DE2813507A1 - Tetrapeptide - Google Patents

Description

Beschreibung

Die Erfindung betrifft neue physiologisch aktive Peptide, Derivate davon sowie ein Verfahren zu ihrer .Herstellung. Insbesondere befaßt sie sich mit neuen Tetrapeptiden, die als Amastatine A₁, A~, A^, B.. und B, bezeichnet werden, sowie mit ihren Derivaten, die eine inhibierende Wirkung auf Aminopeptidase A ausüben und auch eine Stimulierung einer Antxkörperbxldung zeigen. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung dieser Tetrapeptide durch Züchten eines Stammes, der zu dem genus Streptomyces gehört.

Einige physiologisch aktive Peptide oder N-acylierte Peptide wurden in den Kulturbrühen gefunden. Diese Substanzen, beispielsweise Leupeptin, Antipain, Chymostatin und Pepstatin, Inhibiertrypsin, Papain, Chymotrypsin bzw. Pepsin, alle diese Inhibitoren üben jedoch ihre Wirkung auf Proteasen aus, die in einer Endotypreaktion wirken. Weitere Einzelheiten bezüglich dieser Enzyme findet man in "Enzyme Inhibitors of

Microbial Origin", Hamao Umezawa, University of Tokyo Press (1972) in Kapitel IV, Inhibitors of Proteolytic Enzymes (Seiten 15 bis 52) an den folgenden Stellen:

Peptide Seitenzahl Leupeptin 15

Antipain 29

Chymostatin 32

Pepstatin 34

Bestatin, das auch in einer mikroben Kulturbrühe gefunden wurde, inhibiert ein proteolytisches Enzym des Exotyps, d. h., Aminopeptidase B und Leucinaminopeptidase, es übt jedoch keinerlei inhibierende Wirkung auf Aminopeptidase A aus (J. Antibiotics 29, S. 97 - 103 und 600 - 601 und US-PS 4 029 547)

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I NACHGEREICHT

Durch die Erfindung werden die physiologisch aktiver Amastatin A^, A₃/ A₃, B^ und B₃ der Formel I

X-Val-Val-Y (I)

zur Verfugung gestellt, worin

X den S-Amino^-hydroxy-S-methylhexanoylrest oder den S-Amino^-hydroxy-'l-methylhexanoylrest bedeutet,

VaI für den L-Valylrest steht und

Y L-Asparaginsäure :, L-Glutaminsäure oder L-Asparaginsäure-CX-amid, wenn X für den B-Ämino^-hydroxy-S hexanoylrest steht und L-Glutaminsäure oder L-Glutaminsäure-Of-amid bedeutet, wenn X den S-Amino^-hydroxy^-methylhexanoylrest darstellt, und die Aminogruppe der Gruppe VaI₇ die X benachbart ist, mit der Carboxylgruppe von X unter Bildung einer'Amidbindung acyliert ist, die Carboxylgruppe dieser Gruppe VaI die Aminogruppe der anderen Gruppe VaI unter Bildung einer Amidbindung acyliert und die Carboxylgruppe der anderen Gruppe VaI die Aminogruppe von Y unter Bildung einer Amidbindung acyliert.

Ferner wird durch die Erfinuung ein Verfahren zur Herstellung von Amastatinen durch Züchten eines neu isolierten Streptomyces sp. ME98-M3 (FERfI p-3722) in einem Medium zur Verfügung gestellt, das Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen enthält, wobei das Züchten unter aeroben Bedingungen solange durchgeführt wird, bis eine erhebliche Menge der physiologischen Aktivität erzeugt worden ist. Dann v/erden die auf diese Weise erzeugten Amastatine aus der Kulturbrühe gewonnen.

Ferner v/erden durch die Erfindung verschiedene Araastatinderivate zur Verfugung gestellt, beispielsweise die Salze, Estej oder N-acylierten Derivate, die sich nach herkömmlichen chemischen Methoden herstellen lassen.

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Amastatine sowie ihre Derivate besitzen eine starke inhibierende Wirkung auf Aminopeptidase A und erhöhen die Antikörperbildung. Daher betrifft die Erfindung auch ein Inhibierungsmittel für Aminopeptidase A, das Amastatine enthält, sowie eine Zubereitung zur- Erhöhung der Antikörperbildung.

Die Erfindung wird durch die beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1, 2, 3, 4, 5 die Infrarotabsorptionsspektren in KBr der Amastatine A^, A₂, A₃, B₁ bzw. B₃;

Fig. 6, 7, 8, 9 und 10 die NMR-Spektren (100 MHz in D₂O) der Amastatine in der gleichen Reihenordnung wie sie vorstehend angegeben worden ist;.

Fig. 11, 12, 13, 14 und 15 die Massenspektren von N-Acetylamastatindiraethylestern der Amastatine in der gleichen Reihenfolge, wie sie vorstehend angegeben worden ist.

Die erfindungsgemäßen Amastatine A-, A₃, A_, B₁ und B₂ sind strukturell miteinander verwandt. Sie weisen folgende ähnliche physikalische Eigenschaften auf: Schmelzpunkte, Elementaranalysenwerte, pKa-Werte, Rf-Werte bei der Dünnschichtchromatographie sowie Wanderungswerte bei der Durchführung einer Hochspannungspapierelektrophorese. Diese Eigenschaften sind in der folgenden Tabelle I zusammengefaßt.

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Tabelle I Physikalisch/chemische Eigenschaften von Amastatinen

Amastatine
Al A2 A3 ' - Bl B2

195-197 196-200

F. 0C	200-203	202-205	53.06 ■	53.26	-	196-20
		• Elementaranalysewerte	8.32	8.30	53.00
gefunden, %	14.61	I4I79"	7.91
C	23.30	23.65	27.17	54.30
H	berechnet, %	11.67	8.01
0	C		11.16
N	H	53.15	26.10
0	8.07
N	11.61	54.08
26.98	8.25
	11.47
26.20

54.00	.. 54.31 ■
8.40	7.98
23.02	11.21
14.18	26.00
54.19	54.08
8.48	8.25
22.97	11.47
14.36	26.20

für
C₂₁H₃₉N₅O₇ C₂₁H₃₈N₄O₈ C₂₂H₄₀N₄O₈ C₂₂H₄₁N₅O₇ " C₂₂H₄₀N₄O₈

Molekulargewicht 473	474	488	487	488
pKa 3.8	2.3 4.0	3.0 .4.2	3.7	'"" * 3.0 ■■'·- 4.2
Rf-Wert*		- ."	-	. · ■- -
0.47	0.46	0.54	0.55	- 0.52
Rm-Wert **	--
0.52	0.51	0.53	0.54	0.53

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ORIGINAL INSPECTED

* Die Dünnschichtchromatographie wird unter Verwendung einer Kieselgelplatte und eines Lösungsmittelsystems aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser (4:1:1) durchgeführt.

*'* Relativer Wanderungsabstand in Richtung auf eine Kathode zu Alanin mit einer Pufferlösung aus Ameisensäure, Essigsäure und Wasser (25:75:900) bei 3500 V während einer Zeitspanne von 15 Minuten.

Die Amastatine A-, A^, A^/ B- und B2 sind in Wasser, Methanol, Essigsäure, Pyridin sowie Dimethylsulfoxid löslich, wenig löslich in n-Propanol und n-Butanol und praktisch unlöslich in Athylacetat, Butylacetat, Diäthyläther, n-Hexan, Petroläther, Benzol sowie Chloroform. Sie geben positive Rydon-Smith-, Ninhydrin und Kaliumpermangänatreaktionen, jedoch negative Ehrlich- und Sakaguchi-Reaktionen. Es wird keine charakteristische UV-Absorption festgestellt. Die Amastatine sind in neutralen, sauren und alkalischen Lösungen stabil. Die inhibierende Aktivität einer Aminopeptidase A wird nicht durch Erhitzen der wäßrigen Lösung mit einem pH von 2, 7 oder 9 bei 6O⁰C während einer Zeitspanne von 30 Minuten herabgesetzt.

Kachfolgend werden die Strukturen der Amastatine beschrieben, soweit sie bisher aufgeklärt werden konnten.

