HU197945B - Process for producing new peptide antibiotics and compositions comprising such active ingredient - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás új peptid-típusú antibiotikumok és ezeket hatóanyagként tartalmazó, antimikrobiális és tumor-ellenes hatású gyógyszerkészítmények előállítására.

Különböző mikroorganizmusokat különítettünk el talajmintákból, ezeket szintetikus közegben tenyésztettük és azt találtuk, hogy e mikroorganizmusok antibiotikus aktivitást mutatnak. Így különösen egy Görögországból, az athéni Partenon környékéről származó talajmintából egy új, K481-B101 jelzésű baktériumfajtát sikerült elkülönítenünk, amely antibiotikus aktivitású peptidek elegyét termeli.

A találmány elsődleges célkitűzése olyan alkalmas módszer kidolgozása volt, amellyel az említett mikroorganizmus által termelt, gombaellenes és tumorellenes hatást mutató antibiotikumok előállíthatok és kinyerhetők. A találmány körébe tartozik továbbá az említett új peptid-típusú antibiotikumokat hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására is.

A találmány szerinti eljárással előállítható új peptid-típusú antibiotikum a csatolt rajz szerinti (A) általános képlettel jellemezhető; ebben a képletben R egy CH₃-(CH₂)₆CH₃-(CH₂)₄-CH=CH-(CH₂)₂- vagy CH₃-(CH₂)₈-csoportot képvisel.

Az (A) általános képletnek megfelelő új antibiotikus hatású vegyületeket — ahol R a fenti jelentésű — a találmány értelmében oly módon állítjuk elő, hogy az általunk talált Polyangium brachysporum nova species mikroorganizmust asszimilálható szén- és nitrogénforrást tartalmazó tápközegben, aerob körülmények között tenyésztjük, majd a termelt micéliumot elkülönítjük a tápközegtől és a mikroorganizmus által termelt hatóanyagot kinyerjük a tápközegből.

A találmány szerinti új antibiotikus hatású vegyületek szintetikus úton történő előállításához kiindulási anyagként előnyösen alkalmazhatók a csatolt rajz szerinti (XI) és (VIII) képletű vegyületek.

Az új K481-B101 jelű mikroorganizmus morfológiai, tenyésztési és fiziológiai jellemzőit a McCurdy Jr.: Studies on the Taxonomy of the Myxobacterales, II, Polyangium and the demies of the Sorangiaceae; Inti. J. Syst. Bacteriol. 20, 283—296 (1970); H. Reichenbach: Nannocystis exedens gén. nov., sp. nov., a new myxobacterium of the family Sorangiaceae, Arch. Mikrobiol. 70, 119—138 (1970); P. Crhistensen és F. D. Cook: Lysobacter, a new Genus of nonfruiting, gliding bacteria with a high base ratio, Inti. J. Syst. Bacteriol. 28, 367—393 (1978); és P. Christensen: Synonymy of Flavobacterium pectinovorum Dorey with Cytophaga johnsonae Stanier, Inti. J. Syst. Bacteriol. 27, 122—132 (1977) közleményekben leírt módszerekkel állapítottuk meg. A mikroorganizmus fenntartása és tisztítása a J. E. Peterson: Isolation, cultivation 2 and maintenance of the myxobacteria. Methods in Microbiology 3B, 185—210 (1969),

J. R. Norris & D. W. Ribbons, Academic Press (London and New York); és H. Reichenbach és M. Dworkin: The Order Mixobacteriales, The Prokaryotes, I. kötet, 328—355 (1981), Μ. P. Starr etc. Springer-Verlag (Berlin, Heidelberg és New York) munkákban ismertetett módszerekkel történt. A mikroorganizmus taxonómiai helyzetét a Bergey’s Manual, 8 kia L 1974, és „The Prokaryotes I. kötet leírása szerint határoztuk meg.

Morfológiai adatok:

Λ morfológiai vizsgálatokhoz kaziton — Mgagar, kitin agar, élesztősejt agar és nyúltrágya agar tápközeget használtunk. A K48I-BI01 mikroorganizmus Gram-negatív, nem ostoros baktérium. Vegetatív sejtjei hengeresek, 0,6—0,8X2—10 pm méretűek, tompa lekerekített végekkel. A vegetatív sejtek hajlékony, lassan kúszó mozgást mutatnak az agrr-tápközeg nedves felületén vagy lágy agr r közegben. A mixospórák világosan különbőznek a vegetatív sejtektől, oválisán vagy gönbalakúak, 0,6—0,8X0,6—1,5 pm méretűek, fénytörők vagy nem fénytörők és esetenként párosak. A K48.1-B101 mikroorganizmus a legtöbb agar-közegen nyeletlen sporangiumokat képez, amelyek beborítják a mixospórákat. A spórangiumok ovális, vagy gömb alakúak, vagy pedig párna alakot mutatnak, eléggé változatos méretűek 12X20—80X X120 pm nagyságúak, gyakran egy közös bút kólát vagy ragacsos réteg köti össze őket, kettős körvonalúak és egyenként vagy csomókban (sori) fordulnak elő. A K481-B101 mikroorganizmus morfológiai adatait az I. táblázatban foglaltuk össze.

