-
TECHNISCHES SACHGEBIET
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft eine neue Substanz, FA-70D, die proteaseinhibierende
Aktivität
aufweist und als Arznei nutzbar ist, oder ein Salz davon.
-
FACHLICHER HINTERGRUND
-
Als
Gruppe von intrazellulär
produzierten Enzymen bewirken die Proteasen aus der Reihe der Cathepsine
(Cathepsin B, Cathepsin L, Cathepsin H usw.) sowohl intrazellulär als auch
extrazellulär
eine Vielfalt physiologischer Funktionen. So wird beispielsweise
angenommen, daß diese
Enzyme intrazellulär
an der Verarbeitung von Proteinen, an der Zersetzung unerwünschter
Proteine und an der Apoptose beteiligt sind, während sie extrazellulär mit der
Zersetzung extrazellulärer
Matrizes, wie der Degradation des Kollagens der Knochenmatrix und
mit der Verdauung infizierender Bakterien in Verbindung gebracht
werden.
-
Insbesondere
Cathepsin L ist für
seine sehr starke kollagendegradierende Aktivität bekannt, und es wurde auch
bei Versuchstieren gezeigt, daß Cathepsin
L-Inhibitoren eine ausgeprägte
inhibierende Wirkung auf die Zersetzung von Knochenkollagen aufwiesen.
Jede Substanz, die spezifisch Cathepsin L inhibiert, wird als vielversprechender
Wirkstoff für
die Behandlung der Osteoporose angesehen (FEBS Letters, 269 (1), 189–193, 1990).
Darüberhinaus
wird ein solcher spezifischer Inhibitor von Cathepsin L als ein
vielversprechendes Medikament zur Behandlung der Hypercalcämie betrachtet.
-
Cathepsin
B ist ein Enzym, das als in hohem Maß mit Entzündungen, Krebsmetastasen, Myodystrophie
und dergleichen ursächlich
zusammenhängend
gilt. In den letzten Jahren ist eine zunehmende Zahl von Berichten
erschienen, die auf den Zusammenhang zwischen der Bösartigkeit
von Krebs, wie Metastasierung und Invasion und der Cathepsin B-Aktivität hinweisen
(Cancer Research, 52, 3610–3614,
1992).
-
Zur
Behandlung von Krankheiten, die mit den Proteasen der Cathepsinreihe
zusammenhängen,
werden heute spezifische Inhibitoren benötigt, doch wurde bisher noch
kein befriedigender Wirkstoff entdeckt. Insbesondere ist kein spezifischer
Inhibitor des Cathepsins verfügbar,
das mit der Knochenresorption bei der Osteporose zusammenhängt.
-
Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung einer Substanz mit
ausgezeichneter Inhibitionswirkung auf Cathepsin durch Verwendung
von Mikroorganismen.
-
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
-
Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eine große Zahl
von Mikroorganismen aus dem Erdboden isoliert und die von ihnen
erzeugten Stoffwechselprodukte auf solche Substanzen abgesucht,
die Proteasen der Cathepsinreihe inhibieren könnten. Als Ergebnis haben die
Erfinder in Kulturen eines zu den Actinomyceten gehörenden und
als FA-70 bezeichneten Stammes von Mikroorganismen eine Substanz
mit Inhibitionswirkung auf die Proteasen der Cathepsinreihe entdeckt,
diese Substanz isoliert und ihre physikalischchemischen Eigenschaften
und ihre Struktur bestimmt. Die vorliegende Erfindung wurde auf
Grundlage dieser Befunde entwickelt.
-
An
Verbindungen, die von Mikroorganismen erzeugt werden, und die strukturell
den Verbindungen der vorliegenden Erfindung ähneln, wurden beschrieben:
Mer-N5075A (ungeprüfte
japanische Patentanmeldung Nr. 100588/1994; The Journal of Antibiotics,
46, 1622–1624,
1993), α-MAPI
und β-MAPI
(Agricultural and Biological Chemistry, 43, 243–250, 1979; Tetrahedron Letters,
(7), 625–628,
1979), GE20372 Faktor A und B (The Journal of Antibiotics, 48, 332–334, 1995)
und Chymostatinole (JP-A-8003188). Pseudopeptide mit antiviraler
Aktivität,
die hinsichtlich der Struktur der Verbindung der vorliegenden Erfindung
entsprechen, werden in EP-0611776 offenbart.
-
Jedoch
ist die Substanz FA-70D der vorliegenden Erfindung eine neue Verbindung,
die hinsichtlich ihrer Struktur einem durch Peptidbindung verbundenen
Citrullinmolekül
entspricht. Die Verbindung der vorliegenden Erfindung ist als Cathepsin
L-Inhibitor oder als Arznei, etwa als Therapiemedikament für Osteoporose nützlich.
-
Daher
zielt die vorliegende Erfindung auf die Substanz FA-70D von folgender
Formel (1), oder auf ein Salz davon.
-
-
Unter
einem anderen Gesichtspunkt zielt die vorliegende Erfindung auf
ein Verfahren zur Herstellung der Substanz FA-70D oder eines Salzes
davon, das die Kultivierung eines Mikroorganismenstammes der Gattung
Streptomyces umfaßt,
der in der Lage ist, die Substanz FA-70D in einem Kulturmedium zu
erzeugen, so daß der
Stamm die Substanz erzeugt und in der Kulturflüssigkeit anreichert, und die
Gewinnung der Substanz aus jener Flüssigkeit.
-
Unter
weiteren Gesichtspunkten zielt die vorliegende Erfindung auf eine
Arznei, ein Therapiemedikament gegen Osteoporose oder einen Cathepsin
L-Inhibitor, die bzw. das die erwähnte Substanz FA-70D oder auf
ein Salz davon umfaßt.
-
Die
vorliegende Erfindung zielt weiterhin auf ein Arzneimittel, das
die erwähnte
Substanz FA-70D oder ein Salz davon und einen pharmazeutisch verträglichen
Träger
hierfür
umfaßt.
-
Die
vorliegende Erfindung zielt weiterhin auf ein Verfahren zur Behandlung
der Osteoporose, das die Verabreichung einer wirksamen Menge der
Substanz FA-70D oder eines Salzes davon an einen Patienten umfaßt.
-
Die
vorliegende Erfindung zielt unter noch einem weiteren Gesichtspunkt
auf die Verwendung der Substanz FA-70D oder eines Salzes davon als
Arznei.