Amastatin A..: ■

Das Infrarotabsorptionsspektrum (Fig. 1) in Kaliumbromid weist folgende Absorptionspeaks auf: 3300, 2980, 1710, 1665, 1635, 1550, 1470, 1405, 1355, 1225, 1150, 1090 und 700 (cm~¹). Die Aminosäureanalyse des sauren Hydrolysate der Verbindung in 6n HCl bei 105°C während einer Zeitspanne von 18 Stunden ergibt Valin, Asparaginsäure sowie eine bisher unbekannte Aminosäure mit einem Molverhältnis von 2:1:1. Die neue Aminosäure wurde durch Harzchromatographie isoliert und gereinigt. Ihre Struktur wird durch das NMR-Spektrum, IR-Spektrum, die Elementaranalyse, den pKa-Wert, die Farbreaktionen sowie ehe-

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28135α?

mische Reaktionen ermittelt und durch die chemische Synthese als Struktur der folgenden Formel bestätigt:

.H	OH
t	I
r- C -	C - COOH
1	Γ
CH2	H
I
CH
/\
CH CH	3

3-Amino-2-hydroxy-5-methylcapronsäure

Das NMR-Spektrum (100 MHz in D„0) von Amastatin A₁ (Fig. 6) zeigt Signale bei <£ 1 ,1 - 1,4, 1,6 - 2,1, 2_f 2 - 2,6, 3,0 3,2, 3,85 - 3,95 und 4,4 - 4,7. Zur weiteren Charakterisierung wurde das Peptid an dem N-Ende acetyliert und der Dimethylester von N-Acetylamastatin A.. einer Massenanalyse (Fig. 11) unterzogen. Das Ergebnis zeigt, daß diese Aminosäuren durch Amidbindungen in der Reihenfolge N-acetylierte neue Aminosäure, L-Valin, L-Valin sowie L-Asparaginsäuredimethylester, gerechnet von dem N-Ende, gebunden sind. Der vorstehend erwähnte pKa-Wert von 3,8 zeigt, daß die ß-Carboxylgruppe der Asparaginsäure an dem C-Ende des Peptids frei ist und die anderen OC-Carboxylgruppen ein Säureamid bilden. Die Struktur von Amastatin A₁ läßt sich daher wie folgt ermitteln:

H OH H H H I ! I I ! HH - C - C - CONH - C - COlIH - C - COMH -C-

²II ί I I

CH_ H CH CH CH-

ι ² "Λ /\ I ²

CH HC CH HC CH COOH

H₃C CH₃

3-Amino-2-hydroxy-5-methylhexanoyl-L-valyl-L-valyl-L-asparaginsäure-Of-amid

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Amastatin

Das IR-Spektrum (KBr) (Fig. 2) zeigt folgende Peaks: 3400, 3250, 3030, 2930, 1700, 1650, 1620, 1530, 1465, 1390, 1220, 1.160, 1085 und 700 (cm ) . Die Aminosäureanalyse ergibt das gleiche Ergebnis wie im Falle von Amastatin A... Die neue Aminosäure wurde ebenfalls als die gleiche Aminosäure wie diejenige von Amastatin A₁ nach den vorstehend beschriebenen Methoden identifiziert. In dem NMR-Spektrum von Amastatin A₂ (Fig. 7) wurden die Signale bei <£i,2 - 1,5, 1,9 - 2,1, 2,3 2,7, 3,15 - 3,35, 3,85 - 4,15, 4,5 - 4,8 und 4,9 - 5,1 beobachtet. Eine massenspektrometrische Analyse mit hoher Auflösung (Fig. 12) von N-Acetylämastatindimethylester zeigt die gleiche Aminosäuresequenz wie im Falle von Amastatin A*. Die Elementaranalyse sowie die pKa-Werte von 2,8 und 4,0 zeigen jedoch, daß die zwei Carbony!gruppen von Asparaginsäure Carbonsäuregruppen sind. Die Struktur läßt sich wie folgt ermitteln: ■- . - . * ~

H OH H H "K

Ir ι ι ι

BH₁J - C — C - CO5H - C — COIiH — C - COHH - C - COOK ²II t 1 t

CH- H CH CH CH_

ι² A A i²

CH H,C CH. H,C CK₄ COOH

A ³ -?_.. ³

^E5^GCH3 ...

3-Amino~2—hydroxy—S-methylhexanoyl-L-valyl-L-valyl-L· asparaginsäure

Amastatin

Das IR-Spektrum (KBr) (Fig. 3) der Verbindung weist folgende Peaks auf: 3430, 3280, 2950, 1710, 1660, 1630, 1540, Ϊ467, 1395_r 1225, 1090, 96Q und 700 (cm). Bie Aminosäureanalyse des Säurehydrolysats ergibt Valin, Glutaminsäure sowie eine unbekannte Aminosäure. Die neue Aminosäure wird als die gleiche Säure wie im Falle von A.. und A₂ identifiziert. Das

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281350?

NMR-Spektrum von Amastatin A^ (Fig. 8) zeigt Signale bei S 1,2 - 1,6, 2,3 - 2,7, 2,7 - 3,0, 3,1 - 3,4, 3,8 - 4,4 und 4,4 - 4,9. Ein mit hoher Auflösung ermitteltes Massenspektrum (Fig. 13) von N-Acetylamastatin-A-j-dimethylester zeigt, daß N-acetylierte neue Aminosäure, Valin, Valin sowie Glutaminsäuredimethylester in der angegebenen Reihenfolge, beginnend von der N-Endgruppe, unter Bildung von Amidbindungen gebunden sind. Die pKa-Werte von 3,0 und 4,2 lassen vermuten, daß die Qf- und Jf-Carbonylgruppen der Glutaminsäure Carbonsäuregruppen sind. Aus diesen Ergebnissen läßt sich die Struktur von Amastatin A-. wie folgt ermitteln:

H OH H H H ;

Ii I ι I

HH -C-C- CONH - C - COHH - C - COIiH - C - COOH

²IiI ι . -ι . ;

CH E ^: CH CH CH

ι² /\ /\ l

CH HC CH EC CH CL

/ \ ■ l

H C CBL ^G00S

3-Amino-2-hydroxy-5-methylhexanoy1-L-valy1-L-valy1-L-glutaminsäure

Amastatin B₁:

In dem IR-Spektrum (Fig. 4) werden folgende Absorptionsbanden ermittelt: 3340, 3000, 1710, 1665_r 1640, 1550, 1475, 1405, 1315, 1230, 1160, 1090, 960 und 700 (cm"¹). Die Aminosäureanalyse des Säurehydrolysats von Amastatin B^ in 6n HCl bei 105⁰C während einer Zeitspanne von 18 Stunden ergibt Valin, Glutaminsäure sowie eine unbekannte Aminosäure in einem Molverhältnis von 2:1:1. Die neue Aminosäure wurde isoliert und gereinigt und durch NMR-Analyse charakterisiert. Die Struktur der Aminosäure wurde durch chemische Synthese wie folgt ermittelt:

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28 t

HC _

H OH ' I I
C-C- COOH

Il

I ^:

T²

CH, .

3-Amino~2-hydroxy-4-methylcapronsäure

Das NMR-Spektrum von Amastatin B^ (100 MHz in D₂O) (Pig. 9) zeigt Signale bei <£.0,6 - 1,0, 1,2 - 1,55, 1,6 - 2,3, 2,95 - 3,3, 3,8 - 4,4, 7,4 - 7,7 und 7,9 - 8,3. Die Analyse des mit hoher Auflösung ermittelten Massenspektrums (Fig. 14) von N-Acetylamastatin-B-j-dimethylester zeigt, daß N-acetylierte neue Aminosäure, Valin, Valin und Glutaminsäuredimethylester durch Amidbindungen in der erwähnten Sequenz gebunden sind. Durch den pKa-Wert von 3,7 wird die Vermutung nahegelegt, daß die (f-Carbony!gruppe der Glutaminsäure, die an dem C-Ende gebunden ist, eine Carbonsäuregruppe ist. und die andere OC-Carbony!gruppe eine Säureamidgruppe darstellt. Daher läßt sich die Struktur von Amastatin B₁ wie folgt ermitteln:

HH₂-

O H H H

I I I

C-C- COlIH - C - CONH - C - COBH -C- COHH-'

I I

CH H

I CH₂

CH, .

CH

HC CH,

CH

/Y

H₃C CH,

COOH

^C22^H41^N5°7

S-Amino^-hydroxy^-methylhexanoyl-L-valyl-L-valyl-L-glutaminsäure- (X -amid.

8 0.9 8 8-4/05.9-2

Amastatin B^:

Das IR-Spektrum (Fig. 5) weist folgende Absorptionsmaxima auf: 3400, 3260, 2940, 1700, 1655, 1625, 1550, 1450, 1400, 1315, 1225, 1150, 1090, 950 und 700 (cm"¹). Es werden die gleichen drei Aminosäuren wie im Falle von Amastatin B-festgestellt. Das NMR-Spektrum (100 MHz in D₃O) (Fig. 10) zeigt Signale bei $1,1 - 1,55, 2,1 - 2,35, 2,37 - 2,75, 2,8 - 3,2, 3,8 - 4,05, 4,45 - 4,7, 4,75 - 4,9 und 4,9 5,0. Eine Untersuchung des mit hoher Auflösung ermittelten Massenspektrums (Fig. 15) von N-acetyliertem Amastatin-B--dimethylester zeigt, daß die neue N-Acetylaminosäure, zwei Valine sowie Glutamineäuredimethy!ester in dieser Reihenfolge durch Amidbindungen gebunden sind. Die pKa-Werte von 3,0 und 4,2 zeigen, daß die zwei Carbonylgruppen von Glutaminsäure Carbonsäuregruppen sind. Die Struktur von Amastatin B2 ist folgende:

H OH H H H Ί

ι Ι ι ι I

_NH ..C-C- COM - C - CONH - C - CONH -C- COOH

²Il I I I "

H C - CH H CH CH CH₃

³ I /\ /\ ■ = -■ CH- H₀C CH, H,C CH CH- i£. 5 ο 3 ) j j *

CE, ^COOH

^C22^S

S-Amino^-hydroxy^-methylhexanoyl-L-valyl-L-valyl-L-glutaminsäure

Zur weiteren Bekräftigung der Strukturen der vorstehend erwähnten Amastatine wurden die neuen Peptide chemisch nach folgendem Reaktionsschema synthetisiert:

§0988/»/0$92

Synthese der neuen Aminosäure von Amastatin

281350?

