DE60003424T2 - Hydroxylierung von compactin zu pravastatin unter verwendung von micromonospora bakterien - Google Patents
Hydroxylierung von compactin zu pravastatin unter verwendung von micromonospora bakterien Download PDFInfo
- Publication number
- DE60003424T2 DE60003424T2 DE60003424T DE60003424T DE60003424T2 DE 60003424 T2 DE60003424 T2 DE 60003424T2 DE 60003424 T DE60003424 T DE 60003424T DE 60003424 T DE60003424 T DE 60003424T DE 60003424 T2 DE60003424 T2 DE 60003424T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- strain
- micromonospora
- compound
- pravastatin
- idr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241000187708 Micromonospora Species 0.000 title claims description 19
- TUZYXOIXSAXUGO-UHFFFAOYSA-N Pravastatin Natural products C1=CC(C)C(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C2C(OC(=O)C(C)CC)CC(O)C=C21 TUZYXOIXSAXUGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 74
- 229960002965 pravastatin Drugs 0.000 title description 74
- TUZYXOIXSAXUGO-PZAWKZKUSA-N pravastatin Chemical compound C1=C[C@H](C)[C@H](CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)[C@H]2[C@@H](OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@H](O)C=C21 TUZYXOIXSAXUGO-PZAWKZKUSA-N 0.000 title description 70
- AJLFOPYRIVGYMJ-INTXDZFKSA-N mevastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=CCC[C@@H]([C@H]12)OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 AJLFOPYRIVGYMJ-INTXDZFKSA-N 0.000 title description 21
- VGMFHMLQOYWYHN-UHFFFAOYSA-N Compactin Natural products OCC1OC(OC2C(O)C(O)C(CO)OC2Oc3cc(O)c4C(=O)C(=COc4c3)c5ccc(O)c(O)c5)C(O)C(O)C1O VGMFHMLQOYWYHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 20
- AJLFOPYRIVGYMJ-UHFFFAOYSA-N SJ000287055 Natural products C12C(OC(=O)C(C)CC)CCC=C2C=CC(C)C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 AJLFOPYRIVGYMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 20
- BOZILQFLQYBIIY-UHFFFAOYSA-N mevastatin hydroxy acid Natural products C1=CC(C)C(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C2C(OC(=O)C(C)CC)CCC=C21 BOZILQFLQYBIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 20
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 title description 7
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 title description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 29
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 23
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 23
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 23
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 18
- 241000187722 Micromonospora echinospora Species 0.000 claims description 13
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 10
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 10
- 241000187723 Micromonospora sp. Species 0.000 claims description 9
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 claims description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241000218923 Micromonospora megalomicea Species 0.000 claims description 6
- 241000218940 Micromonospora rosaria Species 0.000 claims description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 5
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 claims description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 4
- 230000000640 hydroxylating effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000007483 microbial process Effects 0.000 claims description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 3
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 claims description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims 1
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 claims 1
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 79
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 69
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 30
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 29
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- -1 compactic acid sodium salt Chemical class 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 12
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 11
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 11
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 11
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 9
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 8
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 8
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 8
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 8
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 8
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 8
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 7
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 6
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- BWLUMTFWVZZZND-UHFFFAOYSA-N Dibenzylamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNCC1=CC=CC=C1 BWLUMTFWVZZZND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 239000002024 ethyl acetate extract Substances 0.000 description 6
- OQARDMYXSOFTLN-PZAWKZKUSA-N pravastatin lactone Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@@H](O)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 OQARDMYXSOFTLN-PZAWKZKUSA-N 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 6
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 6
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 6
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 6
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N aldehydo-L-rhamnose Chemical compound C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 5
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 4
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 4
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 4
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 3
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 3
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 3
- BBBFYZOJHSYQMW-LGDQNDJISA-N (2s)-2,4-diamino-4-oxobutanoic acid;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O BBBFYZOJHSYQMW-LGDQNDJISA-N 0.000 description 2
- 102100029077 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase Human genes 0.000 description 2
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-OWMBCFKOSA-N L-ribopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-OWMBCFKOSA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000544912 Melanoides Species 0.000 description 2
- 241000178285 Streptomyces carbophilus Species 0.000 description 2
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 2
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000002143 fast-atom bombardment mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-GUCUJZIJSA-N galactitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-GUCUJZIJSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000002471 hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- GJRQTCIYDGXPES-UHFFFAOYSA-N iso-butyl acetate Natural products CC(C)COC(C)=O GJRQTCIYDGXPES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FGKJLKRYENPLQH-UHFFFAOYSA-M isocaproate Chemical compound CC(C)CCC([O-])=O FGKJLKRYENPLQH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- OQAGVSWESNCJJT-UHFFFAOYSA-N isovaleric acid methyl ester Natural products COC(=O)CC(C)C OQAGVSWESNCJJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- DLRVVLDZNNYCBX-ABXHMFFYSA-N melibiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O1 DLRVVLDZNNYCBX-ABXHMFFYSA-N 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 2
- 229940096701 plain lipid modifying drug hmg coa reductase inhibitors Drugs 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000006798 ring closing metathesis reaction Methods 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 241001446247 uncultured actinomycete Species 0.000 description 2
- 238000005292 vacuum distillation Methods 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N (2R,6R)-form-2.6-Diaminoheptanedioic acid Natural products OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 101710158485 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase Proteins 0.000 description 1
- 241000187362 Actinomadura Species 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 101100313763 Arabidopsis thaliana TIM22-2 gene Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 1
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N Dicyclohexylamine Chemical compound C1CCCCC1NC1CCCCC1 XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000895 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Proteins 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- PCZOHLXUXFIOCF-UHFFFAOYSA-N Monacolin X Natural products C12C(OC(=O)C(C)CC)CC(C)C=C2C=CC(C)C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 PCZOHLXUXFIOCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M N,N,N-Trimethylmethanaminium chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)C OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 1
- 235000019482 Palm oil Nutrition 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 241000938054 Streptomyces lanatus Species 0.000 description 1
- 241000946782 Streptomyces resistomycificus Species 0.000 description 1
- 241000187418 Streptomyces rochei Species 0.000 description 1
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 1
- 241000187175 Streptomyces violaceus Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- CKUAXEQHGKSLHN-UHFFFAOYSA-N [C].[N] Chemical compound [C].[N] CKUAXEQHGKSLHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical group O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012445 acidic reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010564 aerobic fermentation Methods 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007613 bennett's agar Substances 0.000 description 1
- DLRVVLDZNNYCBX-ZZFZYMBESA-N beta-melibiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O1 DLRVVLDZNNYCBX-ZZFZYMBESA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- LAWOZCWGWDVVSG-UHFFFAOYSA-N dioctylamine Chemical compound CCCCCCCCNCCCCCCCC LAWOZCWGWDVVSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002168 ethanoic acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000012499 inoculation medium Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 description 1
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- PCZOHLXUXFIOCF-BXMDZJJMSA-N lovastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 PCZOHLXUXFIOCF-BXMDZJJMSA-N 0.000 description 1
- QLJODMDSTUBWDW-UHFFFAOYSA-N lovastatin hydroxy acid Natural products C1=CC(C)C(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C2C(OC(=O)C(C)CC)CC(C)C=C21 QLJODMDSTUBWDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- NKAAEMMYHLFEFN-UHFFFAOYSA-M monosodium tartrate Chemical compound [Na+].OC(=O)C(O)C(O)C([O-])=O NKAAEMMYHLFEFN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006877 oatmeal agar Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000002540 palm oil Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxomolybdenum Chemical compound O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.OP(O)(O)=O DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920003053 polystyrene-divinylbenzene Polymers 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001965 potato dextrose agar Substances 0.000 description 1
- VWBQYTRBTXKKOG-IYNICTALSA-M pravastatin sodium Chemical compound [Na+].C1=C[C@H](C)[C@H](CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC([O-])=O)[C@H]2[C@@H](OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@H](O)C=C21 VWBQYTRBTXKKOG-IYNICTALSA-M 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- QDRKDTQENPPHOJ-UHFFFAOYSA-N sodium ethoxide Chemical compound [Na+].CC[O-] QDRKDTQENPPHOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N triammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical class [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
- C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/29—Micromonospora
Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues mikrobielles Verfahren zur Herstellung von Pravastatin.
- Insbesondere bezieht sich diese Erfindung auf ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung von Pravastatin der Formel (I)aus einer Verbindung der allgemeinen Formel (II)
wobei R für ein Alkalimetall- oder Ammoniumion steht, mit einem Mikroorganismus, wobei der Mikroorganismus ein Protokaryot der Gattung Micromonospora ist, der in der Lage ist, eine Verbindung der allgemeinen Formel (II) an der 6β-Position zu hydroxylieren.
- Hypercholesterolämie wurde als Hauptrisikofaktor der atherosklerotischen Krankheit, insbesondere für Erkrankungen der Herzkranzgefäße, erkannt. In den beiden vergangenen Jahrzehnten wurde 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym-A-Reductase (HMG-CoA-Reductase EC. 1.1.1.34) als das wichtigste geschwindigkeitsbestimmende Enzym bei der Cholesterol-Biosynthese umfassend studiert. Mevinolin und verwandte Verbindungen, die durch ausgewählte Stämme verschiedener Pilzspezies biosynthetisiert wurden, stellten sich als kompetitive Inhibitoren dieses Enzyms heraus [Endo, A. u. a., J. Antibiotics 29, 1346–1348 (1976); Endo, A. u. a., FEBS Lett. 72, 323–326 (1976); Kuo, C.H. u. a., J. Org. Chem. 48, 1991–1998 (1983)].
- Pravastatin gehört ferner zur Familie der HMG-CoA-Reductase-Inhibitoren. Zunächst wurde Pravastatin im Verlauf von Stoffwechselstudien von Compactin als untergeordnetes Urinstoffwechselprodukt von Compactin bei Hunden festgestellt (Tanaka, M. u. a., unveröffentlicht) [Arai, M. u. a. Sankyo Kenkyusho Nempo, 40, 1–38 (1988)].