-
Die
vorliegende Erfindung zielt weiterhin auf Mikroorganismen, die in
der Lage sind, die Substanz FA-70D zu erzeugen.
-
KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
-
1 zeigt ein Infrarot-Absorptionsspektrum
der Substanz der Erfindung, wie es in Beispiel 1 erhalten wurde.
-
2 zeigt ein 1H-NMR-Spektrum
der Substanz der Erfindung, wie es in Beispiel 1 erhalten wurde.
-
BESTE AUSFÜHRUNGSWEISE
DER ERFINDUNG
-
Das
Salz der Verbindung der Formel (1) gemäß der vorliegenden Erfindung
unterliegt keiner besonderen Einschränkung, ist jedoch vorzugsweise
ein Basensalz, das durch Reaktion mit einer pharmazeutisch verträglichen
basischen Komponente erhalten werden kann. Das vorstehend erwähnte Basensalz
schließt
Salze mit Alkalimetallcarbonaten, wie Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat
usw., Salze mit Alkalimetall-Hydrogencarbonaten, wie Natriumhydrogencarbonat,
Kaliumhydrogencarbonat usw., Salze mit Alkalimetall-Hydroxiden, wie
Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid usw., Salze mit Alkalimetallen,
wie Natrium, Kalium usw., Salze mit Erdalkalimetallen, wie Magnesium,
Calcium usw., Salze mit Ammoniak, Salze mit Aminen, wie Methylamin,
Dimethylamin, Triethylamin, Cyclohexylamin, Piperidin usw. und Salze
mit basischen Aminosäuren,
wie Arginin und Lysin ein.
-
Die
Substanz FA-70D der vorstehenden Formel (1) schließt optische
Isomere ein, daher fallen die Isomere und Gemische davon ebenfalls
in den Schutzbereich der Erfindung.
-
Die
Substanz FA-70D der Formel (1) oder ein Salz davon können anhydrisch
sein oder in geeigneter Weise hydriert worden sein. Sie kann auch
kristallin, pulverförmig
oder amorph sein.
-
Die
physikalisch-chemischen Eigenschaften der Substanz FA-70D sind folgende:
- (1) Erscheinungsform: weiße Pulver
- (2) Empirische Formel: C30H42N6O7 (M) [hochauflösende FAB-(Beschuß mit schnellen
Atomen)-Massenspektrometrie: gefunden 599,3181; berechnet für C30H43N6O7 (M + H) 599,3193]
- (3) Molekulargewicht: 598,701 (FAB- (Beschuß mit schnellen Atomen)-Massenspektrometrie))
- (4) Infrarot-Absorptionsspektrum: KBr-Scheibenverfahren vmax
(cm–1):
3375, 2965, 2935 1675–1640, 1555,
1455, 1400, 1205, 1140, 840, 805, 725, 700. (1)
- (5) Nuklearmagnetisches Resonanzspektrum: Das 400-MHz–1H-NMR-Spektrum
in Dimethylsulfoxid-d6 (DMSO-d6)
bei 30°C
ist in 2 dargestellt.
Die chemischen Verschiebungen sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle
1 - Phe
- Phenylalanin
- Cit
- Citrullin
- Val
- Valin
- APP
- 2-Amino-3-phenylpropanol
- (6) Löslichkeit: Gut löslich in
Methanol und Dimethylsulfoxid und schwach löslich in Ethanol. Praktisch
unlöslich
in Chloroform, Aceton, Ethylacetat, Ether und Hexan.
- (7) Farbreaktionen:
Ehrlich-Reaktion: positiv
Sakaguchi-Reaktion
und Ninhydrin-Reaktion: negativ
- (8) Schmelzpunkt: 157–158°C
- (9) Spezifische Rotation: [α]D 20 = –8,71° (c = 3,56
mg/ml, Methanol)
- (10) Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie:
Ein Peak bei einer Retentionszeit (tR) von
5,8 Minuten unter folgenden Bedingungen:
Säule: Inertsil ODS-2,5 μm (4,6 mm
I.D. × 150
mm, GL Science)
Mobile Phase: Acetonitril/Trifluoressigsäure/Wasser
(35 : 0,05 : 65, V/V/V)
Flußrate: 1 ml/min.
Detektion:
210 nm (0,04 a. u. f. s.)
-
Die
Substanz FA-70D der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden,
indem ein Mikroorganismenstamm, der in der Lage ist, die Substanz
der Erfindung zu produzieren (der im folgenden als Substanz FA-70D-produzierender
Stamm bezeichnet wird) unter geeigneten Bedingungen, typischerweise
unter den folgenden Bedingungen kultiviert wird. Der Substanz FA-70D-produzierende
Stamm beinhaltet zur Gattung Streptomyces gehörende Mikroorganismenstämme.
-
Die
vorliegende Erfindung umfaßt
die genannte Substanz FA-70D und Salze davon, die erhalten werden
kann, indem ein Mikroorganismenstamm der Gattung Streptomyces kultiviert
und die Kulturflüssigkeit
gewonnen wird.
-
Als
Beispiel eines solchen Mikroorganismenstammes der Gattung Streptomyces
kann Streptomyces sp. Stamm FA-70 genannt werden. Dieser Stamm ist
ein Streptomyces-Stamm, den die Erfinder der vorliegenden Erfindung
aus dem Boden in Chéngdé, hébei, Volksrepublik
China isoliert haben, und der am 31. Juli 1995 unter der Bezeichnung:
Mikroorganismus Stamm FA-70 (wie zur Bestimmung vom Hinterleger
bezeichnet) und der Eingangsnummer FERM BP-5183 beim National Institute
of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science
and Technology (Higashi 1-chome 1–3, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan)
hinterlegt wurde.
-
Die
mikrobiologischen Merkmale des Stammes FA-70D, die nach dem im International
Journal of Systematic Bacteriology, 16 (3), 313–340, 1960 beschriebenen Verfahren
untersucht wurden, sind folgende:
-
(a) Morphologie
-
Dieser
Stamm wurde gemäß dem International
Streptomyces Project (ISP) 13 Tage lang bei 27°C auf Medium Nr. 4 (ISP 4) kultiviert.