I HH₂-C-COOH

H₀C-CH J ι CH,

H H

Il

Z-Ii-C-COOH I

H..C-CH 3 ι CH,

Benzyl-»S-4,6-di.-aethylpyri.-aidin 2-yIthiöl carbonat

D-Leucin H H

Z-If-C-CO-F^ J

ELcyclohexylcarbodiiaid"

Pyrazol

, C-CH 3 ι

LiAlH,

H H OH I I l Z-H-C-C-CH

I I H₂CH

H₁C-CH 3 ι

HaCH

H H OH I I I Z-H-C-C-SO-Ha

I I H₂CH

H C-CH

CH, H H J f Z-H-C-CHO

H,C-CH ι

HaHSO,

HCl

H OH Il HH₀-C-C-COOH

²Il

H^C-CH 3 1
CH₃

3-Amino-2—hydroxy-5—methylcapronsäure Z bedeutet Carbobenzoxy

3-Amino-2-hydroxy-4-methylGapronsäure wird aus D-Isoleucin auf die gleiche Weise erhalten.

809-884/0592 ORIGINAL INSPECTED

Chemische Synthese von Amastatin

D-Leucin

3—Amino—2—hydxoiy—5-methy]capronsäure

I OH :

1
Z-NH-CH-CH-COOH L-Valin, - L-Asparaginsäure

CTT ι

I 2 I herkömmliche Feptidsynthe-

CH.J-CH J, se in flüssiger Phase

CH, H₀H-CH-COIIH-CH-COHH-CH-COOBz

3 2,|,

H,C-CH H₁C-CH CH₀

3 ι 3 ι ι

CH CH COOBz

OH

herkömmliches Kupplungsreaktionsverfahren

H₀Ir-CH-CH-COlIH-CH-CONH-CH-COHH-CH-COOH

²I I ti

CH₀ H₀C-CH H₁C-CH CH₀

1 ² 3 , 3. ι ι

H-J-C-CH CH- CH, COOH

j 1 3 3 CH₃

S-Amino^-hydroxy-S-methylhexanoyl-L-valyl-L-valyl-L-asparaginsäure

Andere Analoga wurden nach dem gleichen Schema mit Isoleucin oder Glutaminsäure synthetisiert.

OBiGlMAL 1NSPEC--TD

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2813:501

Die physikalisch- chemischen Eigenschaften der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Amastatine stimmen gut mit den Eigenschaften der chemisch synthetisierten Peptide überein. Daher können die vorstehend angegebenen Strukturen der Amastatine als bestätigt angesehen werden.

Amastatine enthalten eine Aminogruppe und eine Carboxylgruppe in den Fallen A-, A₃ und B^ und eine Aminogruppe und zwei Carboxylgruppen in den Fällen A₃ und B„, wobei diese Gruppen zur Bildung von Salzen, Estern und acylierten Derivaten nach herkömmlichen Methoden befähigt sind. Die Erfindung umfaßt auch derartige Amastatinderivate.

Ein anderes Merkmal der Erfindung besteht in der Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung der Amastatine/ das darin besteht, einen Amastatin-erzeugenden Stamm, der zu den genus Streptomyces gehört, in einem geeigneten Medium, das Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Bedingungen solange zu züchten, bis erhebliche Mengen an Amastatinen in der Kulturbrühe erzeugt worden sind, und die auf diese Weise erzeugten Amastatine nach herkömmlichen Methoden zu gewinnen.

Der zur Herstellung der Amastatine geeignete Mikroorganismus wurde taxonomisch als Streptomyces sp. ME98-M3 charakterisiert. Er wurde aus einem Boden als Stamm ME98-M3 isoliert und in dem Fermentation Research Institute, Japan, mit der Hinterlegungsnummer FERM p-3722 und in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, mit der Hinterlegungsnummer A.T.C.C. 31318 hinterlegt. Die morphologischen Eigenschaften sowie die züchtungstechnischen Eigenschaften des Stammes gehen aus den folgenden Absätzen hervor:

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1. Morphologie

Lufthyphen mit gekrümmten oder schlaufenförmigen Enden erstrecken sich von verzweigten Substrathyphen. Die reife Sporenkette weist 10 oder mehr Sporen auf, die eine Abmessung von 0,6 bis 0,8 χ 1,0 bis 1,2 μ besitzen und glatte Oberflächen aufweisen.

2. Wachsen auf verschiedenen Medien

Die Angaben in Klammern entsprechen dem Parbstandard "Color Harmony Manual", veröffentlicht von der Container Corporation of America, USA.

a) Rohrzucker-Nitrat-Agar

Vegetatives Wachstum: Dunkelgelb (3mc Amber). Kein lösliches Pigment.

Luftmyzeln: Weiß (a, White) bis hellgelblich braun (1 1/2 gc, Dusty Yellow).

b) Glucoseasparagin-Agar

Vegetatives Wachstum: Gelblichbraun (3ne, Topaz Butterscotch) . Kein lösliches Pigment.
Luftmyzeln: Leicht grau (3fe, Silver gray).

c) Glycerinasparagin-Agar (ISP Medium Nr. 5) Vegetatives Wachstum: Gelblich braun (3ne, Topaz Butterscotch) . Kein lösliches Pigment.

Luftmyzeln: Leicht grau (3fe, Silver gray).

d) Agar aus Stärke und anorganischen Salzen (ISP Medium Nr. 4) Vegetatives Wachstum: Dunkelgelb (2ne, Mustard Gold) bis hellgelb (2ne, Old Gold). Kein lösliches Pigment. Luftmyzeln: Gelblichgrau (2ea, Lt. Wheat to Lt. Maze).

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I _ 21 —
NACHGEREICHT j

e) Tyrosin-Agar (ISP Medium Nr. 7)

Vegetatives Wachstum: Gräulichgelbbraun. (3ni-, Clove Brown) . Kein lösliches Pigment.

Luftmyzeln: Gräulichweiß (b, Oyster White) bis gelblichgrau (2ca, Lt. Ivory).

f.) Nährmittel-Agar

Vegetatives Wachstum: Hellgelblichbraun (3pe, Amber Topaz). Kein lösliches Pigment.
Luftmyzeln: Keine.

g) Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP Medium Nr. 2) Vegetatives Wachstum: Dunkelgelblichorange (3pg, Golden Brown). Kein lösliches Pigment.
Luftmyzeln: Weiß (a, White).

h) Weizenmehl-Agar (ISP Medium Nr. 3)

Vegetatives Wachstum: Dunkelgelb (2nc, Brite Gold to Nugget Gold)- Kein.lösliches Pigment.
Luftmyzeln: Gelblichgrau (2ca, Lt. Ivory).

i) Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP Medium Nr. 6) Vegetatives Wachstum: Farblos bis hellgelblichbraun (2ga, Colonial Yellow, Maize). Kein lösliches Pigment. Luftmyzeln: Keine

j) Calciummalat-Agar

Vegetatives Wachstum: Farblos bis hellgelb (1 1/2ia, Sunlight Yellow, Daffodil, Forsythia Jonquil). Kein lösliches Pigment.
Luftmyzeln: Weiß (a, White).

Alle vorstehenden Beobachtungen wurden nach einer Inkubation ·· bei 27⁰C durchgeführt.

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Physiologische Eigenschaften

(a) Wachstumstemperatur: Die optimale Temperatur für das Wachstum beträgt 24 bis 30⁰C auf Maltose-Hefeextrakt-Agar (Maltose 10,0 g, Hefeextrakt 4,0 g, Agar 17,0 g und entionisiertes Wasser 1000 ml, pH 7,0). Kein Wachstum unterhalb 15⁰C sowie oberhalb 45⁰C.

(b) Gelatineverflüssigung auf einem Glukose-Pepton-Gelatine-Medium bei 27⁰C: Eine Verflüssigung beginnt nach 5-tägiger Inkubation und ist nach 21 Tagen beendet. Schwache Verflüssigung.

(c) Stärkehydrolyse auf einem Agar aus Stärke und anorganischen Salzen (ISP Medium Nr. 4) bei 27⁰C: Es beginnt eine sehr schwache Hydrolyse nach ungefähr 5-tägiger Inkubation.

(d) Peptonisierung und Koagulierung von Magermilch bei 37⁰C: Die Koagulierung ist nach 4-tägiger Inkubation beendet, worauf eine mäßige Peptonisierung beginnt.

(e) Melaninbildung auf einer Trypton-Hefeextrakt-Brühe (ISP Medium Nr. 1), einem Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar (ISP Medium Nr. 6) und einem Tyrosinagar (ISP Medium Nr. 7) bei 27°C: Negativ auf allen Medien.

(f) Verbrauch von Kohlehydraten eines Pridham-Gottlieb-Agar bei 27°C: L-Arabinose, Xylose, Glukose, D-Fructose, Rohrzucker, Inosit und Raffinose: Gutes Wachstum? L-Rhamnose und Cellulose: Kein Wachstum.

(g) Verflüssigung von Calciummalat auf einem Calciummalat-Agar bei 27⁰C: Negativ.

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Auf der Grundlage der vorstehend beschriebenen Eigenschaften wird der Stamm ME 98-M3 als zu den genus Streptomyces gehörend identifiziert und als Streptomyces sp. ME 98-M3 bezeichnet .

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß Amastatine unter Verwendung eines Stamms hergestellt werden können, der zu dem genus Streptomyces gehört. Erfindungsgemäß ist der Einsatz aller Stämme vorgesehen, die zu dem genus Streptomyces gehören und die erfindungsgemäßen Tetrapeptide erzeugen. Der vorstehend erwähnte Stamm Streptomyces sp. ME98-M3 umfaßt alle natürlichen und künstlichen Mutanten sowie alle Stämme, die zu der gleichen Spezies wie die Mikroorganismenausführungsform gemäß vorliegender Erfindung gehören.