Tenyésztési jellemzők:

A K48I-B101 mikroorganizmus a kazitonMg⁺⁺ agáron (McCurdy, 1969) és élesztősejt-agaron (Christensen & Cook, 1978) mérsékelten fejlődik, a Bacto táp-agaron és Bacto szív infúziós agaron azonban csak csekély fej ’ődést mutat. YP-lágy agaron (0,3% élesztőkivonat, 0,1% pepton, 0,01% nátrium-klorid, 0,3% agar, pH=6,6—6,8) gyökér- vagy tolszerű rajzok figyelhetők meg a kultúrán, ka.:iton-Mg^‘⁺ agaron azonban ilyenek nem láthatók. A telepek kaziton-Mg⁺⁺ agaron köralakúak, áttetszőek és halvány zöldes sárga színűek, gyengén bemaródnak vagy behatolnak a agarba. A tenyésztési jellemzőket a

2. táblázatban foglaltuk össze.

Fiziológiai jellemzők:

A K481-B101 mikroorganizmus a kemény tőt, kitint, zselatint és kafeint hidrolizálja, a cellulózt és agart azonban nem. Az autoklavozott élesztősejteket megbontja, a Micrococcus luteus élő sejtjeit azonban nem. A K481-B101 mezofin jellegű és 2%-os nátriumklorid-oldattal szemben érzékeny. A fiziológiai jellemzőket a 3. táblázat tartalmazza.

-2197945

Az ostoros baktériumok együttszaporodása (konkomitancia) és spontán változat előfordulása

Gram-negatív, rúdalakú ostoros baktériumok az eredeti tenyészetben konkomitanciát mutatnak. A K481-B101 mikroorganizmus eléggé jól tisztítható a szokásos hígítási és egyedi sejt-elkülönítési módszerek ultrahangos és hősokkos kezelés, valamint az antibiotikus érzékenység (pl 50 pg/ml) koncentrációjú pipemidsav-oldattal) kombinálásával, a mikrospóra vagy termőtest felhasználásával. A K481-B101 tisztítatlan tenyészeteiben műkőid variánsok fordulnak elő, amelyek fehéres, kupola alakú tenyészetet képeznek, rajzó udvarral. Az ilyen műkőid variánsok vegetatív sejtjei valamivel nagyobbak az eredeti törzsénél, 0,8—1,0X2,0—3,5 pm méretűek. A sporangiumok nyalábja (sorus) túlnyomórészt műkőid változatokból ered.

Rendszertani helyzet:

A K481-B101 mikroorganizmus termő, kúszó baktérium, amelyet egy talajmintából különítettünk el. A törzs főbb diagnosztikai jellemzői a következők:

Vegetatív sejtek:

1. hengeralakúak, egyenletes átmérővel

2. a végeken nem vékonyodnak el

3. behatolni képesek az agar-közegbe

4. a kongóvöröst nem adszorbeálják

Mixospórák:

1. a vegetatív sejtektől differenciálódnak

2. oválisak vagy gömbalakúak

3. nem fénytörőek vagy fénytörőek

Sporangiumok:

1. nyeletlenek

2. oválisak, gömbalakúak vagy szabálytalan alakúak

3. gyakran közős burkolat vagy ragacsos réteg köti össze őket

4. kettős korvonalúak

5. halványsárga színűek (meghatározott szín nélkül)

6. egyenként vagy csomókban (sori) fordulnak elő

Tenyésztési és fiziológiai jellemzők:

1. telepek, aranysárgától fehéresig terjedő színűek

2. a telepek gyengén bemaródnak vagy behatolnak az egarba

3. kitinolitikusak, de nem cellulolitikusak

4. az élesztősejteket lizálják, a Micrococcus luteus sejtjeit nem.

A K481-BÍ01 mikroorganizmus fenti morfológiai, tenyésztési és fiziológiai jellemzői alapján ez a mikroorganizmus a Myxobacteriales rendbe sorolandó. A Myxobacterialis rend nemzetségei közül a Myxococcus, Archangium és Cystobacter nemzetségek az elvékonyodó vegetatív sejtek és a termőtest morfológiája alapján különbőznek a K481-B101 mikroorga4 nizmustól. A Melittangium, Stigmatella és Chondromyces nemzetségek a nyeles sporangiumok következtében különböznek a K481BlOl-től.

A K481-B101 mikroorganizmus a Polyangíum és Nannocystin nemzetségekhez hasontó. A Nannocystis nemzetséghez az ovális vagy gömbalakú mixospórák (nyálkás__ spórák), ovális és gömbalakú, magányos sporangiumok folytán hasonlít, de az egyenletes átmérőjű hengeralakú vegetatív sejtek és az agarba való bemaródás vagy behatolás képességének hiánya miatt a Nannocystis nemzetséghez tartozó mikroorganizmusok eltérnek a K481-B101 -tői. A hengeres, tompa legömbölyített végű vegetatív sejtjei, a túlnyomórészt nem-fénytörő mixospórák túlnyomóan történő képzése és az ovális vagy gömbalakú, kettős körvonalú sporangiumok tekintetében a K481B101 mikroorganizmus a Polyangium nemzetséghez hasonlít. A Myxobacterales rend nemzetségeivel való összehasonlító vizsgálat eredményei alapján a K481-B101 mikroorganizmus a Polyangium nemzetség egyik fajának tekinthető. A Polyangium fajai közül a Polyangium luteum a vegetatív sejtek mérete, a sporangiumok színe és alakja, valamint a vegetatív telep színe alapján hasonló a K481BI01 mikroorganizmushoz, azonban ez utóbbi az erősen összehúzódott, ovális vagy gömbalakú mixospórái, vaTamint az élő baktériumsejtek, például a Micrococcus luteus sejtjeinek lizálására való képesség hiánya tekintetében eltér a Polyangium luteumtól.