- Die wichtigste charakteristische Eigenschaft von Pravastatin als hydroxyliertes Produkt von Compactin ist seine Gewebeselektivität. Dieses Arzneimittel hemmt stark die Synthese von Sterol in der Leber und im Darm, hemmt sie in anderen Organen jedoch nur schwach. Es ist vorteilhaft, daß Pravastatin eine geringere Toxizität aufweist als die anderen HMG-CoA-Reductase-Inhibitoren.
- Es wurde berichtet, daß eine mikrobielle Hydroxylierung von Compactin in unterschiedlichem Ausmaß durch mehrere Stämme von Spezies bewerkstelligt werden kann, die zu vielen verschiedenen Pilzgattungen gehören, und durch Stämme von Actinomycete-Spezies, die zu den Gattungen Nocardia, Actinomadura und Streptomyces gehören, unter anderem Streptomy ces roseochromogenes und Streptomyces carbophilus (U.S.-Patentschrift Nr. 5,179,013, U.S.-Patentschrift Nr. 4,448,979, U.S.-Patentschrift Nr. 4,346,227, U.S.-Patentschrift Nr. 4,537,859, japanische Patentschrift Nr. 58,010,572).
- Ein Problem bei der Verwendung von Pilzen für die Herstellung von Pravastatin aus Compactin besteht darin, daß diese Organismen im allgemeinen höhere Konzentrationen von Compactin in einem flüssigen Kulturmedium vermutlich aufgrund dessen antifungaler Wirksamkeit nicht tolerieren [Serizawa, N. u. a., J. Antibiotics 36, 887–891 (1983)]. Bei Streptomyces carbophilus wurde gezeigt, daß das Cytochrom-P450-System für die Hydroxylierung von Compactin zu Pravastatin erforderlich ist [Matsuoka, T. u. a., Eur. J. Biochem. 184, 707–713 (1989)]. Die Schwierigkeit einer genetischen Verbesserung der Hydroxylierungsfähigkeit bei der Verwendung eines derartigen Enzyms besteht darin, daß es sich dabei um einen Komplex von Proteinen und nicht um ein einzelnes Protein handelt.
- Unsere Untersuchung konzentrierte sich darauf, einen Actinomycete-Stamm zu finden, der Pravastatin aus Salzen einer Säureform von Compactin mit einer höheren Ausbeute und durch Anwenden einer höheren Substratkonzentration bei der Bioumwandlung als denjenigen erzeugt, die aus früheren Patentspezifikationen bekannt sind.
- Während des Auswählens, das etwa 6.000 Actinomyceten abdeckte, von denen die meisten unsere eigenen Isolate waren, die aber auch authentische Stämme von internationalen Stammsammlungen umfaßten, wurden fünf Streptomyces und fünf Micromonospora zu weiteren Studien ausgewählt, da sie sich als fähig erwiesen, das Natriumsalz der Säureform von Compactin zu Pravastatin zu hydroxylieren. Diese zehn Actinomyceten-Stämme, von denen acht Stämme taxonomisch auf der Spezies-Ebene in unserem Labor identifiziert wurden, waren die folgenden:
Streptomyces violaceus (gemäß Kämpfer u. a., 1991), Stamm Nr. 1/43.
Streptomyces rochei (Berger u. a., 1949; Waksman und Lechevalier, 1953), Stamm Nr. 1/41.
Streptomyces resistomycificus (Lindenbein, 1952), Stamm Nr. 1/44.
Streptomyces sp., Stamm Nr. 1/28.
Streptomyces lanatus (Frommer, 1959), Stamm Nr. 1/16.
Micromonospora sp., Stamm Nr. IDR-P3.
Micromonospora purpurea (Luedemann und Brodsky, 1964), Stamm Nr. IDR-P4.
Micromonospora echinospora (Luedemann und Brodsky, 1964), Stamm Nr. IDR-P5.
Micromonospora megalomicea (Weinstein u. a., 1969), Stamm Nr. IDR-P6.
Micromonospora rosaria (Horan und Brodsky, 1986), Stamm Nr. IDR-P7. - Da bis heute in der Literatur keine Daten über die Fähigkeit von Micromonospora, Salze der Säureform von Compactin in Pravastatin umzuwandeln, vorliegen, haben wir nicht nur diese bestimmte enzymatische Fähigkeit gründlich studiert, sondern auch die taxonomische Position dieser oben aufgeführten Stämme von Micromonospora.
- Taxonomische Position der Stämme IDR-P3, -P4, -P5, -P6 und -P7 auf der Gattungsebene
- All diese Stämme produzierten gut entwickelte Myzelien, die aus verzweigten Hyphae von etwa 0,4–0,7 μm Durchmesser bestanden. Luftmyzel ist nicht vorhanden oder tritt nur in Spuren auf. Nicht frei bewegliche Sporen treten lediglich auf Sporophoren auf. Hyphae des Substratmyzels sind grampositiv und nicht säureecht. Stämme Nrn. IDR P3–P7 sind aerob, chemoorganotroph und gegenüber einem pH-Wert von unter 6,0 empfindlich. Wände enthalten meso-Diaminopimelinsäure. Die oben aufgeführten diagnostischen Eigenschaften – als Schlüsselcharaktere – zeigen deutlich, daß diese monosporischen Actinomyceten-Stämme typische Angehörige der Gattung Micromonospora sind.
- Taxonomische Beschreibung von Micromonospora sp., Stamm Nr. IDR-P3
- Mikromorphologische Eigenschaften
- Substratmyzel besteht aus gut entwickelten, eher krummen als geraden, sich monopodisch verzweigenden Fäden. Sporen auf den Sporophoren treten einzeln auf, sind sphärisch, weisen einen Durchmesser von etwa 1,8 μm auf und sind mehr oder weniger gleichmäßig auf hyphalen Fäden verteilt. Sporen sind entweder ungestielt oder befinden sich an dem Ende kurzer Sporophoren. In Brühekulturen wurden wahrscheinlich deswegen keine Sporen auf den Hyphae beobachtet, weil die Freisetzung reifer Sporen sehr schnell vor sich geht.
- Kultur-makromorphologische Eigenschaften
- Czapek-Saccharose-Agar: mittleres Wachstum, die Kolonien weisen eine rötliche Farbe auf und sind von punktartigen schwarzen Sporulationsflächen bedeckt.
- Glucose-Asparagin-Agar: Das Wachstum wurde als punktartige und erhöhte rötlich-braune oder schwarze Kolonien aufgezeichnet. Rötliche, diffusionsfähige Pigmente.
- Nähragar: beträchtliches Wachstum, erhöhte, rötlich-braune oder schwarze Kolonien. Rötlich-braunes Exopigment im Medium.
- Agar aus Hefeextrakt/Malzextrakt (ISP Med. 2): gut entwikkelte, erhöhte und runzlige braune Kolonien, die teilweise mit schwarzen Sporulationsflächen oder mit „Pseudo-Luftmyzel" bedeckt sind (dies erscheint als weißlicher oder gräulicher Flaum). Bräunliches oder bräunlich-rotes lösliches Pigment.
- Agar aus anorganischen Salzen und Stärke (ISP Med. 4): mittleres Wachstum von rötlich-braunen erhöhten und runzligen Kolonien. Helles rötliches lösliches Pigment.
- Glycerol-Asparagin-Agar (ISP Med. 5): Wachstum nur in Spuren, gebrochen weiße oder hellorange gefärbte flache Kolonien, hellrosafarbenes lösliches Pigment.
- Nutzung der Kohlenstoffquelle: gutes Wachstum auf und positive Nutzung von L-Arabinose, D-Galaktose, D-Fructose, D-Glucose, D-Xylose, Lactose, Melibiose, Saccharose, D-Mannitol, Dulcitol, Glycerol und Inositol. Wachstum mit L-Rhamnose, D-Raffinose und Inulin war etwas besser als bei dem Blindversuchsmedium. Nutzung der Stickstoffquelle: Gutes Wachstum bei Hefeextrakt und NZ-Amin, keine oder schwache Nutzung von NaNO3.
- Weitere physiologisch-biochemische Eigenschaften: Zellulose und Stärke werden hydrolysiert, Milch wird stark zersetzt. Nitratreduktionstest ist negativ. Kein Wachstum auf Kartoffelscheiben ohne Kalziumkarbonat (pH-Wert 5,8–6,0). Keine Herstellung von Melanoidpigment.
- Dieser Stamm Nr. IDR-P3 von Micromonospora sp. wurde von einer Schlammprobe des Balaton-Sees (Ungarn) isoliert.
- Systematische Position: Weitere vergleichende systematische Studien wären notwendig, um die genaue taxonomische Position dieses Stamms unter den Spezies der Gattung Micromonospora zu klären. Auf der Basis bestimmter Eigenschaften scheint es nicht unmöglich zu sein, daß der Stamm IDR-P3 eine neue Spezies innerhalb der Gattung Micromonospora darstellt.
- Differentiell-diagnostische Beschreibung und Identifizierung von Micromonospora-Stämmen IDR-P9, -P5, -P6 und -P7
- Stamm IDR-P4
- Auf den oben aufgeführten diagnostischen Medien allgemein gutes Wachstum, orangefarbene bis orange-rote, rote, manchmal gelblich oder rosafarbene Kolonien. Lösliche Pigmente und Luftmyzel werden nicht produziert. Die Anzahl von solitären Sporen ist relativ gering. Sie treten auf den Sporophoren endständig auf. Substratmyzel besteht aus sich gut verzweigenden Hyphae. Kein Luftmyzel vorhanden. Kein Wachstum auf D-Melibiose, Raffinose, Mannitol, Glycerol, Lactose, L-Rhamnose, jedoch gutes Wachstum auf D-Arabinose, Glucose, D-Xylose und schwaches Wachstum auf D-Galaktose und D-Fructose. Auf der Basis dieser herkömmlichen diagnostischen Eigenschaften haben wir diesen Stamm als einen Angehörigen der Spezies Micromonospora purpurea identifiziert (Luedemann und Brodsky, 1964).