Amastatine können durch Züchten des Mikroorganismus auf einem geeigneten Medium sowie unter geeigneten Bedingungen erhalten werden. Die zum Züchten der erfindungsgemäßen Mikroorganismen eingesetzten Medien sind die Nährmedien, die zum Züchten von Schimmelpilzen (actinomycetes) als geeignet bekannt sind. Als Kohlenstoffquelle kann man beliebige Kohlenhydrate verwenden, wie sie normalerweise für die Fermentation eingesetzt werden, wie beispielsweise Glycerin, Glukose, Stärke, Dextrin, Lactose, Rohrzucker, Maltose, Melassen sowie Fett; Der Stickstoff kann von jedem beliebigen der bekannten Materialien, die in herkömmlicher Weise eingesetzt werden, geliefert werden, beispielsweise von Pepton, Fleischextrakt, Maisflüssigkeit, Baumwollsamenmehl, Nußmehl, Sojabohnenmehl, Hefeextrakt, Casaminosäure, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat sowie Ammoniumsulfat. Die Medien können Natriumchlorid, Phosphatsalze, Kaliumcarbonat sowie Magnesiumsulfat als anorganische Nährmittel enthalten. Andere Metallsalze können ebenfalls als Spurenelemente, falls erforderlich, zugesetzt werden. Das Züchten oder die Fermentierung können nach jeder aeroben Züchtungsmethode durchgeführt werden, beispielsweise durch Schütteln einer Kultur in einem Kolben oder als Tank-Fermentor-Kultur. Eine Submerskultur ist zur Herstellung in technischem Maßstabe zu bevorzugen. Die Fermentationstemperatur sollte

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NACHGEREICHT

innerhalb eines solchen Bereiches ausgewählt i/erden, %äIT aer Mikroorganismus Amastatin erzeugt. Insbesondere ist ein Temperaturbereich von 25 bis 35°C vorzuziehen. Die Fermentation wird im allgemeinen solange fortgesetzt, bis eine erhebliche Menge an Ainastatinen in der Kulturbrühe erzeugt worden ist.

Die Ainas ta tonerzeugung läßt sich durch Messen der inhibierenden Wirkung auf Aminopeptidase A überprüfen. Die angewendete Überprüfungsmethods ist wie folgt: Die Aminopeptidase-A-Aktivität wird gemäß Nagatsu et al. (I. Nagatsu, T. Nagatsu, T. Yamamoto und G. G. Glenner, Biochim. Biophys. Acta 198 255-70, 1970) mit einer Abänderung wie folgt gemessen: Eine Mischung aus 0,0007 m Glutamyl-ß-naphthylamid (1,0 ml), 0,01 m CaCl₂ (0,2 ml) 0,1 m tris-HCl-Puffer (Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan)-Lösung (pH 7,0, 0,6 ml) und einer Probelösung (0,1 ml) wird bei 37°C während einer Zeitspanne von 3 Minuten bebrütet. Eine Aminopeptidase-A-Lösung (0,1 ml, hergestellt durch Ammoniumsulfatfraktionierung nach der Nagatsu-Methode) wird der Mischung zugesetzt. Die Bebrütung bei 37⁰C wird während einer Zeitspanne von v/eiteren 30 Minuten fortgesetzt, worauf eine 1,0m Acetatpufferlösung mit einem pH von 4,2 (0,6 ml), die 0,1 % Fast Garnet-GBC-Salz (o-Aminoazotoluoldiazoniumsalz) und 10 % Tween 20 enthält, zugesetzt wird. Nach 15 Minuten wird bei Zimmertemperatur das Absorptionsvermögen (a) der Mischung bei 530 nm gemessen. Eine Mischung ohne Probe wird ebenfalls in der gleichen Weise als Vergleichsprobe (b) behandelt. Eine Inhibierungsrate (%) von Aminopeptidase A wird aus folgender Gleichung berechnet:

100

Die Konzentrationen, die für 50 % der Inhibierungsrate (ID₁.-) bei dieser Untersuchung erforderlich sind, betragen 0,65 meg/ ml in Amastatin A-, 0,54 mcg/ml in A₂, 1,0 mcg/ml in A^, 1,5 mcg/ml in B.. bzw. 1 _rQ mcg/ml in B₂-

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ORiGfNAL INSPECTED

Beispielsweise wird ein Medium, das 2 % Glycerin, 2 % Dextrose, 1 % Bactosoyton (Difco), 0,3 % Hefeextrakt, 0,2 % (NH.)₂~

SO₄ und 0,2 % CaCO-, bei einem pH von 7,4 enthält, in einem Autoklaven behandelt und mit Sporen und/oder Myzein beimpft, die v©n einer Schrägkultur -von Streptomyces sp. ME98-M3 erhalten worden sind. .Alle Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht pro Volumen, sofern nichts anderes angegeben ist. Eine Anreicherung von Amastatinen wird nach 3 bis 7 Tage dauerndem aeroben Züchten unter Schütteln bei 27°C festgestellt.

Die Tabelle II zeigt die Herstellung von Amastatinen in Schüttelkulturen mit verschiedenen Medien. Die Fermentation wird unter Einsatz von 100 ml des Mediums in einem 500 ml-Kolben auf einem Rotatxonsschüttler (180 Upm) bei 29⁰C durchgeführt. 0,5 ml der Brühe werden zur Untersuchung als Probe entnommen.

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j NACHGEREIOHT

Tabelle II Amastatinerzeugung in verschiedenen Kulturmedien

Amastatinerζ eugung

Nr. Zusammensetzung des Anfangs- Inhibierung (%) End-

Mediums pH 12 3 Λ 7 ^pH

Tag

31,5 8,6

26,9 9,0

23,2 9,1

17,6 9,3

26,2 31,6 35,3 33,5 46,2 8,1

26,0 9,4

7. Rohrzucker 4,0 7,9 22,2 9,5

Proteinhydrolysat 2,5

8. Glycerin 2,0 6,9 40,0 52,7 52,7 50,2 49,1 8,2 Dextrin 2,0

Soypeptone* 1,0

Hefeextrakt 0,3

9. Stärke 2,0 7,1 33,5 45,7 47,5 40,3 48,3 8,9 Baurrvollsamenmehl 2,0

Maisflüssigkeit 1,0

10. Glycerin 3,0 7,2 19,5 8,6 Fischmehl 2,0

* Soypeptone ist ein enzymairisches Vsrarbeitungsprodukt von Sojabohnenrrehl.

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1.	Stärke Glukose So j abohnenrnahl Hefeextrakt	1,0 1,0 2,0 0,5	6,7
2.	Soj abohnenöl— Stärke Glukose Soj abohnenmehl	2,0 0,5 0,5 2,5	7,1
3.	Glycerin Fleischextrakt Polypepton	2,5 0,5 0,5	7,0
4.	I-lalfcQSe Fleischextrakt Polypepton Hefeextrakt	2,0 0,5 0,5 0,3	7,8
5.	Stärke Glukose Hefeextrakt Casaminosäure	2,0 1,0 0,5 0,5	7,1
6.	La<-tose Hefeextrakt Fleischextrakt Polypepton	2,5 0,5 0,5 0,75	7,8

Die Tabelle III zeigt auch die Amastätinerzeugung in verschiedenen Medien. Die in der Tabelle angegebenen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen werden einem Grundmedium zugesetzt, das 0,1 % Hefeextrakt, 0,1 % WaCl, 0,05 % K₂HPO₄ und 0,05 % MgSO₄/ 7H₂O enthält. Die Fermentation wird mit einem 50 ml Medium, in einem 500 ml Kolben auf einem Rotationsschüttler (200 Upm) bei 28⁰C durchgeführt. Die inhibierende Aktivität wird mit 0,02 ml der Brühe ermittelt.

	Tabelle III	Stickstoff quelle	Amastatinproduktion	4-tägiqer Bebrütung
		Sojabohnenmehl 2,0	nach	Inhibierung (%)
		Trockene Hefe 2,0	pH	18,0
Nr.	Amastatinproduktion in verschiedenen Medien	4,0	6,7	23,0
		Baumwollsamen- 2,0 mehl	6,1	.■ 41,3
A		4,0	6,8	25,9
B	Zusammensetzung des Mediums (%)	Soj abohnenmehl 2,0	6,5	58,6
C	Kohlenstoff quelle	Trockene Hefe 2,0	6,5	15,2
D	Stärke 3,0	Baumwollsamen- 2,0 mehl	8,4	16,0
E	3,0 ;	So j abohnenmehl 2,0	8,2	17,1
F	6,0	4,0	8,3	43,1
G	3,0	Trockene Hefe 2,0	7,4	55,1
H	6,0	4,0	6,8	36,6
I .. -	Glycerin . 3,0	Baumwollsamen- 2,0 mehl	7,4	46,1.
J	. 3,0	6,9	30,4
K	3,0	6,4
L	So j abohnenöl 3,0
M	.' .:. 6,0
	3,0
6,0
3,0

Stärke 4,5 Trockene Hefe 4,0 Sojabohnenmehl 1,5

Baumwollsamen- 4,0 mehl

Baumwollsamen- 4,0 mehl
(NH₄) ₂SO₄ 0,2

Stärke

6,0

6,4
6,5
6,0

57,1 61,8 64,3

8038 8k/0592

~²⁸~ 281350?