Die Ergebnisse der Beobachtung sind folgende:
Verzweigung der
sporulierenden Hyphen: einfache Verzweigung
Form der Sporulation:
Spiralen; die Sporen sind von zylindrischer Form
Zahl der Sporen:
10 bis 50 oder mehr Sporen
Sporenoberfläche: glatt
Sporengröße: 0,5–0,6 × 0,8–0,9 μm
Vorhandensein
von Flagellaten: nicht vorhanden
Vorhandensein von Sporangien:
nicht vorhanden
Anheftungsstelle der Sporophoren: Luftmycel
Besitz
der Fähigkeit
zur Sclerotium-Bildung: kein Besitz
-
(b) Merkmale der Kultur
auf verschiedenen Medien
-
Die
Merkmale der Kultur des Stammes FA-70D auf verschiedenen Medien
sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Taxonomiefarben wurden gemäß The Japan
Color Research Institute (Hrsg.), Standard Color Chart A, 1981,
angegeben. Fallweise wurden in Klammern zusätzlich detailliertere Farben
nach den Farbcodes gemäß dem von
der Container Corporation of America veröffentlichten Color Harmony
Manual(4. Auflage, 1985) angegeben.
-
-
(c) Physiologische Merkmale
-
- Temperaturbereich des Wachstums: gutes Wachstum bei 20–37°C
- Verflüssigung
von Gelatine (Glucose-Pepton-Gelatine-Medium, 27°C): positiv
- Verflüssigung
von Gelatine (einfaches Gelatinemedium, 20°C): negativ
- Gerinnung von Milch (37°C):
negativ
- Peptonisierung von Milch (37°C):
positiv
- Produktion von melanoiden Pigmenten: negativ auf Tyrosin-Agar
(ISP7) und Trypton-Hefeextrakt-Medium (ISP-1);
positiv auf Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP-6).
- Produktion von Hydrogensulfid (mit 0,5% Hefeextrakt angereicherter
Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar
(ISP-6)): positiv
- Hydrolyse von Stärke
(Stärke-anorganisches
Salz-Agar (ISP-4)): positiv
- Reduktion von Nitraten (Bouillon mit 1% Kaliumnitrat, ISP-8):
negativ
- Zersetzung von Cellulose: negativ
-
(d) Verwertung von Kohlenstoffquellen
(Pridham & Gottlieb-Agar,
ISP-9)
-
Dieser
Stamm wächst
gut bei Verwertung von D-Glucose, D-Xylose, Inositol, löslicher
Stärke,
Dextrin, Glycerin und Maltose. L-Arabinose, Saccharose, D-Fructose,
D-Mannitol, L-Rhamnose, Raffinose, D-Galactose und Salicin werden
nicht verwertet.
-
(e) Chemotaxonomie
-
Die
ganze Zelle wurde mittels Dünnschichtchromatographie
nach dem in: The Society for Actinomycetes Japan (Hrsg.), [Experimental
Method for Identifying Actinomycetes], 62–70, 1985 beschriebenen Verfahren
auf Säurehydrolysate
untersucht. Das Ergebnis war die Feststellung der LL-Form von Diaminopimelinsäure.
-
Aufgrund
der vorstehenden bakteriologischen Merkmale, insbesondere der Bildung
eines anhängender
Luftmycels, einer großen
Zahl von Sporenketten vom vegetativen Mycel, da die konstituierende
Aminosäure
der Zellwand LL-Diaminopimelinsäure
ist, und da weder Geißeln
noch Sporangien gebildet werden, gehört der Stamm eindeutig zur
Gattung Streptomyces. Daher wurde der Stamm Streptomyces sp. Stamm
FA-70 benannt.
-
Die
Substanz FA-70D der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden,
indem ein zur Gattung Streptomyces gehörender, Substanz FA-70D-produzierender
Stamm in einem Kulturmedium kultiviert wird, und dieser veranlaßt wird,
die Substanz FA-70D zu produzieren und in der Kulturflüssigkeit
anzureichern, und indem die Substanz aus dieser Flüssigkeit
gewonnen wird. Im Detail beinhaltet das Verfahren das Kultivieren eines
Substanz FA-70D-produzierenden Stammes der Gattung Streptomyces,
wie etwa des erwähnten FA-70- Stammes oder einer
Mutante davon in einem geeigneten Medium, das Abtrennen eines Rohextraktes, der
die Substanz der Erfindung enthält,
von der Kulturflüssigkeit
und das Isolieren und Reinigen der Substanz FA-70D aus dem Rohextrakt.
-
Die
Kultivierung des erwähnten
Mikroorganismenstammes wird nach dem üblichen Kultivierungsverfahren
ausgeführt,
im allgmeinen aber ist die aerobe Kultivierung in einem flüssigen Medium
nach dem Schüttelverfahren
oder das aerobe Spinnerverfahren vorzuziehen.
-
Als
Kulturmedium kann jedes Medium verwendet werden, das Nährstoffquellen
enthält,
die der Substanz FA-70D-produzierende Stamm verwerten kann, sowie
eine Vielfalt synthetischer Medien und natürlicher Medien. Die Kohlenstoffquelle,
die verwendet werden kann, beinhaltet Glucose, Saccharose, Fructose,
Glycerin, Dextrin, Stärke,
Melassen, Maisquellwasser und organische Säuren, ist jedoch nicht auf
diese beschränkt, und
diese Quellen können
allein oder in Kombination miteinander verwendet werden. Die Stickstoffquelle,
die verwendet werden kann, beinhaltet organische stickstoffhaltige
Substanzen, wie Pharma media, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt,
Sojabohnenmehl, Casein, Aminosäuren,
Harnstoff usw., und anorganische stickstoffhaltige Substanzen, wie
Natriumnitrat, Ammoniumsulfat usw. Auch diese Substanzen können allein
oder in Kombination miteinander verwendet werden. Wo nötig, kann
das Medium mit Natriumsalzen, Kaliumsalzen, Magnesiumsalzen, Phosphaten
und Schwermetallsalzen in geeigneten Mengen angereichert werden.
Kommt es im Zug der Kultivierung zu übermäßiger Schaumbildung, können dem
Medium Schaumverhüter,
wie Pflanzenöle,
z. B. Sojabohnenöl,
Leinsamenöl
usw., höhere
Alkohole, z. B. Octadekanol, Tetradekanol, Heptadekanol usw. und
verschiedene Siliconverbindungen beigegeben werden.
-
Der
pH-Wert des Mediums wird vorzugsweise im Neutralbereich gehalten.