- Stamm IDR-P5
- Dieser Stamm erzeugt vorwiegend solitäre Sporophoren und sphärische dunkelbraune bis schwarze Sporen (Durchmesser 0,8–1,5 μm) , die bis zur Reife stark an den Sporophoren haften. Gemäß unseren elektronenmikroskopischen Beobachtungen können auf der Oberfläche dieser Sporen warzige Strukturen oder Auswüchse beobachtet werden („Blunt Spines" gemäß Bd. 4 von Bergey's Manual of Syst. Bact. 1989, Seite 2448), was sehr charakteristisch für die Sporen von Micromonospora echinosora ist. Ansonsten sind die kultur-morphologischen und physiologischen diagnostischen Eigenschaften dieses Stammes ebenfalls sehr ähnlich denen der M. echinospora. Die Farbe der gut entwickelten Kolonien auf dem standardmäßigen diagnostischen Medium ist orange-braun oder dunkelpurpurfarben. Die sporulierende Schicht ist schwarz oder schwarz-purpurfarben, wachsartig. Kein Luftmyzel vorhanden. Kein Melaninpigment produziert. Milch zersetzt. Gutes Wachstum auf D-Xylose, D-Arabinose, D-Glucose und Saccharose, jedoch kein Wachstum bei L-Rhamnose, Raffinose, D-Galaktose, D-Fructose, D-Melibiose und Glycerol. Wir sehen diesen Stamm als einen typischen Angehörigen von Micromonospora echinospora an.
- Stamm IDR-P6
- Auf der Mehrheit von diagnostischen Medien mäßiges bis schwaches Wachstum. Die orangefarbenen oder orange-roten Kolonien bestehen aus langen verzweigten Fäden (Durchmesser etwa 0,6 μm) und einer begrenzten Anzahl von solitären, sphärischen, dunkel gefärbten Sporen (Durchmesser 0,6–1,0 μm). Produziert kein Luftmyzel. Bei bestimmten Medien werden schwach rötliche oder rosafarbene lösliche Pigmente gebildet. Auf Tyrosin-Agar wurden keine Melanoidpigmente erzeugt. Auf einem Grundsubstrat wurden die folgenden Kohlenstoffquellen durch diesen Stamm genutzt: D-Xylose und D-Fructose; nur schwach: D-Melibiose, Mannitol und Galactose, bei Glycerol, L-Rhamnose, Lactose und Raffinose wurde jedoch kein oder nur sporadisches Wachstum beobachtet (siehe auch Kawamoto, I. u. a.: Agric. Biol. Chem., 47, 203–215, 1983). Stamm Nr. IDR-P6 zeigt eine beträchtliche Ähnlichkeit mit der Spezies Micromonospora megalomicea, (Weinstein, 1972), und wir betrachten ihn als Angehörigen dieser Spezies.
- Stamm IDR-P7
- Gutes bis mäßiges Wachstum auf Bennett-Agar, Czapek-Saccharose-Agar, Glucose-Asparagin-Agar, Nähragar, Hafermehl-Agar, Kartoffel-Dextrose-Agar usw. Die Farbe der vegetativen Myzelpigmente reicht von rötlich-braun bis purpurartig-braun. Auf bestimmten Medien werden weinrote diffusionsfähige Pigmente gebildet. Ruf der Oberfläche der Kolonien werden häufig schwarze Flecken erzeugt. Vegetative Hyphae (durchschnittlicher Durchmesser- 0,5 μm) sind stark verzweigt. Sporen (Durchmesser 1,4–1,7 μm) sind einzeln, ungestielt oder auf kurzen Sporophoren getragen und treten entlang der Länge der Hyphae auf. Wachstum und Sporulation sind vom Typ des offenen Netzes von Luedemann. Die folgenden Verbindungen werden von diesem Stamm als einzige Kohlenstoffquelle in dem Medium genutzt: D-Glucose, Lactose, D-Mannitol. L-Rhamnose, Saccharose und D-Xylose. Dulcitol, Glycerol, D-Melibiose und D-Raffinose werden nicht genutzt. Wir haben den Stamm Nr. IDR-P7 als einen typischen Angehörigen von Micromonospora rosaria identifiziert (Horan und Brodsky, 1986) .
- Die oben dargestellten Micromonospora-Stämme wurden bei der National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms (NCAIM), Budapest, Ungarn, unter den nachstehenden Nummernbezeichnungen hinterlegt:
Micromonospora sp. IDR-P3: NCAIM (P) B 001268
Micromonospora purpurea IDR-P4: NCAIM (P) B 001271
Micromonospora echinospora ssp. echinospora IDR-P5: NCAIM (P) B 001272
Micromonospora megalomicea ssp. nigra IDR-P6: NCAIM (P) B 001273
Micromonospora rosaria IDR-P7: NCAIM (P) B 001274 - Auf der Basis des Vorstehenden bezieht sich die Erfindung auf ein neues mikrobielles Verfahren zur Herstellung von Pravastatin der Formel (I)aus einer Verbindung der allgemeinen Formel (II)
wobei R für ein Alkalimetall- oder Ammoniumion steht, durch die Submerszucht eines Stammes, der in der Lage ist, eine Verbindung der Formel (II) in einer aeroben Fermentierung zu 6β-hydroxylieren, und durch die Trennung und Reinigung der Verbindung der Formel (I), die im Verlauf der Bioumwandlung gebildet wird, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:
- a) Kultivieren eines Stamms einer Spezies, die zu der Gattung Micromonospora gehört, der in der Lage ist, eine Verbindung der Formel (II) – bei der R wie oben definiert lautet – bei 25–32°C auf einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalze enthält, zu 6β-hydroxylieren, anschließend b) Zuführen des zu transformierenden Substrats in die entwickelte Kultur, anschließend c) Hydroxylieren des Substrats bis zum Ende der Bioumwandlung, anschließend d) Trennen der Verbindung der Formel (I) von der Kulturbrühe und, falls gewünscht, Reinigen derselben.
- Der Schutzumfang der Erfindung erstreckt sich auf die wilden Stämme und jegliche Mutanten von Spezies, die zu der Gattung Micromonospora gehören, die in der Lage sind, das Natriumsalz der Säureform von Compactin zu Pravastatin zu hydroxylieren.
- Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird Pravastatin mit einem Micromonospora-Stamm erzeugt, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgenden besteht: Micromonospora sp. IDR-P3 [NCAIM (P) B 001268], Micromonospora purpurea IDR-P4 [NCAIM (P) B 001271], Micromonospora echinospora IDR-P5 [NCAIM (P) B 001272], Micromonospora megalomicea IDR-P6 [NCAIM (P) B 001273] und Micromonospora rosaria IDR-P7 [NCAIM (P) B 001274].
- Gemäß dem am stärksten bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung wird Pravastatin mit dem Micromonospora sp.-Stamm IDR-P3 [NCAIM (P) B 001268] erzeugt.
- Die vorliegende Erfindung kann durch ein In-Situ-Fermentierungsverfahren durchgeführt werden, d. h. wenn die Hydroxylierung unter der Teilnahme einer aktiv wachsenden Micromonospora-Kultur bewerkstelligt wird.
- Die Hydroxylierung kann ausgeführt werden, indem ein Aufrühren als Schüttelgefäßkultur oder Belüftung und Aufrühren in Fermentern eingesetzt wird, wenn die Verbindung der Formel (II) zu den wachsenden Kulturen hinzugegeben wird.
- In solchen Fällen kann ein Schaumverhütungsmittel eingesetzt werden. Die entsprechende Kulturdichte dieses Stammes könnte durch die Verwendung eines geeigneten Mediums erreicht werden, das verfügbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganische Salze sowie Spurenelemente enthält.
- Beispielsweise Glucose, Glycerol, Dextrin, Stärke, Rhamnose, Xylose, Saccharose und lösliche Stärke erwiesen sich als assimilierbare Kohlenstoffquellen, während Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Ammoniumcitrat und Ammoniumsulfat gute Stickstoffquellen sind. Anorganische Salze wie beispielsweise Kalziumkarbonat, Natriumphosphate, Kaliumphosphate usw. können zu dem Kulturmedium hinzugefügt werden. Bevorzugte Medien für das Wachstum dieses ausgewählten Stammes sind die in den Beispielen beschriebenen.
- Die Bioumwandlung von Compactin zu Pravastatin kann durch unterschiedliche Fermentierungstechniken, z. B. Batch-Kultur, Fed-Batch-Kultur, bewerkstelligt werden. Vorzugsweise wird eine aufgerührte, eingetauchte Kultur verwendet. Die bevorzugte Temperatur beträgt etwa 25°C bis 37°C, am stärksten bevorzugt etwa 25°C bis 32°C.
- Der bevorzugte pH-Wert beträgt etwa 6,0 bis 9,0, am stärksten bevorzugt etwa 7,0 bis 8,5. Die bevorzugte Schüttelbedingung beträgt etwa 200 U/min bis 400 U/min, am stärksten bevorzugt etwa 250 U/min.
- Die Erfindung schafft ein Verfahren zum Umwandeln von Compactinsäurenatriumsalz zu Pravastatin. Compactinsäurenatriumsalz kann bei dieser Erfindung in einer beliebigen Konzentration verwendet werden, die zu der Herstellung von Pravastatin führt. Vorzugsweise liegt die Compactin-Konzentration zwischen 0,1 und 10 g/Liter, stärker bevorzugt zwischen etwa 0,3 und 3,0 g/Liter.
- Die Erfindung soll jeglichen Prozentsatz einer Umwandlung von Compactin zu Pravastatin durch die Stämme von Micromonospora spp. abdecken, zumindest 30% und am stärksten bevorzugt zumindest etwa 90%.
