FI88053B - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbar peptidantibiotika och vid foerfarandet anvaendbar mikroorganism - Google Patents

Description

1 88053

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidian-tibioottien valmistamiseksi sekä menetelmässä käyttökelpoinen mikro-organismi 5 Tämä keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti

käyttökelpoisten yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on kaava I

CH,

T J OH H

10 CH-OH

R-CH=CH-CH=CH-CO-NH-CH-CO-NH-/ \_ (I) o I ώ CH3 15 jossa R on ryhmä CH3-(CH2)6-, CH3-(CH2)4-CH*CH-(CH2)2- tai CH3-(CH2)e-. Keksintö koskee myös uutta mikro-organismia, jota voidaan käyttää em. menetelmässä.

Monia mikro-organismeja on eristetty maanäytteistä, viljelty synteettisellä alustalla Ja todettu niiden tuot-20 tavan aineita, joilla on antibioottinen vaikutus. Nyt on eristetty uusi bakteerilaji K481-B101 läheltä Parthenonia Ateenassa, Kreikka, otetusta maanäytteestä Ja todettu sen tuottavan peptidlseosta, jolla on antibioottinen vaikutus.

Tämä keksinnön päätarkoituksena on siten tarjota - 25 uusia peptidiantibiootteja, jotka ovat erityisen käyttö kelpoisia sienten ja kasvainten vastaisina aineina.

Tämän keksinnön tarkoituksena on myös tarjota käytännöllisiä menetelmiä näiden antibioottien valmistamiseksi.

30 Lisäksi kuvataan farmaseuttisia valmisteita, jotka sisältävät noita antibiootteja.

Farmaseuttiset valmisteet sisältävät tietyn määrän em. yhdisteitä, jotka ovat sieniä ja/tai kasvaimia vastaan vaikuttavia aineita, yksittäin tai seoksena ja yhdistet-35 tyinä farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan.

2 88053

Keksinnön mukaiselle menetelmälle kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi on tunnusomaista, että Polyangium barchysporum-kanta K481-B101, ATCC 53080, viljellään käyttökelpoista hiilen- ja typenlähdettä sisältä-5 vässä ravintoalustassa aerobisissa olosuhteissa, tuotettu rihmasto erotetaan, fermentaatiossa muodostunut kaavan I mukaisten yhdisteiden seos otetaan talteen ravintoalustasta, ja yhdisteet erotetaan seoksesta.

Kuvioissa 1, 2 ja 3 esitetään Bu-2867T A:n, B:n ja 10 C:n IR-spektrit.

Kuvioissa 4 ja 5 esitetään Bu-2867T A:n 'H-NMR- ja 13C-NMR-spektrit.

K481-B101:n morfologiset, viljely- ja fysiologiset ominaisuudet määritettiin seuraavissa lähdejulkaisuissa 15 kuvattujen menetelmien mukaan:

McCurdy, Jr. H.D.: Studies on the Taxonomy of the Mvxobac- terales. II, Polyangium and the demise of the Sorangia-ceae. Inti. J. Syst. Bacteriol. 20 (1970) 283 - 296, Reichenbach, H.: Nannocystis exedens gen. nov., sp. nov., 20 a new myxobacterium of the family Sprangiaceae. Arch. Mik-robiol. 70 (1970) 119 - 138, Christensen, P. and F. D. Cook: Lysobacter, a new Genus of non-fruiting, gliding bacteria with a high base ratio. Inti. J. Syst. Bacteriol. 28 (1978) 367 - 393, Ja Christensen, P.: Synonymy of 25 Flavobacterium pectinovorum Dorey with Cytophaga johnsonae

Stanier. Inti. J. Syst. Bacteriol. 27 (1977) 122 - 132. Viljelmän ylläpito ja puhdistus suoritettiin menetelmillä, jotka ovat kuvanneet Peterson, J.E.: Isolation, cultivation and maintenance of the myxobacteria. Methods in Mic-- 30 robiology 3B, 185 - 210, 1969, toim. J. R. Norris & D.

W. Ribbons, Academic Press (London and New York) ja Reichenbach, H & M. Dworkin: The Order Mixobacterales♦ The Prokaryotes. Volume I: 328 - 355, 1981, toim. M. P. Starr et al. Springer-Verlag (Berlin, Heidelberg ja New " 35 York). Taksonominen luokitus määritettiin julkaisujen Ber- li 3 88053 gey's manual, 8. painos, 1974 ja The Prokaryotes, Voi. I mukaan.

Morfologia:

Kasitoni-Mg** -agarla, kitiiniagaria, hiivasoluaga-5 rla ja kanin lantapelletti-vesiagaria käytettiin morfologiseen tutkimukseen. K-481-B101 on gram-negatilvinen, silmätön bakteeri. Vegetatiiviset solut ovat sylinterimäisiä (0,6 - 0,8 x 2 - 10 mikrometriä), tylpän pyöreäpäisiä. Vegetatiiviset solut liikkuvat hitaasti ja liukuvasti agar-10 alustan kostealla pinnalla tai pehmeällä agaralustalla. Myksosporit eroavat selvästi vegetatiivisista soluista ja ovat soikion tai pallon muotoisia, 0,6 - 0,8 x 0,6 - 1,5 mikrometriä, ei valoa taittavia tai valoa taittavia ja silloin tällöin parittaisla. K481-B101 muodostaa useimmll-15 la deskriptiivisillä agaralustoilla kiinteitä sporangioita joiden sisällä on myksosporeja. Sporangiot ovat soikeita, pyöreitä tai tyynymäisiä melko vaihtelevan kokoisia, 12 x 20 - 80 x 120 mikrometriä, usein yhteisen kuoren tai limaisen kerroksen ympäröimiä, kaksoisreunaisia ja esiinty-20 vät yksinään tai klustereina (sorus). K481-B101:n morfologia on esitetty taulukossa 1.

Viljelyominaisuudet: K481-B101 kasvaa kohtuullisesti kasitoni-Mg~ -aga-rilla (McCurdy, 1969) ja hiivasoluagarilla (Christensen & .25 Cook, 1978), mutta heikosti Bacto-ravintoalustalla tai Bacto-sydäninfuusioagarilla. Rihmaista tai höytyväistä kasvustoa voidaan nähdä YP-pehmeällä agarilla (hiivauute 0,3 %, peptoni 0,1 %, NaCl 0,01 %, agar 0,3 %, pH 6,6 -6,8), mutta ei kasitoni-Mg” -agarilla. Pesäkkeet kasito-30 ni-Mg** -agarilla ovat pyöreitä, läpikuultavia ja vaalean vihertävän keltaisia ja syövyttävät tai tunkeutuvat heikosti agariin. Viljelyominaisuudet esitetään taulukossa 2.

Fysiologiset ominaisuudet: K481-B101 hydrolysoi tärkkelystä, kitiiniä, gela-35 tiinia ja kaseiinia, muttei selluloosaa tai agaria. Se 4 88053 hajottaa autoklavoituja hiivasoluja, muttei eläviä Micrococcus luteus-soluja. K481-B101 on mesofiilinen ja herkkä 2 %:lle NaCl. Fysiologiset ominaisuudet esitetään taulukossa 3.

5 Flagellaisten bakteerien samanaikainen kasvu ja spontaanin variantin esiintyminen:

Gram-negatiivisten, sauvamaisten, flagellaisten bakteerien samanaikaista kasvua havaittiin alkuperäisessä viljelmässä. K481-B101 puhdistui melko hyvin yhdistämällä 10 tavallisia laimennus- ja yksisolueristysmenetelmiä, soni-kointiin, lämpöshokkikäsittelyyn tai antibioottikäsitte-lyyn (esim. pipemidihappoa 50 pg/ml) käyttäen myksosporeja tai itiöemiä. Puhdistamattomassa K481-B101 -viljelmässä esiintyi limamaisia variantteja, jotka muodostivat val- 15 keahkon kupolimaisen yhdyskunnan, jossa on kasvustokehä. Näiden mukoidivarianttien vegetatiiviset solut ovat jonkin verran suurempia kuin lähtökanta ja olivat kooltaan 0,8 - 1,0 x 2,0 - 3,5 mikrometriä. Sporangiaklusterin (sorus) muodostavat pääasiassa mukoidivariantit.