Die Kultivierungstemperatur sollte innerhalb des Bereichs gehalten
werden, der für
das Wachstum des FA-70D-produzierenden Stammes geeignet ist, d.
h. im allgemeinen 20–37°C und vorzugsweise
um die 25–30°C. Die Kultivierungszeit
beträgt
vorzugsweise 2–6
Tage, und zwar sowohl für
die flüssige
Schüttelkultur
als auch für
die aerobe Rührkultur.
-
Die
verschiedenen vorstehend erwähnten
Inkubationsbedingungen können
je nach Art und Merkmalen der verwendeten Mikroorganismen, äußeren Bedingungen
und ähnlichem
in geeigneter Weise modifiziert werden, und die optimalen Bedingungen
können
in Abhängigkeit
davon aus den vorstehend genannten Bereichen ausgewählt und
innerhalb dieser eingestellt werden.
-
Das
Abtrennen eines Substanz FA-70D-haltigen Rohextraktes aus der Kulturflüssigkeit
kann mit der üblichen
Prozedur zum Gewinnen von Fermentierungsprodukten erreicht werden.
Beispielsweise können
Lösungsmittelextraktion,
Verteilungschromatographie, Adsorptionschromatographie usw. allein
oder in geeigneter Reihenfolge und Kombination verwendet werden.
So wird, da die im Zug der Kultivierung hergestellte Substanz FA-70D
größtenteils
ins Medium sekretiert wird, die Kulturflüssigkeit filtriert oder zentrifugiert,
um die Substanz FA-70D-haltige flüssige Fraktion von der festen
zellulären
Fraktion abzutrennen. Die Substanz FA-70D in der so erhaltenen flüssigen Fraktion
wird dann an Diaion HP-20-Harz
(Mitsubishi Kasei Corporation) adsorbiert. Nachdem das Harz mit
gereinigtem Wasser gespült
wurde, wird die Substanz FA-70D mittels Methanol aus dem Harz eluiert,
und das Lösungsmittel
wird dann unter verringertem Druck abdestilliert, wodurch man ein
Substanz FA-70D-haltiges Rohkonzentrat erhält. Zu diesem Rohkonzentrat
wird n-Butanol hinzugefügt,
um die Substanz FA-70D in das organische Lösungsmittel zu überführen, und
das Lösungsmittel
wird dann unter verringertem Druck entfernt. Der Überstand
wird mit Ethylacetat gewaschen und das Lösungsmittel wird dann unter
verringertem Druck wegdestilliert, wodurch man den Substanz FA-70D-haltigen
Rohextrakt erhält.
-
Die
Substanz FA-70D kann mit dem Routineverfahren zur Isolation und
Reinigung von niedermolekularen Peptiden, z. B. Adsorptionschromatographie
auf aktiver Holzkohle, Diaion HP-20, ionischen Adsorptionsharzen
usw. und Reversphasenchromatographie unter Verwendung von ODS-gebundenem
Silicagel oder ähnlichem
aus dem vorstehend erwähnten
Rohextrakt isoliert und gereinigt werden. Von diesen Verfahren ist die
Diaion HP-20-Chromatographie unter Verwendung eines Gemisches von
Methanol und Wasser (pH 2.0) als Elutionsmittel und Reversphasenchromatographie
unter Verwendung eines Gemiches von Acetonitril und Trifluoressigsäure als
Elutionsmittel besonders nützlich.
Darüberhinaus
kann, wenn eine weitere Reinigung erforderlich ist, die vorstehende
chromatographische Prozedur wiederholt oder in Kombination mit Gelfiltrationschromatographie
unter Verwendung von Sephadex LH-20 (Pharmacia) und Alkohol als
Elutionsmittel ausgeführt
werden. Mit der vorstehenden Prozedur kann ein hoher Reinheitsgrad
der Substanz FA-70D erreicht werden.
-
Zur
Bestimmung der Substanz FA-70D während
des Reinigungsvorganges wird vorteilhafterweise der Test der Enzymaktivität von Papain
oder Cathepsin L, welches von der Substanz gehemmt wird, in Kombination
mit dem Nachweis durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie ausgeführt.
-
Die
spezifische Prozedur zum Test einer solchen Enzymaktivität wird in
den Beispielen und in den Testbeispielen beschrieben.
-
Die
Substanz FA-70D oder ein Salz der Erfindung inhibiert Cathepsin
L und unterstreicht somit ihre Wirksamkeit als Therapiemedikament
gegen Osteoporose und Hypercalcämie.
-
Um
die vorstehend genannte gereinigte Substanz FA-70D in Gestalt einer
Arzneimittelzusammensetzung zu nützen,
kann sie je nach der beabsichtigten Anwendung in eine geeignete
Dosierungsform verarbeitet werden. Die Dosierungsform schließt orale
Dosierungsformen, wie Tabletten, glasierte Tabletten, Pillen, Pulver,
Granulate, Feingranulate, Kapseln, Lösungen, Suspensionen, Emulsionen
usw. und parenterale Dosierungsformen, wie Injektionen, Suppositorien,
Salben, Pflaster, Aerosole usw. ein. Diese Dosierungsformen können mit
den üblichen,
auf dem Fachgebiet allgemein bekannten pharmazeutischen Routineverfahren
hergestellt werden.
-
Der
Träger
für Tabletten
beinhaltet unter anderen verschiedene Exzipienten, wie Lactose,
Saccharose, Natriumchlorid, Glucose, Harnstoff, Stärke, Calciumcarbonat,
Kaolin, kristalline Cellulose, Kieselsäure usw., Bindemittel, wie
einfacher Sirup, Glucoselösung,
Stärkelösung, Gelatinelösung, Carboxymethylcellulose, Schellack,
Methylcellulose, Kaliumphosphat, Polyvinylpyrrolidon usw., Trennmittel,
wie getrocknete Stärke, Natriumalginat,
Agarpulver, Laminarinpulver, Natriumhydrogencarbonat, Calciumcarbonat,
Polyoxyethylensorbit-Fettsäure-Ester,
Natriumlaurylsulfat, Stearyl-Monoglycerid, Stärke, Lactose, usw., auftrennungshemmende
Mittel, wie Saccharose, Stearinsäure,
Kakaobutter, gehärtetes Öl usw.,
Absorptionsförderer,
wie quarternäre
Ammoniumbasen, wie Natriumlaurylsulfat usw., Feuchtigkeitsspender,
wie Glycerin, Stärke
usw., Adsorbentien, wie Lactose Kaolin, Bentonit, kolloides Siliciumdioxid
usw. und Schmiermittel, wie gereinigtes Talkum, Stearinsäuresalze,
Borsäurepulver,
Polyethylenglykol usw. Wo nötig,
können
solche Tabletten mittels eines gewöhnlichen Beschichtungsfilms
zu glasierten Tabletten, zum Beispiel Dragees, gelatinebeschichteten Tabletten,
magensaftresistente Tabletten, filmbeschichteten Tabletten usw.
weiterverarbeitet werden, und sie können doppelt oder mehrfach
beschichtete Tabletten usw. sein.