Sojabohnenmehl: "Es-san meat", Ajinomoto Co. Baumwollsamenmehl: "Pharmamedia", Traders Oil Mill Co.

Diese Ergebnisse zeigen, daß die Amastatinerzeugung in Abhängigkeit von dem Medium und der Bebrütungszeit schwankt. Bevorzugte Bestandteile des Mediums-für die Amastatinerzeugung sind Glycerin, Glukose, Stärke, Sojabohnenöl, Soypeptone, Baumwollsamenmehl, Maisflüssigkeit, Sojabohnenmehl, Hefe, Casaminosäure sowie Ammoniumsulfat.

Gefäß- und Tankfermentatoren ermöglichen ebenfalls eine gute Erzeugung von Amastatin. Beispielsweise wurde eine Submerskultur in einem Tank unter Einsatz von 100 1 des Mediums P gemäß Tabelle III in einem 200 1-Fermentator gezüchtet. Nach 96-stündiger Bebrütung mit einer Belüftung von 100 l/Minute und einem Rühren mit 200 üpm wurde die größte Amastatinmenge erhalten. 0,1 ml der Brühe ergaben zu diesem Zeitpunkt eine 50 %ige Inhibierung bei der Durchführung der vorstehend beschriebenen Untersuchungsmethode. Amastatinanaloga, d. h. A-, A₂/ A,, B₁ und B₂ werden gewöhnlich gleichzeitig in der Fermentationsbrühe erzeugt. Die Menge eines jeden Analogons in der Brühe hängt von dem Mikroorganismenstamm, dem Medium, den Züchtungsbedxngungen und dergleichen ab.

Auf diese Weise in der Fermentationsbrühe erzeugte Amastatine können nach jeder Methode gewonnen werden, die zur Isolierung und Reinigung von Peptiden angewendet wird und an sich bekannt ist. Für eine Isolierung in kleinem Maßstabe wird das Brühenfiltrat im Vakuum zur Trockne eingedampft, worauf der Rückstand mit einem Lösungsmittel, welches Peptide aufzulösen vermag, wie Methanol, Äthanol, Dimethylsulfoxid, Essigsäure oder Pyridin, extrahiert wird. Bei einem Arbeiten in großem Maßstabe werden Amastatine aus dem Brühenfiltrat mit einem Lösungsmittel extrahiert, das Peptide aufzulösen vermag und mit Wasser nicht mischbar ist, wie beispielsweise n-Butanol. Ein Konzentrieren der Extrakte liefert rohe Amastatinpulver.

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1 NACHGEREICHT] - 29 -

_: 281350?

Amastatine lassen sich in zufriedenstellender Weise durch Adsorption an einem herkömmlichen Adsorbens, wie Aktivkohle, einem organischen Adsorbens, wie Amberlite XAD-4 (Rohm and Haas Company) sowie Cellulose, Ionenaustauschern oder Kie-._r selgel, isolieren. Beispielsweise wurde .Aktivkohle dem Brühenfiltrat (2 %) zur Adsorption der Peptide zugesetzt. Die Ak- . tivkohle wurde abfiltriert und dann mit Wasser und anschließend zweimal mit 20 bis 25 Volumina Methanol mit 40⁰C gewaschen. Mehr als 70 % Amastatin in der Brühe-werden' durch die Methanoleluierung erhalten. Gleichzeitig erzeugte Amastatinanalo.ga, wurden auf diese Weise als Rohpulver aus·ihren Mischungen isoliert. Jedes Amastatinanalogori kann in wirksamer Weise. durch Chromatographie fraktioniert und gereinigt werden. Für diesen Zweck wird Cellulose mit einer Mischung aus Äthylacetat, Äthanol und Ammoniak (17:2:1) als bevorzugtes Lösungsmittelsystem verwendet. Die Isolierung und Reinigung von Amastatinen sind auch unter Einsatz von Ionenaustauscherharzen mit sauren und basischen funktionellen Gruppen möglich. Stark basische oder stark saure Ionenaustauscherharze x^erden bevorzugt.

Die Erfindung sieht ferner ein Verfahren zur Herstellung von Amastatinderivaten vor. Metallsalze von Amastatinen lassen sich leicht durch Neutralisation erhalten. Eine andere Salzform von Amastatin wird durch Kristallisation nach Zugabe von

anorganischer Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, erhalten, da Amastatine eine frei Aminogruppe aufweisen. N-acylierta Derivate lassen sich durch die Behandlung mit einem Anhydrid oder Halogenid einer organischen Säure, wie Essigsäure oder Propionsäure unter geeigneten Bedingungen erhalten. Amastatine A₉, A₃ und B₂ (22 mg, 20 mg bzw. 20 mg) wurden in Wasser aufgelöst. Acetylchlorid wurde der Lösung bei einem pH von 8,5 zugesetzt, um die freie Aminogruppe zu acetylieren. Die M-Acetylamastatine A₉, A-, und B₉ wurden in Ausbauten von 13 mg, 11 mg bzw. 10 mg erhalten. Die NMR- und IR-Spektren bestätigten, daß die Produkte W-acetylierte Amastatine sind. Die Ester von Amastatinen werden durch Veresterung der freien Carboxylgruppe mit Alkohol unter geeigneten Badingun-

.809884/0592

281350?

gen hergestellt. Zu N-Acetylamastatinen A-, A-, und B₂ (9 mg, 8 mg bzw. 8 mg) wurde eine Mischung aus 0,5 ml Thionylchlorid und 4 ml Methanol in einem Eisbad zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde in dem Eis während einer Zeitspanne von 30 Minuten und dann bei Zimmertemperatur über Nacht gehalten. Ein Eindampfen im Vakuum zur Trockne ergab N-Acetylamastatin-r dimethylester (10 mg von Ao, 9 mg von A, bzw. 9 mg von B_?). Die NMR- und Massenspektren bestätigten, daß die Produkte die Dimethylester von N-Acetylamastatin A_n, A₃ bzw. B₂ sind. Daher umfaßt die Erfindung auch Verfahren zur Herstellung von Salzen, N-acylierten Derivaten sowie Estern von Amastatinen.

Die erfindungsgemäßen Amastatine besitzen eine starke inhibierende Aktivität auf Aminopeptidase A, wie vorstehend bereits dargelegt worden ist. Die Inhibierungsaktivität gegenüber Aminopeptidase A ist so spezifisch, daß andere Aminopeptidasen, wie Aminopeptidase B, gegenüber den Tetrapeptiden nicht anfällig sind. Die Tabelle IV zeigt ID_5Q-Werte von Amastatinen im Falle von Aminopeptidase A und B.

	Tabelle IV	B durch Amastatine
Inhibierung	von Aminopeptidase A und	(mcg/ml)
	ID
Amastatine		Aminopeptidase B
	Aminopeptidase A	>100
A1	0,65	>100
A2	0,54	>100
A3	1,0	>100
Bl	1,5	>100
B2	1,0

Aminopeptidase A wird bei einer Konzentration von 0,5 bis 1,5 mcg/ml inhibiert, während Aminopeptidase B sogar in Gegenwart von 100 mcg/ml Amastatin nicht beeinflußt wird.

Zusätzlich zu der Inhibierungsaktivität zeigen die neuen

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2813501

Tetrapeptide gemäß vorliegender Erfindung eine Stimulierung humoraler Antikörperbildung.

Mäuse (dd/Y) werden durch intravenöse Injektion von 10 roten Schafblutzeilen (SRBC) immunisiert. Amastatine in Salzlösung werden intraperitoheal oder oral an die Mäuse verabreicht. 4 Tage danach wird die Anzahl der Plättchenbildungszellen (PFG) in der Milz nach der homoIytischen Plättchenmethode von Jerne (N. K. Jerne, A. A. Nordin und C. Henry: The agar plaque technique for recognizing antibody-producing cells/ Cellbond Antibodies. B. Amos und H. Kopröwskied, Seiten 109 - 122, Wister Institute Press, Philadelphia, 1963; N. K. Jerne und A. A. Nordine, Plaque Formation in Agar by Single Antibody-Producing Cells, Science, 140, Seite 405, 1963) ermittelt. .

Wie aus der Tabelle V hervorgeht, führt die intraperitoneale Injektion von 1 bis 1000 meg/Maus oder die orale Verabreichung von TO bis 1000 mcg/Maus an Amastatin A₂ zu einer Erhöhung der Zahl der plattchenbxldenden Zellen (PFC) um das ungefähr zwei- oder: dreifache im Vergleich zu der Anzahl an PFC in dem Antigen allein.

Tabelle V _; ' " "

Wirkung von Amastatin auf die Antikörperbildung zu SRBC (I) in

: : Mäusen ; . '- -

Amastatin A₂ Amastatin, verabreicht Dosis/Maus* i.p. oral

	0	149000	PFC/Milz
108 SRBC	•1000 μg	235000	125000
Il	100	283000	153000
Il	10	504000	192800
Il	1	264800	286400
Il		102700

* i.p. injiziert zum Zeitpunkt der Immunisation

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2-81350?

Nachdem Amastatin A- intraperitoneal einmal pro .Tag während einer Zeitspanne von 4 Tagen in Mäuse injiziert worden ist,

werden die Mäuse durch intravenöse Injektion von 10 SRBC immunisiert. Vier Tage nach der Immunisation wird die Anzahl der antxkörperbildenden Zellen in der Milz der Maus ermittelt. Dabei wird festgestellt, daß die intraperitoneale Injektion von 100 bis 1000 mcg/Maus/Tag an Amastatin A- die Anzahl der PFC um ungefähr das 2- oder 3-fache im Vergleich zu der Anzahl von PFC in dem Antigen allein erhöht.