20 Taksonominen luokitus: K481-B101 on maanäytteestä eristetty itiöemiä muodostava, liukuva bakteeri. Kannan tärkeimmät karakteristiset ominaisuudet ovat seuraavat:

Vegetatiiviset solut: 25 1) sylinterimäisiä, tasainen halkaisija 2) ei suippo päistä 3) tunkeutuvat agaralustoihin 4) ei adsorboi kongopunaa

Myksosporit: 30 1) eroavat vegetatiivisista soluista 2) soikion tai pallon muotoisia 3) ei valoa taittava tai valoa taittava

Sporangiot: 1) paikallaan pysyviä . 35 2) soikiomaisia, pallomaisia tai epäsäännöllisiä 5 88053 3) usein yhteisen kuoren tai limaisen kerroksen ympäröimiä 4) kaksolsääriviivallisia 5) vaaleankeltaisia (selkeä väri puuttuu) 5 6) esiintyvät yksin tai klustereina (sorus)

Viljely- Ja fysiologiset ominaisuudet: 1) pesäke kullankeltainen - vaikeahko 2) pesäkkeet syövyttävät ja tunkeutuvat heikosti agariin 10 3) hajottaa kitiiniä muttei selluloosaa 4) hajottaa hiivasoluja, muttei Micrococcus luteus- soluja K481-B101:n yllämainitut morfologiset, viljely- ja fysiologiset ominaisuudet osoittavat, että K481-B101 voi-15 daan luokitella Myxobacterales-lahkoon. Myxobacterales- lajien joukossa lajit Myxococcus, Archangium ja Cystobac-ter eroavat K481-B101:stä suippojen vegetatiivisten solu-jensa ja itiöemänsä morfologian osalta. Lajit Melittan-gium, Stigmatella ja Chondromyces eroavat K481-B101:stä 20 varrellisten sporangioidensa osalta.

K481-B101 muistuttaa lajeja Polyangium ja Nannocys-tis. K481-B101 muistuttaa lajia Nannocystis soikion tai pallon muotoisten myksosporien ja soikion tai pallon muotoisten yksinäisissä sporangioiden osalta, mutta eroaa . 25 jälkimmäisestä tasaläpimittaisten sylinterimäisten vegeta tiivisten solujensa sekä kyvyttömyyden syövyttää Ja tunkeutua agariin osalta. K401-B101 muistuttaa lajia Polyangium tylpän pyöreäpäisten sylinterimäisten vegetatiivisten solujensa, vallitsevan el valoa taittavien myksosporien 30 muodostumisen ja soikion tai pallon muotoisten, kaksols-ääriviivallisten sporangioidensa osalta. Perustuen vertailuun Myxobacterales-lajien kanssa K481-B101 katsotaan luokiteltavan suvun Polyangium lajiksi. Polyangium-lajeista P. luteum muistuttaa K481-B101:tä vegetatiivisten solujen 35 koon, sporangioiden värin ja muodon sekä vegetatiivisten 6 88053 pesäkkeen värin osalta. K481-B101 eroaa kuitenkin P. lu-teumista siinä, että sen myksosporit ovat soikion tai pallon muotoisia ja hyvin supistuneita ja siinä, että se ei hajota eläviä bakteerisoluja kuten Micrococcus luteus 5 -soluja.

Niinpä K481-B101 päätellään olevan uusi laji, joka kuuluu sukuun Polyangium, heimoon Polyangiaceae, lahkoon Myxobacterales, ja se ehdotetaan nimettäväksi Polyangium brachysporum sp., nov. Tyyppikanta on nro K481-B101 (sing-10 le isolate) ja viljelmä on talletettu talletuslaitokseen

American Type Culture Collection talletusnumerolla ATCC 53080.

I; 7 88053

Taulukko 1. K481-B101:n morfologia

Vegetatiiviset solut :Gram-negatiivisia. Sylinterimäi- siä, päät tylpät, pyöristyneet, 5 (0,6 - 0,8 x 2,0 - 10 mikromet riä). Ei adsorboi kongopunaa.

Myksosporit :Eroavat vegetatiivisista soluis ta. Paljon kutistuneet, tulevat soikion tai pallon muotoisiksi, 0,6 -10 0,8 x 0,6 - 1,5 mikrometriä, ei valoa taittavia. Pitempi inkubaa-tio tuottaa valoa taittavia soluja.

Sporangiot :paikallaan pysyviä, esiintyvät yk- 15 sin tai klustereina. Soikion, pal lon tai tyynyn muotoisia tai muodottomia. Sangen vaihtelevan kokoisia, 12 x 20 - 80 x 120 mikro-metriä. Yhteisen kuoren tai lima-20 kerroksen ympäröimiä. Kaksois- ääriviivallisia. Esiintyvät agarln sisällä. 2-10 tai useamman spor-anglon muodostamat klusterit vaih-.. . televat 50 Ja 300 mikrometrin vä- 25 Iillä kokonaismassakooltaan.

Mikropesäke :Kitiiniagarilla 2 viikon inkubaa- tion jälkeen. Vegetatiivisten so-luketjujen pylväs- tai siksakjär-jestys reunoilla. Yksittäisten 30 solujen liukuvaa liikettä havait tavissa, mutta solumassan liikettä ei näy.

8 88053

Taulukko 2. K481-B101-pesäkkeen viljelyominaisuudet ka-sitoni-Mg++ -agarilla (McCurdy, 1969) 28 °C, 6 vrk.

Muoto :pyöreä 5 Pinta :sileä, myöhemmin osittain ryppyinen

Korkeus :koholla

Reuna :kokonaan tai jonkin verran epäsäännöllinen, selvät ulok- 10 keet, kuten kielen, höyhenen tai juuren muotoiset, puuttuvat

Optiset ominaisuudet :läpikuultava tai läpinäkymätön

Pesäkkeen väri :vaalean vihertävänkeltäinen

Diffundoituva pigmentti :ei ole 15 Kasvu kitiiniagarilla 28 °C, 3 viikkoa.

Ohut, läpikuultava, vaaleankeltainen tai väritön. Paksu, läpinäkymätön ja kellertävänvalkoinen reunoilta. Sporangioita muodostuu konsentrisesti reunoilla. Syövyttää tai tunkeutuu heikosti agariln.

20

Taulukko 3. K481-B101:n fysiologiset ominaisuudet

Hydrolyysi

Liukoinen tärkkelys + .. . Perunatärkkelys + • 25 CMC-natrium +

Selluloosa

Agar

Kitiini +

Alginaattinatrium : : 30 Polypektaattinatrium

Gelatiini +

Kaseiini +

II

β 88053

Kasvu

Simon's sitraattiagar Christensen sitraattiagar Glukoosi-ammoniumsuola-agar 5 Asparagiini-ammoniumsuola-agar +

Tuotanto

Indoli H2s

Asetoiini (VP-reaktio) 10 Ureaasi +

Oksidaasi +

Katalaasi +

Lyyttinen toiminta Elävä Micrococcus luteus kanta 15 PCI 1001 & ATCC 9341 -solu

Autoklavoitu hiivasolu +

Reaktiot

Maidon koagulointi : -

Maidon peptonlsointi : + 20 NaCl-sieto : Kasvu: 1,0 % NaCl tai alle Ei kasvua: 2,0 % NaCl tai yli pH-sieto : Kasvurajat: pH 5,5 -

10,5 Heikkoa kasvua: pH

25 5,0 Ei kasvua: pH 4,5 ja 11,5

Kasvulämpötila : Maksimlkasvu: 37 °C

Kasvurajat: 15 °C - 42 °C Ei kasvua: 10 °C ja 45 °C 30 Hapetus - käyminen : Hapetus (Hugh ja Leifson -alusta)

Antibioottituotanto:

Polyangium brachysporum -kantavlljelmää lisättiin 28 °C 3 vrk vinopinnalla, jossa oli 0,5 % liukoista tärkke-35 lystä, 0,5 % glukoosia, 0,1 % lihauutetta, 0,1 % hiiva- 10 38053 uutetta, 0,2 % Nz-case, 0,2 % NaCl, 0,1 % CaC03 ja 1,6 % agarla (pH 7,0). Hyvin kasvanut vinopinta käytettiin ymppäämään kasvatusalusta, joka sisälsi 2 % malssitärkkelys-tä, 3 % soijajauhoa, 0,3 % MgS04.7H20 ja 1 % CaC03 (pH 7,0 5 ennen sterilointia). Inkuboinnin jälkeen 28 °C 3 vrk pyörivässä ravistelijassa (250 kierrosta/min), 5 ml kasvustosta siirrettiin 500 ml erlenmeyer-pulloon, joka sisälsi 100 ml tuotantoalustaa, jonka koostumus oli sama kuin kasvatus-alustan.

