WO1996015253A1 - Verfahren zur herstellung von 1-hydroxymethyl-1.4-androstadien-3.17-dion - Google Patents

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WO1996015253A1
WO1996015253A1 PCT/EP1995/001231 EP9501231W WO9615253A1 WO 1996015253 A1 WO1996015253 A1 WO 1996015253A1 EP 9501231 W EP9501231 W EP 9501231W WO 9615253 A1 WO9615253 A1 WO 9615253A1
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dione
androstadiene
hydroxymethyl
methyl
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PCT/EP1995/001231
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Inventor
Matthias Gottwald
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Schering Aktiengesellschaft
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/06—Hydroxylating

Definitions

  • the invention relates to a process for the preparation of l-hydroxymethyl-1,4-androstadiene-3.17-dione of the formula I.
  • l-hydroxymethyl-1,4-androstadiene-3.17-dione is a pharmacologically active compound (EP-B 0,129,500) and an important intermediate for the preparation of active substances (DE-A 4,330,237.8). According to the prior art known so far, this substance is ultimately produced in a multi-stage, very complex chemical synthesis from 1,4-androstadiene-3.17-dione, as can be seen from the already mentioned European patent EP-B 0,129,500.
  • this compound can be prepared in a relatively simple manner by fermentation from l-methyl-1.4-androstadiene-3.17-dione, which in turn can be synthesized in a one-step reaction from 1.4-androstadiene-3.17-dione ( WO 94/04553).
  • Suitable microorganisms for carrying out the method according to the invention are, as already mentioned, those of the genus Asidia, Aspergillus, Botrydiplodia, Glomerella, Haplosporeila, Rhizopus or Streptomyces.
  • Absidia coerulea (ATCC 6647), Aspergillus oniki (CBS 11832), Botryodiplodia malorum (CBS 13450), Glomerella cingulata (ATCC 12097 and IFO 5257), Haplosporeila acaciae (CBS 46969), Rhizopus arrhiz have proven to be particularly suitable 11145) and Streptomyces platensis (NRRL 2364).
  • the process according to the invention is carried out under the fermentation conditions which are also used in the known microbiological conversions of other substrates with these microorganism cultures.
  • submerged cultures are grown in a suitable nutrient medium with aeration.
  • a solution for example in methanol, ethanol, glycol monomethyl ether, dimethylformamide or dimethyl sulfoxide
  • an aqueous suspension of l-methyl-1,4-androstene-3.17-dione is then added to the culture and fermented until a maximum substrate conversion is reached.
  • the aqueous suspension of l-methyl-1.4-androsten-3.17-dione can be prepared in a simple manner by, for example, grinding this substance with twice at five times the amount of water with the addition of a nonionic surfactant in a ball mill until it has a particle size of approx Has 1 to 5 ⁇ .
  • Suitable surfactants are, for example, the commercially available wetting agents such as Tegin ®, Tween ® or Span ®.
  • the culture is prepared in a customary manner, for example by extracting it with an alcohol, ketone or ester which is poorly soluble in water, concentrating the extract and purifying the residue obtained by chromatography and / or crystallization.
  • a 1500 fermenter is inoculated with each 1500 ml of this cultivation, which is charged with 23.5 l of sterile medium of the same composition as described for the preculture. After a growth phase of 12 hours at 0.7 bar overpressure with aeration (15 1 / min) and stirring (220 revolutions per minute), a sterile-filtered solution of 5 g l-methyl-1,4-androstadien-3.17-dione in 75 ml dimethylformamide added and further stirred and aerated. Foaming is controlled by adding silicone SH. After 36 hours of contact time, the culture broth is extracted with 12.51 and twice with 8 1 methyl isobutyl ketone.
  • a 2-1 Erlenmeyer flask containing 1000 ml of a nutrient solution sterilized in an autoclave for 30 minutes at 120 ° C from 3% glucose, 1.0% Com Steep liquor, 0.2% NaN ⁇ 3, 0.1% KH 2 PO, 0.2% K 2 HPO 4 , 0.05 % MgSO 4 • 7H 2 0, 0.002% FeSO 4 • 7H 2 O and 0.05% KCI (pH 5.7) is inoculated with a slant tube culture from the strain Aspergillus on ⁇ (CBS 118329) and inoculated for 2.5 days at 30 ° C Rotary shaker shaken.
  • a 201 fermenter is inoculated, which is charged with 19 1 sterile medium of the same composition as described for the preculture.
  • 19 1 sterile medium of the same composition as described for the preculture.
  • a steri. filtered solution of 4 g of l-methyl-1,4-androstadiene-3,17-dione (ZK 95639) 1 in 75 ml of dimethylformamide are added and the mixture is stirred and aerated further.
  • Foaming is controlled by adding silicone SH.
  • the culture broth is extracted once with 101 and once with 81 methyl isobutyl ketone. Chromatography on silica gel with a gradient of hexane and acetone and crystallization from acetone / isoether gives 1.96 g 2.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 1-Hydroxymethyl-1.4-androstadien-3.17-dion der Formel (I), welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man 1-Methyl-1.4-androstadien-3.17-dion der Formel (II) mit einer lebenden Kultur eines Microorganismus der Gattung Absidia, Aspergillus, Botrydiplodia, Glomerella, Haplosporella, Rhizopus oder Streptomyces fermentiert.