- Im Verlauf der Fermentierung wird die Zusammensetzung der Kulturbrühe durch ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Verfahren (HPLC-Verfahren) gesteuert. Gemäß dem HPLC-Verfahren wird die Probe der Brühe zweifach mit Methanol verdünnt und zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wird für die Analyse verwendet. Für die Analyse verwendete Parameter des HPLC-Systems sind: analytische HPLC-Ausrüstung von Waters; Säulenpakkung: Novapack C18 5 μm von Waters; Messung bei 237 nm; Einspritzvolumen 10 μl; Flußrate 0,6–0,9 ml/min linearer Gradient; Gradientenelution wird verwendet, Eluenten: Lösungsmittel A = Acetonitril – 0,1 M NaH2PO4 in Wasser (25:75), Lösungsmittel B = Acetonitril – Wasser (pH-Wert 2 bei H3PO4) (70:30).
- Parameter der Gradientenelution
- Retentionszeiten: Pravastatin (Natriumsalz) 10,6 min; Compactin (saures Natriumsalz) 19,5 min; Pravastatin (Lactonform) 17,3 min; Compactin (Lactonform) 23,5 min.
- Zur Isolierung von Pravastatin kann jegliches bekannte Verfahren verwendet werden, z. B. Extrakti on/Rückextraktion, Anionenaustauschchromatographie, Fällung.
- Für die Wiedergewinnung des Produkts aus der Brühe ist es vorteilhaft, die Tatsache zu berücksichtigen, daß Pravastatin während der Bioumwandlung in seiner Säureform gebildet wird und somit durch seine Adsorption auf einer Anionenaustauschharzsäule aus dem Filtrat der Brühe isoliert werden kann. Für die Isolation des Produkts ist es vorteilhaft, ein stark basisches Anionenaustauschharz zu verwenden, das ein Polystyren-Divinylbenzen-Polymer ist, das quaternäre ammoniumaktive Gruppen trägt, z. B. Harze Dowex Al 400 (OH–), Dowex 1 × 2 (OH–), Dowex 2 × 4 (OH–), Amberlite IRA 900 (OH–). Das auf dem Ionenaustauschharz adsorbierte Produkt kann durch wäßrige Essigsäure oder ein Natriumchlorid enthaltendes Gemisch aus Aceton und Wasser, vorzugsweise durch ein 1% Natriumchlorid enthaltendes Gemisch aus Aceton und Wasser (1:1) aus der Säule eluiert werden. Pravastatinhaltige Fraktionen werden kombiniert, und das Aceton, das in dem Eluat vorliegt, wird in Vakuum abdestilliert. Der pH-Wert des Konzentrats wird mit 15%iger Schwefelsäure im Bereich von 3,5–4,0 eingestellt, und die angesäuerte wäßrige Lösung wird durch Ethylacetat extrahiert. Aus dem Ethylacetatextrakt kann Pravastatin durch ein 1/10- und 1/20-Volumenverhältnis von 5% Natriumhydrogencarbonat oder schwach alkalisches Wasser (pH-Wert 7,5–8,0) extrahiert werden. Man stellte fest, daß Pravastatin durch Säulenchromatographie auf einem nichtionischen Adsorptionsharz in einer reinen Form aus dem oben erhaltenen alkalischen wäßrigen Extrakt wiedergewonnen werden kann. Ein vorteilhaftes Verfahren besteht darin, daß das in der wäßrigen Phase aufgelöste Ethylacetat zuerst durch Vakuumdestillation aus dem alkalischen wäßrigen Extrakt entfernt wird und das wäßrige Extrakt anschließend auf eine Diaion-HP-20-Säu1e geladen wird. Auf der Säule adsorbiertes Pravastatin wird durch Elution mit wäßrigem Aceton, bei dem der Acetongehalt allmählich erhöht wird, gereinigt, anschließend werden die chromatographischen Fraktionen, die Prava statin als einzelne Komponente enthalten, kombiniert und in Vakuum konzentriert. Das Konzentrat wird mit Holzkohle abgeklärt und lyophilisiert, anschließend aus einem Gemisch aus Ethanol/Ethylacetat kristallisiert, was Pravastatin in einer zur pharmazeutischen Anwendungen akzeptablen Qualität ergibt.
- Nach Abschluß der Bioumwandlung kann Pravastatin entweder aus der Fermentationsbrühe oder aus dem Filtrat, das nach der Abscheidung der Myzelmasse erhalten wurde, extrahiert werden. Letzteres kann entweder durch Filtration oder Zentrifugierung entfernt werden, es ist jedoch vor allem bei einem industriellen Maßstab vorteilhaft, eine Ganzbrühenextraktion durchzuführen. Vor der Extraktion wird der pH-Wert entweder der Fermentationsbrühe oder des Filtrats der Brühe mit einer Mineralsäure, vorzugsweise mit verdünnter Schwefelsäure, auf 3,5–3,7 eingestellt. Die Extraktion erfolgt mit Essigsäureester mit einem 2–4 Kohlenstoffatome enthaltenden aliphatischen Alkohol, vorzugsweise mit Ethylacetat oder Isobutylacetat. Der Ethylacetatextrakt wird mit Wasser gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Dann wird aus Pravastatin das Lactonderivat hergestellt. Der Lactonringschluß wird in einer Lösung aus getrocknetem Ethylacetat bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Rühren durchgeführt, indem die Lactonbildung mit einer katalytischen Menge an Trifluoressigsäure herbeigeführt wird. Der Lactonringschluß wird durch eine Dünnschichtchromatographieanalyse (TLC – thin layer chromatographic analysis) geprüft. Nach Abschluß der Lactonbildung wird die Ethylacetatlösung zuerst mit einer 5%igen wäßrigen Natriumhydrogencarbonatlösung und anschließend mit Wasser gewaschen, wird mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und in Vakuum verdampft. Der Rückstand wird mit Kieselsäuregelsäulenchromatographie gereinigt und als die Eluentengemische aus Ethylacetat/n-Hexan mit einem allmählich zunehmenden Ethylacetatgehalt verwendet. Pravastatin wird durch Hydrolyse bei Raumtemperatur in Aceton mit einer äquivalenten Menge an Natriumhydroxid aus dem Pravastatin- 1acton hergestellt. Wenn die Bildung des Pravastatinnatriumsalzes abgeschlossen ist, wird das Pravastatin mit Aceton gefällt. Dann wird der Niederschlag gefiltert und mit Aceton und n-Hexan gewaschen, in Vakuum getrocknet und anschließend aus einem Gemisch aus Ethanol/Ethylacetat kristallisiert.
- Man stellte fest, daß die Chromatographie bei dem Gel Sephadex LH-20 vorteilhafterweise zum Reinigen von Pravastatin verwendet werden kann. Durch Anwendung dieses Verfahrens kann Pravastatin erzeugt werden, das die Reinheit von 99,5% (durch HPLC gemessen) übersteigt.
- Im Verlauf unserer Experimente stieß man auf die folgende Erfindung: aus dem organischen Lösungsmittelextrakt, vorzugsweise aus dem Ethylacetat- oder Isobutylacetat-Extrakt der Brühe oder des Brühenfiltrats des Stamms Micromonospora sp. IDR-P3, der in der Lage ist, eine Verbindung der allgemeinen Formel (II) zu 6β-hydroxylieren, kann Pravastatin als kristallines Salz mit sekundären Aminen gefällt werden. Ferner stellte man fest, daß für die Salzbildung mehrere sekundäre Amine, die Alkyl-, Cycloalkyl-, Aralkyl- oder Aryl-Substituenten enthalten, geeignet sind. Zweckmäßigerweise wurden aus denselben nicht-toxische sekundäre Amine ausgewählt, z. B. Dioctylamin, Dicyclohexylamin, Dibenzylamin. Die Isolierung der organischen Sekundäres-Aminsalz-Zwischenprodukte, z. B. Dibenzylaminsalz, wurde durchgeführt, indem Dibenzylamin in einer 1,5-Äquivalentmenge, bezogen auf den Pravastatingehalt des Extrakts, hinzugegeben wird, der Extrakt anschließend durch Vakuumdestillation auf 5% seines ursprünglichen Volumens konzentriert wird und anschließend eine weitere Menge an Dibenzylamin in einem 0,2-Äquivalentverhältnis zu dem Konzentrat hinzugegeben wird. Das kristalline Dibenzylaminsalz wird aus dem Konzentrat ausgefällt. Das kristalline Rohprodukt wird gefiltert und in Vakuum getrocknet, und es wird mit Holzkohle in einer Methanol- oder Acetonlösung abgeklärt. Anschließend kann mit einer Umkristallisation des abgeklär ten Produkts aus Aceton ein chromatographisch reines Pravastatindibenzylaminsalz-Zwischenprodukt erhalten werden.
- Organische sekundäre Aminsalze aus Pravastatin können durch Natriumhydroxid oder ein Natriumalkoxid, vorzugsweise Natriumethoxid, in Pravastatin umgewandelt werden.
- Die Isolierung von Pravastatin über ein Zwischenprodukt eines sekundären Aminsalzes ist ein einfacheres Verfahren als alle bisher bekannten Isolationsverfahren. Während der Prozedur werden keine Artefakte gebildet, und die Trennung von Pravastatin von den Nebenprodukten der Bioumwandlung und von den verschiedenen Stoffwechselprodukten, die durch den hydroxylierenden Mikroorganismus biosynthetisiert werden, kann auf vorteilhafte Weise gelöst werden.
- Das Verfahren gemäß der Erfindung wird durch die folgenden Beispiele dargestellt.
- Beispiel 1
- Es wurden Sporen von der Oberfläche einer 7–10 Tage alten Schrägkultur des Stammes Micromonospora sp. IDR-P3 [NCAIM (P) B 001268] auf einem Agar aus löslicher Stärke (SM) erhalten und in 5 ml sterilem destilliertem Wasser suspendiert. Diese Suspension wurde anschließend verwendet, um 100 ml steriles TI-Impfmedium in einen 500-ml-Erlenmeyer-Kolben zu impfen. Zusammensetzung des SM-Mediums
Lösliche Stärke 10,0 g Na2HPO4 1,15 g HH2PO4 0,25 g KCl 0,2 g MgSO4x7H2O 0,2 g Agar 15,0 g in 1.000 ml destilliertem Wasser - Der pH-Wert des Mediums wurde vor der Sterilisation auf 7,0 eingestellt, und das Gemisch wurde 25 Minuten lang bei 121°C sterilisiert. Zusammensetzung des TI-Mediums
Lösliche Stärke 20,0 g Hefeextrakt 10,0 g in 1.000 ml Leitungswasser - Der pH-Wert wurde vor der Sterilisation auf 7,0 eingestellt, und das Medium wurde 25 Minuten lang bei 121°C wärmebehandelt.