10 Antibioottituotantoa tarkkailtiin paperiliuska- agardiffuusiomenetelmällä käyttäen Candida albicans A9540 testiorganismina. Fermentointia jatkettiin 4 vuorokautta 28 °C:ssa pyörivässä ravistelijassa ja antibioottituotanto saavutti maksimin 100 yg/ml.

15 Fermentaatio suoritettiin myös sekoitusastiafer- menttorissa. 500 ml annos pullofermentoinnista saatua sie-menviljelmää käytettiin ymppäämään 10 litraa tuotantoalustaa 20 litran astiassa. Fermentointi suoritettiin 28 °C:ssa sekoittaen 250 kierrosta/min ja ilmastaen 10 1/min. Anti-20 bioottituotanto saavutti maksimin 150 pg/ml neljänkymmenen tunnin fermentoinnin jälkeen.

Antibiootin eristys ja puhdistus:

Fermentointiliemi (48 1) sentrifugoitiin sharpless-... sentrifugin avulla. Rihmastokakku homogenoitiin 7 Iraan ; 25 metanolia ja seosta sekoitettiin yksi tunti. Kun kiinteät aineet oli poistettu suodattamalla, metanoliuute haihdutettiin vesipitoiseksi liuokseksi, joka yhdistettiin lie-misuodokseen ja uutettiin n-butanolilla (24 1). Uute konsentroitiin 0,5 l:ksi, joka kaadettiin n-heksaaniin 30 (3,5 1) sekoittaen raa'an antibiootin (41 g) saostamisek- si. Tämä kiinteä aine kromatografoitiin silikageelikolon-nilla C-200 (760 ml) eluoiden etyyliasetaatilla ja lisääntyvällä määrällä metanolia (0 - 50 %). Eluoitu bioaktiivi-suus havaittiin paperiliuskamittausmenetelmällä käyttäen 35 Candida albicansia A9540 testiorganismina. Aktiiviset i n 88053 fraktiot yndistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin vaaleankeltaista jauhemaista (13 g) BU-2867T-kompleksia. 200 mg annos tätä kiinteää ainetta kromatografoitiin kään-teisfaasikolonnissa (C18, 100 ml) käyttäen etanolin ja ve-5 den seosta (3:7 - 5:5) eluointiin. Eluaattia tarkkailtiin anti-sieni-biologisella mittausmenetelmällä ja TLC:llä (silanoitu, Et0H:H20-55:45). Ensimmäiset aktiiviset fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin alipaineessa, jolloin saatiin puhdasta valkoista kiinteää BU-2867T A:ta (61 mg), 10 joka kiteytettiin vesipitoisesta metanolista värittömiksi neuloiksi (34 mg). Toisen ja kolmannen aktiivisen fraktion haihdutus tuotti BU-2867T B:tä (1 mg) ja C:tä (11 mg). BU-2867T C kiteytettiin metanolista ohuina neuloina. Ylläkuvatun käänteisfaasikromatografian toistaminen 15 tuotti kaikkiaan 3,9 g BU-2867T A, 44 mg BU-2867T B ja 342 mg BU-2867T C.

Antibiootin kuvaus: BU-2867T A ja C eristettiin värittöminä neuloina, kun taas BU-2867T B saatiin valkoisena amorfisena jauhee-20 na. Ne liukenevat helposti metanoliin, etanoliin, n-buta-noliin ja dimetyylisulfoksidiin, hiukan kloroformiin, ase-tonitriiliin ja etyyliasetaattiin ja ovat käytännöllisesti katsoen liukenemattomia n-heksaaniin ja veteen. Ne olivat . . positiivisia Rydon-Smith-reagenssin suhteen ja värjäytyi- 25 vät ruiskutettaessa jodia tai rikkihappoa TLC-levylle. Ne olivat negatiivisia ninhydriini-, Sakaguchi-, antroni- ja Dragendorff-reaktioiden suhteen. BU-2867T A:sta, B:stä Ja C:stä analysoitiin C27H44N406, C29H46N406 ja C29H4eN406 vastaavasti, massaspektrometrisesti ja mikroanalyyttisesti. Kol-30 men komponentin UV-spektrit metanolissa osoittivat yhden maksimin 261 nm:ssä, joka el siirtynyt happamessa tai emäksisessä liuoksessa. BU-2867T A:n, B:n ja C:n fysikoke-mialliset tiedot on esitetty yhteenvetona taulukossa 4. Niiden IR-spektrit KBr:ssä (kuviot 1, 2 ja 3) osoittivat 35 vahvoja amidivyöhykkeitä noin 1630 Ja 1540 cm*1 ja OH- i2 88053 ja/tai NH-absorptiota 3300 cm"1. BU-2867T A:n ^-NMR-spekt-ri (kuvio 4) osoitti kuuden olefiinisen protonin (6:6,16, 6,20 (2H), 6,28, 6,49 ja 7,09 ppm) ja neljän amidiprotonin (6:7,49, 7,82, 7,87 ja 8,72 ppm) läsnäolon. Spektrissä ha-5 valttiin myös kaksi metyyliryhmää (6:0,93 ppm, t ja 1,07 ppm, d). BU-2867T A:n 13C-NMR-spektrissä (kuvio 5) näkyi yli 23 hllllslgnaalia, sisältäen neljä karbonyylihiiltä, kuusi oleflinihiiltä ja kolme metyylihiiltä. BU-2867T B:n ja C:n 13C-NMR-spektrit olivat hyvin samanlaisia kuin 10 BU-2867T A:n, lukuunottamatta BU-2867T B:n kahta lisäole- fiinihiiltä ja BU-2867T C:n kahta lisämetyleenihiiltä BU-2867T A:hän verrattuna.

BU-2867T A:ta kuumennettiin palautusjäähdyttäen 6N HCl:ssä 16 tuntia. Lipofiilisen tuotteen (V) poiston jäl-15 keen etyyliasetaattiuutolla hydrolysaatti konsentroitiin öljymäiseksi jäännökseksi, joka kromatografoitiin Dowex 50W x 4 ionin vaihtohartsllla kehittäen pyridiinl-muurahaishappo -etikkahappopuskurilla (0,1 - 0,2 M, pH 3,1 -5,1). Tarkkaillen ninhydriinireagenssilla neljä järjestyk-20 sessä eluoitua aminohappoa l. II, III ja IV eristettiin ja kiteytettiin vetyklorideina. Aminohappo I [a]25 *C: -12,7° 5N HCl:ssä) tunnistettiin L-treoniiniksi fysikokemiallis-ten ominaisuuksiensa perusteella. Aminohapon II ^-NMR-spektri ja EI-MS (M* : m/z 134) osoitti, että se oli 4-ami-• 25 no-3-hydroksi-n-valeriaanahapon diastereoisomeerien seos,