Description

Verfahren zur Herstellung von l-HydroxymethyI-1.4-androstadien -3.17-dion
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von l-Hydroxymethyl-1.4- androstadien-3.17-dion der Formel I
Figure imgf000003_0001
welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man l-Methyl-1.4-androstadien-3.17-dion der Formel II
Figure imgf000003_0002
mit einer lebenden Kultur eines Mikroorganismus der Gattung Absidia, Aspergillus, Botrydiplodia, Glomerella, Haplosporeila, Rhizopus oder Streptomyces fermentiert.
l-Hydroxymethyl-1.4-androstadien-3.17-dion ist bekanntlich eine pharmakologisch wirksame Verbindung (EP-B 0,129,500) und ein wichtiges Zwischenprodukt zur Herstellung von Wirksubstanzen (DE-A 4.330,237.8). Nach dem bisher gekannten Stand der Technik wird diese Substanz in einer vielstufigen, sehr aufwendigen chemischen Synthese letztlich aus 1.4-Androstadien-3.17-dion hergestellt, wie aus der bereits erwähnten Europäischen Patentschrift EP-B 0,129,500 ersichtlich ist.
Es wurde nun gefunden, daß man diese Verbindung in relativ einfacher Weise auf fermentativem Wege aus l-MethyI-1.4-androstadien-3.17-dion herstellen kann, welches selbst wiederum in einer einstufigen Reaktion aus 1.4-Androstadien-3.17-dion synthetisiert werden kann (WO 94/04553). Geeignete Mikroorganismen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sinbd wie bereits erwähnt solche der Gattung Asidia, Aspergillus, Botrydiplodia, Glomerella, Haplosporeila, Rhizopus oder Streptomyces. Als besonders geeignet haben sich solche der Spezies Absidia coerulea (ATCC 6647), Aspergillus oniki (CBS 11832), Botryodiplodia malorum (CBS 13450), Glomerella cingulata (ATCC 12097 und IFO 5257), Haplosporeila acaciae (CBS 46969), Rhizopus arrhizus (ATCC 11145) und Streptomyces platensis (NRRL 2364) erwiesen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter den Fermentationsbedingungen durchgeführt, welche man auch bei den bekannten mikrobiologischen Umwandlungen von anderen Substraten mit diesen Mikroorganismen-Kulturen anwendet.
Unter den für diese Mikroorganismen üblicherweise verwendeten Kulturbedingungen werden in einem geeigneten Nährmedium unter Belüften Submerskulturen angezüchtet. Dann setzt man der Kultur eine Lösung (beispielsweise in Methanol, Ethanol, Glykolmonomethylether, Dimethylforma id oder Dimethylsulfoxid) oder eine wässrige Suspension des l-Methyl-1.4-androsten-3.17-dion zu und fermentiert bis eine maximale Substratumwandlung erreicht ist.
Die wässrige Suspension des l-Methyl-1.4-androsten-3.17-dions läßt sich in einfacher Weise herstellen, indem man beispielsweise dieser Substanz mit der zweifachen bei fünffachen Menge Wasser unter Zusatz eines nichtionischen Tensids in einer Kugelmühle mahlt, bis sie eine Korngröße von ca. 1 bis 5 μ besitzt. Geeignete Tenside sind beispielsweise die handelsüblichen Netzmittel wie Tegin ®, Tween ® oder Span ® genannt.
Nach erfolgter Fermentation wird die Kultur in üblicher Weise aufbereitet, beispielsweise indem man sie mit einem in Wasser schwer löslichen Alkohol, Keton oder Ester extrahiert, den Extrakt einengt und den erhaltenen Rückstand durch Chromatographie und/oder Kristallisation aufreinigt.
Das nachfolgende Ausführungsbeispiel dient zur nächeren Erläuterung des erfindungs¬ gemäßen Verfahrens. Beispiel 1
Zwei 2-1 Erlenmeyerkolben, die je 1000 ml einer 30 Minuten bei 120°C im Autoklaven sterilisierten Nährlösung aus 1% Com steep liquor und 1,25 % Sojabohnenmehl (pH 6.2) enthalten, werden mit einer Schrägröhrchen-Kultur des Stammes Aspergillus ochraceus (NRRL 405) beimpft und 2 Tage bei 30°C auf einem Rotationsschüttler geschüttelt.
Mit je 1500 ml dieser Anzucht wird ein 301-Fermenter beimpft, der mit 23,5 1 sterilen Mediums der gleichen Zusammensetzung wie für die Vorkultur beschrieben beschickt ist. Nach einer Anwachsphase von 12 Stunden bei 0,7 bar Überdruck unter Belüftung (15 1/min) und Rühren (220 Umdrehungen pro Minute) wird eine sterilfiltrierte Lösung von 5 g l-Methyl-1.4-androstadien-3.17-dion in 75 ml Dimethylformamid hinzugegeben und weiter gerührt und belüftet. Schaumbildung wird durch Zugabe von Silikon SH kontrolliert. Nach 36 Stunden Kontaktzeit wird die Kulturbrühe einem mit 12,51 und zweimal mit 8 1 Methylisobutylketon extrahiert.
Die vereinigten Extrakte aus 12 Fermentern mit einem Substanzeinsatz von 69 g werden am Rotationsverdampfer bis auf ca. 1 1 eingeengt, wobei das gewünschte Produkt auskristalisiert. Man erhält 59,43 g l-Hydroxymethyl-l,4-androstadien-3,17-dion als leicht verunreinigtes Rohprodukt (Schmelzpunkt 195/197-198°C). Die Chromatographie der Mutterlaugen an Kieselgel mit einem Gradienten aus Dichlormethan und Aceton und Kristallisation aus Aceton liefert weitere 7,95 g 1- HydroxymethyI-l,4-androstadien-3,17-dion (Schmelzpunkt 206-208° .
Beispiel 2
Ein 2-1 Erlenmeyerkolben, der mit 1000 ml einer 30 Minuten bei 120°C im Autoklaven sterilisierten Nährlösung aus 3% Glucose, 1.0% Com Steep liquor, 0.2% NaNθ3, 0.1% KH2PO , 0.2% K2HPO4, 0.05% MgSO4 • 7H20, 0.002% FeSO4 • 7H2O und 0.05% KCI (pH 5.7) enthält, wird mit einer Schrägröhrchen-Kultur des Stammes Aspergillus onϋά (CBS 118329) beimpft und 2.5 Tage bei 30°C auf einem Rotationsschüttler geschüttelt. Mit 1 1 dieser Anzucht wird ein 201-Fermenter beimpft, der mit 19 1 sterilen Mediums der gleichen Zusammensetzung wie für die Vorkultur beschrieben beschickt ist. Nach einer Anwachsphase von 12 Stunden bei 0.7 bar Überdruck (29°C) unter Belüftung (201/min) und Rühren (220 Upm) wird eine steri. filtrierte Lösung von 4 g l-Methyl-1,4- androstadien-3,17-dion (ZK 95639) 1 in 75 ml Dimethylformamid hinzugegeben und weiter gerührt und belüftet. Schaumbildung wird durch Zugabe von Silikon SH kontrolliert. Nach 35 Stunden Kontakt wird die Kulturbrühe einmal mit 101 und einmal mit 81 Methylisobutylketon extrahiert. Die Chromatographie an Kieselgel mit einem Gradienten aus Hexan und Aceton und Kristallisation aus Aceton/Isoether liefert 1.96 g 2.