Tabelle VI
Wirkung von Amastatin auf die Antxkörperbxldung zu

SRBC (II) in Mäusen

Dosis in μg/Maus* SRBC** PFC/Milz

O	.ν.	108 SRBC	76000
1000	Il	121000
100	Il	138000
10	Il	196000
1	II	58000
* Tage -4 ,	i.p.
** Tag 0, χ

Die Wirkung von Amastatin auf die primäre Antxkörperbxldung gegenüber SRBC in dissoziierten Milzzellenkulturen wird nach den Methoden von Mishell und Dutton untersucht. Alle Milzkulturen (1,5 χ 10 ) werden aus den Milzen von CDF₁-Mäusen präpariert und mit 10 SRBC als Antigen während einer Zeitspanne von 4 Tagen bei 37°C in einer 7 %igen CO₃-Atmosphäre gezüchtet. Amastatin wird in dem Medium aufgelöst. Jede Amastatinkonzentration zwischen 0,0001 μg und 1 μg pro Kultur wird zum Zeitpunkt der Immunisation (Stunde 0) sowie 24, '48 oder 72 Stunden nach dem Start der Kulturen zugesetzt. Vier Tage nach dem Start der Kulturen wird die Antxkörperbxldung einer jeden Kultur durch Zählen der PFC unter Anwendung der von Cuningham et al. beschriebenen Methode ermittelt.

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1 - 33 -

NACHGEREICHT

vOif

Wie aus der Tabelle VII hervorgeht, hat die Zugabe bis 1 ]i.q Amastatin A-, zu Milzzellenkultüren 0 oder 2 4 Stunden nach dem Start der Kulturen eine Erhöhung der PFC-Anzahl zur Folge.

Tabelle VII

.Amastatin Zuhake ^von Amastatin, Stunden nach dem Start der Kultur ^g/Kultur 0 24 48 72

10 SRBC	0	,01	2920
Il	1	,0001	4420	3100	2280	. 2520
Il	0	4200	2950	2380	3160
IT	0	2900	3080	2940	3080

Ferner erhöht Amastatin die Einstellung einer verzögerten Hypersensitivität (DTH) gegenüber SRBC. Weibliche dd/Y-Mäuse werden

durch Injektion von 10 SRBC in 0,05 ml einer Salzlösung in die rechte hintere Pfote immunisiert. Vier Tage danach wird die

Reaktion durch Injektion von 10 SRBC in die linke hintere Pfote ausgelöst und die Zunahme der Dicke der linken hinteren Pfote 24 Stunden später gemessen.

Amastatin A~ wird intraperitoneal einmal pro Tag in Mäuse während einer Zeitspanne von vier Tagen vor der Immanisation durch

10 SRBC injiziert. Wie aus der Tabelle VIII hervorgeht, erhöht Amastatin A₂ in einer Menge von 0,1 bis 10 mcg/Maus/Tag das Ansprechen der Pfote, die Injektion von 100 mcg/Maus/Tag zeigt jedoch keine Wirkung bezüglich des Ansprechens der Pfote. Eine intraperitoneale Injektion von 1 bis 1000 mcg/Maus an Amastatin A-, zum Zeitpunkt der Immunisation erhöht ebenfalls nicht das Ansprechen der Pfote.

ORlGlNAt INSPECTED 809884/0592

Tabelle VIII Einfluß von Amastatin auf die Einstellung einer verzögerten

Hypersensitivität gegenüber SRBC in Mäusen

Amastatin, injiziert an den Tagen oder am Tag

Dosis in μg/Maus __A

_Qie

Zunahme der Pfotendicke

o ;io,2 " 9,0

1000 8,1

100 10,0 7,3

10 14,3 8,T

1 14,1 8,4

0,1 13,8

* Zum Zeitpunkt der Immunisation

Die Tatsache, daß Amastatine, die Antikörperbildung erhöhen und eine verzögerte Hypersensitivität ermöglichen, zeigt, daß die Peptide zur Potenzierung des Wxrtsabwehrsystems gegenüber bakteriellen und viralen Infektionen sowie gegenüber Krebs verwendet werden können. Aminopeptidase A ist eine der Angiotensinasen. Eine starke Inhibierung der Enzymaktivität verursacht eine Inhibierung der Angiotensin-II-Zersetzung zur Aufrechterhaltung einer bestimmten Konzentration an Angiotensin sowie zur Erhöhung des Blutdrucks. Amastatine lassen sich möglicherweise für diesen Zweck sowie auch zur Potenzierung der Aldosteronaktivität einsetzen.

Die erfindungsgemäßen Amastatine besitzen eine sehr niedrige Toxizität. Herkömmliche Aminopeptidase-A-Inhibitoren sind stark toxische Substanzen, beispielsweise Metallchelierungsmittel, wie Athylendiamintetraessigsäure oder o-Phenanthrolin oder Protein-modifizierende Mittel. Amastatine zeigen eine inhibierende Wirkung bei niedrigen Konzentrationen und sind wesentlich weniger toxisch als die herkömmlichen Inhibitoren. In der Tabelle IX ist die akute Toxizität von Amastatin in Mäusen bei einer intraperitonealen Verabreichung angegeben.

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281350?

	Toxizität	Tabelle IX	Toxizität
		von Amastatinen	keine
	Dosis		keine .
Amastatine	- .	(mg/kg, i.p.)	keine
		125	keine
A2		125	keine
A3		125
BT		125
B2 -	125

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie
zu beschränken.

Beispiel 1

Ein Medium (100 1), das 6,0 % lösliche Stärke, 4,0 % Baumwollsamenmehl, 0,2 % (NH₄)₂SO₄, 0,1 % Hefeextrakt, 0,2 %
CaCO₃, 0,05 % K₃HPO₄, 0,05 % MgSO₄-TH₂O, 0,1 % NaCl und
0,01 % Adecanol (Antischaum, Asahidenka Co.) enthält, wird in einem Fermentationsgefäß aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 200 1 bei 120⁰C während einer Zeitspanne von 30 Minuten sterilisiert und mit einer Saatkultur
(5 1) von Streptomyces sp. ME98-M3 (FERM p-3722), hergestellt unter Verwendung des gleichen Mediums durch Züchten in einem Kolben, beimpft. Eine Submerskultur wird bei 27°C während
einer Zeitspanne von 96 Stunden bei einer Belüftung von 200 1/ Minute und bei 200 üpm durchgeführt. Aus zwei Chargen, die bei der Fermentation anfallen, werden 200 1 einer filtrierten Brühe erhalten.

Das Filtrat mit einem ID,-„-Wert von 0,1 ml wird auf eine
3-1-Säule, die mit Amberlite XAD(-4) der Rohm and Haas Co. gefüllt ist, aufgebracht. Amastatine werden mit 30 1 50 %igen Methanols eluiert. Die Konzentrierung des Eluats im Vakuum bei 6O⁰C liefert ein rohes Amastatinpulver in einer Menge, von 390 g. Der ID „-Wert des Pulvers beträgt 250 mcg/ml.

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2-81350?

390 g des Pulvers werden in 3,9 1 Wasser aufgelöst, wobei der pH auf 8,2 mit 1 η NaOH eingestellt wird. Die Lösung wird auf eine mit Dowex 1 (X4) gefüllte Säule aufgebracht (Acetattyp, 3,5 1, Dow Chemicals Co.)· Die Eluierung mit 101 einer 0,1 η Essigsäure ergibt nach einem Waschen mit 10 1 Wasser 110 g des aktiven Pulvers (ID^_n =100 mcg/ml). Dieses Pulver wird in 1,1 1 0,3 m Pyridin/Essigsäure-Pufferlösung (pH 6,0) aufgelöst und auf eine mit DEAE-Sephadex A25 gefüllte Säule (600 ml, Pharmacia Fine Chemicals AB), die zuvor mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist, aufgebracht. Ein durch Eluierung mit dem gleichen Puffer erhaltener aktiver Peak wird im Vakuum konzentriert, wobei man 30,6 g des aktiven Pulvers (ID₅₀ =40 mcg/ml) erhält.

Eine Lösung des aktiven Pulvers in 400 ml O₇05 m Pyridin/Ameisensäure-Pufferlösung (pH 2,9) wird auf eine mit Dowex 50 (X4) gefüllte Säule (310 ml, Dow Chemicals Co.), die zuvor mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist, aufgebracht. Ein aktiver Peak wird durch die Eluierung mit einer Pyridin/Ameisensäure-Pufferlösung (2 1) mit einem linearen Gradienten von 0,05 m, pH 2,9, bis 0,2 m, pH 3,1, erhalten; Die Konzentrierung des Peaks im Vakuum ergibt 5,1 g des aktiven Pulvers (IDc₀ = 8,5 mcg/ml).