Konishi, M.; K. Saito, K. Numata, T. Tsuno, K. Asama, H. Tsukiura, T. Naito & H. Kawaguchi : Tallysomycin, a new antibiotic complex related to bleomycin. II. Structure determination of tallysomycins A and B. J. Antibiotics - 30 30 (1977) 789 -805, ja sen identiteetti varmistettiin suo ralla vertailulla autenttiseen näytteeseen. III:n molekyyli kaavaksi saatiin C5H9N02 alkuaineanalyysillä ja EI-mas-saspektrometrialla (M* : m/z 115). Sen 1H-NMR osoitti siinä olevan yksi metyyli (6:1,50 ppm, d, J:6,0 Hz), yksi metii-35 ni (6:4,0 - 4,2, m) ja kaksi trans-olefiiniprotonia li 13 88053 (6:6,05 ppm, d, J:15,0 Hz ja 6,57 ppm, d-d, J:6,0 ja 15,0 Hz). Nämä spektritiedot osoittivat selvästi lii:n olevan 4-amino-2-(E)-penteenlhappo, Honore', T.; H. Hjeds, P. Krogsgaard-Larsen & T. R. Christiansen: Synthesis and 5 Structure-Activity Studies of Analogs of γ-aminobutyric Acid (GABA). Eur. J. Med. Chem. 13 (1978) 429 - 434. Ill on 2(S)-konfiguraatiossa perustuen sen spesifiseen rotaatioon ([a]D22*5:-6β 5N HClrssä. Aminohapon IV pääteltiin olevan 4-hydroksilysiini perustuen sen alkuaineanalyysiin 10 (C6H14N203), EI-MS (M + 1 : m/z 163) ja ^-NMR-spektriin (6:1,8 - 2,1 ppm 4H, m, 3,18 ppm, 2H, t ja 3,6 - 4,3 ppm, 2H, m) Ja γ-laktoniyhdisteen (UC«0: 1770 cm-1) muodostumiseen käsiteltäessä 6N HCl:llä. Izumiya, N.; Y. Fujita, F. Irreverre & B. Witkop: The Synthesis of Erythro-γ-hydroxy-15 L-lysine and its Nonoccurence in Collagen, Biochemistry 4 (1965) 2501 - 2506, raportoi 4-hydroksilysiinien mutaro-taatiosta ja IV:lie havaittu siirtymä osoitti erytro-L-konflguraatiota. Niinpä aminohapon IV rakenteen todettiin olevan erytro-4-hydroksi-L-lysiini.

20 LipofHiistä hapanta fraktiota (V), joka saatiin yllämainitussa happohydrolyysissä, käsiteltiin diatsome-taanilla, jolloin saatiin öljymäinen metyyliesteri (VI) kromatografisen puhdistuksen jälkeen. Sen UV (AMeOH: max 25 260 nm, t :22000) EI-MS (M* : m/z 210) ja ^-NMR (neljä -CH-, yksi C-CH3 ja kuusi -CH2-) osoittivat, että VI oli metyyli-2,4-dodekadienoaatti. Kytkentävakion suuruus osoitti selvästi, että molemmilla kaksoissidoksilla oli trans-geometria. Alkuperäinen happo V oli siten 2(E), 30 4(E)-dodekadienohappo, Burden, R. S. S L. Crombie: Amides of Vegetable Origin, Part XII. A new series of alka-2,4- dienoic tyramine-amides from Anacyclus pyrethrum D.C.

(Compositae), J. Chem. Soc. (C) (1969), 2477 - 2481.

I :L-treoniini CH0-CH-CH-COOH

3 I I

35 OH NH2 i4 88053

II :4-amino-3-hydroksi-n-vale- CH„-CH-CH-CH„-COOH

3 I I 2

riaanahappo NH2OH

III :4(S)-amino-2(E)-penteeni- CH«-CH-CH=CH-COOH

J I

happo NH2 5 IV ;ERYTRO-4-hydroksi-L-ly- NH2-CH2-CH2-CH-CH2~CH-COOH siini OH NH2

V : 2(E),4(E)-dodekadieno- CH3»(CH2)6-CH»CH-CH=CH-COOH

happo 10 BU-2867T A:n molekyylikaava on C27H44N406 ja sen 13C-NMR:ssä oli kuusi olefiinihiiltä ja neljä amidihiiltä. Sen vuoksi on selvää, että aminohappo II oli tuote joka syntyi luonnollisen aminohapon III hydratoituessa happo-hydrolyysin aikana. Antibiootin pitäisi olla syklinen pep-15 tidi, koska se oli negatiivinen ninhydriinireaktion suhteen eikä osoittanut mitään titrattavaa ryhmää potentio-metrisessa titrauksessa. Tätä tuki myös se, että BU-2867T A:sta syntyi di-O-asetyylijohdannainen (EI-MS: M* - m/z 604, XH-NMR: 2,02 ppm, 3 H ja 2,08 ppm, 3H) asetyloitaessa 20 pyridiinissä. Asetaatin MS osoitti myöskin vahvoja fragmentti-ioneja m/z 179:ssä ja 322:ssa, jotka viittasivat V-»I-»-sekvenssin läsnäoloon antibiootissa.

BU-2867T A:lie suoritettiin entsymaattinen hajotus fisiinillä 0,01M fosfaattipuskurissa (pH 7,0). Kun reak-25 tioseos oli tehty happamaksi arvoon pH 2,2 se uutettiin n-butanolilla, jotta saatiin hapan yhdiste (VII). Seuraava vesiliuoksen uutto pH:ssa 10,0 n-butanolllla tuotti nin-hydriinipositiivisen aineen (VIII). Yhdisteen (VII) osoitettiin olevan 2,4-dodekadienyyli-treoniini (V-*I) IR 30 (uc=0: 1720 & 1650 cm’1), EI-MS (M+ -H20: m/z 279 ja M* -

Thr: m/z 179) ja 1H-NMR -spektrillä. Rakennetta selvitti lisäksi se, että VII tuotti I ja V hydrolysoitaessa 6N HClrssä. Palautusjäähdytettäessä 6N HCl:ssä yhdiste VIII tuotti aminohappoja II, III ja IV, minkä osoitti TLC.

35 VIII:n EI-MS:ssa molekyyli-ioni löydettiin m/z 241:ssä, is 88053 mikä viittaa sykliseen peptidirakenteeseen. 1H-NMR (270 MHz, DMSO-d6:ssa) paljasti kaksi amidi-NH-protonia 7,43 ppm:ssä (tripletti) ja 9,10 ppm:ssä (laaja), mikä sopii yllämainittuun sykliseen rakenteeseen. Laaja irrotuskoe 5 osoitti että III:n aminoryhmä ja IV:n ε-aminoryhmä olivat kytkeytyneet karbonyyleihin muodostaen amideja, kun taas IV:n α-aminoryhmä oli vapaa. Siten VII:n ja Vlll:n rakenteeksi saatiin allaoleva: CH« i 3

10 CHOH

vii ch3-(ch2)6-chIch-ch£ch-co-nh-ch-cooh 15 VI11 ΝΗ2"^τνφ^ o CH3

20 Yhdisteitä VII ja VIII saatiin myös kun BU-2867T

A: lie suoritettiin entsymaattinen hajotus tai hydrolyysi papaiinilla tai kymopapaiinilla. BU-2867T A:n (4 g) ja papaiinin (Sigma P-3375, 50 g) seos 20 l:ssa 10 % vesipitoisessa metanolissa sekoitettiin 28 °C:ssa 22 tuntia. Seos 25 tehtiin happameksl pH-arvoon 3,3 etikkahapolla ja uutettiin etyyliasetaatilla (10 1). Uutteen haihdutus tuotti öljyä (6,3 g), joka kromatografoitiin silikageelillä (Wakogel C-200, 250 ml) CH2Cl2:n ja metanolin seoksella (9:1), jolloin saatiin puolittain puhdas, öljymäinen yh- 30 diste VII (3,3 g), öljyn lisäkromatografia Sephadex LH-20:llä ja sitä seurannut kiteytys tuotti värittömiä neuloja puhdasta VII:ä. 1,15 g (saanto 50 %). Sulamispiste 90 - 91 °C. [a]p7 + 17,4° (C 0,5, MeOH), Analyysi, laskettu C16H27N04.H20 varten: 35 C 60,93, H, 9,27, N, 4,44. Löydetty: C 61,34, H, 9,03, ie 88053 N 4,20. EI-MS: m/z 279 (M’-HjO). UV λΜβΟΗ nm (ε): 260 max (28,000). IR umax (KBr) cm-1 : 3520, 3410, 3300, 1720, 5 1690, 1655, 1630, etc. 1H-NMR (80 MH,, DMS0-d6) δ 0,88 (3H, t), 106 (3H, d), 6,20 (3H, m), 7,00 (1H, m), 7,84 (1H, d, NH), jne.