Claims

Patentanspruch
Verfahren zur Herstellung von l-Hydroxymethyl-1.4-androstadien-3.17-dion der Formel I
Figure imgf000007_0001
welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man l-Methyl-1.4-androstadien-3.17-dion der Formel II
Figure imgf000007_0002
mit einer lebenden Kultur eines Mikroorganismus der Gattung Absidia, Aspergillus, Botrydiplodia, Glomerella, Haplosporeila, Rhizopus oder Streptomyces fermentiert.
PCT/EP1995/001231 1994-11-14 1995-04-03 Verfahren zur herstellung von 1-hydroxymethyl-1.4-androstadien-3.17-dion WO1996015253A1 (de)

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DEP4441597.4 1994-11-14
DE4441597 1994-11-14

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PCT/EP1995/001231 WO1996015253A1 (de) 1994-11-14 1995-04-03 Verfahren zur herstellung von 1-hydroxymethyl-1.4-androstadien-3.17-dion

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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2921052A1 (de) * 1978-05-23 1980-01-17 Richter Gedeon Vegyeszet Bei aerober gaerung zur einfuehrung einer 12 beta -hydroxygruppe in den aglykonteil von 12-desoxyherzglykosiden faehiger aus waldboeden erhaeltlicher mikroorganismenstamm und verfahren zur herstellung von 12 beta -hydroxycardenolidverbindungen
EP0033120A1 (de) * 1980-01-23 1981-08-05 Schering Aktiengesellschaft 1-Hydroxysteroide, Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische Präparate, die diese Verbindungen enthalten
US4379842A (en) * 1980-02-13 1983-04-12 Hoffmann-La Roche Inc. Process for the manufacture of 1α-hydroxydehydroepiandrosterone
EP0129500A2 (de) * 1983-06-18 1984-12-27 Schering Aktiengesellschaft 1-Alkyl-androsta-1,4-dien-3,17-dione, Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Präparate
EP0139907A2 (de) * 1983-08-26 1985-05-08 Schering Aktiengesellschaft Verfahren zur Herstellung von Estran-Derivaten

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