A fentiek alapján megállapítható, hogy a K481-B101 mikroorganizmus új species, amely a Myxobacterales rend, Polyangiacae család Polyangium nemzetségéhez sorolható; elnevezésére a Polyangium brachysporum nova species nevet javasoljuk. A K481-B101 mikroorganizmus típustőrzsét egyedi izolátum alakjában ATCC 53080 sz. alatt helyeztük letétbe az American Type Culture Collection intézetnél.

1. táblázat

A K481-B101 mikroorganizmus morfológiája

Vegetatív sejtek: Gram-negatív, Hengeres alakúak, tompa legömbölyített végekkel; méretük 0,6—0,8X X2,0—10 pm. A kongóvörös színezéket nem adszorbeálják.

Mixospórák: Megkülönböztethetők a vegetatív sejtektől. Erősen zsugorodottak, ovális vagy gömbalakot vesznek fel, méretük 0,6—0,8X0,6—1,5 pm; nem fénytörőek. Huzamosabb inkubáció esetén fénytörő mixospórák képződnek.

Sporangiumok: Nyeletlenek, magányosak vagy csomókban fordulnak elő, oválisak, gömbalakúak,

-3197945 párna alakúak vagy alaktalanok. Méretük erősen változó, 12X20 pm-tól 80X120 pm-ig. Közös burkolat vagy ragacsos réteg köti össze őket. Kettős körvonalúak. Beágyazódnak az agarba. A 2—10 vagy több sporangiumot tartalmazó csomók teljes tömegükben 50—300 mikron méretűek.

Mikrokolónia: Kitin-agaron 2 heti inkubáció után. A szélén vegetatív sejtek láncai helyezkednek el rácsos vagy cikcakkos alakban. Az egyes sejtek kúszó mozgása figyelhető meg, a sejtcsomók azonban nem mutatnak mozgást.

2. táblázat

A K481-B101 kaziton-Mg⁺⁺ agaron (McCurdy)28°C-on 6 nap alatt kifejtett kultúra jellemzői

Alak: köralakú

Felület: sima, később részben ráncos

Emelkedés: emelkedett

Perem: teljesen vagy kissé szabálytalan, határozott kiemelkedések (nyelv, toll vagy rizoid alakban) nincsenek

Optikai tulajdonság: félig átlátszó vagy átlátszatlan

A telep színe: halvány zöldessárga Diffundáló pigment: nincs Kitin-agaron, 28°C-on 3 heti inkubáció után mutatott fejlődés: vékony, áttetsző, halványsárga vagy színtelen. A széleken vastag átlátszatlan, sárgásfehér. A sporangiumok koncentrikus alakban jelennek meg a széleken. Az agart gyengén erodálja vagy behatol az agarba.

3. táblázat

A K481-B101 fiziológiai jellemzői Hidrolizáló képesség

Oldható keményítő	+
burgonyakeményítő	+
karboximetil-cellulóz-nátrium	+
cellulóz	—
agar	—
kitin	+
nátrium-alginát	—
nátrium-polipektát	—
zselatin	+
kazein	+
Növekedés táptalajokon
Simon-féle citrát-agar	—
Christensen-féle citrát-agar	—
glükóz-ammóniumsó agar	—
aszparagin-ammóniumsó agar	+
Termelés
Indol	—
hidrogén-szulfid	+

acetcin (VP-reakció) — ureáz + oxidáz -+kataláz +

L'zálóképesség

Micrococcus luteus PCI 1001 és

ATCC 9341 élő sejtjei — autoklávozott élesztősejtek +

Reakciók

Tej koagulálása: — tej peptonizálása + nátrium-klorid tűrés 1,0% vagy kisebb

NaCl tartalomnál növekedés van;

2,0% vagy nagyobb NaCl tartalomnál növekedés nincs pH-tíírés pH 5,5,5—10,5: jó növekedés pH 5,0: gyenge növekedés pH 4,5 és 11,5: nincs növekedés növekedési hőmérséklet maximális növekedés 37°C-nál növekedési tartomány 15—42°C nincs növekedés 10°Cnál és 45°C-nál oxidációs vagy termen- oxidatív (Hugh and tatív reakció Leifson közegeq)

Az antibiotikumok mikrobiológiai úton történő termelését az alábbi 1. példa szemlélteti.

1. példa

A Polyangium brachysporum K481-B101 törzstenyészetét 28°C .hőmérsékleten 3 napig szaporítottuk ferde agar közegen: 0,5% oldható keményítő, 0,5% glükóz, 0,1% húskivonat, 0,1% élesztőkivonat, 0,2% Nz-kazein, 0,2% nátrium-klorid, 0,1% kalcium-karbonát és 1,6 agar (pH 7,0). Egy jól kifejlett ferde agaron kultúrát alkalmaztunk a vegetatív közeg beoltására; (közeg: 2% kukoricakeményítő, 3% szójaliszt, 0,3% MgSO₄.7H₂O és 1% C.aCO₃, pH sterilizálás előtt 7,0). Forgó rázóasztalon történő inkubálás után (hőmérséklet 28°C, rázási sebesség 250 fordulat perceiként). A tenyészet 5 ml-jét átvittük egy 500 ml-es Erlenmeyer-lombikba, amelybe előzetesen 100 ml termelő tápközeget helyeztünk (a termelő tápkőzeg összetétele egyezik a vegetatív tápközegével). Az antibiotikum termelését papírkorongos agar-diffúziós módszerrel ellenőriztük; vizsgáló mikroorganizmusként Candida albicans A9540 törzset alkalmaztunk. A fermentációt 28°C hőmérsékleten 4 napig folytattuk rázóasztalon; az antibiotikum-termelés 100 μg/ml maximumot ért el.