Etyyllasetaattiuuton jälkeen hapan vesiliuos konsentroitiin kuiviin. Jäännös (36 g) liuotettiin 50 ml:aan 10 vettä, pH säädettiin 9,0:ksi ja liuos pantiin käänteisfaa-si-piikolonniin (C18, Merck, 1,6 1), joka kehitettiin vedellä. Yhdistettä VIII sisältävät fraktiot yhdistettiin ja konsentroitiin in vacuo. Jäännös kromatografoltiin Sepha-dex LH-20:llä (250 ml) 50 % vesipitoisella metanolilla ja 15 sitten käänteisfaasi-piillä (C18) happamalla vedellä (pH 3,0 HC1), mikä tuotti puhdasta VIII-vetykloridia.

747 mg (saanto 35 %). Sp. 190 °C (hajoaa) [a] jj6 -113° (c 0,5, H20). EI-MS: m/z 241 (M*). UV: loppuabsorptio. IR,l-« (KBr) cm1: 3400, 1660, 1620, 1530, jne. *H-NMR 20 (80 MH,, DMS0-d6) 6 1,27 (3H, d), 1,4 - 1,8 (4H), 2,98 (2H, m), 4,52 (1H, m), 6,19 (1H, d), 6,45 (1H, d-d), 7,43 (1H, t, NH), 9,46 (1H, d, NH). Analyysi: Laskettu CiiH9N303·HC1 ·HjO:lie: C 44,67, H 7,50, N 14,21, Cl 11,99. Löydetty C 45,04, H 7,82, N 13,81, Cl 12,55.

25 Koska BU-2867T A oli negatiivinen ninhydriinille eikä siinä ollut titrattavaa ryhmää, sen rakenne oli loogisesti se joka syntyy, kun VII ja VIII yhdistetään pepti-disidoksella.

Kuumennettaessa 6N HCl:n kanssa sekä BU-2867T B 30 että C tuottivat saman aminohappokompleksin, joka saatiin BU-2867T A:sta. Näiden kahden antibiootin rasvahappo-osat uutettiin hydrolysaatista, käsiteltiin diatsometaanilla ja eristettiin metyyliestereinä IX (BU-2867T B:stä) ja X (BU-2867T C:stä). Ne säilyttivät kanta-antibiooteilleen ..35 havaitun tyypillisen UV-maksimin (AMeOH: 260 nm). IX:n max I.

17 88053 EI-MS tuotti molekyyli-ionin m/z 236:ssa, mikä viittaa C14-happoesteriin, jossa on kolme kaksoissidosta. UV- ja ^-NMR-spektrit osoittivat selvästi 2(E),4(E)-dienohappo-rakenteen ja IX:stä eristettävän kolmannen kaksoissidok-5 sen.

IX:n otsonolyysi, jota seurasi otsonidin pelkistävä hajotus, tuotti n-heksanaalia, joka eristettiin ja tunnistettiin 2,4-dinitrofenyyli-hydratsoniksi (EI-MS M* : m/z 280). Nämä todisteet varmistivat, että IX oli metyyli-10 2(E),4(E),8-tetradekatrienoaatti. Esterin X (EI-MS; M* m/z 238) molekyylipainon todettiin olevan 28 yksikköä (C2H4) korkeampi kuin VI:n, mikä kuvaa BU-2867T A:n ja C:n välillä havaittua molekyylikaavan eroa. Tämä, yhdistettynä lH-NMR- ja UV-tietoihin, paljasti X:n olevan metyyli-15 2(E),4(E)-tetradekadienoaatti. Yllämainittujen kokeiden tulokset viittasivat BU-2867T A:n, B:n ja C:n seuraavanlaisiin rakenteisiin: ?H3

CH-OH 9H . H

20 e e I

R-CH=CH-CH=CH-CO-NH-CH-CO-NH< >=0

Vr'T

0 ch3 25 BU-2867T A : R = CH3-(CH2)6_ BU-2867T B : R = CH3-(CH2)4-CH«CH-(CH2)2_ BU-2867T C : R = CH3-(CH2)e_ V 30 is 88053

(O

n pH VO

0 ™ Ή

rH V

ι-ι o o 1 3 3 r i ™ Ή + ^ ,, «ro U co σν 2 © ^-S 'H o VO * k — o ^ ε if ° O oo oo o -VT n

Jc ;o Γ: 3 ^ a; a: oo n n Γ- m <N O 2 * * Φ 10 J£+j H oo co oo in m o' ,-ι

“ •H I 1 J* «* -» -- H

V l-l _ X - V

JL .£ £ σν n n ,h

2 tl? t- (N vo VO VO

+J CQi>fS UCJU M

<D

tn

Zi r» m

^ m O r- fN

^2 ® «N » ^ Ό X K «λ σ* ’ä 3 n» Z 2 E e0 \ v * 0) -n f-· (—I (H + —.

X _ W · vo o S o O ®C° vok^wq * p- qj I? , °22 o ι-t n rH £ p-1 o «r K S VO TT cv M £.5^7 2 - T T, CO ^ s, mn.T vo rH cv in <n o n- £ ; S· 1 1 ; ►. · -

Il I tN σν O O rH

G 3 flj ίΉ CMVOVO VO

" ta>(N uuu ph nj r-

C

n 00 J· m C .μ (0 ». r»

••O) -n _ - TT

< Ό O O rH

3 rH CN Z o

En 3 3 K rH

I- tn (D ™ * 2 ... s - c „ > s »? _ _

: V H < ^ 0” 5 " +* “ “V IT

:·. D 6 * S 3 * °, = s “ °

CQ O Cr ,0 P» rH z T T o in o VO

VO4J rH TT PS) o PH m ·· OOpll TJ· (N Cv in T— ...:^ 7 -h S3 vv

1 SH 2 Γ> rH O rH

- - - o StllU10 PN VO VO VO

: x, mi^PH υυα m : : ’: 3

- - - H

- - 3 : : : <d - · EH ~ K o

O VW K

: £ > « ’· ’" in N ~ »m 1/1 h ^ in rH m ::: a> o « 3 ^ ' ·· 4J V rj ·· Q. m . t" «f* 4-i m CS vo «υ>ι n e -h m —

..... ·Ή — I—I \ e o —' .O

oa (03 >1 E e ”2

+> m C 4-) 4-1 (OOOO

..... O -H (0-P 44 S3 _i PM tn PH

3 ε - O 0) Φ CO ox □ S o S3 ε td / ΡΛί Ό s .2 2 « i mi

.· * O H q Λί tn >1 T SE X "XX

: -h 3 „Q h to » h ^ ;· o u o o

o«.asj j«> a s S3S

:...: D H S3 I; ie 88053

BU-2867T:n entsymaattinen hajotus Pseudomonas-asy-laasilla tuotti erilaisia tuotteita kuin ylläkuvattu hyd-rolyysi fisiinillä tai papaiinilla. Pseudomonas-kantaa Pa-129 fermentoitiin 10 l:ssa alustaa, joka sisälsi 2 % 5 liukoista tärkkelystä, 0,2 % glukoosia, 3 % soijajauhoa, 1 % CaC03 ja 0,3 % MgS04*7H20 37 °C:ssa 3 vrk ja solut kerättiin sentrifugoimalla. Kun solut oli pesty suolaliuoksella (1 1) kahdesti, ne suspendoitiin 0,75 l:aan suolaliuosta. Solususpensio sekoitettiin ennalta autoklavoituun natrium-10 alginaatin (75 g) ja CM-selluloosan (75 g) suspensioon (1,5 1) ja seos kaadettiin 30 litraan 0,1 M CaCl2-liuosta sekoittaen. Soluihin jäänyt geeli jäykistettiin sekoittamalla 25 %:ssa glutaraldehydiliuoksessa ja pakattiin kolonniin (4,0 x 175 cm). BU-2867T A (1,5 g) -liuos 20 % 15 vesipitoisessa metanolissa (30 1) johdettiin kolonnin läpi virtausnopeudella 0,4 - 0,8 1/h. Yhdistetty effluentti Johdettiin sitten Amberlite IRC-50-(70 % NH4+ -muoto, pH