- Die sich entwickelnde Kultur wurde drei Tage lang bei 32°C in einem Dreh-Schüttelapparat geschüttelt (250 U/min; und Amplitude: 2,5 cm), anschließend wurden 5 ml aliquote Teile derselben verwendet, um 10 Erlenmeyer-Kolben, die jeweils ein Volumen von 500 ml aufwiesen und 100 ml TT-Medium, das 25 Minuten lang bei 121°C sterilisiert wurde, enthielten, zu impfen. Zusammensetzung des TT-Mediums
Kartoffelstärke 30,0g Sojabohnenmehl 30,0g CaCO3 5,0g CoCl2x6H2O 2,0mg Palmöl 2,0g in 1.000 ml Leitungswasser - Der pH-Wert wurde vor der Wärmesterilisation auf 7,0 eingestellt.
- Die Inkubation wurde 72 Stunden lang bei 32°C durchgeführt, anschließend wurden 50 mg Compactinsäurenatriumsalz zu jedem Kolben in destilliertem Wasser hinzugefügt, und die Kultivierung wurde 96 Stunden lang durchgeführt. Die Umwandlungsrate von Compactinsäurenatriumsalz zu Pravastatin, anhand von HPLC gemessen, betrug 82%.
- Nach Abschluß der Fermentierung wurden die Kulturen vereint, und aus der erhaltenen kollektiven Fermentationsbrühe, die 410 mg Pravastatin enthielt, wurde die Isolierung des Letzteren wie folgt durchgeführt: Die Fermentierungsbrühe wurde 20 Minuten lang bei 2.500 U/min zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit der Brühe und die Myzelmasse wurden getrennt, anschließend wurde Letztere erneut in 250 ml Wasser suspendiert, und die erhaltene Suspension wurde 1 Stunde lang gerührt und anschließend gefiltert. Der pH-Wert der kombinierten zentrifugierten Brühe und des Filtrats wurde durch 15%ige Schwefelsäure auf 4,0 eingestellt, anschließend wurde das saure Filtrat mit 3 × 300 ml Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten Ethylacetatextrakte wurden mit 300 ml Wasser gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und in Vakuum auf ein Volumen von 100 ml konzentriert. Anschließend wurde aus Pravastatin Pravastatinlacton hergestellt, indem Trifluoressigsäure in einer katalytischen Menge bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Rühren hinzugegeben wurde. Die Bildung von Pravastatinlacton wurde das TLC-Verfahren gesteuert: Adsorptionsmittel: Kieselsäuregel 60 F254 DC (Merck) Aluminiumfolie; Entwicklungslösungsmittel: Gemisch aus Aceton/Benzen/Essigsäure (50:50:1,5); Erfassung: mit Phosphomolybdänsäure-Reagens. Der Rf-Wert von Pravastatinlacton betrug 0,7. Nach Abschluß der Lactonbildung wurde das Ethylacetat mit 2 × 20 ml 5%igem wäßrigem Natriumhydrogencarbonat gewaschen, anschließend mit 20 ml Wasser gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und in Vakuum verdampft. Es wurden 0,5 g Verdampfungsrückstand erhalten, der auf 10 g einer Säule, die Kieselsäuregel-60-Adsorptionsmittel enthielt, chromatographiert wurde (Durchmesser der Säule: 1,2 cm, Höhe der Adsorptionsmittelschicht: 17 cm). Zum Eluieren wurden Gemische aus Ethylace tat/n-Hexan verwendet, bei denen der Ethylacetatgehalt allmählich erhöht wurde. Pravastatinlacton wurde aus der Säule mit dem Gemisch aus 60% Ethylacetat und 40% n-Hexan eluiert. Die Fraktionen, die Pravastatinlacton enthielten, wurden kombiniert und in Vakuum verdampft. Der erhaltene Rückstand, der 230 mg Pravastatinlacton enthielt, wurde in 5 ml Aceton aufgelöst, und unter Rühren wurden 110 Molprozent Natriumhydroxid in 1M ethanolischer Lösung hinzugefügt. Das Rühren der Lösung wurde eine halbe Stunde bei Raumtemperatur fortgesetzt. Anschließend wurde die Lösung auf ein Volumen von 2 ml konzentriert, und zu dem Konzentrat wurden 4 ml Aceton hinzugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht auf +5°C gehalten. Der Niederschlag wurde gefiltert, mit 2 ml Aceton und anschließend mit 2 ml n-Hexan gewaschen und bei Raumtemperatur in Vakuum getrocknet. Das sich ergebende Roh-Pravastatin wurde in Ethanol aufgelöst, mit Holzkohle abgeklärt und anschließend aus dem Ethanol/Ethylacetat-Gemisch kristallisiert. Auf diese Weise wurden 170 mg Pravastatin erhalten.
- Schmelzpunkt 170–173°C (Zersetzung)
-
- [α]D 2 = +156° (c = 0,5, in Wasser).
- UV-Absorptionsspektrum (20 μg/ml, in Methanol): λmax = 231, 237, 245 nm (log ε = 4,263; 4,311; 4,136).
- Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr): νOH 3.415, νCH 2.965, νC = 0 1.730, νCOO– 1.575 cm–1.
- 1H-NMR-Spektrum (D2O, δ, ppm): 0,86, d, 3H (2-CH3); 5,92, dd, J = 10,0 und 5,4 Hz, 1H (3-H); 5,99, d, J = 10,0 Hz, 1H (4-H); 5,52, br, 1H (5-H); 4,24, m, 1H (6-H); 5,34, br, 1H (8-H); 4,06, m, 1H (β-H), 3,65, m, 1H (δ-H); 1,05, d, 3H (2'-CH3); 0,82, t, 3H (4'-H3).
- 13C-NMR-Spektrum (D2O, δ, ppm) : 15,3, q (2-CH3); 139,5, d (C-3); 129,5, d (C-4); 138,1, s (C-4a); 127,7, d (C-5); 66,6, d (C-6); 70,1, d (C-8); 182,6, s (COO–); 72,6, d (Cβ); 73,0, d (C-δ); 182,0, s (C-1'); 18,8, q (2'-CH3); 13,7, q (C-4').
- Positives FAB-Massenspektrum (charakteristische Ionen): [M+Na]+ 469; [M+H]+ 447.
- Negatives FAB-Massenspektrum (charakteristische Ionen): [M-H]– 445, [M-Na]– 423, m/z 101 [2-Methylbutansäure-H]–.
- Beispiel 2
- 10 Erlenmeyer-Kolben, die jeweils ein Volumen von 500 ml aufwiesen und 100 ml MT1-Bioumwandlungsmedium enthielten, wurden mit einer Impfkultur, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt worden war, geimpft, anschließend 96 Stunden lang bei 28°C inkubiert, und anschließend wurden zu jedem Kolben in destilliertem Wasser 50 mg Compactinsäurenatriumsalz hinzugegeben, dann wurde die Hydroxylierung 72 Stunden lang durchgeführt, als weitere 50–50 mg Substrat zu den Kulturen in destilliertem Wasser hinzugefügt wurden, und die Fermentierung wurde anschließend 72 Stunden lang fortgesetzt. Zusammensetzung des MT1-Bioumwandlungsmediums
Kartoffelstärke 10,0 g Dextrose 20,0 g Sojabohnenmehl 10,0 g Hefeextrakt 10,0 g CaCO3 5,0 g Sonnenblumenöl 2,0 g in 1.000 ml Leitungswasser - Der pH-Wert des Bioumwandlungsmediums wurde vor der Sterilisation auf 7,0 eingestellt. Das Gemisch wurde 25 Minuten lang bei 121°C sterilisiert.