-
Zur
Herstellung von Pillen könne
verschiedene Exzipienten, wie Glucose, Lactose, Stärke, Kakaobutter,
gehärtetes
Pflanzenöl,
Kaolin, Talkum, usw., Bindemittel, wie Gummiarabicum-Pulver, Tragacanth-Pulver, Gelatine
usw. und Trennmittel, wie Laminarin, Agar usw. als Träger verwendet
werden.
-
Kapseln
können
in der üblichen
Weise hergestellt werden, d. h. indem man die Verbindung der Erfindung
mit dem vorstehend erwähnten
Träger
vermischt und das Gemisch in Hartgelatine-Kapselschalen oder Weichkapselschalen
füllt.
-
Was
die flüssigen
Zubereitungen für
orale Verabreichung betrifft, so können Lösungen, Sirupe und Tränke hergestellt
werden, indem man einen Geschmacksverbesserer, einen Puffer, einen
Stabilisator usw. mit dem Routineverfahren zum Wirkstoff der Erfindung
hinzufügt.
Als Geschmacksverbesserer können
unter anderem Saccharose, Orangenschalen, Zitronensäure, Weinsäure usw.
verwendet werden. Als Puffer kann Natriumcitrat verwendet werden,
er ist jedoch nicht auf dieses beschränkt, und der Stabilisator kann
unter anderen Substanzen Tragacanth, Gummiarabicum und Gelatine
sein.
-
Zur
Verwendung als Injektionen werden die Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen
vorzugsweise sterilisiert und isotonisch zum Blut gemacht. Als Verdünnungsmittel
zur Herstellung solcher Injektionen können unter anderen Wasser,
Ethylalkohol, Macrogole, Propylenglykol, ethoxylierter Isostearylalkohol,
polyoxylierter Isostearylalkohol und Polyoxyethylensorbit-Fettsäure-Ester
verwendet werden. Bei dieser Prozedur kann der pharmazeutischen
Zusammensetzung eine ausreichende Menge Natriumchlorid, Glucose
oder Glycerin zugesetzt werden, um sie isotonisch zu machen. Es
ist auch möglich,
dem Träger
ein Mittel zur Kontrolle des pH-Wertes, einen Puffer, einen Stabilisator,
ein Mittel zur örtlichen
Betäubung
usw. als Additiv hinzuzufügen, und
so Injektionen für
intravenöse,
intramuskuläre,
subcutane, intradermale oder intraperitoneale Verabreichung herzustellen.
Das Mittel zur Kontrolle des pH-Wertes oder der Puffer kann unter
anderem Natriumcitrat, Natriumacetat, und Natriumphosphat sein,
ist jedoch nicht auf diese Substanzen beschränkt. Der Stabilisator kann
unter anderen Substanzen Natriumpyrosulfit, Ethylendiamintetraessigsäure, Thioglykolsäure und
Thiomilchsäure
sein. Als Mittel zur örtlichen
Betäubung
können
unter anderen Procainhydrochlorid und Lidocainhydrochlorid verwendet
werden, es ist jedoch nicht auf diese beschränkt.
-
Suppositorien
können
durch Hinzufügen
einer Suppositoriengrundlage, wahlweise eines Tensids, zum Wirkstoff
der Erfindung in der per se bekannten Weise hergestellt werden.
Als Grundlage können
unter anderen ölige
Basen, wie Macrogole, Lanolin, Kakaobutter, Fettsäuretriglyceride,
Witepsol® (Dynamit
Nobel) usw. verwendet werden.
-
Zur
Herstellung von Salben werden die üblichen Träger, wie Salbengrundlagen,
ein Stabilisator, ein feuchtigkeitsspendendes Mittel und ein Konservierungsmittel
wie erforderlich zur Verbindung der Erfindung hinzugefügt, und
das Gemisch und die Zubereitung werden in routinemäßiger Weise
verarbeitet. Als Salbengrundlagen können flüssiges Paraffin, weißes Petrolatum,
gebleichtes Bienenwachs, Octyldodecylalkohol und Paraffin verwendet
werden, sie sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Das Konservierungsmittel
kann Methyl-p- hydroxybenzoat,
Ethyl-p-hydroxybenzoat und Propyl-p-hydroxybenzoat sein, um nur
einige zu nennen.
-
Die
Pflaster können
durch Beschichten eines üblichen
Trägers
mit der erwähnten
Salbe, Paste, Creme oder dem Gel in der routinemäßigen Weise hergestellt werden.
Als Träger
können
vorteilhafterweise gewebte oder nichtgewebte Stoffe aus Baumwolle,
gesponnenem Rayongarn oder chemischen Fasern, Filme aus flexiblem
Polyvinylchlorid, Polyethylen, Polyurethan usw. und geschäumte Folien
aus solchen Materialien verwendet werden; er ist jedoch nicht nur
auf diese beschränkt.
-
Wo
nötig,
können
den vorstehend beschriebenen Dosierungsformen andere Additive beigegeben
werden, wie Farbstoffe, Konservierungsstoffe, Duftstoffe, Geschmacksstoffe,
Süßstoffe
usw. und andere medizinisch wirksame Inhaltsstoffe.
-
Der
Anteil des Wirkstoffs der Erfindung an der Arzneimittelzusammensetzung
der Erfindung ist nicht so kritisch und kann aus einem weiten Bereich
frei gewählt
werden, doch beträgt
er im allgemeinen vorzugsweise 1–70 Gewichts-%.
-
Es
gibt keine bestimmte Einschränkung
hinsichtlich der Verabreichungsweise der Erfindung der Arzneimittelzusammensetzung.
Somit kann je nach der einzelnen Dosierungsform, dem Alter und Geschlecht
und anderen Faktoren des Patienten und der Schwere der Erkrankung
ein geeigneter Modus gewählt
werden. Beispielsweise werden Tabletten, Pillen, Lösungen,
Suspensionen, Emulsionen, Granulate und Kapseln oral verabreicht.