6,7, 300 ml) ja HP-20 -kolonnin (300 ml) läpi peräkkäin. IRC-50 -kolonni pestiin vedellä ja kehitettiin 1,5 N 20 NH40H:lla. Ninhydriinipositiiviset fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin vaaleankeltaista kiinteää ainetta (800 mg), joka ladattiin kään-teisfaasipiikolonnille (C18, 250 ml). Kolonni kehitettiin vedellä keskipaineessa ja ninhydriinipositiiviset eluaatit 25 yhdistettiin, konsentroitiin, jolloin saatiin valkoista kiinteää L-treonyylisyklistä amiinia (XI, 612 mg). Saanto 62 %, sulamispiste 170 °C, [a]” -157° (c 0,5, H20). EI-MS: m/z 342 (M+). UV: loppuadsorptio. IR (KBr) cm-1: 3350, 3280, 1650, 1620, 1530 jne. 1H-NMR (80 MHt, DMS0-d6) 6 1,05 30 (3H, d), 1,21 (3H, d), 1,4 - 2,2 (4H), 4,35 (2H, m), 4,47 (1H, m, OH), 4,62 (1H, d, OH), 6,16 (1H, d), 6,42 (1H, d-d), 7,36 (1H, t, NH), 7,97 (1H, d, NH), 8,62 (1H, d, NH).

20 8 805 3 OH f XI : CH,-CH-CH-CO-NH-c''sJ/ \__

rh'Y

H CH, 5 3

Yllä saatu HP-20 -kolonni kehitettiin vedellä (1 1) ja sitten 0,1 N NaOH:n ja metanolin seoksella (1:2). 2,4- dodekadienohappoa (V) sisältävät fraktiot yhdistettiin,

10 konsentroitiin 300 ml:ksi ja tehtiin happamaksi arvoon pH

2,0. Tämä liuos uutettiin etyyliasetaatilla (300 ml) ja n- butanolilla (100 ml). Etyyliasetaattiuutteen haihdutus tuotti öljymäisen jäännöksen, joka kromatografoitiin

Sephadex LH-20 -kolonnilla (800 ml). Eluoitiin metanolilla 15 ja tarkkailtiin eluaatteja UV-absorptiolla 260 nm:ssä, minkä jälkeen halutut eluaatit konsentroitiin, jolloin saatiin värittömiä levyjä puhdasta V:tä (259 mg). Saanto 53 %. Sulamispiste 48 - 49 °C. UV XMeOH nm (ε ) : 258 max 20 (24,000). IR n.., (KBr) cm'1 : 1680, 1630, 1605, 1410, 1300 etc. 1H-NMR (80 MHz, CD30D) 6 0,89 (3H, t), 2,0 (10H), 2,12 (2H, m), 5,75 (1H, d), 6,16 (2H, m), 7,21 (1H, m). Tämä yhdiste oli identtinen BU-2867T A:n happohydrolysoinnista saadun 2,4-dodekadienohapon kanssa. N-butanoliuute kon-- 25 sentroitiin in vacuo ja lyofilisoitiin lähtöaineen, BU-2867T A:n (160 mg, 11 %) talteenottamiseksi.

Ylläolevasta kuvauksesta selviää, että yhdisteet VIII Ja XI ovat arvokkaita välituotteita tämän keksinnön eri antibioottiyhdisteiden tuottamisessa. Tavanomainen 30 asylaatio esimerkiksi karboksyylihapon ja alkyylihappokar-bonaatin (H0C00R) seoksella muodostaa tarvittavan peptidi-sidoksen, Advanced Organic Chemistry, Fieser & Fieser, s. 1039 - 1046, Reinhold Publishing Corporation, New York, 1965. Hydroksyyliryhmät voidaan suojata millä tahansa ta-35 vanoraaisella tavalla, kuten tetrahydropyranyylillä tai t-butyylieettereillä. VIII:n amiiniryhmän asylaatio hapoilla ti 2i 88053 CH3-(CH2)6-CH«CH-CH-CH-CO-NH-CH-CHOH-CH3

COOH

CH3-(CH2)4-CH»CH-(CH2)2-CH=CH-CH«CH-CO-NH-CH-CHOH-CH3 5 COOH

ja CH3-(CH2)8-CH=CH-CH=CH=CO-NH-CH-CHOH-CH3

COOH

10 tuottaa BU-2867T A:ta, B:tä ja C:tä. Esimerkiksi BU-2867T A:ta tuotetaan yhdistämällä VII ja VIII. Seosta, jossa oli VII (15 mg), N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidiä (10 mg) ja i-hydroksi-1,2,3-bentsotriatsolia (8 mg) 2 ml:ssa dimetyy-liformamldia, sekoitettiin kaksi tuntia huoneenlämmössä. 15 Yhdistettä VIII (10 mg) lisättiin seokseen ja sekoitusta jatkettiin yön yli. Liuos konsentroitiin Jäännökseksi, joka kromatografoitiin käänteisfaasi-piillä (C10, 40 ml) eluoiden 80 % metanolilla. Aktiiviset eluaatit haihdutettiin ja jäännös puhdistettiin preparatiivlsella HPLCrllä 20 (kolonni: SSD-DDS-842, liikkuva faasi: 90 % vesipitoinen metanoll). Aktiivisen hulppufraktion haihdutus tuotti BU-2867T A:ta (7,4 mg, saanto 28 %), joka oli kalkin puolin identtistä luonnollisen antibiootin kanssa. TLC (Sila-noitu, Et0H-H20 - 55:45) Rf: 0,45. HPLC (Lichrosorb RP-18, 25 Et0H-H20 * 65:35) Rt: 6,43 min.

BU-2867T A voidaan tuottaa myös yhdistämällä V ja XI. Dimetyyliformamidiliuosta (1 ml), jossa oli V (3,4 mg), N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidiä (3,7 mg) ja 1-hydroksi-l,2,3-bentsotriatsolia (2,8 mg) sekoitettiin 2 30 tuntia huoneenlämmössä. Liuokseen lisättiin XI (5 mg) Ja seosta sekoitettiin vielä 3 tuntia ja konsentroitiin in vacuo. Jäännös liuotettiin metanoliin ja puhdistettiin preparatiivlsella HPLC:llä käyttäen samaa kolonnia ja liikkuvaa faasia kuin yllä. BU-2867T A 4 mg, saanto 45 %. 35 Identtisyys luonnollisen BU-2867T A:n kanssa vahvistettiin suoralla vertailulla.

22 88053

Yhdistettä XI voidaan valmistaa yndisteestä VIII käyttäen tavanomaisia menetelmiä. Sekoitettuun seokseen, jossa oli N-t-butoksikarbonyyli-L-treoniinia (44 mg), N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidiä (40 mg) ja 1-hydroksi-5 1,2,3-bentsotriatsolia (30 mg) dimetyyliformamidissa (4 ml), lisättiin VIII (40 mg) huoneenlämmössä. Seos konsentroitiin in vacuo jäänökseksi, joka kromatografoltiin käänteisfaasi-piikolonnilla (C18, 40 ml) metanolin ja veden seoksella (suhteet: 1:9 - 2:3). Sopivat fraktiot yhdistet-10 tiin, konsentroitiin in vacuo ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin N-BOC-L-treonyyli-VIII (-B0C-XI). 51 mg saanto, KBr 69 %. uc-o :1690 ja 1640 cm*1. hi-NMR (80 MHz) δρρβ DMS0-d6:ssa: 1,00 (3H, d), 1,22 (3H, d), 1,35 (9H, s), 15 6,11 (1H, d), 6,33 (1H, d-d), jne. BOC-XI (36 mg) ja muu rahaishapon (1 ml) seosta sekoitettiin 1 tunti huoneenlämmössä. Tämä konsentroitiin, laimennettiin vedellä (1 ml), pH säädettiin 10,0:ksi ja pantiin käänteisfaasi-piikolon-niin (C18, 20 ml). Kehitettäessä vedellä ja tarkkailtaessa 20 eluaattia ninhydrilnltestillä, sopivat eluaatit yhdistettiin ja pakastekuivattiin, jolloin saatiin valkoista klln- KBr teää XI. 25 mg, saanto 88 %. υο-ο: 1650 cm’1. 1H-NMR &prin DMS0-d6:ssa: 1,04 (3H, d), 1,22 (3H, d), 6,14 (1H, d), 6,42 25 (1H, d-d), 7,35 (1H, t, NH), 7,98 (1H, d, NH), 8,65 (1H, d, NH) jne. EI-MS: M* m/z 342.

Niinpä on mahdollista tuottaa kaavan I mukaisia antibiootteja antamalla yhdisteiden Vili ja Xl reagoida sopivien happojen kanssa, mistä tahansa ne ovatkin peräi-30 sin. Lisäksi, käyttämällä yhdisteitä VIII Ja XI, kaavan I mukaisia yhdisteitä, varsinkin niitä, joita syntyy enemmän, voidaan käyttää valmistettaessa muita kaavan I mukaisia yhdisteitä. Esimerkiksi BU-2867T A:ta, jota saadaan enemmän fermentoinnilla, voidaan käyttää valmistettaessa 35 BU-2867T B ja BU-2867T C entsymaattisella hydrolyysillä ja kytkemällä toivottuun happoon, kuten yllä on kuvattu.

il j * ' 23 8 8 053 BU-2867T:n saantoa ja fermentoimalla saatujen A-, B- ja C-fraktioiden jakautumista voidaan muutella lisäämällä erilaisia rasvoja ja öljyjä ja tiettyjä pinta-aktii-visia aineita alustaan, jossa Polyangium brachysporum 5 K481-B101 kasvatetaan. Esimerkiksi soijaöljyn, maissiöl jyn, oliiviöljyn, hydratun kasviöljyn, sianihran ja talin lisääminen lisäsi BU-2867T:n kokonaissaantoa. Rasvat ja öljyt, jotka sisälsivät paljon linolihappoa (C18:2), kuten soijaöljy, maissiöljy ja sianihra, lisäsivät muodostuneen 10 BU-2867T B:n määrää. Paljon oleiinihappoa (C18:1) sisältävät öljyt, kuten oliiviöljy, lisäsivät muodostuneen BU-2867T C:n osuutta. Paljon steariinihappoa (C18:0) sisältävät hyd-ratut kasviöljyt lisäsivät vain BU-2867T A:n määrää.

Mikrobien vastainen vaikutus: 15 BU-2867T A:n, B:n ja C:n inhiboiva minimikon- sentraatio (MIC) määritettiin eri mikro-organismeille agarlaimennusmenetelmällä. Bakteereille käytettiin ravin-toagaria (Eiken) ja sienille Sabouraud-dekstroosiagaria (Difco). Ympin koko oli 104 CFU/ml bakteereilla ja 105-107 20 CFU/ml sienillä.

Taulukossa 5 esitetään BU-2867T A:n, B:n ja C:n antibakteeriset aktiivisuudet in vitro. Komponentit A ja C eivät inhiboineet gram-positiivisten ja gram-negatiivis-ten bakteerien kasvua 50 pg/ml, kun taas komponentti B • : 25 osoitti kohtalaista aktiivisuutta joitakin gram-positiivi-sia bakteereja vastaan.

BU-2867T -komponenttien sientenvastaiset ominaisuudet on esitetty taulukossa 6. Komponentti C osoitti vahvaa sientenvastaista tehoa kliinisesti tärkeitä patogeenisiä 30 sieniä kuten Candida albicans, Cryptococcus neoformans,

Aspergillus fumigatus, Trichophyton mentagrophytes ja Mu-cor spinosus vastaan. Komponentit A Ja B olivat jonkin verran vähemmän aktiivisia kuin komponentti C, mutta niiden sientenvastaiset spektrit muistuttivat viimemainitun 35 spektriä.

24 88 053

Taulukko 5: BU-2867T-komponenttien bakteerienvastaiset spektrit MIC (/Ug/ml)

BU-2867TA BU-2867B BU-2867C

Gram-posituvinen organismi - - - 5

Staphylococcus aureus 209P >50 25 > 50 " " Smith >50 3,1 >50 " " Bx-1633 > 50 50 >50 10 Staphylococcus D153 > 50 6.3 > 50 epidermidis ' " " A22152 > 50 50 > 50

Streptococcus faecalis A9612 >50 >50 >50

Micrococcus luteus PCI-1001 > 50 50 > 50 15

Bacillus subtilis PCI-219 >50 50 > 50

Gram-negatiivinen organismi

Escherichia coli NIHJ >50 >50 >ςη 20

Klebsiella pneumoniae D-ll >50 >50 >50

Proteus mirabilis A9554 >50 >50 >50

Proteus vulgaris A9436 >50 >50 >50 • ".· Morganella morganii A9553 >50 >50 >50 • 25 • · : *’ Serratia marcescens A20222 >50 >50 >50 ·;·; Enterobacter cloacae A9659 >50 >50 >50 \ Pseudomonas aeruginosa A9930 >50 >50 >50

Alusta: ravintoagar » » · • · 25 88053

Taulukko 6: BU-2867T-komponenttien sientenvastaiset spektrit MIC (/ug/ml)

Koe-eliö BU-2867A BU-2867B BU-2867C

5

Candida albicans IAM 4888 3,1 3.1 1,6 " " A 9540 1;6 1,6 0,8

Cryptococcus neoformans D 49 25 25 3,1 10 " IAM 4514 25 25 3,1

Aspergillus fumigatus IAM 2530 1,6 3,1 0,8 " " IAM 2034 1,6 3,1 0,8

Aspergillus flavus FA 21436· 25 25 50

Fusarium moniliforme A 2284 > 50 >50 > 50

Piricularia oryzae D 91 >50 >50 >50

Trichophyton mentagrophytes D 155 25 12,5 1,6 " " #4329 25 12,5 6;3 20 Blastomyces dermaditis IFO 8144 50 50 >50

Sporothrix schenckii IFO 8158 >50 >50 >50

Petriellidium boydii IFO 8073 >50 > 50 50

Mucor spinosus IFO 5317 1,6 0,8 0,2 V 25 .·_ Alusta: Sabouraud dekstroosiagar

Kasvaintenvastainen aktiivisuus: BU-2867T A:n, B:n ja C:n kasvaintenvastainen aktii-. visuus määritettiin naaraspuolisissa CDF^ ja urospuolisia-

.-.*.30 sa BDF1-hiirissä. Lymfosyyttileukemia P388 (CDFi Ja BDFX

-hiiret) Ja imusolusyöpä L1210 (BDFX -hiiret) siirrostet-. . tiin 106 ja 105 solua/ml sisältävän 0,8 ml laimennetun as- kiittinesteen intraperitonaalisella injektiolla. Melanoot-tinen melanooma B16 (BDF1-hiiret) silrrostettiin antamalla 35 0,5 ml 10 % kasvainsuspensiota intraperitonaalisesti. Tes- 26 8 8053 timateriaalit liuotettiin 10 % dimetyylisulfoksidia sisältävään 0,9 % suolaliuokseen ja tasaisesti kasvavia annoksia niitä annettiin hiirille intraperitonaallsesti 24 tuntia kasvainsolujen siirrostuksen jälkeen. Joko olivomysii-5 niä (NSC 38270) tai mitomysiini C:tä käytettiin vertailu-yhdisteenä kokeissa.

BU-2867T A, B ja C osoittivat kasvalntenvastaista aktiivisuutta P388-leukemiaa vastaan hoitoalkataululla 1 (kerran päivässä päivinä 1, 4 ja 7). Taulukossa 7 esite-10 tään saadut tulokset lisäyksenä koe- (T) ja vertailueläin-ten (C) henkiinjäämisajan mediaanissa (MST) erilaisilla annostuksilla ilmaistuna prosenttisuhteena. 125 ylittävät prosentuaaliset suhteet osoittavat merkittävää kasvainten-vastaista vaikutusta.

15

Taulukko 7: BU-2867T komponenttien kasvaintenvas- tainen aktiivisuus P388-leukemiaa vastaan T/C % eloonjäämisajan mediaanista 20 annos mg/kg/vrk, ip 3 1 0,3 0,1 BU-2867T A 140 130 120 " B 165 140 120 " C 155 130 V 25 Olivomysiini A 140 135 100 BU-2867T A ja C olivat hyvin aktiivisia P388-leuke-miaa vastaan hoitoaikataululla 2 (kerran päivässä päivinä 1-9); BU-2867T A oli vähemmän aktiivinen L1210-leukemiaa .30 ja B16-melanoomaa vastaan. Taulukossa 8 esitetään erilaisilla annostuksilla saadut tulokset jälleen ilmaistuna . . eloonjäämisajan mediaanin lisääntymisen prosentuaalisena suhteena, 125 ylittävien arvojen merkitessä merkittävää kasvainten vastaista vaikutusta.

li 27 88053

Taulukko 8: BU-2867T A:n ja C:n kasvaintenvastai- nen aktiivisuus T/C % eloonjäämisajan mediaanista 5__

Annos mg/kg/vrk, lp _2__1_ 0^5 0,25 0,13 0,063 0,031 P388-leukemia BU-2867T A 67 228 186 156 147 136 109 10 " C 234 189 175 159 153 123 100

Mitomysilni C 290 240 170 150 130 115 L1210-leukemia BU-2867T A 129 118 118 106

Mitomysilni C 140 141 129 129 106 15 B16-melanooma BU-2867T A Myrkyl- 125 116 113 100 linen

Mitomysilni C 63 181 163 141 131 20 BU-2867T A:n ja C:n akuutti myrkyllisyys määritet tiin urospuolisissa ddY-hiirissä yhdellä intraperltoneaa-lisella annostuksella. LDS0-arvot olivat 8,1 mg/kg ja 25 mg/kg.

Kaavan I mukaisten yhdisteiden farmakologisesti .25 aktiivisia valmisteita voidaan valmistaa tavanomaisin ga- leenisen farmasian menetelmin suullisesti tai parenteraa-lisesti käytettäväksi esim. nisäkkäisiin, ihminen mukaanlukien. Tavanomaiset täyteaineet ovat farmaseuttisesti hyväksyttäviä orgaanisia tai epäorgaanisia parenteraali-·. 30 sesti, enteraalisesti tai paikallisesti annettavaksi sopivia kantaja-aineita, jotka eivät reagoi haitallisesti aktiivisten yhdisteiden kanssa. Sopiviin farmaseuttisesti hyväksyttäviin kantajiin kuuluvat muun muassa vesi, suolaliuokset, alkoholit, arabikumi, kasviöljyt, polyetyleeni-35 glykolit, gelatiini, laktoosi, amyloosi, magnesiumstea- 28 88053 raatti, talkki, piihappo, vaseliini, parfyymiisijy, rasva-happomonoglyseridit ja -diglyseridit, pentaerytritoliras-vahappoesterit, hydroksimetyyliselluloosa, polyvinyylipyr-rolidoni jne. Farmaseuttiset valmisteet voidaan steriloida 5 Ja haluttaessa sekoittaa muihin aineisiin, esim. voitelu-, säilöntä-, stabilointi-, kostutus-, emulgointiainei-siin, osmoottiseen paineeseen vaikuttaviin suoloihin, puskureihin, väriin, makuaineisiin ja/tai aromaattisiin aineisiin ja muihin vastaaviin, jotka eivät reagoi haitalli-10 sesti aktiivisten yhdisteiden kanssa.

Parenteraaliseen käyttöön parhaiten sopivia ovat injisottavat steriilit liuokset, edullisimmin öljy- tai vesiliuokset, samoin kuin suspensiot, emulsiot tai siirrännäiset, peräpuikot mukaanlukien. Ampullit ovat käytän-15 nöllisiä kerta-annoksia.

Enteraaliseen käyttöön sopivimpia ovat tabletit, pastillit, peräpuikot tai kapselit, joissa on talkki-tai/ja hiilihydraattikantaja tai sitoja tai muu vastaava, jolloin kantaja on edullisimmin laktoosi ja/tai maissi-20 tärkkelys ja/tai perunatärkkelys. Siirappia, eliksiiriä tai vastaavaa voidaan käyttää, kun käytetään makeutettua kantajaa. Hitaasti vapauttavia valmisteita voidaan valmistaa, mukaanlukien ne, joissa aktiivinen yhdiste on suojattu vähitellen hajoavilla kerroksilla, esimerkiksi mikro-.25 kapseloinnilla, monikerroksisella pinnalla, jne.

Yleensä kaavan I mukaiset yhdisteet jaellaan tarvittavan annoksen sisältävinä kerta-annoksina farmaseuttisesti hyväksyttävässä kantajassa. Kaavan I mukaisten yhdisteiden annostus on yleensä 5 - 250 mg/vrk esim. 75 kg 30 painaville ihmispotilaille. Sopivat annokset tietylle po tilaalle voidaan määrittää tavanomaisilla menetelmillä, . . esimerkiksi vertailemalla kyseisen yhdisteen ja tunnetun antibiootin tai kasvainten vastaisen aineen eri ominaisuuksia esimerkiksi sopivan tavanomaisen farmakologisen 35 järjestelmän mukaan.

il 29 88053

Edellisestä kuvauksesta alan ammattimies pystyy helposti toteamaan tämän keksinnön olennaiset piirteet ja poikkeamatta sen hengestä ja piiristä tehdä erilaisia muutoksia Ja muunnelmia sovittaakseen keksinnön eri käyttö-5 tarkoituksiin ja olosuhteisiin.

Claims (6)

3o 88053

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on kaava I 5 T*3 OH H f"0H r-ch=ch-ch=ch-co-nh-Ch-co-nh< \_ W-° «X»

0 E 10 jossa R on ryhmä CH3-(CH2)6-, CH3-(CH2)4-CH=CH-(CH2)2- tai CH3-(CH2)8-, tunnettu siitä, että Polyangium bra-chysporum-kanta K481-B101, ATCC 53080, viljellään käyttö- 15 kelpoista hiilen- ja typenlähdettä sisältävässä ravinto- alustassa aerobisissa olosuhteissa, tuotettu rihmasto erotetaan, fermentaatiossa muodostunut kaavan I mukaisten yhdisteiden seos otetaan talteen ravintoalustasta, ja yhdisteet erotetaan seoksesta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että ravintoalustaan lisätään rasvaa tai öljyä.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että erotettu rihmasto uutetaan orgaa- 25 nisella liuottimena ja uute yhdistetään ravintoalustaan ennen seoksen talteenottamista.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että seos otetaan talteen ravintoalustasta uuttamalla orgaanisella liuottimena.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että kaavan I mukaisten yhdisteiden muo-. . dostumista tarkkaillaan käyttäen testieliönä Candida albi- cansia.

6. Polyangium brachysporum-kanta K481-B101, ATCC - : 35 53080. 3i 88053