- Nach Beendigung der Bioumwandlungsperiode wurden die Kulturen vereint, und das Pravastatin wurde gemäß der folgenden Prozedur aus der kollektiven Brühe isoliert:
Die vereinte Brühe, die gemäß der HPLC-Analyse 750 mg Pravastatin enthielt, wurde 20 Minuten lang bei 2.500 U/min zentrifugiert. Die abgeschiedene Myzelmasse wurde eine Stunde lang mit 250 ml Wasser gerührt und anschließend gefiltert. Die zentrifugierte Brühe und das Filtrat wurden kombiniert, und der pH-Wert der sich ergebenden Lösung wurde mit 15%iger Schwefelsäure auf einen Wert von 3,5–4,0 eingestellt, anschließend wurde die Lösung mit 3 × 300 ml Ethylacetat extrahiert. Anschließend wurden 150 Molprozent Dibenzylamin – für den Pravastatingehalt berechnet – zu dem Ethylacetatextrakt hinzugegeben. Der Ethylacetatextrakt wurde bis auf ein Volumen von etwa 30 ml verdampft, und die Suspension wurde über Nacht bei 0–5°C gehalten. Das ausgefällte Pravastatinsäuredibenzylaminsalz wurde gefiltert und auf dem Filter mit gekühltem Ethylacetat und n-Hexan gewaschen und schließlich in Vakuum getrocknet. Die 1,1 g rohes Pravastatinsäuredibenzylaminsalz wurden bei einer Temperatur von 62–66°C in 33 ml Aceton aufgelöst, und die Lösung wurde eine halbe Stunde lang mit 0,1 g Holzkohle abgeklärt. Anschließend wurde die Holzkohle durch Filtration aus der Lösung entfernt. Kristalle, die sich aus der abgeklärten Lösung niederschlugen, wurden wiederum bei der obigen Temperatur aufgelöst, anschließend wurde die Lösung über Nacht bei +5°C gehalten. Der Niederschlag wurde gefiltert, mit gekühltem Aceton und n-Hexan gewaschen und in Vakuum getrocknet. Das erhaltene Pravastatinsäuredibenzylaminsalz (0,7 g) wurde in 10 ml Ethanol suspendiert, anschließend wurden 110 Molprozent Natriumhydroxid zu der Lösung gegeben, indem 1M wäßrige Lösung eingespeist wurde. Das Rühren der alkalischen Lösung wurde eine halbe Stunde bei Raumtemperatur fortgesetzt. Nach Abschluß der Natriumsalzbildung wurden 30 ml Wasser hinzugegeben, und der pH-Wert der Lösung wurde neutralisiert, anschließend wurde Ethanol in Vakuum abdestilliert. Das wäßrige Konzentrat wurde auf einer mit 50 ml des Harzes Diaion HP 20 gefüllten Säule chromatographiert (Durchmesser der Säule: 1,5 cm, Höhe der Harzschicht: 28 cm). Die Säule wurde mit Gemischen aus Aceton/entionisiertem Wasser eluiert, wobei die Konzen tration des Acetons in 5%-Schritten erhöht wurde. Durch ein 15% Aceton enthaltendes Gemisch aus Aceton und entionisiertem Wasser konnte Pravastatin aus der Säule eluiert werden. Fraktionen wurden gemäß dem in Beispiel 1 angegebenen TLC-Verfahren analysiert. Der Rf-Wert von Pravastatin betrug 0,5. Pravastatin enthaltende Fraktionen wurden kombiniert, und der Acetongehalt wurde in Vakuum verdampft. Durch die Lyophilisation des wäßrigen Rückstands wurden 390 mg chromatographisch reines Pravastatin erhalten. - Beispiel 3
- 4,5 Liter TT/2-Medium in einem Laborfermenter wurden 45 Minuten lang bei 121°C sterilisiert und mit 500 ml einer Impfschüttelkultur, die gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 hergestellt wurde, geimpft, anschließend bei 32°C inkubiert, mit 250 l steriler Luft/h belüftet und mit einem Flachblatt-Rührapparat bei 300 U/min gerührt. Die Inkubation wurde 72 Stunden lang fortgesetzt, und es wurden 2,5 g Compactinsäurenatriumsalz zu der Kultur hinzugefügt. Nach der 48. Stunde der Bioumwandlungsperiode wurde das Compactinsubstrat vollständig aus der Fermentationsbrühe aufgezehrt, anschließend wurden wiederum weitere 2,5 g Compactinsäurenatriumsalz zu der Kultur gegeben. Die zweite Compactindosis wurde innerhalb von 24 Stunden aufgezehrt.
- Die Umwandlungsrate von Compactinsäurenatriumsalz zu Pravastatin betrug bei dem Bioumwandlungsverfahren etwa 90%. Zusammensetzung des TT/2-Bioumwandlungsmediums
Glucose 75,0 g lösliche Stärke 50,0 g Sojabohnenmehl 50,0 g Hefeextrakt 50,0 g Pepton 5,0 g NaNO3 20,0 g CaCO3 25,0 g in 4.500 ml Leitungswasser - Beispiel 4
- 4,5 Liter des TT/1-Fermentationsmediums wurden in einem Laborfermenter 45 Minuten lang bei 121°C sterilisiert und mit 500 ml der Impfschüttelkultur, die gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 hergestellt worden war, geimpft, anschließend bei 28°C inkubiert, mit 200 l steriler Luft/h belüftet und mit einem Flachblatt-Rührapparat bei 400 U/min gerührt. Zusammensetzung des TT/1-Bioumwandlungsmediums
Glucose 125,0 g Kartoffelstärke 25,0 g Sojabohnenmehl 50,0 g Hefeextrakt (Gistex) 50,0 g Pepton 50,0 g CoCl2x6H2O 10,0 mg Sonnenblumenöl 10,0 g in 4.500 ml Leitungswasser - Der pH-Wert des Bioumwandlungsmediums wurde vor der Sterilisation auf 7,0 eingestellt.
- Die Kultivierung wurde 96 Stunden lang bei 28°C fortgesetzt. Zu diesem Zeitpunkt wurden 2,5 g Compactinsäurenatriumsalz in einer sterilen gefilterten wäßrigen Lösung zu der Kultur hinzugegeben. Am 5. Tag der Fermentierung war das Compactinsäurenatriumsalz vollständig aus der Fermentationsbrühe aufgezehrt. Anschließend wurde das Speisen des Substrats weitere drei Tage lang täglich in Portionen von 2,5 g/Tag wiederholt. Das Compactinsäurenatriumsalz-Substrat wurde in den vier Tagen allmählich aufgezehrt und vollständig zu Pravastatin umgewandelt. Gemäß den Ergebnissen von HPLC-Messungen am Ende der Fermentationsperiode wurden aus 10 g Compactinsubstrat 9 g Pravastatin hergestellt.
- Nach Beendigung der Bioumwandlung wurde das in der Konzentration von 1.800 μg/ml gebildete Pravastatin wie folgt isoliert:
5 Liter Kulturbrühe wurden 20 Minuten lang bei 2.500 U/min zentrifugiert. Anschließend wurden zu der abgetrennten Myzelmasse 2 Liter Wasser hinzugefügt, und die Suspension wurde eine Stunde lange gerührt und dann gefiltert. Diese beiden Filtrate wurden vereint und mit einer Flußrate von 500 ml/Stunde auf einer Säule, die 300 g (540 ml) des Harzes Dowex Al 400 (OH–) enthielt, passiert (Durchmesser der Säule: 4 cm, Höhe der Harzschicht: 43 cm), anschließend wurde die Harzschicht mit 1 Liter entionisiertem Wasser gewaschen. Anschließend wurde die Säule mit 1 Liter eines Gemischs aus Aceton und Wasser (1:1), wobei das Gemisch 10 g Natriumchlorid enthielt, eluiert, indem 50-ml-Fraktionen gesammelt wurden. Die Fraktionen wurden anhand des in Beispiel 1 angegebenen TLC-Verfahrens analysiert. Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden kombiniert, und das Aceton wurde in Vakuum abdestilliert. Der pH-Wert des Konzentrats wurde durch 15%ige Schwefelsäure auf einen Wert von 3,5–4,0 eingestellt, anschließend wurde es mit 3 × 250 ml Ethylacetat extrahiert. Zu dem kombinierten Ethylacetatextrakt wurden 40 ml entionisiertes Wasser hinzugegeben, anschließend wurde der pH-Wert durch 1M Natriumhydroxid auf einen Wert von 7,5–8,0 eingestellt. Nach 15minütigem Rühren wurden die wäßrige und die Ethylacetat-Phase getrennt, dann wurde die Ethylacetatlösung mit 2 × 40 ml entionisiertem Wasser extrahiert, wie oben beschrieben wurde. Anschließend wurde die kombinierte alkalische wäßrige Lösung auf ein Volumen von 50 ml konzentriert und auf einer Säule, die mit 600 ml des nicht-ionischen Adsorptionsharzes Diaion HP20 (Mitsubishi Co., Japan) gefüllt war, chromatographiert (Durchmesser der Säule: 3,8 cm, Höhe der Harzschicht: 53 cm). Die Säule wurde mit 600 ml entioni siertem Wasser gewaschen, anschließend mit Gemischen aus Aceton und entionisiertem Wasser eluiert, wobei die Acetonkonzentration in 5%-Schritten erhöht wurde, wobei 50-ml-Fraktionen gesammelt wurden. Das Eluat wurde anhand des im Beispiel 1 angegebenen TLC-Verfahrens analysiert. Durch ein Gemisch aus Aceton und entionisiertem Wasser, wobei das Gemisch 15% Aceton enthielt, wurde Pravastatin aus der Säule eluiert. Fraktionen, die Pravastatin als einzige Komponente enthielten, wurden kombiniert, und die Lösung wurde in Vakuum auf ein Volumen von 150 ml konzentriert. Anschließend wurden 0,6 g Holzkohle zu der konzentrierten wäßrigen Lösung hinzugegeben, und Pravastatin wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur abgeklärt. Anschließend wurde die Holzkohle gefiltert, und das Filtrat wurde lyophilisiert. Die sich ergebenden 6,5 g lyophilisiertes Pravastatin wurden zweimal aus einem Gemisch aus Ethanol und Ethylacetat kristallisiert. Der Niederschlag wurde gefiltert und mit 20 ml Ethylacetat und 20 ml n-Hexan gewaschen und bei Raumtemperatur in Vakuum getrocknet. Somit wurden 4,6 g chromatographisch reines Pravastatin erhalten. - Beispiel 5
- Eine Sporensuspension wurde mit 5 ml sterilem destilliertem Wasser von der Oberfläche einer 10 Tage alten Schrägkultur, auf einem Agar aus löslicher Stärke, wie bei Beispiel 1 beschrieben ist, eines Stammes von Micromonospora echinospora ssp. echinospora IDR-P5 [NCAIM (P) B 001272] – der zu der 6β-Hydroxylierung von Compactinsäurenatriumsalz fähig ist – hergestellt, und die erhaltene Sporensuspension wurde verwendet, um 100 ml Impfmedium TI, das in einem 500-ml-Erlenmeyer-Kolben sterilisiert wurde, zu impfen. Die Zusammensetzung des Mediums TI wurde auch bei Beispiel 1 beschrieben. Das geimpfte Medium wurde auf einem Dreh-Schüttelapparat (250 U/min, 2,5 cm Amplitude) 3 Tage lang bei 28°C geschüttelt, anschließend wurden 5 ml aliquote Teile der entwickelten Kultur in 100–100 ml Bioumwandlungsmedium TT/1 transferiert, das 25 Minuten lang bei 121°C in 500-ml-Erlenmeyer-Kolben sterilisiert wurde. Die Zusammensetzung des Mediums TT/1 ist in Beispiel 4 beschrieben. Die Kolben wurden 3 Tage lang bei 25°C auf einem Dreh-Schüttelapparat (250 U/min, 2,5 cm Amplitude) geschüttelt, anschließend wurden 10–10 mg Compactinsubstrat (Compactinsäurenatriumsalz) in einer sterilen gefilterten wäßrigen Lösung zu den Kulturen hinzugefügt, und die Fermentierung wurde 168 Stunden lang fortgesetzt.