Injektionen werden entweder allein oder unter Beimischung mit einer
gewöhnlichen
Infusion, wie einer Glucoselösung
oder einer Aminosäureinfusion
auf dem intravenösen
Weg verarbeicht. Wenn nötig,
können Injektionen
allein intramuskulär,
intradermal, subcutan oder intraperitoneal verabreicht werden. Suppositorien werden
in den After verabreicht. Salben werden auf die Haut oder auf die
Schleimhäute
in der Mundhöhle
verabreicht.
-
Die
Menge des Wirkstoffes der Erfindung, die pro Dosierungseinheit der
vorstehenden Formen zubereitet wird, läßt sich nicht allgemeingültig festlegen,
denn sie hängt
vom klinischen Zustand des Patienten und der Dosierungsform ab.
Im allgemeinen jedoch beträgt
die Menge pro Dosierungseinheit vorzugsweise etwa 1–1000 mg
für orale
Zubereitungen, etwa 0,1–500
mg für
Injektionen und etwa 5–1000
mg für
Suppositorien.
-
Die
tägliche
Dosis des Wirkstoffes der Erfindung in jeder der vorstehenden Dosierungsformen
kann nach dem Zustand, Körpergewicht,
Alter, Geschlecht, und anderen Bedingungen des Patienten wohlüberlegt gewählt werden.
Gewöhnlich
jedoch kann als tägliche
Dosis für
einen erwachsenen Patienten etwa 0,1–1000 mg/kg und vorzugsweise
etwa 1–100
mg/kg angesetzt werden. Diese Dosierung kann einmal täglich oder
verteilt auf 2–4
Dosen verabreicht werden.
-
BEISPIELE
-
Die
folgenden Arbeitsbeispiele und Testbeispiele sind lediglich dazu
gedacht, die Erfindung in weiteren Details zu beschreiben, und sollten
keineswegs als Definition des Schutzbereichs der Erfindung ausgelegt werden.
-
Beispiel 1: Herstellung
der Substanz FA-70D der Erfindung
-
(a) Kultivierungsvorgang
-
Ein
Erlenmeyerkolben (500 ml) wurde mit 100 ml eines Mediums (pH 7.2)
aus 0,5% Glucose, 2,4% löslicher
Stärke,
0,3% Rindfleischextrakt, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Pepton, 0,4% Maisquellwasser,
0,002% Kobaltchlorid und 0,4% Calciumcarbonat beschickt und nach
der Sterilisierung mit einer Schleife voll Streptomyces sp. Stamm
FA-70 (Eingangsnummer FERM BP-5183) inokuliert. Der Kolben wurde
dann 3 Tage lang bei 27°C
auf einem Rotationsschüttler
inkubiert (220 U/min, 7 cm Ausschlag).
-
Dann
wurde ein Medium (pH 7.0), bestehend aus 2,0% Glycerin 2,0% Dextrin,
0,3% Hefeextrakt, 1,0% Soytone, 0,2% Ammoniumsulfat und 0,2% Calciumcarbonat
auf konische Kolben von 500 ml Fassungsvermögen verteilt, 100 ml pro Kolben,
und nach der Sterilisierung (121°C,
15 min) wurde diese Ansatzkultur in einer Größenordnung von 2% (V/V) zu
jedem Kolben hinzugefügt.
Die inokulierten Kolben wurden auf einem Rotationsschüttler 3
Tage lang bei 27°C
inkubiert (220 U/min, 7 cm Ausschlag).
-
(b) Abtrennungsvorgang
-
Die
durch die vorstehende Prozedur erhaltene Kulturflüssigkeit
(8.5 L, pH 6.1) wurde gewonnen, zentrifugiert (3000 U/min, 15 min)
und filtriert. Das so erhaltene Kulturfiltrat wurde mit 1N Natriumhydroxid/Wasser auf
pH 8.0 eingestellt, und es wurde Diaion HP-20-Harz (Mitsubishi Kasei Corporation)
hinzugefügt
(850 ml). Nach einstündigem
Schütteln
wurde das Harz durch Filtration abgetrennt, und dann wurde das Harz
mit Methanol (4250 ml) behandelt, während es mit 1N Hydrochlorsäure unter
Rühren
auf pH 2.0 eingestellt wurde, um die Substanz FA-70D zu eluieren.
Die vorstehende Prozedur wurde noch zweimal wiederholt und der Methanolextrakt
wurde mit 1N Natriumhydroxid/Wasser auf pH 6.0 eingestellt und zentrifugiert.
Der Überstand wurde
unter verringertem Druck konzentriert, um eine methanolfreie Substanz
FA-70D-haltige wässrige
Lösung
zu erhalten. Diese wässrige Lösung wurde
mit 1N Natriumhydroxid/Wasser auf pH 8.0 eingestellt und 3 mal mit
dem gleichen Volumen (V/V) n-Butanol extrahiert. Der vereinigte
n-Butanolextrakt wurde unter verringertem Druck konzentriert, und
der feste Überstand
wurde 3 mal mit Ethylacetat (50 ml) gespült und getrocknet, wodurch
man einen Substanz FA-70D-haltigen Rohextrakt (7,2 g) erhielt.
-
(c) Isolierung und Reinigungsvorgang
-
Der
vorstehend beschriebene Rohextrakt (4,2 g) wurde in Methanol (84
ml) aufgelöst,
und die Lösung wurde
zentrifugiert (3000 U/min, 15 min), wodurch die methanollösliche Fraktion
von der unlöslichen
Fraktion getrennt wurde. Die unlösliche
Fraktion wurde weiter mit Methanol (33 ml) verdünnt und zentrifugiert, um die methanollösliche Fraktion
von der unlöslichen
Fraktion abzutrennen. Die methanollöslichen Fraktionen wurden vereinigt,
mit Wasser (2213 ml) verdünnt
und mit 1N Salzsäure
auf pH 3.0 eingestellt. Das so erhaltene Präzipitat wurde entfernt. Die
methanolhaltige wässrige
Lösung
wurde mit 1N Natriumhydroxid/Wasser auf pH 7.0 eingestellt und auf
eine CM-Sephadex-Säule
(Pharmacia, CM-Sephadex
C-25, H+-Form, 3,6 cm I.D. × 30 cm) aufgebracht.