A fermentációt keverő fermentorban is lefolytattuk. Egy 20 literes edényben levő 10 liter termelő tápközeg beoltására a lom-4197945 bikos fermentáció útján kapott inokulum-kultúra 500 ml-nyi adagját alkalmaztuk. A fermentációt 28°C hőmérsékleten, 250 percenkénti fordulattal végzett keverés és percenként 10 liter levegőztetés mellett folytattuk le. Az antibiotikum-termélés 40 órai fermentáció után 150 pg/ml maximumot ért el.

Az antibiotikumok elkülönítése és tisztítása

1 fermentlevet Sharpless-centrifugán centrifugáltunk. A micélium-pogácsát 7 liter metanollal homogenizáltuk és ezt az elegyet 1 óra hosszat kevertük. Az oldhatatlan részek kiszűrése után a metanoios kivonatot bepároltuk; a visszamaradó vizes oldatot egyesítettük a fermentlé szűrletével és 24 1 butanollal extraháltuk. Az extraktumot 0,5 1 térfogatra bepároltuk és ezt keverés közben 3,5 liter n-hexánban öntöttük, a nyers antibiotikum lecsapása céljából. Az így kapott 41 g szilárd nyers antibiotikumot 760 ml C-200 szilikagélt tartalmazó oszlopon kromatografáltuk; etil-acetáttal és 0%-tói 50%-ig növekvő metanoltartalmú etil-acetáttal eluáltunk. Az eluátum bioaktivitását papírkorong módszerrel vizsgáltuk, Candida albicans A9540 mikroorganizmus alkalmazásával. Az aktív frakciókat egyesítettük és bepároltuk; maradékként 13 g BU-2867T komplexet kaptunk halványsárga por alakjában. E szilárd termék 200 mg-nyi részét egy fordított fázisú oszlopon (C₁₈, 100 ml) kromatografáltuk, 3:7—5:5 térfogatarányú etanol-víz eleggyel eluáltunk. Az eluátumot antifungális bio-próbával, valamint vékonyréteg-kromatográfiai módszerrel (szilán-bevonattal, etanol és víz 55:45 técfogatarányú elegyével) vizsgáltuk. Az eluálás során három különálló szakaszban kaptuk az aktív anyagot tartalmazó frakciókat. Az első szakaszbeli aktív frakciókat egyesítettük és csökkentett nyomáson bepároltuk; így 61 mg BU-2867T A antibiotikumot kaptunk tiszta fehér szilárd termék alakjában. Ezt vizes metanolból átkristályosítva 34 mg tisztított terméket kaptunk' színtelen tűkristályok alakjában. A második és harmadik szakaszbeli aktív frakciók külön-külön történő egyesítése és bepárlása útján 1 mg BU-2867T B, illetőleg 11 mg BU-2867T C antibiotikumot kaptunk. A BU-2867T C antibiotikum metanolból finom tűkristályok alakjában kristályosodik. A fent leírt fordított fázisú kromatográfiai tisztítás megismétlése forán összesen 3,9 g BU-2867T A, 44 mg BU-2867T B és 342 mg BU-2867T C terméket kaptunk.

Az antibiotikumok jellemzése

A BU-2867T A és C antibiotikumokat színtelen tűkristályok, míg a BU-2867T B antibiotikumot fehér amorf por alakjában kaptuk. Ezek a termékek könnyen oldódnak metanolban, etanolban, n-butanolban és dimetil-szulfoxidban, kevéssé oldódnak kloroformban, acetonitrilben és etil-acetátban, míg n8

-hexánban és vízben gyakorlatilag oldhatatlanok. Mindhárom antibiotikum Rydon-Smith reagenssel pozitív reakciót ad; vékonyréteg-k'omatográfiai lemezen jóddal vagy kénsavval permetezve színeződik. Negatív reakciót adnak ninhidrinnel, Sakaguchi-reagenssel, antronnal és a Dragendorff-reakcióban. A három antibiotikum elemzéssel megállapított tapasztalati képlete:

BU-2867T A: C₂₇H₄₄N₄O₆

BIJ-2867T B: C₂₉H₄₆N₄O₆

BU-2867T C: C₂₉H₄₈N₄O₆

Az elemzést tömegspektrometriai és mikroanalitikai módszerrel végeztük. A három antibiotikum metanolban mért ibolyántúli színképe egyetlen maximumot mutat 261 nm-nél; ez a maximum savas vagy alkalikus oldatban nem tolódik el. A BU-2867T A, B és C fizikai-kémiai jellemző adatait a 4. táblázatban foglaltuk össze. A három termék infravörös színképét (kálium-bromidban) az 1.,

2. és 3. ábra szemlélteti; ezek a színképek erős arnid-sávokat mutatnak 1630 és 1540 cm' kerül és -OH és/vagy -NH-NH abszorpció-s ivókat 3300 cm^-1-nél.

A BU-2867T A Ή-NMR színképe (4. ábra) hat olefines proton jelenlétét (Ő: 6,16, 6,20 (2H), 6,28, 6,49 és 7,09 ppm) és négy amid-proton (δ: 7,49, 7,82, 7,87 és 8,72 ppm) jelenléiét mutatja. Két metilcsoport (δ: 0,93 ppm, t és 1,07 ppm, d) jelenléte is megfigyelhető a színképen.

A BU-2867T A ¹³C-NMR színképe (5. ábra) 23-nál több szénatom-szignált mutat, ezek között négy karbonil-szénatom, 6 olefines szénatom és 3 metil-szénatom szignálja látható. A BU-2867T B és C antibiotikumok ^l3C-NMR színképe igen hasonló a BU-2867T A antibiotikuméhoz, csupán azzal az eltéréssel, hogy a BU-2867T B színképében két további olefines szénatom, a BU-2867T C színképében pedig két további metilén-szénatom jelenléte látható.

A BU-2867T A antibiotikumot 6 n sósavban 16 óra hosszat forraltuk visszafolyatás közben. Az (V) lipofil termék etil-acetátos extrakció útján való eltávolítása után a hidrolizátumot bepároltuk és a kapott olajszerű maradékot Dowex 50WX4 ioncserélő gyantán kromatografáltuk, előhívószerként piridin-hangyasav-ecetsav puffért (0,1-0,2 mólos, pH 3,1—5,1) alkalmaztunk. Ninhidrin-reagenss?l ellenőrizve négy aminosavat (I, II, II· és IV) eluáltunk ebben a sorrendben; elkülönítésük és kikristályosításuk hidroklorid alakjában történt. Az (I) aminosavat ([a]₂5= = — 12,7°, 5 n HCl-ben) fizikai-kémiai tulajdonságai alapján L-treoninként azonosítottuk. A (II) aminosav Ή-NMR és EI-MS (M⁺+l: m/z 134) színképe azt mutatta, hogy ez a termék a 4-amino-3-hidroxi-n-valeriánsav két diasztereomerjének elegye; vö.: M. Konishi,

K. Saito, K. Numata, T. Tsuno, K- Asama, H. Tsukiura, T. Naito és H. Kawaguchi: Tallysomycin, A new antibiotic complex related to bleomycin, II. Structure determination of 5

-5197945 tallysomycins A and B (Tallizomicin, a bleomicinnel rokon új antibiotikum-komplex, II. a tallizomicin A és B szerkezetének meghatározása), J. Antibiotics 30, 789—805 (1977); az azonosságot autentikus mintával való közvetlen összehasonlítás is megerősítette. A (III aminosav elem-analízissel megállapított tapasztalati képlete C₅H₉NO₂, EI-tömegspektruma (M⁺: m/z 115) is megerősíti ezt a képletet. ‘H-NMR spektruma egy metilcsoport (δ: 1,5 ppm, d, J: 6,0 Hz), egy metíncsoport (δ: 4,0—4,2, m) és két transz-olefines proton (ö: 6,05 ppm, d, J: 15,0 Hz és 6,57 ppm, dd, J: 6,0 és 15,0 Hz) jelenlétét mutatja. Ezek a spektrum-adatok világosan mutatják, hogy a (III) aminosav 4-amino-2- (E)-penténsav) vö.: T. Honore, H. Hjeds, P. Krongsgaard-Larsen & T. R. Christiansen: Synthesis and Structure-Activity Studies of Analogs of v-amino-butyric Acid 1GABA), Eur. J. Med. Chem., 13, 429434, 1978). A (III) aminosavnak fajlagos forgatóképessége ([a]p^2>5=—6°, 5 n sósavban) alapján 2 (S)-konfiguráció tulajdonítható.

A (IV) aminosav elemanalízise (C₆H₁₄N₂O₃) alapján a 4-hidroxi-Iizinnek bizonyult; színkép-adatai: EI-MS (M-J-l: m/z 163 'H-NMR δ: 1,8—2,1 ppm, 4H, m; 3,18 ppm, 2H, t; 3,6—4,3 ppm, 2H, m); 6 n sósavoldattal kezelve v-laktont (vg-o: 1770 cm^-1) képez. N. Izumiya, Y. Fujita, F. Irreverre és B. Witkop: „The Synthesis of Erythro-y-hydroxy-Llysine and its Nonoccurrence in Collagen (Eritro-y-hidroxi-L-lizin szintézise és első nem fordulása kollagénben; Biochemistry 4, 2501 — 2506, 1965) a 4-hidroxi-Iizinek mutarotációjáról számolnak be; a (IV) aminosavra vonatkozólag megfigyelt eltolódási érték a vegyület eritro-L-konfigurációjára mutat. így a fenti adatok alapján nyilvánvaló, hogy a (IV) aminosav eritro-4-hidroxi-L-lizin.

A fenti savas hidrolízis során kapott lipofil savas frakciót (V) diazometánnal kezelve és a terméket kromatográfiás módszerrel tisztítva egy olajszerű (VI) metilésztert kapunk. Ennek ibolyántúli szénkép-adatai — X_max metanolban: 260 nm, ε: 22 000; valamint egyéb spektrális adatai EI-MS (M⁺: m/z 210); H-NMR: 4 -CH-, 1 C-CH₃ és 6 -CH₂- jelenlétét mutató szignálok — azt mutatják, hogy a (VI) észter 2,4-dodekadiénsav-metilészter. A kapcsolási állandó nagysága alapján nyilvánvaló, hogy mindkét kettőskötés transz-konfigurációjú. Az eredeti (V) sav ezek szerint 2(E),4(E)-dodekadiénsav volt; vő.: R. S. Burden és L. Crombie: Amides of Vegetable Origin, XII. A new series of alka-2,4-aienoic tyramine-amides írom Anacyclus pyrethrum D. C. (Compositae). J. Chem. Soc. (C), 1969: 2477—2481 (1969). Az említett öt vegyület tehát a következő:

I: L-treonin CH₃-CH-CH-COOH

I l

OH NH₂

II: 4-amino-3-hidroxí-n-valeriansav CH₃-CH-CH-CH₂-COOH

II

NH₂OH

III: 4(S)-amino-2 (E)-penténsav

-»TT /VT ΡΠ PH Γ/Λ/ΊΤΙ

NH

IV: eritro-4-hidroxi-L-lizin

NH₂-CH₂-CH₂-CH-CH₂-CH-COOH I I

OH NH₂

V: 2(E),4(E)-dodekadiénsav

CH₃- (CH₂)₆-CH=CH-CH-CH-COOH

A BU-2867T A antibiotikum molekuláris képlete C₂₇H₄₄N₄O₆; a vegyület a ¹³C-NMR szerint 6 olefines szénatomot és 4 amid-szénatomot tartalmaz. Nyilvánvaló tehát, hogy a (II) aminosav mesterséges termék, amely a savas hidrolízis folyamán a természetes (III) aminosav hidratációja folytán képződött. Maga ez antibiotikum ciklikus peptidnek mutatkozik, minthogy ninhidrin-reakciója negatív és a potenciometriás titrálásnál semmilyen titrálható funkciót nem mutat. Ezt a megállapítást megerősíti az a tény is, hogy a BU-2867T A antibiotikum piridinben történő acetilezés egy di-O-acetil-származékot képez, amelynek színkép-adatai: EI-MT: M⁺=m/z 604; 'H-NMR: 2,02 ppm, 3H és 2,08 ppm 3H. Az acetát tömegspektrum-adatai erős fragmens-ionok jelenlétét mutatják m/z 179 és 322 értéknél, ami az (V) —»· (Ι)--» szekvenciának az antibiotikumban való jelenléte utal.

A BU-2867T A antibiotikumot enzimes lebontásnak vetjük alá ficinnel, 0,01 M foszfát-pufferoldatban (pH 7,0). A reakcióelegyet

2,2 pH-értékre savanyítva n-butanollal extraháljuk és így a (VII) szerkezeti képletű savszármazékot kapjuk. A vizes oldat n-butanollal 10,0 pH-értéknél végzett további extrakciója egv (VIII) szerkezeti képletű, ninhidrinre pozitív terméket eredményez. A (VII) képlete vegyület sálnkép-adatai — IR vc-o: 1720 és 1650 cm^-1; EI-MT: M⁺ H₂O: m/z 279 és M⁺ — Thr: m/z 179; valamint az ‘H-NMR spektrum is — azt mutatják, hogy a vegyület 2,4 dodekadíenoil-treonin ((V)—► (I)). A feltételezett szerkezetet megerősíti az a tény is, hogy a (VII) képletű vegyület 6 n sósavoldattal hidrolizálva a fenti (I) aminosavat és (V) vegyületet adja termékként. A (VIII) képletű vegyület 6 π sósavoldattal forralva a (II), (III) és (IV) savakat adja a vékonyréteg-kromatográfiai elemzés szerint. A (VIII) képletű vegyület R(-MS színképe egy molekuláris ion jelenlétét mutatja m/z 241 értéknél, ami a ciklikus peptid-szerkezetet bizonyítja. A vegyület Ή-NMR színképe (270 MHz, DMSO-d₆) két amid NH-proton jelenlétét mutatja (7,43 ppm, triplett és 9,10 ppm, széles), ami szintén összhangban van a feltételezett ciklikus szerkezettel. A széleskörűbb kölés-felbontási kísérlet eredményei azt mutatták, hogy a (III) aminosav aminocsoportja

-6197945 és a (IV) aminosav ε-aminocsoportja karbonilcsoporthoz van kötve és így amidot képez, míg a (IV) aminosav α-aminocsoportja szabad. Mindezek a kísérleti eredmények a (VII) illetőleg (VIII) képlet szerinti szerkezetet igazolják.

A BU-2867T A antibiotikum enzimes lebontása vagy papainnal Vagy kimopapainnal történő hidrolízise során szintén keletkezik a (VII) és (VIII) képletű vegyület. 4 g BU-2867T A és 50 g papain (Sigma P-3375) elegyét 20 liter 10%-os vizes metanolban 28°C hőmérsékleten 22 óra hosszat keverjük, majd az elegyet ecetsavval 3,3 pH-értékre savanyítva 10 liter etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos kivonat bepárlása útján 6,3 g olajszerű maradékot kapunk; ezt szilikagélen (Wakogel C-200, 250 ml) diklór-metán és metanol 9:1 arányú elegyével kromatografálva

3,3 g (VII) képletű vegyületet kapunk, félig tiszta, olajszerű alakban. Ennek az olajszerű terméknek Sephadex LH-20 gyantán történő további kromatografáiása és ezt követően kristályosítás útján tiszta (VII) képletű vegyületet kapunk színtelen tűkristályok alakjában; hozam: 1,15 g (az elméleti hozam 50%a); op.: 90—91°C; [<x]²⁷=+17,4° (c=0,5, metanolban).

Elemzési adatok: a C₁₆H₂₇NO₄.H₂O képlet alapján számított értékek: C 60,93%, H9,27%, N4,44%;

talált értékek: C 61,34%; H9,03%,

N 4,20%

EI-MT: m/z 279 (M⁺-H₂O).

UV X_max (CH₃OH) nm ( ): 260 (28 000).

IR (KBr): v_max=3520, 3410, 3300, 1720, 1690, 1655, 1630 stb. cm-'.

‘H-NMR (80 MHz, DMSO-d₆): 6=0,88 (3H, t), 1,06 (3H, d), 6,20 (3H, m), 7,00 (1H, m), 7,84 (1H, d, NH) stb.

Az elegyet etil-acetáttal extraháljuk, a savas vizes fázist elkülönítjük és bepároljuk szárazra. A kapott 36 g maradékot vízben oldjuk (50 ml), az oldatot 9,0 pH-értékre állítjuk be és fordított fázisú szilícium-dioxid C₁₈, Merck, (1,6 liter) oszlopra visszük. Az oszlopot vízzel eluáljuk; a (VIII) képletű vegyületet tartalmazó frakciókat egyesítjük és vákuumban bepároljuk. A maradékot 250 ml Sephadex LH-20 gyantán kromatografáljuk 50%-os vízzel metanollal, majd fordított fázisú szilícium-dioxid (C_I8) oszlopon, amelyet híg sósavval 3,0 pH-értékre savanyított vízzel eluálunk. Az eluátumból 747 mg tiszta (VIII) képletű vegyületet (az elméleti hozam 35%-a) kapunk a 190°C-on bomlás közben olvadó hidroklorid alakjában; [a]²⁶=—113° (c=0,5, H₂O). ^d

EI-MT: m/z 241 (M⁺).

UV: vég-abszorpció.

IR (KBr): v_max=3400, 1660, 1620, 1530, stb. cm '.

'H-NMR (80 MHz, DMSO-d₆): 6=1,27 (3H, d), 1,4-1,8 (4H), 2,98 (2H, m), 4,52 (1H, m), 6,19, (1H, d), 6,45 (1H, dd), 7,43 (1H, t, NM), 9,46 (1H, d, NH).

Elemzési adatok: a CnH9N3O3.HCl.H2O képlet alapján számított értékek: C 44,67%, H 7,50%,

N 14,21%, Cl 11,99%;

♦alált értékek: C 45,04%, H7,82%,

N 13,81%, Cl 12,55%.

A BU-2867T A antibiotikum ninhidriddel negatív reakciót ad és nem tartalmaz Bírálható csoportot, ezért logikusan következik, hogy ez az antibiotikum a (VII) képletű vegyületből és ehhez peptid-kötéssel kapcsolódó (VIII) képletű vegyületből áll.

n sósavoldattal melegítve mind a BU2867T B, mind a BU-2867T C antibiotikumból ugyanazt az aminosav-komplexet kapjuk, mint a BU-2867T A antibiotikumból. Ha e két antibiotikum hidrolizátumából a zsirsav-molekularészeket extraháljuk és diazo-metánnal kezeljük, akkor a BU-2867T B és C antibiotikumokból egyaránt a megfelelő metilésztert [az alábbiakban: (IX), ill. (X) vegyület] kapjuk. Ezek az észterek megtartják az eredeti antibiotikumra jellemző UV-maximum értéket: Vnax (CH₃OH)=260 nm. A (IX) észter EI-MS spektruma molekuláris iont mutat m/z 236nál, ami azt mutatja, hogy ez a vegyület három kettőskötést tartalmazó 14 szénatomos karbonsavészter. Az UV és Ή-NMR spektrumok határozottan 2(E),4(E)-diénsav szerkezetet mutatnak, egy különálló harmadik kettőskötéssel a (IX) vegyületben.

A (IX) vegyület ozonolízise és a kapott ozonid ezt követő lebontása útján egy n-hexanol származékot kapunk, amelyet elkülönítés után 2,4-dinitro-fenil-hidrazonként azonosítottunk (EI-MT M⁺: m/z 280). Ezek az adatok azt bizonyítják, hogy a (IX) vegyület 2(E) ,4(E),8-tetradekatriénsav-metilészter.

A (X) észter (EI-MT M⁺: m/z 238) molekulatömege alapján ez a vegyület egy C₂H₄egységgel többet tartalmaz, mint a (VI) vegyület, ami megfelel a BU-2867T A és a BU-2867T C antibiotikumok közötti molekulaképiet-különbségnek. Ez a tény, az Ή-NMR és UV spektrum-adatokat is figyelembe véve arra mutat, hogy a (X) vegyület 2 (E) ,4 (E) tetradekadiénsav-metilészter.

A fent leírt kísérleti adatok tehát azt mulatják, hogy a BU-2867T A, B és C antibiotikumok szerkezete az (A) általános képletnek felel meg; ahol az R jelentése az egyes antibiotikumokban:

3U-2867T A: R=CH₃-(CH₂)₆3U-2867TB: R=CH₃-(CH₂)₄-CH=CH- (CH₂)₂3U-2867T C: R=CH₃- (CH₂)₈-7197945 \D ίο kJ

O *3 kO

CS

I

O

CQ

			r. *		o
			cm Σ		o
			00	+	o
			·. *	£	kO
u		ω	co 00		on
o un		Ο 4	se	00			on
	u	Zi		<r	r—	on	on
CS	o	<β	oo co	un	kO	*	*
1	<r	4	<r <r		0x1	o	τ—
cn	o	SC	Ft Ft
Γ-.	Τ-	σ»	cn on
CS	Ι	CM	kO kO
		Ο
			o o

. táblázat

A BU-2867T A, B es C antibiotikumok fizikai-kémiai tulajdonságai

	Γ--	on
	r-	CS
	Ft		o
	cn	cn	o
o			o
CM	z,	Z +_
se		2	oo

w	kJ			on	kO	cn	kO			on
H	o				Ft		<r	1—		cn
r·'-	IX	o		kD	00	co	un	kO	·»	<·
kO		o		O				es	o	r-
oo		<r		4·	se	se
es		on	o	z
1	kJ	CM	o	kO	r,	.«
So	'Φ	1	es	4-	τ—	CTs
tí	X	CM	Cn	se		00
	0)	cn	1	cn	Ft	f
		CM		CM	o	o
				o	kO	kO
					o	o