- Am Ende der Bioumwandlung wurde der Pravastatingehalt der Fermentationsbrühe anhand eines HPLC-Verfahrens ermittelt. Zu diesem Zeitpunkt betrug die durchschnittliche Pravastatinkonzentration 40 μg/ml.
- Beispiel 6
- Die Fermentation, das Speisen des Substrats und die Bioumwandlung wurden mit dem Stamm IDR-P6 [NCAIM (P) B 001273] von Micromonospora megalomicea ssp. nigra durchgeführt, wie in Beispiel 5 zu lesen ist. Der Pravastatingehalt der Fermentationsbrühe wurde anhand eines HPLC-Verfahrens ermittelt. Am Ende der Bioumwandlung betrug der Pravastatingehalt der Brühe 50 μg/ml.
- Beispiel 7
- 5 ml aliquote Teile einer Impfkultur des Stamms IDR-P4 [NCAIM (P) B 001271] von Micromonospora purpurea, die gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 hergestellt worden war, wurden verwendet, um 100–100 ml TT/14-Medium, das in 500-ml-Erlenmeyer-Kolben dispensiert und 25 Minuten bei 121°C sterilisiert worden war, anzuimpfen. Zusammensetzung des Mediums TT/14
Kartoffelstärke 5,0 g Glucose 25,0 g Hefeextrakt (GISTEX) 15,0 g Pepton 15,0 g CaCO3 1,0 g in 1.000 ml Leitungswasser - Der pH-Wert des Bioumwandlungsmediums wurde vor der Sterilisation auf 7,0 eingestellt.
- Die Kolben wurden 3 Tage lang auf einem Dreh-Schüttelapparat (250 U/min, 2,5 cm Amplitude) geschüttelt. Das Speisen des Substrats, die Bioumwandlung und die Bestimmung des Pravastatingehalts wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 5 durchgeführt. Am Ende der Bioumwandlung betrug der Pravastatingehalt der Fermentationsbrühe 40 μg/ml.
- Beispiel 8
- Die Fermentation, das Speisen des Substrats und die Bioumwandlung wurden mit dem Stamm IDR-P7 [NCAIM (P) B 001274] von Micromonospora rosaria durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben wurde. Am Ende der Bioumwandlung wurden anhand des HPLC-Verfahrens in der in der Fermentationsbrühe 350 μg/ml Pravastatin gemessen.
Claims (7)
- Ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel (I)aus einer Verbindung der allgemeinen Formel (II)
wobei R für ein Alkalimetall- oder Ammoniumion steht, durch die Submerskultur eines Micromonospora-Stamms, der in der Lage ist, eine Verbindung der Formel (II) unter aeroben Bedingungen zu 6β-hydroxylieren, und durch die Trennung und Reinigung der Verbindung der Formel I), die im Verlauf der Bioumwandlung gebildet wird, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: a) Kultivieren eines Micromonospora-Stamms, der in der Lage ist, eine Verbindung der Formel (II) – bei der R wie oben definiert lautet – bei 25–32°C auf einem Nährmedium, das verfügbare Kohlenstoffund Stickstoffquellen und Mineralsalze enthält, zu 6β-hydroxylieren, anschließend b) Zuführen des zu transformierenden Substrats in eine Entwicklungskultur, anschließend c) Hydroxylieren des Substrats, bis die Bioumwandlung abgeschlossen ist, anschließend d) Trennen der Verbindung der Formel (I) von der Kulturbrühe und, falls gewünscht, Reinigen derselben.
- Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Stamm der Micromonospora sp. IDR-P3, der bei der National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Ungarn, unter der Nummer NCAIM (P) B 001268 hinterlegt ist, oder ein Mutantenstamm desselben, der in der Lage ist, eine Verbindung der allgemeinen Formel (II) zu 6β-hydroxylieren, angewandt wird.
- Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Stamm der Micromonospora purpurea IDR-P4, der bei der National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Ungarn, unter der Nummer NCAIM (P) B 001271 hinterlegt ist, oder ein Mutantenstamm desselben, der in der Lage ist, eine Verbindung der allgemeinen Formel (II) zu 6β-hydroxylieren, angewandt wird.
- Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Stamm der Micromonospora echinospora ssp. echinospora IDR-P5, der bei der National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Ungarn, unter der Nummer NCAIM (P) B 001272 hinterlegt ist, oder ein Mutantenstamm desselben, der in der Lage ist, eine Verbindung der allgemeinen Formel (II) zu 6βhydroxylieren, angewandt wird.
- Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Stamm der Micromonospora megalomicea ssp. nigra IDR-P6, der bei der National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Ungarn, unter der Nummer NCAIM (P) B 001273 hinterlegt ist, oder ein Mutantenstamm desselben, der in der Lage ist, eine Verbindung der allgemeinen Formel (II) zu 6β-hydroxylieren, angewandt wird.
- Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Stamm der Micromonospora rosaria IDR-P7, der bei der National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Ungarn, unter der Nummer NCAIM (P) B 001274 hinterlegt ist, oder ein Mutantenstamm desselben, der in der Lage ist, eine Verbindung der allgemeinen Formel (II) zu 6β-hydroxylieren, angewandt wird.
- Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem die Verbindung der Formel (I), die während der Fermentierung gebildet wird, durch eine Adsorption an einem anionischen Ionenaustauschharz oder durch eine Extraktion mit einem wasserunlöslichen organischen Lösungsmittel von der Kulturbrühe getrennt wird, gefolgt von der Herstellung ihres Lactonderivats oder ihres sekundären Aminosalzes als Zwischenprodukt, oder durch eine Reinigung des alkalischen wäßrigen Extraktes, der aus dem organischen Lösungsmittelextrakt der Fermentierungsbrühe mit einer Chromatographie an einem nicht-ionischen Adsorptionsharz erhalten wird.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9902352A HUP9902352A1 (hu) | 1999-07-12 | 1999-07-12 | Eljárás pravasztatin mikrobiológiai előállítására |
| HU9902352 | 1999-07-12 | ||
| PCT/HU2000/000066 WO2001004340A1 (en) | 1999-07-12 | 2000-06-29 | Hydroxylation of compactin to pravastatin by micromonospora |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE60003424D1 DE60003424D1 (de) | 2003-07-24 |
| DE60003424T2 true DE60003424T2 (de) | 2004-05-19 |
Family
ID=89998701
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE60003424T Expired - Fee Related DE60003424T2 (de) | 1999-07-12 | 2000-06-29 | Hydroxylierung von compactin zu pravastatin unter verwendung von micromonospora bakterien |
Country Status (32)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6905851B1 (de) |
| EP (3) | EP1190087B1 (de) |
| JP (2) | JP4531315B2 (de) |
| KR (2) | KR100479837B1 (de) |
| CN (2) | CN1590555A (de) |
| AP (1) | AP1405A (de) |
| AT (1) | ATE243262T1 (de) |
| AU (2) | AU773633B2 (de) |
| BG (1) | BG65109B1 (de) |
| BR (1) | BR0013156A (de) |
| CA (2) | CA2379015A1 (de) |
| CZ (2) | CZ297009B6 (de) |
| DE (1) | DE60003424T2 (de) |
| DK (1) | DK1190087T3 (de) |
| ES (1) | ES2200891T3 (de) |
| HR (1) | HRP20020028B1 (de) |
| HU (1) | HUP9902352A1 (de) |
| IL (2) | IL147583A0 (de) |
| IS (1) | IS2138B (de) |
| MX (1) | MXPA02000356A (de) |
| NO (1) | NO20020119L (de) |
| NZ (1) | NZ516563A (de) |
| OA (1) | OA12150A (de) |
| PL (2) | PL353493A1 (de) |
| PT (1) | PT1190087E (de) |
| RU (2) | RU2235780C2 (de) |
| SK (2) | SK285726B6 (de) |
| TR (1) | TR200200726T2 (de) |
| UA (1) | UA67854C2 (de) |
| WO (2) | WO2001004340A1 (de) |
| YU (1) | YU2002A (de) |
| ZA (1) | ZA200200273B (de) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SI9800046A (sl) | 1998-02-18 | 1999-08-31 | LEK, tovarna farmacevtskih in kemi�nih izdelkov, d.d. | Postopek za pridobivanje inhibitorjev HMG-CoA reduktaze visoke čistosti |
| HUP9902352A1 (hu) * | 1999-07-12 | 2000-09-28 | Gyógyszerkutató Intézet Kft. | Eljárás pravasztatin mikrobiológiai előállítására |
| DE04010770T1 (de) | 1999-11-30 | 2005-10-20 | Biogal Gyogyszergyar | Verfahren zur Rückgewinnung von Statinverbindungen aus einer Fermentationsbrühe |
| AU779306B2 (en) | 1999-12-14 | 2005-01-13 | Teva Gyogyszergyar Reszvenytarsasag | Novel forms of pravastatin sodium |
| JP3737801B2 (ja) * | 2000-10-05 | 2006-01-25 | テバ ジョジセルジャール レースベニュタールシャシャーグ | プラバスタチンラクトン及びエピプラバスタチンを実質的に含まないプラバスタチンナトリウム、並びにそれを含む組成物 |
| JP3236282B1 (ja) * | 2000-10-16 | 2001-12-10 | 三共株式会社 | プラバスタチンを精製する方法 |
| ATE356554T1 (de) * | 2001-02-09 | 2007-04-15 | Unilever Nv | Nahrungsmittel enthaltend sojaprotein und statin |
