CZ2002127A3

CZ2002127A3 - Mikrobiální způsob výroby pravastatinu

Info

Publication number: CZ2002127A3
Application number: CZ2002127A
Authority: CZ
Inventors: Antonia Jekkel; Gabor Ambrus; Eva Ilkoy; Ildiko Horvath; Attila Konya; Istvan Mihaly Szabo; Zsuzsanna Nagy; Gyula Horvath; Julianna Mozes; Isvan Barta; Gyorgy Somogyi; Janos Salat; Sandor Boros
Original assignee: Ivax Corporation
Priority date: 1999-07-12
Filing date: 2000-07-11
Publication date: 2003-06-18
Also published as: EP1190087B1; EP1198448A2; HRP20020028B1; SK612002A3; RU2004114667A; CN1590555A; BG65109B1; HRP20020028A2; PL353493A1; JP4531315B2; WO2001004340A1; JP2003504071A; HU9902352D0; YU2002A; CN1399686A; EP1198448A4; ZA200200273B; AU773633B2; KR100479837B1; CA2373544A1

Description

OBLAST TECHNIKY

Předložený vynález se týká mikrobiální technologie výroby pravastatinu.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

U atherosklerózy, zejména z hlediska onemocnění koronárních cév srdce, se za významný rizikový faktor považuje hypercholesterolemie. Významným faktorem přispívajícím rozvoji hypercholesterolemie je biosyntéza cholesterolu. Enzym HMG-CoA reduktáza katalyzuje přeměnu HMG-CoA na mevalonát v poměru určujícím rychlost biosyntézy cholesterolu. Během dvou minulých desetiletí byla 3-hydroxy-3methylglutaryl-coenzym A reduktáza (HMG-CoA reduktáza EC. 1.1.1.34) intenzivně studována. Zjistilo se, že mevinolin a jemu příbuzné látky syntetizované různými druhy hub působí jako kompetitivní inhibitory uvedeného enzymu {Endo, A. et al., J. Antibiotics 29, 1346-1348 (1979): Endo. A. et al., FEBs lett. 72, 323-326 (1976: Kuo, C.H. et al., J. Org. Chem.48, 1997-1988 (1983)}.

Spolu s kompaktinem, lovastatinem, simvastatinem, fluvastatinem a atorvastinem patří provastatin do této skupiny inhibitorů HMG-CoA reduktázy. Pravastatin byl prvně isolován u psa jako vedlejší metabolit kompaktinu (Tanaka, M. et al., nepublikováno) při studiu metabolismu kompaktinu {Aral, M. et al., Sankyo Kenkyusho Nempo, 40, 1-38 (1998). Jednotlivé tkáně reagují na pravastatin nestejně; selektivita tkání má jedinečný charakter. Pravastatin selektivně inhibuje syntézu cholesterolu v játrech a v tenkém střevě, ale inhibuje jen slabě siaÚMi KJS

WO 01/03647 •PCT/US00/1 jeho syntézu v jiných orgánech. Koga, T. et al. Biochim. Biophys. Acta, 1990, 1045, 115-120. Výhodou pravastatinu je jeho nižší toxicita oproti jiným inhibitorům HMG-CoA reduktázy·

Uvádí se, že kompaktin lze konvertovat na pravastatin mikrobiální hydroxylací pomocí různých rodů hub a rovněž bakterií patřících do rodu Nocardia ze skupiny Aktimomycetes; rodu Actinomudura ze skupiny Maduromycetes a druhu Streptomyces roseochromogennes a Streptomyces carbophillus spolu s jinými druhy skupiny Streptomyces (U.S. patent č. 5, 179,013, U.S. patent č. 4, 448,979, Patent č. 4, 346,227, U.S. Patente. 4, 537,859, japonský patent č. 58-10571).

Při výrobě pravastatinu pomocí hub se naráží na jeden problém: houby všeobecně nesnášejí v kultivačním mediu vysoký obsah kompaktinu, pravděpodobně pro jeho antifungální účinek {Serizawa, N.et al., J Antibiotics 36, 887-891 (1983)}.

Ukázalo se, že pro hydroxylací kompaktinu na pravastatin bakterií Streptomyces carbophilus je nutná účast systému cytochromu P450 {Matsuoka. T. et al., Eur. J. Biochem. 184, 707-713 (1989)}. Problémem využití systému cytochromu P450 spočívá v tom, že genetická modifikace DNA je zde obtížná vzhledem k tomu, že není tvořen jednou bílkovinou nýbrž komplexem bílkovin.

Je potřeba zlepšit způsob mikrobiální přípravy pravastatinu ve směru tolerance k vysoké koncentraci kompaktinu a vysoké výnosnosti pravastatinu ve vysoké koncentraci v kultivačním mediu.

PODSTATA VYNÁLEZU

Předložený vynález skýtá nový mikrobiální proces výroby pravastatinu. Podrobněji řečeno, tento vynález poskytuje mikrobiální způsob výroby pravastatinu obecného vzorce I, υ«.02.Ο2 bunslaiion v

z látky obecného vzorce II

v nichž R+ zastupuje alkalický kov nebo amonný iont pomocí prokaryontu rodu Micromonospora ze skupiny Actinoplanetes schopného hydroxylace pozice 6-β u látky obecného chemického vzorce (II).

Předložený vynález poskytuje nový způsob mikrobiální výroby pravastatinu.

Předložený vynález je vyvrcholením výzkumu prováděného za cílem nalezení mikroorganismu který by produkoval pravastatin ve vysoké koncentraci a za výhodnějších podmínek než v případech známých mikrobiálních systémů. Byl proveden výběr ze 6000 kmenů aktinomycet. Z nich bylo nalezeno pouze deset mikroorganismů schopných hydroxylovat sodnou sůl kompaktinu na pravastatin. Tuto schopnost vykazovaly zejména následující druhy: Streptomyces violaceus No. 1/43 (Kámpfer et al. 1991), Streptomyces rocheiNo 1/41 (Ber3 ·· » · • ·

WO 01/03647 «« • » · « · ♦ • · · • · ·

.. VČŤ/USOO/1 ger et al. 1989), Streptomyces resinomycificus (Lindenbein,

1952), Streptomyces lanatus (Formmer 1959), Streptomyces sp. No. 1/28, Micromonospora sp. No. IDR-P₃, Micromonospora purpurea No. IDR-P^ (Leudemann and Brodsky 1964), Micromonospora megalormicea ssp. nigra No. IDR-P_Ě (Wiensten at al 1969), Micromonospora rosaria No. IDR-P₇ (Horan and Brodsky 1989). Jelikož nebylo známo, že by rod Micromonospora byl schopný konvertovat soli kyselé formy kompaktinu v pravastatin, podnikli jsme z tohoto hlediska detailní studii a pozitivní selekci druhů rodu Micromonospora.

Micromonospora je rod bakterií příslušející do taxonomické skupiny Actinomycetes. Ukázalo se, že rod Micromonosporaje v rámci řádu Actinomycetales a nadrodu Actinoplanetes mnohem bližší sporangioformním aktinomycetám, jako jsou Actinoplanes a Dactylosporangium a značně se odlišuje od ostatních monosporických rodů, jako jsou Thermomonospora a Thermoactinomyces, s nimiž byl spojován. Rod Actinoplanetes vykazuje podobné chemotaxonomické znaky a značnou podobnost v nukleových kyselinách. Jsou to Gram-pozitivní, v nekyselém prostředí rychle rostoucí organismy s nefragmentujícími větvícími se přehrádkovitými hyfami o průměru 0,2 - 0,6 pm. Vzdušné mycelium se vyvíjí vzácně, nebo pouze řídké. Rod Micromonospora 0rskov, 1923.

Micromonospora chalcea (Foulerton, 1905) tvoří dobře vyvinuté, větvící se přehrádkované mycelium o průměrném průřezu 0,5 pm. Nepohyblivé spoiy se tvoří jednotlivě. Jsou přisedlé nebo na krátkých či dlouhých sporoforech, které se často objevují ve formě větvících se svazků. Sporofory se větví monopodiálně, v některých případech sympodiálně. Vzdušné mycelium chybí, nebo se u některých kultur objevuje nepravidelně jako omezený bílý nebo šedavý nálet. Buněčné stěny obsahují kyselinu meso-diaminopimelovou nebo její 3-hydroxy derivát, případně obě tyto látky, a glycin. V buněčných hyd

WO 01/03647 *

• ·* • « » fl ·· ·· » *« *· « ·» » · « · » * · » » · » • ··*«· » « · _t* **·* » '* *ft*t/USOO/l rolysátech se objevuje xyloza a arabinóza. Typickými fosfolipidy jsou zde manosidy fosfatidylethanolaminu, fosfatidylinositolu a fosfatidylinositolu. Micromonospora chalcea je aerobní až mikroaerobní chemoorganotrofní organismus. Je citlivý na kyselost prostředí nižší nežli pH 6,0. Roste normálně mezi 20° až 40° C ale nikoliv nad 50° C. 0rskov, 1923.

Bylo pozorováno, že několik značně vzdálených druhů rodu Micromonospora je schopno hydrolyzovat kompaktin na jeho pozici 6-β, a tak se ukazuje, že schopnost hydroxylovat kompaktin na pozici 6-β je mezi jednotlivými druhy rodu

Micromonospora značně rozšířena. Micromonospora v předloženém vynálezu obsahuje kmeny divokých typů a mutantů schopné konverze kompaktinového substrátu v pravastatin.

Přednostní kmeny rodu Micromonospora, které zde slouží k dalšímu popisu jistých přednostních základů podstaty tohoto vynálezu a kjeho ilustraci uvedením speciálních příkladů, byly vybrány pro svou vysokou hydroxilační kapacitu, která může při koncentraci 0,1 g.l·¹ sodné soli kompaktinu dosáhnout kolem 90%. Následující kmeny rodu Micromonospora byly uloženy 13. dubna 1999 do maďarské sbírky mikroorganismů National Collection of Agricultural and Industrial

Microorganisms” v Budapešti, pod těmito čísly:

NCAIM P (B) 001271 - Micromonospora purpurea IDR-P₄,

NCAIM P (B) 001272 -Micromonospora ečhinospora ssp. echinospora IDR-P₆,

NCAIM P (B) 001273 - Micromonospora megalomicea ssp. nigra IDR-P₆,

NCAIM P (B) 001274 - Micromonospora rosaria IDR-P7.

Isolovaný kmen Micromonospora species označený IDRP₃ byl do maďarské sbírky mikroorganismů National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms” v Budapešti uložen dne 13. října 1998 pod číslem NCAIM P (B) 001268.

Kmen Micromonospora sp. No. IDR-P₃ byl isolován ze vzorku i

” fOT/USOO/1 ·· ·· ♦ · ·

WO 01/03647 .......

bahna odebraného Balatonského jezera v Maďarsku. Tyto druhy kromě schopnosti produkce pravastatinu ze sodné soli kompaktinu ve vysoké koncentraci v podmínkách vhodných pro fermentací ve velkém měřítku tvořily při biosysntéze pouze menší množství jiných, chemickou strukturou příbuzných metabolitů. Uvedené druhy jsou takto velmi vhodné pro průmyslovou výrobu pravastatinu.

Taxonomické charakteristiky kultur Micromonospora IDR-P₃jsou shrnuty následovně:

Morfologické vlastnosti: substrátové mycelium je složeno z dobře vyvinutých, spíše zakřivených nežli rovných, větvících se vláken. Na sklíčkové kultuře lze pozorovat monopodiální typ větvení hyf (sporoforů). Spory jsou jednoduché, kulovité, o průměru přibližně 1,8 pm a jsou po vláknech hyf rovnoměrně rozmístěné. Spory jsou jak přisedlé, tak na koncích krátkých sporoforů. Při kultivaci v tekutém mediu nebyly spoiy na sporulujících hyfách pozorovány, zřejmě proto, že se zralé spory rychle uvolňovaly do media.

Kultivační a morfologické vlastnosti:

Czapek-Dox agar: střední růst, kolonie mají červenavou barvu a jsou pokryté černými tečko vitými sporulujícími oblastmi.

Glukózo-asparaginový agar: růst byl zaznamenán jako bodové a vyvýšené, rudohnědé nebo černé kolonie tvořící červenavé barvivo pronikající do media.

Živný agar: dobrý růst, vyvýšené rudohnědé nebo černé kolonie. V kultivačním mediu rudohnědý exopigment.

Kvasnično-sladinkový agar (ISP Med. 2): dobře vyvinuté vyvýšené a vrásčité hnědé kolonie částečné pokryté černými sporulujícími oblastmi nebo „pseudovzdušným“ myceliem objevujícím se jako omezený bělavý nebo šedavý poprašek. Hnědavý, nebo hnědorudý rozpustný pigment.

08.02.02

PCVUSOO/l

WO 01/03647

Minerální škrobový agar (ISP Med. 4): střední růst rudohnédých vyvýšených a vrásčitých kolonií. Světle rudý rozpustný pigment.

Glycero-asparaginový agar (ISP Med. 5): Růst pouze ve stopách, bělavé nebo světle oranžově zbarvené ploché kolonie, světle růžový rozpustný pigment.

Pigment pozorovaný na některých kultivačních půdách má charakter zvláštního indikátoru: pigment v kyselé oblasti pH žlutý mění se v zásaditém prostředí do poněkud tmavšího odstínu nebo do červenavého zbarvení.

Využití zdroje uhlíku: Dobrý růst a pozitivní využití Larabinózy, D-cellobiózy, D-glukózy, laktózy, D-maltózy, Dmanitolu, D-mannózy, α-methyl-D-glukosidu, L-rhamnózy, Dribózy, D-sacharózy, D-trehalózy a D-xylózy. Adonitol, dulcitol, myo-inositol, inulin, D-melezitóza, D-rafinóza asimilovány nebyly. Růst s glycerolem, D-galaktózou, D-melibičzou a Dsalicinem byl mírně lepší nežli růst na negativním kontrolním mediu.

Využití zdrojů dusíku: Dobrý růst s kvasničným extraktem a NZ-aminem; žádné využití L-asparaginu, L-glutamové kyseliny a NaNO₃.

Jiné fyziologicko-biochemické vlastnosti: Celulóza a škrob jsou hydrolysovány, mléko je hydrolysováno velmi silně. Test na redukci nitrátů je negativní. Žádný růst na bramborových plátcích bez uhličitanu vápenatého (pH 5,8 - 5,0).

Přednostní forma tohoto vynálezu je založena na našich studiích kmenů Micromonospora uložených v maďarské sbírce mikroorganismů National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms” v Budapešti, a vztahuje se k novému způsobu mikrobiální přípravy pravastatinu chemického vzorce I

08.02.0?. msniilatíon KJS • · · ft « ft · ft · ’pčf/usoo/i

Λ

WO01/O3647

kde R+ zastupuje alkalický kov nebo amoniový iont, submersní kultivací kmene mikroorganismu schopného hydroxylovat aerobní fermentaci uhlík na pozici u látky obecného vzorce (II) a dále pak separace a purifikace látky chemické struktury (I) vytvořené během biokonverse, kde tento proces zahrnuje:

a) kultivaci mikroorganismu rodu Micromonospora schopného v živném mediu obsahujícím asimilovatelné zdroje uhlíku, dusíku a minerální soli za teploty 25 - 32° C hydroxylovat 6-β látky obecného vzorce (II) - kde symbol R+ je definován výše, a dále

b) doplňování substrátu až do konce biokonverse,

c) fermentaci substrátu až do konce biokonverse, poté

d) separaci látky vzorce (I) od pěstebního media, a v případě potřeby její purifikaci.

Právě dle přednostní podstaty tohoto vynálezu, vyrábí se pravastatin buď divokými nebo mutantními kmeny rodu Micromonospora vyselektovanými ze skupiny složené z Micromonospora purpurea IDR-P₄ (NCAIM P (B) 001271}, Micromo8 • · · • · ·

WO 01/03647 ·’ řčY/usoo/i nospora echinospora ssp. echinospora IDR-P₆ {NCAIM P (B) 001272}, Micromonospora megalomicea ssp. nigra IDR-P₆{NCAIM P (B) 001273} a Micromonospora rosaria IDR-P? {NCAIM P (B) 001274}.

Dle preferované přednostní podstaty tohoto vynálezu se pravastatin vyrábí pomocí kmene Micromonospora sp. označeného IDR-P₃ {NCAIM P (B) 001268}.

Předložený vynález může být realizován jako fermentace in-situ - jako hydroxylace za přítomnosti aktivně rostoucích mikroorganismů pěstovaných technikou jednorázové kultury nebo kultury pěstované na živinami dosycovaném kultivačním mediu.

Hydroxylace může být prováděna s využitím třepání, jakožto nádobová kultura na třepacích přístrojích, nebo pomocí areace a míchání ve fermentorech, kdy se látka o chemickém vzorci (II) do kultivačního media přidává. V takovém případě se může do media přidat protipěnivý prostředek.

Uvedené mikroorganismy lze pěstovat a udržovat na vhodném mediu obsahujícím uhlík a dusík zahrnující glukózu, glycerol, dextrin, škrob, ramnózu, xylózu, sacharózu, rozpustný škrob, atd. Příklady zdroje dusíku zahrnují sojovou moučku, kukuřičný výluh, pepton, kvasničný extrakt, masový extrakt, citrát amonný, síran amonný, atd. Do kultivačního media se rovněž mohou přidat anorganické soli, jako jsou uhličitan vápenatý, fosforečnan sodný, fosforečnan draselný atd. Přednostní media pro kultivaci mikroorganismů jsou uvedena v Příkladech.

Pro kultivaci kultury se upřednostňuje míchané tekuté medium. Přednostní teplota pro průběh hydroxylace je mezi 25 - 37° C. Přednostní kyselost media se pohybuje mezi pH 6.0 - 9,0; přičemž nejvhodnější je mezi pH 7,0 - 8,5. Přednostní intenzita protřepávání je kolem 200 ot.mim¹ až 400 ot.min’¹; nejlépe kolem 250 ot.min’¹ (otáček za minutu).

08.02.02

WO 01/03647

PtT/USOO/1

Je možné aplikovat jakoukoli koncentraci kompaktinu, jejímž výsledkem bude produkce pravastatinu. Pro hydroxy láci in-situ Jq vhodná koncentrace kompaktinu mezi 0,1 až 10 g.l·¹; nejvhodnější je mezi 0,3 až 3,0 g.l·¹. Pro vynalezený způsob není procentický podíl konverse kompaktinu kritickou hodnotou. Nicméně přednostní je konverse, jejíž hodnoty se pohybují v rozsahu kolem 30% a více; nejvhodnější je kolem 60% a ještě výhodnější kolem 90%.

Složení fermentačního tekutého media lze sledovat metodou vysoce výkonné kapalinové chromatografie (HPLC) za podmínek popsaných v Příkladech.

Pravastatin lze izolovat z kultivačního tekutého media jakoukoli metodou - tj. extrakce/reextrakce, iontoměničovou chromatografií a vysrážením. Níže uvedené způsoby isolace jsou velmi vhodné pro isolaci pravastatinu jakožto biosyntetického metabolitů mikroorganismu Micromonospora. Avšak tyto metody jsou uvedeny pouze za účelem úplného objasnění vhodných způsobů získání pravastatinu počínaje kompaktinem určitým kmenem Micromonospora, a v žádném případě není jejich úmyslem klást jakákoli omezení další invenci.

Po ukončení biokonverze je možné pravastatin extrahovat buď přímo z fermentačního media nebo po odstranění bakteriálních buněk z jeho filtrátu. Bakteriální buňky lze odstranit buď filtrací, nebo separací na centrifuze. Avšak zejména v průmyslovém měřítku je výhodné provést extrakci celého media. Extrakčními rozpouštědly jsou veškerá rozpouštědla, která se nemísí zcela s vodou. Přednostními extrakčními rozpouštědly jsou taková, která se sama ve vodě rozpouštějí slabě. Zejména se preferují rozpouštědla zahrnující estery kyseliny octové s alifatickou alkoxylovou skupinou se 2-4 uhlíky, jako jsou ethylacetát a isobutyl acetát.

Během našich pokusů bylo zjištěno, že pravastatin lze sekundárními aminy vysrážet z organického extraktu kulti10 • * tt · • · • ’ TVT/US00/1

WO 01/03647 .......

vačního media ve formě krystalické soli. Dále bylo zjištěno, že několik sekundárních aminů obsahujících alkyl-, cykloalkyl-, aralkyl- nebo aryl- substituenty, je pro tvorbu solí zvlášť vhodných. Zejména tyto následující jsou z nich obzvlášť vhodné, a to především pro jejich nízkou toxicitu: dioktylamin, dicyklohexylamine a dibenzylamin.

Metoda izolace organické soli sekundárního aminu pravastatinu je ilustrována na příkladu dibenzylaminu. Isolace soli dibenzylaminu se provádí přidáním dibenzylaminu v množství 1,5 ekvivalentu obsahu prvastatinu v extraktu. Poté se extrakt koncentruje vakuovou destilací na 5% původního objemu a do tohoto koncentrátu se přidá další dávka dibenzylaminu, a to v poměru 0,2 ekvivalentu. Z koncentrátu se vysráží krystalická sůl dibenzylaminu. Hrubý krystalický produkt se oddělí filtrací a usuší se ve vakuu. Vyčistí se aktivním uhlím v methanolu nebo acetonu. Dibenzylaminovou sůl pravastatinu je možné dále vyčistit rekrystalizací z acetonu.

Oraganické pravastatinové soli sekundárních aminů lze transformovat na pravastatin hydroxidem sodným nebo sodnými alkoxidy. Přednostním sodným akoxidem je ethoxid sodný.

Oproti jakékoli dříve známé metodě isolace pravastatinu je jeho isolace prostřednictvím sekundární aminové soli metodou jednodušší. Během této metody se netvoří žádné artefakty. S výhodou může řešit separaci pravastatinu z vedlejších produktů biokonverze a z různých metabolitů biosyntetizovaných hydroxylačním mikroorganismem.

Další metoda isolace pravastatinu z kultivačního media využívá s výhodou skutečnosti, že biokonversí vzniká kyselá forma pravastatinu. Pravastatin tak lze izolovat z kultivačního media adsorbci na anexu intotoměničové kolony, přednostně z filtrátu media. Silně zásadité pryskyřice anexu jako jsou polymer polystyren-divinylbenzenu, nesoucí kvarterní amoniové

9

WO 01/03647 skupiny, jako jsou pryskyřice Dowex® Al 400 Dowex® A 1x2 (OH- forma), Dowex® A 2x4 (OH’··* ’··’ * ’··* TVT/USOO/1 (OH- forma), forma), Amberlit® IRA 900 (OH^- forma), se pro absorbci volné kyseliny pravastatinu z kultivačního media hodí velice dobře. Na pryskyřici absorbovaný materiál lze uvolnit z kolony vymytím vodným roztokem kyseliny octové nebo směsí acetonu a vody obsahující chlorid sodný. Zejména vhodným roztokem k vymytí pravastatinu je 1% roztok chloridu sodného ve směsi aceton : voda (1 : 1). Frakce obsahující pravastatin se kombinují s acetonem, který se oddestiluje ve vakuu. Kyselost koncentrátu se upravuje 15% kyselinou sírovou na pH 3,5 - 4,0 a okyselený vodný roztok se extrahuje ethylacetátem. Pravastatin může být reextrahován z ethylacetátového extraktu použitím 1/10 —

1/20 objemového poměru 5% hydrouhličitanu sodného nebo jiným roztokem slabé zásady (pH 7,5 - 8.0).

Pravastatin může být získán ze zásaditého vodného extraktu v čisté formě sloupcovou chromatografii na neiontoměničové adsorbční pryskyřici. Jediným postupem by se jakýkoliv zbytkový ethylacetát rozpuštěný během extrakce v zásadité vodní fázi měl odstranit vakuovou destilací a pak vodní extrakt vložit na kolonu Dialon HP-20. Pravastatin adsorbovaný v koloně se purifikuje vymytím vodným roztokem acetonu s postupně se zvyšujícím podílem acetonu. Poté se pravastatin obsahující chromatografické frakce jako jednoduché komponenty spojují a koncentrují ve vakuu. Koncentrát se čistí aktivním uhlím a lyofilizací. Pravastatin následně krystaluje ze směsi ethanolu a ethylacetátu a poskytuje tak pravastatin takové kvality, která je přijatelná pro farmaceutické použití.

Další metodou izolace pravastatinu je jeho laktonizace, jíž se zlepší možnost jeho separace od jiných kyselých látek v kultivačním mediu. Před extrakcí se anorganickou kyselinou

- nejlépe kyselinou sírovou - upraví kyselost kultivačního media, případně jeho filtrátu, na pH 3,5 - 3,7. Medium se pak

• · • · • · · • fcfcfcfc

WO 01/03647 *·** PCT/USOO/1 extrahuje s vodou se nemísícím organickým rozpouštědlem, nejlépe nějakým esterem kyseliny octové s alifatickou alkoxylovou skupinou se 2 - 4 uhlíky, jako je ethylacetát nebo isobutylacetát. Pak se ethylacetátový extrakt promyje vodou a usuší anhydridem síranu sodného. Poté se pravastatin převede na lakton. Laktonový kruh může být syntetizován v bezvodém roztoku ethylacetátu za teploty místnosti a za stálého míchání s použitím katalyzačního množství kyseliny trifluorooctové. Laktonový kruh lze sledovat chromatografií na tenké vrstvě („TLC“). Poté, co se vytvoří lakton, vymyje se roztok ethylacetátu 5% vodním roztokem hydrouhličitanu sodného a následně vodou. Roztok ethylacetátu se zbaví vody bezvodým síranem sodným a ethylacetát se odpaří ve vakuu. Residuum se čistí na koloně silikagelové chromatografie a vymyje se směsí ethylacetátu a hexanu s postupně se zvyšujícím obsahem ethylacetátu.

Vyčištěný lakton pravastinu se konvertuje na pravastatin sodný hydrolýzou za teploty místnosti v ethanolu s ekvivalentením či vyšším množstvím hydroxidu sodného. Po vytvoření sodné soli pravastatinu může se tato sůl vysrážet acetonem. Sraženina se zfiltruje a promyje acetonem a n-hexanem a usuší ve vakuu. Sodná sůl pravastatinu může krystalovat ze směsi ethanolu a ethylacetátu a poskytnout tak sodnou sůl > pravastatinu v kvalitě přijatelné pro farmaceutické použití.

Další metoda isolace pravastatinu využívá chromatografie na gelu Sephadex LH. Na gelu Sephadex LH může být chromatograficky produkován pravastatin dosahující čistoty 99,5% (měřeno pomocí HPLC).

Vynález byl výše popsán z hlediska objasnění jeho podstaty; následuje jeho ilustrace příklady vynalezeného způsobu biosysntézy pravastatinu využívajícího mikroorganismu rodu Micromonospora a metod isolace pravastatinu.

WO 01/03647 • ·* • ·· ·· • · · · · ♦ • · · · · · ······· · · • *··* TCT/US00/3

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

Byla použita vysoce výkonná kapalinová chromatografie („HPLC“) na zařízení vyrobeném firmou Waters® . Podmínky HPLC: náplň kolony Waters Novapack Ci b 5 pm, reverzní náplň kolony: UV detekce: λ = 237 nm; objem vzorku: 10 μΐ, průtočná rychlost: lineární gradient 0,6 - 0,9 ml.mim¹, eluční gradient: rozpouštědlo A = acetonitril : 0,lM ve vodě (25 : 75); rozpouštědlo B = acetonitril: H3PO4 ve vodě - pH 2 (70 : 30). Eluční program: je uveden v Tab. 1.

Tab. 1.

Čas (min)	Průtočná rychlost (ml. min’¹)	Eluent A (%)	Eluent B (%)
0	0,6	100	0
2	0,7	100	0
20	0,9	0	100
21	0,9	0	100
22	0,9	100	0
27	0,7	100	0

Retenční čas: pravastatin (sůl Na) 10,6 min; kompaktin (kyselý) 19,5 min; pravastatin (lakton) 17,3 min; kompaktin (lakton) 23,5 min.

PŘÍKLAD 1

Rozpustný kultivační škrobový agar („SM“, tab.2) byl upraven na pH 7,0 a pak sterilisován po 25 min. při teplotě 121° C.

0 0

WO 01/03647 ·« · ·· ·· • · · · · · · • · * · · · · • ······· « * ϊ TOT/uSOO/1

Tab. 2.

Složení kultivačního media SM
Rozpustný škrob	10,0 g
Kvasničný extrakt	5,0 g
Na₂HPO₄	1,15 g
KH2PO4	0,25 g
KC1	0,2 g
MgSO₄.7H₂O	0,2 g
Agar	15,0 g
Voda	1000 ml

Na SM medium byla inokulována Micromonospora sp. IDR-P₃{NCAIM P (B) 001268}. Suspenze spor v destilované vodě byla připravena ze spor získaných ze 7 - 10 dní staré kultury Micromonospora sp. IDR-P₃ {NCAIM P (B) 001268} pěstované na šikmém rozpustném škrobovém agaru (SM).

Suspenze byla použita k inokulaci inokulačního media TI (lOOml, Tab 3.) v Erlenmevrových nádobách, kde byla kyselost media TI upravena na pH 7,0 a které bylo sterilisováno po 25 min při teplotě 121° C.

Tab. 3.

Složení kultivačního media TI
Rozpustný škrob	20,0 g
Kvasničný extrakt	10,0 g
CaCO₃	5,0 g
C0CI2.6H₂O	2,0 mg
Voda	1000 ml

03.02.02 íraiiiJíii.isir! Κ.ΪS

WO 01/03647 • ·· ·» · ·* ·· ·· · · · · · · · · • ··· · · · · · · ♦ • · · · · ···♦·»· · · ··’ WT7US00/J

Kultura byla po 3 dny třepána na rotační třepačce (250 ot.mim¹; amplituda 2,5 cm) při teplotě 32° C. Poté bylo této inokulační kultury v množství 5 ml použito k inokulaci deseti 500 ml Erlenmeyerových nádob obsahujících 100 ml kultivačního media TT (Tab. 4.), s upraveným pH na hodnotu 7,0 a sterilisováného po 25 min při teplotě 121° C.

Tab. 4.

Složení kultivačního media TT
Bramborový škrob	30,0 g
Sojová moučka	30,0 g
CaCO₃	5,0 g
C0CI2.6H₂O	2,0 mg
Palmový olej	2,0 g
Voda	1000 ml

Bakterie pak byly inkubovány po 72 hod. při teplotě 32° C. Poté byla do každé Erlenmeyrovy nádoby dodána sodná sůl kompaktinu (50mg) rozpuštěná v destilované vodě a biokonverze pak pokračovala při teplotě 32° C po dalších 96 hod. Dle výsledků získaných HPLC dosáhla konverze sodné soli kompaktinu v pravastatin 82 %.

Po skončení fermentace byly kultury spojeny. Pravastatin byl vyprodukován v průměrné koncentraci 410 pg.ml·¹. Isolace pravastatinu byla provedena následujícím způsobem. Supernatant kultivačního media a bakteriální buňky byly odseparovány. K bakteriálním buňkám bylo přidána voda (250 ml) a suspenze byla míchána po dobu jedné hodiny a poté přefiltrována. Supernatant a filtrát byly smíchány. 15 % kyse16 (inshitioí! KJS

WO 01/03647 • «« ·· · ·· ·♦ ··< ·>· ·»·· ···· ··*· ·· * ·· ··· ······· · · ·Ϊ· *·.·* ’··* Ϊ *··* Wř/USOO/1 linou sírovou byla upravena kyselost na pH 4,0. Okyselená směs supernatantu s filtrátem byla extrahována ethylacetátem (3x 300 ml). Ethylacetatové extrakty byly promyté vodou (300 ml), odvodněné anhydridem síranu sodného a koncentrovány vakuem na objem 100 ml.

Za teploty místnosti a stálého míchání byl lakton pravastatinu připraven z pravastatinu přidáním katalytického množství triíluorooctové kyseliny. Průběh syntézy pravastatinu byl sledován pomocí TLC: adsorbent. Kieselgel (silica gel) 60 F254 DC (Merck) na hliníkovém podkladu; eluční směs: směs aceton : benzen : kyselina octová (50 : 50 : 1,5); detekce: kyselina fosfomolybdenová; Rf (lakton pravastatinu) = 0,7. Po dokončení laktonizace byl ethylacetát promyt 5% vodným roztokem hydrouhličitanu sodného (2 x 20 ml), pak vodou (20 ml) a odvodněn anhydridem síranu sodného. Ethylacetát byl odpařen ve vakuu. Zbytek (0,5 g) byl separován pomocí sloupcové chromatografie na 10 g adsorbentu Kieselgel 60 (průměr kolony: 1,2 cm), a eluován směsí ethyl acetátu a n-hexanu o zvyšující se polaritě. Lakton pravastatinu byl vymyt z kolony směsí 60% ethylacetátu a n-hexanu. Frakce obsahující lakton pravastatinu byly spojeny a odpařeny ve vakuu. Zůstatek (230 mg) byl rozpuštěn v ethanolu (5ml) a pak k němu bylo jako 1 M ethanolový roztok přidáno za stálého míchání 110 % mol hydroxidu sodného. Míchání pokračovalo za teploty místnosti po dobu půl hodiny. Poté byl roztok zahuštěn na objem 2 ml. Ke koncentrátu byl přidán aceton (4 ml). Směs byla přes noc udržována v teplotě +5° C. Precipitát byl filtrován, promyt acetonem (2 ml) a pak n-hexanem (2 ml) a za teploty místnosti byl pod vakuem usušen. Výsledný hrubý produkt pravstatinu byl rozpuštěn v ethanolu. Roztok byl vyčištěn aktivním uhlím a pak byl pravastatin (170 mg) krystalizován ze směsi ethanolu a ethylacetátu.

WO 01/03647 * «« *♦ · *· <· • · · ··· * · · · • ·«· ·«·« ·· · • · · ♦ · · *··♦ · ♦ · · • 9« · · * · · · ··· ·· «· · ·· WT/US00/1

Charakterizace:

Teplota tání: 170 - 173° C (za rozkladu.) [α]ϋ²⁰ = + 156 ⁰ C (v = 0,5 ve vodě).

Ultrafialové adsorbční spektrum (20 pg.ml·¹, v methanolu): Amax = 231,237,245 nm (log ε = 4,263; 4,311; 4,136).

Infračervené adsorbční spektrum (Kbr): v OH 3415, v CH 2965, v C-0 1730, v C00- 1575 cm.

H-NMR spektrum (D 2O, δ, ppm): 0,86, d, 3H (2-CH 3); 5,92, dd, J = 10,0 a 5,4 Hz, 1H(3-H); 5,99,d,J = 10,0 Hz, 1H (4-H); 5,52, br, 1H (5-H); 4,24, m, 1H (6-H); 5,34, br, 1H (8-H); 4,06, m, 1H (β-Η), 3,65, m, 1H (6-H); 1,05, d, 3H (2'-CHs); 0,82, t, 3H (4'- H₃).

¹³ H-NMR spektrum (D 2O, δ, ppm): 15,3, q (2-CH 3); 139,5, d(C-3); 129,5, d )C-4); 138,1 s (C-4a); 127,7, d (c-5); 66,6, d (C-6); 70,1, d (C-8); 182,6, s (COO); 72,6, d (Cβ); 73,0 d (C- 6); 182,0, s (C-Γ); 18,8, q (2'-CH₃); 13,7 q (C-4').

Pozitivní hmotnostní spektrum z FAB (Fast Atoms Borbardment); charakteristické ionty: 469 [M+Na]⁺ ; 447 [M+ H]⁺;

Negativní hmotnostní spektrum z FAB (charakteristické ionty): 4645[M+H]-; 423 [M+ Na]- ; m/z 101 [2-methyl máselná kyselina - J].

Příklad 2

Biokonverznímu kultivačnímu mediu MT (Tab.5.) byla upravena kyselost na hodnotu pH 7,0 a to pak bylo sterilisováno po 25 min při teplotě 121° C.

WO 01/03647 * ·· ·· » ·· ♦» ··· ··» · » » « • ··· · · · · · · · « · » · · · ···· · · · « ··· ·· · · · » ··· ·» ♦· · »· Wř/US00/l

Tab. 5.

Složení biokonverzního kultivačního media MT

Bramborový škrob	10,0 g
Dextróza	20,0 g
Sojová moučka	10,0 g
Kvasničný extrakt	10,0 g
CaCO₃	5,0 g
C0CI2.6H₂O	2,0 mg
Slunečnicový olej	2,0 g
Voda	1000 ml

Deset 500 ml Erlenmeyrových nádob obsahujících biokonverzní kultivační medium MT (100 ml) bylo inokulováno inokulem připraveným dle Příkladu 1 a inkubováno 96 hod. při teplotě 28° C. Sodná sůl kompaktinu (50 mg) byla rozpuštěna v minimu destilované vody a přidána do každé nádoby. Fermentace pokračovala po 72 hodin. Pak do každé nádoby bylo přidáno dalších 50 mg sodné soli kompaktinu a fermentace pokračovala dalších 72 hodin.

Kultury byly spojeny a pravastatin byl isolován z kultivačního media následujícím postupem. Smíchané kultury obsahující 750 mg pravastatinu dle výsledků HPLC byly centrifugovány při 2500 ot. min^-1 po dobu 20 min. Odseparované bakteriální buňky pak byly míchány po dobu jedné hodiny s vodou (250 ml) a pak zfiltrovány. Supernatant a filtrát byly smíchány a 15% kyselinou sírovou bylo upraveno pH na hodnotu 3,5 - 4,0. Tento roztok byl extrahován ethylacetátem (3 x 300 ml). K ethylacetátovému extraktu pak bylo přidáno 150 % mol benzylaminu - vztaženo na obsah pravastatinu. Ethyl acetátový extrakt byl zahuštěn odpařením na objem 30 ml a tato suspenze byla ponechána přes noc při teplotě 0 - 5° C.

<02.02, • · • · · ·

WO 01/03647 '•PCT/USOO/l

Sraženina byla oddělena od roztoku filtrací a vymyta na filtru studeným ethylacetátem a n-hexanem a poté vysušena ve vakuu. Surová dibenzylamoniová sůl pravastatinu (1,1 g) byla při teplotě 62 - 66° C rozpuštěna v acetonu (33 ml). Roztok byl po dobu půl hodiny čištěn aktivním uhlím (0,1 g). Aktivní uhlí bylo z roztoku odděleno filtrací a vymyto ohřátým acetonem (10 ml). Vysrážené krystaly z koncentrátu se při teplotě 62 66° C opět rozpustily. Roztok byl ponechán přes noc při teplotě +5° C. Sraženina byla oddělena filtrací, promyta studeným acetonem a n-hexanem a vysušena ve vakuu. Takto získaná benzylamoniová sůl pravastatinu (0,7 g) byla rozmíchána s ethanolem (10 ml), a poté bylo k roztoku přidáno 110 % mol 1 M vodného roztoku hydroxidu sodného. Tento zásaditý roztok byl míchán za pokojové teploty po dobu půl hodiny. Pak byla přidána voda (30 ml) a kyselost roztoku byla neutralizována. Ethanol byl oddestilován ve vakuu. Výsledný vodný koncentrát byl separován pomocí sloupcové chromatografie na koloně naplněné 50 ml pryskyřice Diaion HP 20 (průměr kolony: 1,5 cm). Kolona byla eluována směsí acetonu a deionizované vody, přičemž koncentrace acetonu rostla po 5%. Pravastatin mohl být vymyt z kolony 15% srněsí acetonu a deionizované vody. Frakce byly analyzovány metodou TLC uvedenou v Příkladu 1: Rf (pravastatin) = 0,5. Frakce obsahující pravastatin byly spojeny a aceton z nich byl odpařen ve vakuu. Lyofilizace vodného residua poskytla chromatograficky čistý pravastatin (360 mg).

Příklad 3

Kultivační medium TT/2 (4,5 1, Tab. 6) bylo v laboratorním fermentoru 45 min. sterilisováno při 121° C a inokulováno mikroorganismem Micromonospora sp. IDR-P3 z třepané » · · · ·

WO 01/03647 ••••PCT/USOO/1 kultury na mediu Tl (500 ml), které byla připraveno tak, jak je popsáno v Příkladu 1.

Tab. 6.

Složení biokonverzního kultivačního media TT/2
Glukóza	75,0 g
Rozpustný škrob	50,0 g
Sojová moučka	50,0 g
Kvasniěný extrakt	50,0 g
Sojový pepton	5,0 g
CoCl₂.6H₂O	2,0 mg
CaCO₃	5,0 g
Voda	1000 ml

Kultivační medium pak bylo inkubováno při 28° C, provzdušňováno sterilním vzduchem intenzitou 150 l.hod'¹ a mícháno plochým listovým míchadlem rychlostí 300 ot.min'¹. Fermentace pokračovala po dobu 72 hod. a následně byla ke kultuře přidána sodná sůl kompaktinu (2,5 g). Substrát kompaktinu byl z kultivačního media biokonverzí spotřebován ve 48. hodině. K substrátu byl pak přidána další sodná sůl kompaktinu (2,5 g). Tato druhá dávka kompaktinového substrátu byla spotřebována během 24 hod. Konverzní poměr přeměny kompaktinu v pravastatin činil 90 %.

Příklad 4, • * · 9

9 ·

9 9

·..· ···*PCT/USOO/1 • · · • · · • · · · • · · · · ·

WO 01/03647

Fermentační medium TT/1 (5 1, Tab. 7) bylo upraveno na kyselost pH 7,0 a sterilisováno po 45 min v laboratorním fermentoru teplotou 121° C.

Tab. 7.

Složení biokonverzníh kultivačního media TT/1
Glukóza	125,0 g
Bramborový škrob	25,0 g
Sojová moučka	50,0 g
Kvasničný extrakt (Gistex)	50,0 g
Sojový pepton	50,0 g
CoCl₂.6H2O	2,0 mg
CaCOs	5,0 g
Slunečnicový olej	2,0 g
Voda	1000 ml

Kultivační Medium TT/1 bylo inokulováno inokulem Micromonospora sp. IDR-P₃ z třepané kultuiy (500 ml) připravené tak, jak je popsáno v Příkladu 1. Kultura pak byla inkubována 95 hod. při 28° C, s provzdušňováním intenzitou 200

l.hod^-1 sterilovaného vzduchu a za stálého míchání plochým listovým míchadlem o 400 ot.min^-1. Sodná sůl kompaktinu (2,5 g) byla ke kultuře přidána ve formě sterilního přefiltrovaného vodného roztoku. Fermentace probíhal při 28° C. Pátý den fermentace byl kompaktin z fermentačního media spotřebován. Další sodná sůl kompaktinu (7,5 g) byla po další dny postupně přidávána v dávkách 2,5 g. Tato další celá dávka sodné soli kompaktinu byla úplně konvertována na pravastatin během 4 dnů od první aplikace. Na konci fenmentace byla ír;!.ni)'aL»!.r! KJS

M * WO 01/03647 ··* ••••PCT/USOO/I sodná sůl kompaktinu (10 g) konvertována v pravastatin (9 g,

90%).

Z kultivačního media s koncentrací 1800 μ.ml·¹ pravastatinu byl pravastatin isolován následujícím postupem.

Kultivační medium (5 1) bylo 20 minutovou centrifugací o 2500 ot.min-¹ odseparováno od bakteriálních buněk.

K odseparovaným buňkám byla přidána voda (2 1) a výsledná suspenze byla hodinu míchána a pak zfiltrována. Supernantant a filtrát byly s pojeny a přepasážovány přes kolonu obsahující pryskyřici Dowex® Al 400 (OH)· (300g, průměr kolony: 4 cm) s průtočnou rychlostí 500 ml.hod'¹. Pryskyřice byla promyta deionizovanou vodou (11). Kolona pak byla vymyta směsí 1 : 1 acetonu a vody (1 1) obsahující 10 g chloridu sodného, a bylo získáno 50 ml frakcí. Tyto frakce byly analyzovány metodou TLC uvedenou v Příkladu 1. Frakce obsahující produkt byly smíchány a aceton z nich byl oddestilován ve vakuu. 15% kyselinou sírovou bylo upraveno pH koncentrátu na hodnotu 3,5 - 4,0. Koncentrát by extrahován ethylacetátem (2 x 250 ml). K směsnému ethylacetátovému extraktu byla přidána deionizovaná voda (40 ml). 1M hydroxidem sodným bylo upraveno pH vodné fáze na hodnotu 7,5 - 8.0. Po 15 minutovém míchání, byly vodná a ethylacetátová fáze od sebe odděleny.

3Γ

Vodná zásaditá extrakce byla dvakrát opakována. Spojené zá* sadité vodné roztoky byly zahuštěny na objem 50 ml a toto residuum bylo separováno chromatograficky přes Diaion® HP 20 (Mitsubishi Co. Japan, 600 ml, průměr kolony 3,8 cm). Kolona byla propláchnuta deionizovanou vodou (600 ml), pak vymyta směsí acetonu a deionizované vody s 5% postupnými přírůstky koncentrace acetonu v eluentu. Eluent byl soustředěn v 50 ml frakcích. Eluent byl analyzován metodou TLC uvedenou v Příkladu 1. Pravastatin byl vymyt z kolony 15% směsí acetonu a deionizované vody. Frakce obsahující dle výsledků TLC čistý pravastatin byly spojeny a roztok byl koncentrován ve

08.02.02 í!';!í)sSat.k>Í! Kň

9 • · · • 9 · ·

99999 9 9

WO 01/03647 • 9 9 · ·

I 9 9

PCT/USOO/1 »

» 9 9 vakuu na objem 150 ml. Koncentrovaný eluent byl za pokojové teploty vyčištěn mícháním po dobu jedné hodiny s aktivním uhlím (0,6 g). Aktivní uhlí bylo odfiltrováno a filtrát byl lyofilisován. Výsledný lyofilisovaný pravastatin (6,5 g) byl dvakrát překrystalizován ze směsi ethanolu a ethylacetátu. Aby se získal chromatograficky čistý pravastatin (4,6 g), byla sraženina odfiltrována a vymyta ethylacetátem (20 ml) a n-hexanem (20 ml) a usušena za teploty místnosti ve vakuu.

Příklad 5

Sterilní kultivační medium z rozpustného škrobu SM z Příkladu 1 bylo inokulováno bakteriálním kmenem Micromonospora echinospora ssp. echinospora IDR-P₆, {NCAIM P (B) 001272} a deset dní ikubováno. Suspenze spor v destilované vodě (5 ml) byla připravena ze spor získaných z deset dní starého media z rozpustného škrobu. Této suspenze bylo použito k inokulaci 100 ml sterilního inokulačního media TI, popsaného v Příkladu 1, v 500 ml Erlenmeyerově nádobě. Tato kultura byla při teplotě 28° C třepána 3 dny na rotační třepačce (250 ot.min-¹., amplituda 2,5 cm), Takto získaná kultura byla poté v 5 ml dávkách přenesena do 500 ml Erlenmeyerových nádob obsahujících po 100 ml biokonverzního media TT/1 sterilovaného po 25 min. při teplotě 121° C. Složení media TT/1 je popsáno v Příkladě 3. Nádoby byly inkubovány 3 dny při teplotě 25°C za stálého třepání na rotační třepačce (250 ot.min’¹, amplituda 2,5 cm). Do každé nádoby byla přidána sodná sůl kompaktinu (10 mg) ve formě sterilního vodného roztoku. Fermentace pokračovala za teploty 25° C po 168 hod. Na konci biokonverze bylo pomocí HPLC určeno, že obsah pravastatinu v mediu činil 40 pg.ml·¹.

i .02 ísOíiikHkwi KJS

WO 01/03647

• · φ φ · φ φ * ··· · PCT/US00/1

Příklad 6.

Inokulace, iknkubace, fermentace a sycení substrátu bylo provedeno s bakteriálním kmenem Micromonospora megalomicea ssp. nigra IDR-P₆ (NCAIM P (B) 001273} tak, jak bylo popsáno v Příkladu 5. Obsah pravastatinu v mediu po 168 hod. fermentace činil dle HPLC 50 pg.ml·¹.

Příklad 7.

Inokulum (5 ml) kultury bakteriálního kmene Micromonospora purpurea IDR-P₄ (NCAIM P (B) 001271}, bylo připraveno podle metody popsané v Příkladu 1. Inokulační kultury bylo použito k naočkování kultivačního media TT/14 (100 ml, tab. 8) s upravenou kyselostí na pH 7,0 a sterilovaného po dobu 25 min. teplotou 121° C v 500 ml Erlenmeyerových nádobách.

Tah. 8.

Složení biokonversního kultivačního media TT/14

Bramborový škrob	5,0	g
Glukóza	25,0	g
Kvasničný extrakt (Gistex)	15,0	g
Sojový pepton	15,0	g
CaCOs	5,0	g
CoCl₂.6H₂O	2,0	mg
Voda z vodovodu	1000	ml

PCT/LSOO/J • ·· ·« · ·· • · · · · · • · · · · · « « ··· ······· · • · · ·· · · ·>

• · · · · ·· · ···

WO 01/03647

Nádoby byly třepány na rotační třepačce (250 ot.min-¹., amplituda 2,5) po 3 dny. Sycení sodnou solí kompaktinu, biokonverse a stanovení obsahu pravastatinu bylo prováděno podle popisu v Příkladu 5. Na konci biokonverse činil obsah pravastatinu ve mediu dle výsledků HPLC 40 pg.ml·¹.

Příklad 8.

Inokulace, iknkubace, fermentace a sycení substrátu sodnou solí kompaktinu bylo provedeno s bakteriálním kmenem Micromonospora rosaria IDR-P₇ {NCAIM Ρ (B) 001274} podle metody popsané v Příkladu 1. Na konci biokonverze činil obsah pravastatinu ve mediu dle výsledků HPLC 350 pg.ml·¹.

Ten, kdo je v tomto oboru zkušený a má tímto k dispozici popis vynálezu s odkazy na podstatu jeho přednostních způsobů, jistě ocení variace, které se nijak neuchylují od ducha a šíře tohoto vynálezu, jak byl popsán shora a patentově nárokován dále.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY:

·· · ·· ····

14%

1. Mikrobiální způsob výroby látky obecného vzorce (I) z látky obecného vzorce II, kde R+ zastupuje alkalický kov nebo amoniový iont, kmenem schopným fermentací na pozici 6β hydroxylovat látku obecného vzorce (II) a separace a purifikace látky obecného vzorce (I) vytvořené během biokonverze vyznačuj ící se t í m, ž e zahrnuje tyto kroky:

a) Kultivaci mikroorganismu rodu Micromonospora schopné- ho na pozici 6-β hydroxylovat látku obecného vzorce (II), kde R+ je definováno výše, na kultivačním mediu obsahujícím asimilovatelné zdroje dusíku a uhlíku, dále pak

b) sycení vyvíjející se kultury substrátem, který má být transformován, pak

25.3.02 translationK.J.S.

·· y ·#·♦·*· • ··· · · ♦ · * ζ ♦ ♦ · · · ···· · · ······ * ··· ♦« ·· *

c) fermentaci substrátu až do konce biokonverze, poté

d) separaci látky o chemickém vzorci (I) z kultivačního media a kultury a, je-li to třeba, její purifikaci.
2. Způsob podle Nároku lvyznačující se t i m, že je mikroorganismus kultivován při teplotě mezi přibližně 25 a přibližně 37° C.
3. Způsob podle Nároku 2 vyznačující se tí

1 m, ž e je mikroorganismus kultivován při teplotě * mezi přibližně 25 a přibližně 32° C.
4. Způsob podle Nároku 1 vyznačující se t í m, že kultivačním mediem je vodná tekutina.
5. Způsob podle Nároku lvyznačující se t í m, že kultivační medium dále obsahuje anorganické soli.
6. Způsob podle Nároku 2 vyznačující se t í m, ž e se pěstuje kmen Micromonospora sp. IDRP₃ uložený v maďarské sbírce mikroorganismů „National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms“ v Budapešti pod označením NCAIM P (B) 001268 nebo jeho mutant schopný na pozici 6-β hydroxylovat látku obecného vzorce (II).

*
7. Způsob podle Nároku lvyznačující se t * í m, ž e se pěstuje kmen Micromonospora purpurea IDR-P₄ uložený v maďarské sbírce mikroorganismů „National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms“ v Budapešti pod označením NCAIM P (B) 001271.
8. Způsob podle Nároku 9 vyznačující se t í m, že se pěstuje kmen Micromonospora echinospora ssp. echinospora IDR-P₆ uložený v maďarské sbírce mikroorganismů „National Collection of Agricultural and Industrial

25.3.02 translationK.J.S.

Microorganisms“ v Budapešti pod označením NCAIM P (B) 001272 nebo jeho mutantní kmen, který je schopný na pozici 6-β hydroxylovat látku obecného vzorce (II).
9. Způsob podle Nároku 1 vyznačující se t í m, že se pěstuje kmen Micromonospora megalomicea ssp. nigra IDR-P₆ uložený v maďarské sbírce mikroorganismů „National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms“ v Budapešti pod označením NCAIM P (B) 001273 nebo jeho mutantní kmen, který je schopný na pozici 6-β hydroxylovat látku obecného vzorce (II).
10. Způsob podle Nároku 1 vyznačující se t í m, že se pěstuje kmen Micromonospora rosaria IDR-P? uložený v maďarské sbírce mikroorganismů „National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms“ v Budapešti pod označením NCAIM P (B) 001274 nebo jeho, mutantní kmen, který je schopný na pozici 6-β hydroxylovat látku obecného vzorce (II).
11. Způsob podle Nároku 1 vyznačující se t í m, ž e R+je sodíkovým iontem.
12. Způsob podle Nároku lažlO vyznačujíc í se t í m, ž e látka chemického vzorce (I) vytvořená během fermentace je separována z kultivačního media a kultury adsorbci na anexové iontoměničové pryskyřici nebo extrakcí vodou nemísitelným organickým rozpouštědlem s následnou přípravou jejího laktonového derivátu nebo její sekundární aminové soli jako prostředníku, nebo purifikací alkalického vodního extraktu získaného z extraktu kultivačního media

25.3.02 translationK.J.S.

a kultury organickým rozpouštědlem pomocí chromatografické metody na pryskyřici neadsorbující ionty.

/VL/

-v*· <

>

, ·· »· · ·· ·» ·· * ··· *«· • ··· 0 0 · 0 0 0 0 0 0 · · · · 0000 *00 0 • · · 0 0 0000

25.3.02 translationK.J.S.