Die Substanz FA-70D-haltige nichtabsorbierte Fraktion (Säulendurchflußfraktion)
wurde mit 1N Natriumhydroxid/Wasser auf pH 7.0 eingestellt und auf
eine DEAE-Sephadex-Säule
(Pharmacia, DEAE-Sephadex A-25, OH–-Form,
3,6 cm I.D. × 30
cm) aufgebracht. Die Säule
wurde mit Wasser gespült,
und die Elution wurde mit 0,1 M Natriumchlorid ausgeführt. Das
so erhaltene Eluat wurde erneut auf eine Diaion HP-20-Säule (2 cm
I.D. × 15
cm Länge)
aufgebracht. Nachdem die Säule
mit Wasser gespült
wurde, wurde die Elution mit 60% Methanol/Wasser (mit verdünnter Salzsäure auf
pH 2.0 eingestellt) ausgeführt.
Das so erhaltene Eluat wurde unter verringertem Druck konzentriert
und ergab ein trockenes, Substanz FA-70D-haltiges Pulver (240 mg).
-
Die
Feststellung aktiver, Substanz FA-70D-haltiger Fraktionen in jeder
Stufe geschah mit Hilfe des Tests auf Papain-inhibierende Aktivität (Biochemical
Journal, 201, 189–198,
1982).
-
Dazu
wurden 0,5 ml 400 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6.8) mit 8 mM Dithiothreitol
und 4 mM Tetranatrium-Ethylendiamintetraacetat, 0,8 ml einer Enzymlösung mit
5 μM Papain
und 0,1% Brij 35 (Polyoxyethylen (23) Laurylether) (Wako Pure Chemical
Ind.) und 0,2 ml einer wässrigen
Lösung,
die eine Probe enthielt, 10 Minuten lang bei 40°C präinkubiert. Dann wurden 0,5
ml einer 0,1%igen wässrigen
Dimethylsulfoxid-Lösung
mit 20 μM
Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-L-arginin-4-methylcoumaryl-7-amid hinzugefügt, und
das Gemisch wurde 10 Minuten lang bei 40°C inkubiert. Die Enzymreaktion
wurde durch Hinzufügen
von 2,0 ml 100 nM Natriumacetatpuffer (pH 4.3) mit 100 mM Natriummonochloracetat
gestoppt, und die Intensität
der Fluoreszenz (F) bei einer Exzitationswellenlänge von 350 nm und einer Emissionswellenlänge von
458 nm wurde gemessen. Als Kontrolle wurden der Probe 0,2 ml Wasser
anstelle der 0,2 ml der erwähnten
wässrigen
Lösung hinzugefügt und die
Intensität
der Fluoreszenz (F0) bei 458 nm in ähnlicher
Weise gemessen. Die enzyminhibierende Aktivität wurde mittels folgender Formel
berechnet:
Enzyminhibierende Aktivität (%) = F/F0 × 100
-
Das
so erhaltene Trockenpulver wurde in Methanol aufgelöst, und
die Lösung
wurde auf eine Gelfiltrationssäule
(Pharmacia, Sephadex LH-20, 2 cm I.D. × 127 cm) aufgebracht. Die
Elution wurde mit Methanol ausgeführt. Die aktiven Fraktionen
wurden vereinigt, und das Lösungsmittel
wurde entfernt und ein trockenes Pulver gewonnen (37 mg). Dieses
trockene Pulver wurde in Methanol aufgelöst und der Reversphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
unterworfen, und zwar auf einer Inertsil ODS-2-Säule (GL-Science, 5 μm, 10 mm
I.D. × 250
mm) und mit Acetonitril/Trifluoressigsäure/Wasser (V/V/V, 35 : 0,05
: 65) als mobiler Phase bei einer Durchflußrate von 4,0 ml/min. Die aktiven
Fraktionen wurden vereinigt und das organische Lösungsmittel wurde unter verringertem
Druck wegdestilliert. Die restliche wässrige Lösung wurde lyophilisiert und
ergab so Substanz FA-70D als weißes Pulver (11 mg).
-
Die
physikalisch-chemischen Eigenschaften der so erhaltenen Substanz
FA-70D waren folgende:
- (1) Erscheinungsform:
weiße
Pulver
- (2) Empirische Formel: C30H42N6O7 (M) [hochauflösende FAB-
(Beschuß mit
schnellen Atomen)-Massenspektrometrie: gefunden 599,3181; berechnet
für C30H43N6O7 (M + H) 599,3193]
- (3) Molekulargewicht: 598,701 (FAB- (Beschuß mit schnellen Atomen)-Massenspektrometrie)
- (4) Infrarot-Absorptionsspektrum: KBr-Scheibenverfahren: vmax
(cm–1):
3375, 2965, 2935 1675–1640, 1555,
1455, 1400, 1205, 1140, 840, 805, 725, 700. (1)
- (5) Nuklearmagnetisches Resonanzspektrum: Das 400-MHz-1H-NMR-Spektrum in Dimethylsulfoxid-d6 (DMSO-d6) bei 30°C ist in 2 dargestellt. Die chemischen
Verschiebungen sind in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle
3 - Phe
- Phenylalanin
- Cit
- Citrullin
- Val
- Valin
- APP
- 2-Amino-3-phenylpropanol
- (6) Löslichkeit: Gut löslich in
Methanol und Dimethylsulfoxid und schwach löslich in Ethanol. Praktisch
unlöslich
in Chloroform, Aceton, Ethylacetat, Ether und Hexan.
- (7) Farbreaktionen:
Ehrlich-Reaktion: positiv
Sakaguchi-Reaktion
und Ninhydrin-Reaktion: negativ
- (8) Schmelzpunkt: 157–158°C
- (9) Optische Rotation: [α]D 20 = –8,71°
(c
= 3,56 mg/ml, Methanol)
- (10) Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie:
Ein Peak bei einer Retentionszeit (tR) von
5,8 Minuten unter folgenden Bedingungen:
Säule: Inertsil ODS-2,5 μm (4,6 mm
I.D. × 150
mm, GL Science)
Mobile Phase: Acetonitril/Trifluoressigsäure/Wasser
(35 : 0,05 : 65, V/V/V)
Flußrate: 1 ml/min
Detektion:
210 nm (0,04 a. u. f. s.)
-
Testbeispiel 1
-
Bestimmung der enzyminhibierenden
Aktivität
der Substanz FA-70D
-
Die
inhibierende Aktivität
gegenüber
Cathepsin L oder Cathepsin B wurde mit dem Verfahren von A. J. Barrett
et al. [Biochemical Journal, 201, 189–198, 1982] geprüft. Die
Chymotrypsin- oder Trypsin-inhibierende Aktivität wurde in Übereinstimmung mit den in Tsuru,
D. und Funatsu, M. (Hrsg.), Seikagaku-Jikkenho-Tanpakushitsu Bunkai
Koso II [Methods of Biochemistry, Proteolytic Enzymes II], Bd.31,
7–14,
1993 beschriebenen Verfahren geprüft.
-
Das
Verfahren zum Testen der inhibitorischen Aktivität gegenüber Cathepsin B ist folgendes:
Es wurden 0,5 ml 400 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6.0) mit 8 mM
Dithiothreitol und 4 mM Tetranatrium-Ethylendiamintetraacetat, 0,8
ml einer Enzymlösung
mit 5 μM
Cathepsin B und 0,1% Brij 35 (Wako Pure Chemical Ind.) und 0,2 ml
einer wässrigen
Lösung
der Verbindung der Erfindung 10 Minuten lang bei 40°C präinkubiert.
Dann wurden 0,5 ml einer 0,1%igen wässrigen Dimethylsulfoxid-Lösung mit
20 μM Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-L-arginin-4-methylcoumaryl-7-amid
hinzugefügt,
und das Gemisch wurde 10 Minuten lang bei 40°C inkubiert. Dann wurde die
Enzymreaktion durch Hinzufügen
von 2,0 ml 100 mM Natriumacetatpuffer (pH 4.3) mit 100 mM Natriummonochloracetat
gestoppt. Die Intensität
der Fluoreszenz (F) wurde bei einer Exzitationswellenlänge von
350 nm und einer Emissionswellenlänge von 458 nm bestimmt. Als
Kontrolle wurden der Probe 0,2 ml Wasser anstelle der 0,2 ml der
erwähnten
wässrigen
Lösung
der Verbindung hinzugefügt
und die Intensität
der Fluoreszenz (F0) bei 458 nm in ähnlicher
Weise gemessen. Die enzyminhibierende Aktivität wurde mittels folgender Formel
berechnet:
Enzyminhibierende Aktivität (%) = F/F0 × 100
-
Die
inhibierende Aktivität
gegenüber
Cathepsin L wurde folgendermaßen
gemessen: Mit Ausnahme der Tatsache, daß Cathepsin L anstelle von
Cathepsin B in der gleichen Konzentration verwendet wurde, und daß die 400
mM Natriumphosphatpuffer auf pH 5.5 eingestellt wurden, wurde die
vorstehend beschriebene Testprozedur zur Bestimmung der enzyminhibierenden
Aktivität
wiederholt.
-
Die
inhibierende Aktivität
gegenüber
Chymotrypsin wurde folgendermaßen
gemessen: Es wurden 0,1 ml 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7.5), 0,15
ml Wasser, 0,01 ml 5 ng/ml Chymotrypsin/Wasser und 0,04 ml einer wässrigen
Lösung
der Verbindung der Erfindung 5 Minuten lang bei 37°C präinkubiert.
Dann wurden 0,1 ml einer wässrigen
Lösung
von 100 μM
Succinyl-L-leucyl-L-leucyl-L-valyl-L-tyrosin-4-methylcoumaryl-7-amid
hinzugefügt,
und das Gemisch wurde 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die Enzymreaktion
wurde durch Hinzufügen
von 0,5 ml 100 mM Natriumacetatpuffer (pH 4.3) mit 100 mM Natriummonochloracetat
gestoppt, und die Intensität
der Fluoreszenz (F) wurde bei einer Exzitationswellenlänge von
350 nm und einer Emissionswellenlänge von 458 nm gemessen. Als
Kontrolle wurden der Probe 0,04 ml Wasser anstelle von 0,04 ml der
erwähnten
wässrigen
Lösung
der Verbindung der Erfindung hinzugefügt und die Intensität der Fluoreszenz
(F0) bei 458 nm in ähnlicher Weise gemessen. Die
enzyminhibierende Aktivität
wurde mittels folgender Formel berechnet:
Enzyminhibierende
Aktivität
(%) = F/F0 × 100
-
Die
inhibierende Aktivität
gegenüber
Trypsin wurde folgendermaßen
gemessen: Mit Ausnahme der Tatsache, daß Trypsin in der gleichen Konzentration
an Stelle von Chymotrypsin und Benzoyl-L-leucyl-L-lysyl-argingin-4-methylcoumaryl-7-amid
in der gleichen Konzentration an Stelle von Succinyl-L-leucyl-L-leucyl-L-valyl-L-tyrosin-4-methylcoumaryl-7-amid
verwendet wurde, wurde die vorstehend beschriebene Prozedur zur
Bestimmung der inhibierenden Aktivität gegenüber Chymotrypsin wiederholt,
und die enzyminhibierende Aktivität wurde in der gleichen Weise
wie vorstehend berechnet.
-
Die
Ergebnisse sind in der Tabelle 4 dargestellt.
-
-
Aus
dem Testbeispiel geht klar hervor, daß die Substanz FA-70D der Erfindung
Cathepsin L stärker inhibiert
als Cathepsin B und Chymotrypsin stärker inhibiert als Trypsin. Formulierungsbeispiel
1: Kapseln
Substanz
FA-70D | 10
mg |
Lactose | 50
mg |
Maisstärke | 47
mg |
Kristalline
Cellulose | 50
mg |
Talkum | 2
mg |
Magnesiumstearat | 1
mg |
pro Kapsel | 160 mg |
-
Nach
dem vorstehenden Rezept wurden Kapseln durch das routinemäßige Verfahren
hergestellt. Formulierungsbeispiel
2: Injektion
Substanz
FA-70D | 5
mg |
Destilliertes
Wasser zur Injektion | q.s. |
pro Ampulle | 5 ml |
-
Nach
dem vorstehenden Rezept wurde eine Injektion das routinemäßige Verfahren
hergestellt. Formulierungsbeispiel
3: Suppositorien
Substanz
FA-70D | 20
mg |
Witepsol
W-35 (Warenzeichen von Dynamit Nobel) | 1380
mg |
pro Suppositorium | 1400 mg |
-
Nach
dem vorstehenden Rezept wurden Suppositorien das routinemäßige Verfahren
hergestellt.
-
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
-
Die
Substanz FA-70D der Erfindung inhibiert Proteasen der Cathepsinserie
stark und ist als therapeutisches Arzneimittel für verschiedene Krankheiten
im Zusammenhang mit diesen Enzymen wertvoll, besonders für die Osteoporose.