| JP2003026634A (ja) * | 2001-07-17 | 2003-01-29 | Mercian Corp | プラバスタチンナトリウム塩の製造方法 |
| US6716615B2 (en) | 2002-02-27 | 2004-04-06 | Yung Shin Pharmaceutical Ind. Co., Ltd. | Strains of saccharaothrix, process for producing pravastatin using the strains and isolation process of (HMG)-CoA reductase |
| EP1452602A1 (de) * | 2003-02-25 | 2004-09-01 | Antibiotic Co., | Fermentatives Verfahren zur Herstellung von Pravastatin |
| CN1244688C (zh) | 2003-07-09 | 2006-03-08 | 上海天伟生物制药有限公司 | 生产普伐他汀钠的微生物和方法 |
| WO2005051372A2 (en) | 2003-11-24 | 2005-06-09 | Teva Gyógyszergyár Zártköruen Muködo Részvénytársaság | Method of purifying pravastatin |
| MX2010008654A (es) * | 2008-02-06 | 2010-10-06 | Biocon Ltd | Medios de fermentacion y procedimientos para los mismos. |
| RU2522806C1 (ru) * | 2012-11-27 | 2014-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр "Биоинженерия" Российской академии наук | Усовершенствованный способ очистки правастатина |
| JP6441599B2 (ja) * | 2014-07-14 | 2018-12-19 | 合同酒精株式会社 | プラバスタチンの製造法 |
| CN114031496A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-02-11 | 广东蓝宝制药有限公司 | 一种高纯度普伐他汀1,1,3,3-四甲基丁胺的制备方法 |
| CN114133331A (zh) * | 2021-12-10 | 2022-03-04 | 广东蓝宝制药有限公司 | 一种回收获得高纯度普伐他汀酯的方法 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MX7065E (es) | 1980-06-06 | 1987-04-10 | Sankyo Co | Un procedimiento microbiologico para preparar derivados de ml-236b |
| JPS5810572A (ja) | 1981-07-07 | 1983-01-21 | Sankyo Co Ltd | Ｍｌ−２３６ｂ誘導体およびその製造法 |
| JPS5889191A (ja) | 1981-11-20 | 1983-05-27 | Sankyo Co Ltd | ３−ヒドロキシ−ｍｌ−２３６ｂ誘導体の製造法 |
| JPS59175450A (ja) * | 1983-03-24 | 1984-10-04 | Sankyo Co Ltd | Ｍｌ−２３６ｂ誘導体 |
| US5179013A (en) * | 1987-02-02 | 1993-01-12 | Sankyo Company, Limited | Cytochrome P-450 enzymes |
| JPH06253853A (ja) * | 1993-03-09 | 1994-09-13 | Asahi Chem Ind Co Ltd | マクロライド抗生物質生合成遺伝子を含有するｄｎａ |
| US6043064A (en) * | 1993-10-22 | 2000-03-28 | Bristol-Myers Squibb Company | Enzymatic hydroxylation process for the preparation of HMG-CoA reductase inhibitors and intermediates thereof |
| JPH08149986A (ja) * | 1994-09-28 | 1996-06-11 | Taisho Pharmaceut Co Ltd | １２−ヒドロキシ−６−ｏ−アルキルエリスロマイシン及びその類縁体の製造方法 |
| JPH0889277A (ja) * | 1994-09-28 | 1996-04-09 | Taisho Pharmaceut Co Ltd | １２−ヒドロキシ−６−ｏ−アルキルエリスロマイシン及びその類縁体の製造方法 |
| US5942423A (en) * | 1995-06-07 | 1999-08-24 | Massachusetts Institute Of Technology | Conversion of compactin to pravastatin by actinomadura |
| SI20072A (sl) * | 1998-09-18 | 2000-04-30 | LEK, tovarna farmacevtskih in kemi�nih izdelkov, d.d. | Postopek za pridobivanje inhibitorjev HMG-CoA reduktaze |
| US6682913B1 (en) * | 1999-02-03 | 2004-01-27 | Institute For Drug Research Ltd. | Microbial process for preparing pravastatin |
| HUP9902352A1 (hu) * | 1999-07-12 | 2000-09-28 | Gyógyszerkutató Intézet Kft. | Eljárás pravasztatin mikrobiológiai előállítására |
| IN191580B (de) * | 1999-12-17 | 2003-12-06 | Ranbaxy Lab Ltd |
-
1999
- 1999-07-12 HU HU9902352A patent/HUP9902352A1/hu unknown
-
2000
- 2000-06-29 CN CNA2004100493556A patent/CN1590555A/zh active Pending
- 2000-06-29 EP EP00944121A patent/EP1190087B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-29 OA OA1200200015A patent/OA12150A/en unknown
- 2000-06-29 JP JP2001509543A patent/JP4531315B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-29 RU RU2002103376/13A patent/RU2235780C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-06-29 DK DK00944121T patent/DK1190087T3/da active
- 2000-06-29 NZ NZ516563A patent/NZ516563A/xx unknown
- 2000-06-29 AP APAP/P/2002/002404A patent/AP1405A/en active
- 2000-06-29 YU YU2002A patent/YU2002A/sh unknown
- 2000-06-29 CN CN00811127A patent/CN1399686A/zh active Pending
- 2000-06-29 WO PCT/HU2000/000066 patent/WO2001004340A1/en active IP Right Grant
- 2000-06-29 US US10/030,726 patent/US6905851B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-29 SK SK49-2002A patent/SK285726B6/sk unknown
- 2000-06-29 DE DE60003424T patent/DE60003424T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-29 AU AU58355/00A patent/AU773633B2/en not_active Ceased
- 2000-06-29 EP EP03075550A patent/EP1327689A1/de not_active Withdrawn
- 2000-06-29 AT AT00944121T patent/ATE243262T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-06-29 KR KR10-2002-7000475A patent/KR100479837B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-06-29 ES ES00944121T patent/ES2200891T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-29 MX MXPA02000356A patent/MXPA02000356A/es active IP Right Grant
- 2000-06-29 TR TR2002/00726T patent/TR200200726T2/xx unknown
- 2000-06-29 BR BR0013156-3A patent/BR0013156A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-06-29 PT PT00944121T patent/PT1190087E/pt unknown
- 2000-06-29 UA UA2002010326A patent/UA67854C2/uk unknown
- 2000-06-29 IL IL14758300A patent/IL147583A0/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-06-29 PL PL00353493A patent/PL353493A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2000-06-29 CZ CZ20020119A patent/CZ297009B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-06-29 CA CA002379015A patent/CA2379015A1/en not_active Abandoned
- 2000-07-11 JP JP2001508931A patent/JP2003528576A/ja active Pending
- 2000-07-11 CZ CZ2002127A patent/CZ2002127A3/cs unknown
- 2000-07-11 PL PL00364872A patent/PL364872A1/xx unknown
- 2000-07-11 AU AU63492/00A patent/AU6349200A/en not_active Abandoned
- 2000-07-11 SK SK61-2002A patent/SK612002A3/sk unknown
- 2000-07-11 IL IL14758800A patent/IL147588A0/xx unknown
- 2000-07-11 CA CA002373544A patent/CA2373544A1/en not_active Abandoned
- 2000-07-11 WO PCT/US2000/019384 patent/WO2001003647A2/en not_active Application Discontinuation
- 2000-07-11 KR KR1020027000486A patent/KR20020060150A/ko not_active Application Discontinuation
- 2000-07-11 EP EP00950379A patent/EP1198448A4/de not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-01-10 NO NO20020119A patent/NO20020119L/no not_active Application Discontinuation
- 2002-01-10 HR HR20020028A patent/HRP20020028B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2002-01-11 IS IS6227A patent/IS2138B/xx unknown
- 2002-01-11 ZA ZA200200273A patent/ZA200200273B/xx unknown
- 2002-01-14 BG BG106302A patent/BG65109B1/bg unknown
-
2004
- 2004-05-13 RU RU2004114667/13A patent/RU2004114667A/ru not_active Application Discontinuation
- 2004-12-16 US US11/014,658 patent/US20050124051A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE60003424T2 (de) | Hydroxylierung von compactin zu pravastatin unter verwendung von micromonospora bakterien | |
| DE3242849C2 (de) | ||
| DE60019898T2 (de) | Mikrobielles verfahren zur herstellung von pravastatin | |
| DE4320023A1 (de) | Holotyp-Stamm Aspergillus obscurus und Verfahren zur Herstellung von µ,£-Di-(hydroxy)-7-[1,2,6,7,8,8a-hexa-(hydro)-2,6-di-(methyl)-8-(2'-{methyl}-butyryloxy)-naphthalin-1-yl]-heptansäure-£-lacton{Mevinolin} und/oder µ,5-Di-(hydroxy)-7-[1,2,6,7,8,8a-hexa-(hydro)-2,6-di-(methyl)-8-(2'-{mehtyl}-butyryloxy)-naphthalin-1-yl]-heptansäure | |
| DE60007338T2 (de) | Verfahren zur herstellung von mycophenolsäure und derivaten davon | |
| CH647749A5 (de) | Salze und ester von monacolin-k, verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische praeparate. | |
| DE3323025A1 (de) | Anthracyclin-derivate, ein mikrobiologisches verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als cytostatika | |
| CH631740A5 (en) | Process for the preparation of maytansinol and its derivatives | |
| EP0019148B1 (de) | Antibiotikum zur Unterdrückung des Wachstums von Mikroorganismen sowie dessen Herstellung durch Fermentation | |
| DE2849666A1 (de) | Verfahren zur herstellung des antibiotikums c-15003 p 4 | |
| DD159645A5 (de) | Verfahren zur herstellung von makroliden | |
| DE3444184A1 (de) | Antibiotikum em 5487 | |
| DE2921052C2 (de) | ||
| DE2746209A1 (de) | Neues antibiotikum und verfahren zu dessen herstellung | |
| DE3404470A1 (de) | Anthracyclinonglucuronide, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende arzneimittel | |
| DE19611366A1 (de) | Neue Naturstoffe der Hyphodermine und chemische Derivate |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |