. Dazu wird unter Das eingesetzte Ausgangsmaterial kann z. B. nach dem

sterilen Bedingungen eine Lösung von 25 mg d,l-Cortison in der deutschen Patentanmeldung R18742 IVb/12o) in 1,5 cm³ Methanol gegeben. Man läßt 3 Tage bei 27° C angegebenen Verfahren hergestellt werden, schütteln und trennt dann das Mycel ab. Dieses wird mit iq

Wasser und Essigester gewaschen. Man extrahiert die Beispiel 23

vereinigten Filtrate, wie im Beispiel 13 beschrieben. Der

Extraktionsrückstand besteht gemäß papierchromato- 120 cm³ sterile Bierwürze werden mit einer Kultur von

graphischer Untersuchung aus 1-Dehydro-cortison und Ophiobolus herpotrichus beimpft und 3 Tage bei 27°C aus einem Produkt, das sich wie Cortison verhält. Diese 15 geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen beiden Substanzen werden mittels präparativer Papier- eine Lösung von 40 mg d,l-19-Nor-progesteron (d,l-Zl⁴-chromatographie aufgetrennt. Man erhält einerseits 3,20-Dioxo-19-nor-pregnen) in 1,5 cm³ Aceton zu und läßt d,l-Dehydro-cortison (d-^-S.ll^O-trioxo-^^l-dioxy- weiter bei 27°C schütteln. Nach 3 Tagen wird das Mycel pregnadien) (F. = 231 bis 234 C, [d\p = + 169⁰C [Di- abgetrennt und mit Wasser und Essigester gewaschen, oxan]) und andererseits 1-Cortison (F. = 215°C, 20 Man extrahiert die vereinigten Filtrate, wie im Beispiel! 3 [d\r> = —210⁰C [Dioxan]). beschrieben. Der Extraktionsrückstand besteht gemäß

papierchromatographischer Untersuchung aus einem

Beispiel 21) Produkt, das sich wie Ausgangsmaterial verhält, und aus

120 cm³ einer sterilisierten Czapek-Dox-Nährlösung 19-Nor-cortexon. Mittels präparativer Papierchromatowerden mit einer Kultur von Trichothecium roseum 25 graphie werden die beiden Substanzen getrennt, und man beimpft und 5 Tage bei 27°C geschüttelt. Dann gibt man erhält 1-19-Nor-progesteron {[a]_B = — 143°C) und d-19-unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg Nor-cortexon. Letzteres wird in üblicher Weise mittels d,l-Aldosteron in 1,5 cm³ Aceton zu und schüttelt weiter Pyridin-Acetanhydrid acetyliert. Das 21-Acetat zeigt bei der gleichen Temperatur. Nach 4 Tagen wird das ein [ab von + 145° C, Mycel abgetrennt und mit Wasser und Essigester ge- 30 . . . ..

waschen. Die vereinigten Filtrate extrahiert man, wie im Beispiel ^4

Beispiel 13 beschrieben. Gemäß der papierchromato- 120 cm³ sterile Bierwürze werden mit einer Kultur von

graphischen Untersuchung besteht der Extraktions- Ophiobolus herpotrichus beimpft und 3 Tage bei 27⁰C rückstand zur Hauptsache aus einem Produkt, das sich geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen wie Aldosteron verhält, und aus 17a-Oxy-aldosteron. Die 35 eine Lösung von 40 mg d,l-9a-Fluor-ll/?-oxy-progesteron beiden Substanzen werden mittels präparativer Papier- (J*-3,20-DioxO'U/5-oxy-9a-nuor-pregnen) in 1,5 cm³ Ace-Chromatographie (System Bush C) getrennt. Man erhält ton zu und läßt weiter bei 27° C schütteln. Nach 4 Tagen 1-Aldosteron und d-^ct-Qxy-aldosteron. wird das Mycel abgetrennt und mit Wasser und Essig'

_R . _, ester gewaschen. Man extrahiert die vereinigten Filtrate,

Beispiel Zi ₄₀ ^₆ ^_n B_ej_spi_ei ^3 beschrieben. Der Extraktionsrüek-

120 cm³ sterile Bierwürze werden mit einer Kultur von stand besteht gemäß papierchromatographischer Unter-Ophiobolus herpotrichus beimpft und 3 Tage bei 27° C suchung aus einem Produkt, das sich wie Ausgangsgeschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen material verhält, und aus Qa-Fluor-corticosteron. Mittels eine Lösung von 40 mg d,l-/J⁴-3,20-Diketo-ll/3-oxy- präparativer Papierchromatographie werden die beide». pregnen-18-säure-lakton-(18 -*■ ilß) in 1,5 cm³ Aceton 45 Substanzen getrennt, und man erhält 1-9a-Fluor-llß-oxyzu und läßt weiter bei 27°C schütteln. Nach 6 Tagen wird progesteron ([α]# = —190°C) und 9a-Fluor-cortico<5teron, das Mecyl abgetrennt und mit Wasser und Essigester Letzteres wird in üblicher Weise mittels Pyridin—Acetgewaschen. Man extrahiert die vereinigten Filtrate, wie anhydrid acetyliert. Das 21-Monoacetat zeigt ein [a]p im Beispiel 13 beschrieben. Der Extraktionsrückstand von + 187° C. besteht gemäß papierchromatographischer Untersuchung 50 Beispiel 25

aus einem Produkt, das sich wie Ausgangsroaterial ver-

hält, und aus 2l⁴-3,2Q-Diketa41jiiö21-dioxy-pregnen- 120 cm³ sterile Bierwürze werden mit einer Kultur von