Das Pulver wird weiter durch Kieselgelchromatographie mit einem Lösungsmittelsystem aus n-Butylacetat, n-Butanol, Essigsäure und Wasser (12:4:1:1) gereinigt. 0,8 g eines hochaktiven Pulvers werden erhalten (ID „ = 2,5 mcg/ml). Zur Fraktionierung des aktiven Pulvers zur Gewinnung eines jeden Amastatinanalogons wird die vorstehend beschriebene Dowex 50-Säulenchromatographie erneut durchgeführt. Amastatine A-, A₃ und B₂ werden voneinander durch die Rechromatographie abgetrennt. Jedes durch Konzentrieren der aktiven Fraktion erhaltene Pulver wird durch Adsorption an Dowec 50 (X4) (H -Typ) sowie durch Eluierung mit 0,2n NH^OH entsalzt. Die nachfolgend angegebenen im wesentlichen reinen Amastatine werden erhalten:

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A₂: 30 mg (ID₅₀ 0,54 mcg/ml)

A₃: 47 mg (ID₅₀ 1*0 mcg/ml) und B₃: 20 mg (ID₅₀ 1,0 mcg/ml)

Diese Präparate besitzen die vorstehend erwähnten physikalischchemischen Eigenschaften. ■ ■

Beispiel 2

Ein Medium (125 ml), das 2 % Kartoffelstärke, 2 % Baumwollsamenmehl, 1 % Maisflüssigkeit und 0,32 % CaCOo enthält, wird in einen 500 ml-Kolben bei 120⁰C während einer Zeitspanne von 20 Minuten sterilisiert, mit Streptomyces sp. ME98-M3 (FERM p-3722) beimpft und bei 27°C unter Hin- und Herschütteln mit 130 Upm während einer Zeitspanne von 2 Tagen bebrütet. Diese Kultur wird als Impfmaterial verwendet.

Ein Medium (15 1), das 2 % Glycerin, 2 % Dextrin, 1 % Bactosoytone (Difco Co.), 0,3 % Hefeextrakt, 0,2 % (NH₄J₂SO₄ und 0,2 % CaCO₃ enthält, wird in einem 30 1-Fermentationsgefäß sterilisiert, mit 1 1 der Impfkultur, die in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellt worden ist, beimpft und bei einer Belüftung von 15 l/Minute sowie unter Rühren (200 Upm) bei 27°C während einer Zeitspanne von 4 Tagen bebrütet. Ein Brühenfiltrat (50 1) mit einem ID_5Q-Wert von 0,14 ml wird aus vier Chargen der Kultur erhalten.

Das Filtrat wird nach im wesentlichen der in Beispiel 1 beschriebenen Methode gereinigt. Die Rechromatographxe des aktiven Pulvers, das durch die Silikagelbehandlung und durch die Entsalzung durch Dowex 50 erhalten worden ist, liefert 25 mg im wesentlichen reines Amastatin A^ (^ID5q ⁼ °'^{65 mc}<j/ ml) und 35 mg im wesentlichen reines Amastatin B₁ (^ID5q ⁼ 1,50 mcg/ml). Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Präparate stimmen gut mit den vorstehend erwähnten Eigenschaften überein.'

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2-81350?

Beispiel 3

3 mg Amastatin A. wird in 0,5 ml 0,1 η HCl aufgelöst und bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 1 Stunde stehengelassen. Die Konzentrierung der Lösung im Vakuum sowie das Abdampfen der überschüssigen Chlorwasserstoffsäure ergibt das Hydrochloridsalz von Amastatin A₁. Salze anderer Analoga werden nach der gleichen Methode erhalten. Diese Salze besitzen die folgenden Eigenschaften:

HCl A₁ : F. 165 - 170⁰C

IR-Spektrum 3400, 3270, 2950, 1710, 1660,

1640, 1540, 1470, 1390, 1285,

1230, 1180, 1090 (cm"¹)

809884/0592

■: : 28-1

^Ο·75

A₂ : :_T. 158-162⁰C

"■;■"■■■■■■_--MR TSpektrum.- 3300, 2950, 2600, 1725, 1660, - 1640, 1535, 1470, 1395, 1280,

1230, 1180, 1090,: 930 (cm"¹) ID^₀ : 0~6mcg/ml

:^Aj · F. 148-153'C \ ." '

IR-Spektrum 3250, 2930, 2600, 1710, 1650,

1635, 1530, 1465, I39O, 1220,

1113, 930 (cm"¹)
^ID50 l.lmcg/ml

^Bl VV-F."," 16O-165°C

IR.-Spektruiu _{34OOj 3}?₇O, 2950, I₇IO, I655,

1635, 1540, 1470, 1390, 1290,

1230, II70, 1070(CnT¹)

^ID50 1.8ucg/nil

B₂ : ; p. 145-15O°C

IR-Spektrum 3400, 3250, 2900, I720, I690,

1625, 1535, 1435, 1385, 1275,

1220, 1175, 1155, 1105, 1085,

1010, 985, 925, 790 (cm"¹) ^Ιΰ50 l.lmcg/ml

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Beispiel 4

22 mg Amastatin A2 werden in 10 ml Wasser aufgelöst. 0-,5 ml Acetylchlorid werden viermal in 10-minütigen Intervallen unter Rühren bei Zimmertemperatur und unter Aufrechterhaltung eines pH von 8,5 unter Einsatz von T η NaOH zugesetzt. Nach 2 Stunden wird der pH auf 2,0 unter Verwendung von konzentrierter HCl eingestellt, worauf die Mischung mit 20 ml Äthylacetat zweimal extrahiert wird. Die Konzentrierung der Eösungsmittelschicht im Vakuum ergibt 13 mg des Produkts.

F. : 160 - 164°C

ID₅₀ : 450 mcg/ml

Das IR- und das NMR-Spektrum bestätigen, daß das Produkt aus N-Acetylamastatin A2 besteht.

N-Acetylamastatine A-, A,, 3- und B^ werden nach der gleichen Methode erhalten.

Beispiel 5

30 mg Amastatin A- werden in 2 ml absolutem Methanol aufgelöst. Eine Mischung aus 1 ml Thionylchlorid und 2 ml absolutem Methanol wird unter Eiskühlung zugesetzt. Die Mischung wird unter Kühlung während einer Zeitspanne von 30 Minuten und dann bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Die Konzentrierung der Mischung im Vakuum ergibt 31 mg des Reaktionsproduktes .

F. : 148 - 153°C

ID₅₀ : 17 mcg/ml

Das IR- und das NMR-Spektrum bestätigen, daß das Produkt aus Amastatin-A„-dimethylester besteht.

Dimethylester von Amastatin A₃ und B~ werden nach der gleichen Methode erhalten. N-Acetylamastatine A„, A-. und B~ ergeben Dimethylester eines jeweiligen Analogons unter Anwendung der gleichen Methode.

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1 ■—~ T - 41 -

JjVJACHQERBGHTJ 2Β1350Ϊ

Monomethylester von Amastatin A. und B. werden ebenfalls nach der gleichen Methode erhalten.

Das feste Harz Amberlite XAD Ist ein makroretikulares vernetztes Polystyrolpolymeres (US-PS 3 531 463) . Derartige makroporöse nichtionische Adsorptionsharze weisen eine aromatische Grundstruktur mit einem durchschnittlichen Porendurchmesser von 4 - 20 im und vorzugsweise 7-10 nm auf. Insbesondere werden Polystyrolharze mit einer Oberfläche von 10Ώ bis 1000 m² pro Gramm eingesetzt, und zwar Styrol-Divinylbenzol-Copolyinere, die von der Rohm and Haas Company als Amberlite-XAD-Harze in den Handel gebracht werden.

Dowex 50 ist eine Polystyrolkernsulfonsäure.

"Sephadex LH-20" Ist ein lyophiles unlösliches Molekularslebchromatographlemittel, das durch Vernetzung von Dextran hergestellt und von der Firma Pharmacia, Uppsala, Schweden, in den Handel gebracht wird.

Sephadex LH-2U kann durch andere ähnliche Gelfiltratlonsmittel ersetzt werden, beispielsweise Sephadex G25 bis G200, Sepharose 4B und 6B (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) sowie Bio-Gel A .1,5 m (Bio Rad Co.). Bevorzugte Gelfiltratlonsmittel sind auch die carboxymethylsubstituierten vernetzten Dextrangele, die in den Spalten 3 und 4 der US-PS 3 81-9 336 beschrieben werden,

Döwex 1-X2{OK ) ist die basische Form oder Hydroxidform von Cholestyraminharz, wobei es in seiner Chloridform ein synthetisches stark basisches Anionaustauscherharz ist, das quaternäre funktioneile Ammoniumgruppen enthält, die mit einem Styrol/Divinylbsnzol-Copolymeren verknüpft sind. Hauptbestandteil: Polystyroltrlmethylbenzylammonium als Cl -Anion enthält ferner Diviny!benzol (ungefähr 2 %) und Wasser

typische Struktur der Hauptpolymergruppen

(ungefähr 43 %) . Vernetziingsgrad: 1 - 10 %. Teilchengröße: 50 - 100 mesh. Volumenproζentzunähme, neu bis erschöpft (Cl" bis OH~) = 20 %. Stabil bei Temperaturen bis zu 150⁰C. Kapazität: 3,5 müq/g trocken, 1,33 mÄq/ml feucht.

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Claims (1)

1. MÜLLER-BORE · DETJFEL · 3CBÖV -HJBRTiäL

   DR. WOUFGANG MÜLLER-BORfe (PATENTANWALTVON 1927-1975) DR. PAUU DEUFEU. DIPL.-CHEM. DR. AUFRED SCHÖN. DIPL.-CHEM. WERNER HERTEU. DIPU.-PHYS.

   S/Z 7-4

   Saidarihojin. Biseibutsu Kagaku Kenkyukai,

   14-23, Kamiosaki 3-chane, Shinagawa-ku,

   Tokyo / Japan

   Tetrapeptide

   Patentansprüche

   1. Tetrapeptide der Formel I

   X-Val-Val-Y (D

   worin

   X den S-Amino^-hydroxy-S-methylhexanoylrest oder den 3-Amino-2-hydroxy-4-methylhexanoylrest bedeutet,

   VaI für den L-Valylrest steht und

   Y L-Asparaginsäure- OC-amid, L-Asparaginsäure oder L-GIutaminsäure, wenn X für den 3-Amino-2-hydroxy-5-Eiethylhexanoylrest steht, und L-GIutaminsäure- Qf-amid oder L-Glutaminsäure bedeutet, wenn X den 3-Amino-2-hydroxy-4-iaethylhexanoylrest darstellt, und die Aminogruppe

   S StViTCIrEN SO · SIEBERTSTH. 4 · POSTFACH 800720 - KAUEI.: IIUEBOPAT · TEX. (039) 474005 · TEIEK 3-24233

   der Gruppe VaI, die X benachbart ist, mit der Carboxylgruppe von X unter Bildung einer Amidbindung acyliert ist, die Carboxylgruppe dieser Gruppe VaI die Aminogruppe der anderen Gruppe VaI unter Bildung einer Amidbindung acyliert und die Carboxylgruppe der anderen Gruppe VaI die Aminogruppe von Y unter Bildung einer Amidbindung acyliert,

   sowie nichttoxische, pharmazeutisch verträgliche Salze davon sowie N-acylierte Derivate davon.

   2. Tetrapeptide der Formel I

   X-Val-Val-Y (I)

   worin

   X den 3-Amino-2-hydroxy-5-methylhexanoylrest oder den 3-Amino-2-hydroxy-4-methylhexanoylrest bedeutet,

   VaI für den L-Valylrest steht und

   Y L-Asparaginsäure-CV-amid, L-Asparaginsäure oder L-Glutaminsäure, wenn X für den 3-Amino-2-hydroxy-5-methylhexanoylrest steht, und L-Glutaminsäure-Oc'-amid oder L-GIutaminsäure, wenn X für den 3-Amino-2-hydroxy-4-methylhexanoylrest steht, bedeutet und die Aminogruppe der Gruppe VaI, die X benachbart ist, mit der Carboxylgruppe von X unter Bildung einer Amidbindung acyliert ist, die Carboxylgruppe dieser Gruppe VaI die Aminogruppe der anderen Gruppe VaI unter Bildung einer Amidbindung acyliert und die Carboxylgruppe der anderen Gruppe VaI die Aminogruppe von Y unter Bildung einer Amidbindung acyliert.

   3. Nichttoxische, pharmazeutisch verträgliche Salze der Tetrapeptide gemäß Anspruch 2.

   - N-Acy!derivate der Tetrapeptide gemäß Anspruch 2.

   809884/05

   281350?

   5. N-Acety!derivate der Tetrapeptide gemäß Anspruch 2.

   6. S-Amino^-hydroxy-S-methylhexanoyl-L-valyl-L-valyl-L-asparaginsäure-Οί-amid gemäß Anspruch 2 der Formel

   H OH H Η" Η Il I I I

   - C - C - CONH - C - CONH - C - COM - C - CONH,

   COOH

   ι ι I I CH_ H CH CH I ² /\ /\ CH
   /V ■ ILC CH,
   3 3 HC CH H₃C CH -

   7. S-Amino-S-hydroxy-S-methylhexanoyl-L-valyl-L-valyl-L-asparaginsäure gemäß Anspruch 2 der Formel

   , H OH H H H

   Il I I I ■ \

   - C - C - CONH - C - CONH -C- CONH - C - COOH _t

   COOH

   11 I 1 CH CH 2 Λ Λ CH
   Λ HC CH H,C CH- 3 3

   8. 3-Amino-2-hydroxy-5-methylhexanoy1-L-valyl-L-valyl-L-glutaminsäure gemäß Anspruch 2 der Formel

   H OH H HH

   ir I « l

   C - C - COJiH - C - CONH - C- CONH - C - COOH

   CH'

   C CH

   ■ ι

   CH

   H₃C CE₃

   CH

   H₃C CE₃

   COOH

   9. 3-Amino-2-hydroxy-4—methylhexanoy1-L-valyl-L-valyl-L-glutaminsäure-Of-amid gemäß Anspruch 2 der Formel

   8 0 98 8A/0 592

   H OH • H H I I I I I CH C - C - COKH - C - CONH -Ο /\ I I Ι HC CH CH H CH i /\ _?2 • HC CH

   _ 4 „

   H-C- CONH₀ t *

   GH

   j *

   COOH

   0. S-Amino^-hydroxy^-methylhexanoyl-L-valyl-L-valyl-L-glutaminsäure gemäß Anspruch 2 der Formel

   H OH ■ H Η" Η

   ill I I

   HH -C-C- COIfH - C - CONH - C - CONH - C - COOH

   ²Il I ι ι

   H-.C - CH H CH CH CH₀

   ³I /\ /\ ι²

   CH_ H,C CH, H,C CH, CH- i

   I² ■ 3 3 3 3 I²I

   CH, . COOH j

   J i

   11. Verfahren zur Herstellung eines Tetrapeptide der Formel I

   X-Val-Val-Y (I)

   worin

   X den 3-Amino-2-hydroxy-5-methylhexanoylrest oder den 3-Amino-2-hydroxy-4-methylhexanoylrest bedeutet,

   VaI den L-Valylrest darstellt und

   Y L-Asparaginsäure-iY-amid, L-Asparaginsäure oder L-GIutaminsäure, wenn X für den 3-Amino-2-hydroxy-5-methylhexanoylrest steht, und L-Glutaminsäure-Cf-amid oder L-Glutaminsäure, wenn X für den 3-Amino-2-hydroxy-4-methylhexanoylrest steht, bedeutet, und die Aminogruppe der Gruppe VaI, die X benachbart ist, mit der Carboxylgruppe von X unter Bildung einer Amidbindung; acyliert ist, die Carboxylgruppe dieser Gruppe VaI die Aminogruppe der anderen Gruppe VaI unter Bildung einer

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   Amidbindung acyliert und die Carboxylgruppe der anderen Gruppe VaI die Aminogruppe von Y unter Bildung einer Amidbindung acyliert,

   dadurch gekennzeichnet, daß aerob ein Mikroorganismus, welcher diese Tetrapeptide zu erzeugen vermag und zu den genus Streptomyces gehört, in einem Medium, das zuirt Wachstum des Mikroorganismus zur Anreicherung des Tetrapeptids geeignet ist, gezüchtet wird und das auf diese Weise erzeugte Tetrapeptid gewonnen wird.

   12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus die identifizierenden Eigenschaften von ATCC 31318 besitzt.

   13. Zubereitung zur Erhöhung einer Antikörperbildung, gekennzeichnet durch eine wirksame Menge eines Tetrapeptids der Formel I

   X-Val-Val-Y (I)

   worin

   X den S-Amino^-hydroxy-S-methylhexanoylrest oder den 3-Amino-2—hydroxy-4-methylhexanoylrest bedeutet,

   VaI den L-VaIylrest darstellt und

   Y L-Asparaginsäure- Of-amid, L-Asparaginsäure oder L-Glutaminsäure, wenn X für den 3-Amino-2-hydroxy-5-methyl— hexanoylrest steht, und L-Glutaminsäure-Of-amid oder L-Glutaminsäure bedeutete wenn X für den 3-Amino-2-hydroxy-4-methylhexanoylrest steht, und die Aminogruppe der Gruppe VaI, die X benachbart ist, mit der Carboxylgruppe von X unter Bildung einer Amidbindung acyliert ist, die Carboxylgruppe dieser Gruppe VaI die Aminogruppe der anderen Gruppe VaI unter Bildung einer Amidbindung acyliert und die Carboxylgruppe der anderen Gruppe VaI die Aminogruppe von Y unter Bildung einer Amidbindung acyliert,

   sowie nichttoxischer, pharmazeutisch verträglicher Salze davon oder N-acylierter Derivate davon als Wirkstoff.

   B098 8 4/0 592

   14. Zubereitung zur Inhibierung einer Aminopeptidase A, gekennzeichnet durch Tetrapeptide der Formel I

   X-Val-Val-Y (I)

   worin

   X den 3-Amino-2-hydroxy~5-methylhexanoylrest oder den 3-Amino-2-hydroxy-4-methylhexanoylrest bedeutet,

   VaI den L-Valylrest darstellt und

   Y L-Asparaginsäure- Q(-amid, L-Asparaginsäure oder L-Glutaminsäure, wenn X für den 3-Amino-2-hydroxy-5-methylhexanolylrest steht, und L-Glutaminsäure-Oi -amid oder L-Glutaminsäure bedeutet, wenn X für den 3-Amino-2-hydroxy-4-methylhexanoylrest steht, und die Aminogruppe der Gruppe VaI, die X benachbart ist, mit der Carboxylgruppe von X unter Bildung einer Amidbindung acyliert ist, die Carboxylgruppe dieser Gruppe VaI die Aminogruppe der anderen Gruppe VaI unter Bildung einer Amidbindung acyliert und die Carboxylgruppe der anderen Gruppe VaI die Aminogruppe von Y unter Bildung einer Amidbindung acyliert,

   sowie nichttoxischer, pharmazeutisch verträglicher Salze davon oder N-acylierter Derivate davon als Wirkstoff.

   809884/0592