18-säure-lakton-(18 ->· 11 ß). Mittels präparativer Papier- Rhizopus species beimpft und 3 Tage bei 27° C geschüttelt, Chromatographie werden die beiden Substanzen getrennt, Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung und man erhält l-zJ⁴-3,20-Diketo-ll/3-oxy-pregnen- 55 von 30 mg d,l-Cortexon {ll-Desoxy-eorticosteron, d,l-.<d** 18-säure-lakton-(18 ■+■ Uß) ([α]χ> = —154° C) und 3,20-Dioxo-21-oxy-pregnen) in 1,5 cm³ Aceton zu und läßt d-J*-3,20-Diketo41/3,21-dioxy-pregnen-18-säure-lakton- weiter bei 27°C schütteln. Nach 4 Tagen wird das (18 ->- U/S) ([o]z> = + 117⁰C). Mycel abgetrennt und das Kulturfiltrat, wie in den vor-

„ . ■ 1 00 herigen Beispielen beschrieben, extrahiert. Der Extrak-

eispie 4 _6o tionsrückstand besteht gemäß papierchromatographischer

120 cm³ sterile Bierwürze werden mit einer Kultur von Untersuchung zur Hauptsache aus einem Produkt, das Ophiobolus herpotrichus beimpft und 3 Tage bei 27⁰C sich wie Ausgangsmaterial verhält, und aus 6/?-0xygeschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen cortexon. Mittels präparativer Papierchromatographie eine Lösung von 40 mg d,M*-3,18,20-Trioxo-ll/3-oxy- werden die beiden Substanzen getrennt. Man erhält pregnen bzw. dessen IS.ll-Cyclohalbaeetal in 1,5 cm³ 65 1-Cortexon ([«]# = —175° C) und d-6/?-Oxy-cortexon Aceton zu und läßt weiter bei 27° C schütteln. Nach ([α]_Ώ = + 100° C). Tagen wird das Mycel abgetrennt und mit Wasser und Beismel 26

Essigester gewaschen. Man extrahiert die vereinigten "

Filtrate, wie im Beispiel 13 beschrieben. Der Extraktions- 120 cm³ sterile Bierwürze werden mit einer Kultur von

rückstand besteht gemäß papierchromatographischer 70 Peziza sp,, ETH M 26, beimpft und 3 Tage bei 27° C ge-

schüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg d,l-Cortexon (11-Desoxy-corticosteron) in 1,5 cm³ Aceton zu und läßt weiter bei 27⁰C schütteln. Nach 4 Tagen wird das Mycel abgetrennt und das Kulturfiltrat, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben, extrahiert. Der Extraktionsrückstand besteht gemäß papierchromatographischer Untersuchung zur Hauptsache aus einem Produkt, das sich wie Ausgangsmaterial verhält, und aus 7a-Oxy-cortexon. Mittels präparativer Papierchromatographie werden die beiden Substanzen getrennt. Man erhält 1-Cortexon ([(x]d = -173⁰C) und d-7a-Oxycortexon ([a]_D = + 155⁰C).

Beispiel 27

120 cm³ steiile Bierwürze werden mit einer Kultur von Lenzites abietina beimpft und 3 Tage bei 27⁰C geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg d,l-Cortexon (11-Desoxy-corticosteron) in 1,5 cm³ Aceton zu und läßt weiter bei 27°C schütteln. Nach 4 Tagen wird das Mycel abgetrennt und das Kulturfiltrat, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben, extrahiert. Der Extraktionsrückstand besteht gemäß papierchromatographischer Untersuchung zur Hauptsache aus einem Produkt, das sich wie Ausgangsmaterial verhält, und aus 15/?-Oxycortexon. Mittels präparativer Papierchromatographie werden die beiden Substanzen getrennt. Man erhält 1-Cortexon ([α]χ> = — 170°C) und d-15^-Oxy-cortexon {[a]_D = + 141°C).

Beispiel 28

120 cm³ sterile Czapek-Dox-Nährlösung werden mit einer Kultur von Gibberella baccata beimpft und 3 Tage bei 27° C geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg d,l-Cortexon (11-Desoxy-corticosteron) in 1,5 cm³ Aceton zu und läßt weiter bei 27⁰C schütteln. Nach 4 Tagen wird das Mycel abgetrennt und das Kulturfiltrat, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben, extrahiert. Der Extraktionsrückstand besteht gemäß papierchromatographischer Untersuchung zur Hauptsache aus einem Produkt, das sich wie Ausgangsmaterial verhält, und aus 15a-Oxy-cortexon. Mittels präparativer Papierchromatographie werden die beiden Substanzen getrennt. Man erhält 1-Cortexon (Md = —169°C) und d-lSa-Oxy-cortexon ([a]_D = + 195° C).

Beispiel 29

120 cm³ sterile Bierwürze werden mit einer Kultur von Pleospora Gaeumanni beimpft und 3 Tage bei 27° C geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg d,l-Cortexon (11-Desoxy-corticosteron) in 1,5 cm³ Aceton zu und läßt weiter bei 27° C schütteln. Nach 4 Tagen wird das Mycel abgetrennt und das Kulturfiltrat, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben, extrahiert. Der Extraktionsrückstand besteht gemäß papierchromatographischer Untersuchung zur Hauptsache aus einem Produkt, das sich wie Ausgangsmaterial verhält, und aus 14cc-Oxycortexon. Mittels präparativer Papierchromatographie werden die beiden Substanzen getrennt. Man erhält 1-Cortexon ([α]χ> = — 174⁰C) und d-14a-Oxy-cortexon {[a]_D = + 179°C).

Beispiel 30

120 cm³ einer Nährlösung, die auf 11 Leitungswasser 10 g Rohglukose, 5 g Pepton, 5 g NaCl, 3 g Fleischextrakt (bekannt unter dem Handelsnamen Oxo Lab Lemco) und 10 g CaCO₃ enthält und mit verd. NaOH auf pn 7,5 gebracht wird, werden sterilisiert und mit einer Kultur des Streptomyces-Stammes Nr. 7747 (Institut für spezielle Botanik, ETH Zürich) beimpft. Man läßt Tage bei 27⁰C schütteln und gibt dann unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg d,l-Cortexon in 1,5 cm³ Aceton zu. Man schüttelt weiter bei der gleichen Temperatur und trennt nach 2 Tagen das Mycel ab. Das Kulturfiltrat wird, wie im Beispiel 13 beschrieben, extrahiert. Der Extraktionsrückstand besteht gemäß papierchromatographischer Untersuchung aus einem Produkt, das sich wie Ausgangsmaterial verhält, und aus 16a-Oxy-cortexon (A ⁴-3,20-Dioxo-l6,21 -dioxy-pregnen). Die beiden Substanzen werden mittels präparativer Papierchromatographie getrennt. Man erhält 1-Cortexon ([Ct]₁, = — 171⁰C) und d-loa-Oxy-cortexon {[a]_D = + 114⁰C).

Die verfahrensgemäß zu verwendenden Ausgangsstoffe lassen sich nach an sich bekannten Verfahren, ausgehend von den totalsynthetisch zugänglichen tetracyclischen Zwischenprodukten, z. B. der Cholestan-, Pregnan- oder Testanreihe, herstellen.

Claims (8)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Racematspaltung von d,l-Steroiden, dadurch gekennzeichnet, daß man auf d,l-Steroide der Östran-, Pregnan-, Androstan- oder Testanreihe oder die entsprechenden 19-Norverbindungen durch aerobe Kulturen von Mikroorganismen produzierte oxydierende Enzyme einwirken läßt und mindestens eine der enantiomorphen Formen isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man hydroxylierende oder dehydrierende Enzyme verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man aerobe Kulturen von solchen Mikroorganismen verwendet, die in 6-, 7-, 8-, 11-, 14-, 15-, 16-, 17- oder 21-Stellung eine Hydroxylgruppe einzuführen vermögen.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man aerobe Kulturen von solchen Mikroorganismen verwendet, die in 6-, 7-, 11-, 15- oder 16-Stellung Oxogruppen einzuführen vermögen.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man aerobe Kulturen von solchen Mikroorganismen verwendet, die in 1 (2) und/oder 4 (5)-Stellung eine Doppelbindung einzuführen vermögen.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man aerobe Kulturen von solchen Mikroorganismen verwendet, die Hydroxylgruppen in 3- und/oder 17-Stellung zu Oxogruppen zu dehydrieren vermögen.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem Arbeitsgang mehrere Mikroorganismen einwirken läßt.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsstoffe d,l-Pregnanverbindungen, insbesondere d,l-Progesteron, d,l-Cortexon, d,l-Cortison, d,l-Zl⁴-3,20-Dioxo-ll^-oxypregnen-18-säure-lakton-(18->-ll), d,l-Zl⁴-3,18,20-Trioxo-lljÖ-oxy-pregnen bzw. sein 18,11-Cyclohalbacetal, d,l-zJ⁴-3,20-Dioxo-ll/S,18-dioxy-pregnen, in 17 α-Stellung hydroxylierte Verbindungen, insbesondere d,l-Zl ⁴-3,18,20-Trioxo-l 1/3,17 a-dioxy-pregnen oder d,l-A ⁴-3,20-Dioxo-l 1 /?, 18,17-trioxypregnen, oder Androstanverbindungen, insbesondere d,l-Androstendiol, d,l-17-Methyl-androstendiol, d,l-Dehydroepiandrosteron oder d,l-Pregnenolon, verwendet.

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