0 Pn «—1
	*tü
	4-1			00	Ρ-»
	C0			un
<d	•pj			«.	Ft
	kJ			o	o
H	Já			T—	T—		o
r--	53		o				o
k£>	4-1		CM	z	z	+	o
00			se			E
es			CM	Ft	»1		m
1			>s^	kO			on
S3	3	o		un	kO	o
se	a)	0	•	«<.	Ft	es
	1-M	»—	kO	00	00	un	v—
	0)	kO o	O				kO
	AJ	CM o	4-	se	se		es
	3	i --	z
	**p4	cn ^-	4-	F	Ft
	N	un T-	4-	es	o
	zn	cs |	se	es	cn
			r>	Ft	Ft
			<M		o
			U	\O	kO
				o	o

un on <r

O kO u

kJ φ

tx k«Z •AJ

	un	Pí U~|
								F	*d·	F	on
								kJ l	··	kJ oo	··
		se						00 Φ	un	oo ^-	un
		o						o g	un	O 1	kO
		σ»					ω	JJ Φ		AJ CX
		se						CÖ r*J		3 P4
		Q			x—\ ζ«-\		a	Ö		6
					&xS fr-S		O	o	o	o
		Ft	··		k-z k-X		ö	P AJ	CM	kJ ’	CM
		un	co					AJ	se		se
		Ft	•pj		4-»			1 o		• kJ
		o	N		4-»	N		OO S	1	Pn O	1
		II	*rJ		O		se	Φ 0		T—I co
		υ		AJ	AJ AJ	s	o X	AJ 3	se	0 0	se
			3	0)	''rJ	Φ 3	Φ xO	o	Ψ4 kJ	o
			3	<—J	g ^cO		£ g	kJ t—1	\e>	• je	ΙΛ
00			cO	ex	“~3 r—4			Pn ·Η	se	Pn υ	se
Φ			O	^Φ	N cO	H	3 N	CM	3 ·Η	CM
1”J		4-	kJ	-X	CO AJ	s		□ co	o	Pn pj	o
ί-1		CM Q				1				00
0)	ex	bj	•rj			1—i	>	'Φ		co
’-J	o	t!-i			W	S3	>		z

-8197945

A BU-2867T antibiotikumok Pseudomonas-aciláz enzimmel történő lebontása útján más lebontási termékeket kapunk, mint a fentebb leírt, ficinnel vagy papainnal lefolytatott hidrolízis esetén. A Pseudomonas Pa-129 törzset 10 liter 2% oldható keményítőt, 0,2% glükózt, 3% szójalisztet, 1% kalcium-karbonátot és 0,3% magnézium-szulfát-heptahidrátot tartalmazó tápközegben 37°C hőmérsékleten 3 napig szaporítjuk, majd a sejteket centrifugálással elkülönítjük. Az elkülönített sejteket 1 — 1 liter nátrium-klorid-oldattal kétszer mossuk, majd 0,75 liter nátrium-klorid-oldatban szuszpendáljuk őket. Ezt a sejt-szuszpenziót 1,5 liter vízzel készített, 75 g nátrium-alginátot és 75 g karboxi-metil-cellulózt tartalmazó, autoklávban sterilizált szuszpenzióval keverjük, majd a kapott elegyet keverés közben leöntjük 30 liter 0,1 mólos kalcium-klorid-oldatba. A sejtekbe zárt gélt 25%-Os glutár-aldehid-oldattal való keverés útján merevítjük és egy 4,0X175 cm méretű oszlopba töltjük. Ezen az oszlopon 1,5 g BU-2867T A 30 liter 20%-os vizes metanollal készített oldatát vezetjük át óránként 0,4-0,8 liter áramlási sebességgel. Az oszlopról távozó folyadékot azután egy 300 ml Amberlite IRC-50 gyantát (70% NH₄ ⁺ alakban, pH=6,7) tartalmazó oszlopon, majd ezt követően egy 300 ml HP-20 gyantát tartalmazó oszlopon vezetjük át. Az IRC-50 oszlopot vízzel mossuk, majd 1,5 n ammónium-hidroxi-oldattal eluáljuk. A ninhidrinnel pozitív reakciót mutató frakciókat egyesítjük, bepároljuk és a maradékot liofilizáljuk. Ily módon 800 mg halványsárga szilárd terméket kapunk, amelyet egy 250 ml szilícium-dioxidot (C,8) tartalmazó fordított fázisú oszlopra viszünk. Az oszlopot közepes nyomás alatt vízzel eluáljuk, a ninhidrinnel pozitív reakciót mutató eluátumokat egyesítjük és bepároljuk. 612 mg (XI) képletű L-treonil-ciklíkus amint (az elméleti hozam 62%-a) kapunk; op.: 170°C; [a]²⁷=157° (c=0,5,H2O)

EI-MT: m/z 342 (M+).

UV: vég-abszorpció.

IR (KBr): v_műX=3350, 3280, 1650, 1620, 1530 stb. cm^-1

Ή-NMR (80 MHz, DMSO-d₆): 6=1,05 (3H, d), 1,21 (3H, d), 1,4-2,2 (4H), 4,35 (2H, m),4,47 (1H, m, OH), 4,62 (lH,d, OH), 6,16 (1H, d), 6,42 (1H, dd), 7,36 (1H, t, NH), 8,62 (1H, d, NH).

A HP-20 oszlopot 1 liter vízzel eluáljuk, majd az eluálást 0,1 n nátrium-hidroxid-oldat és metanol 1:2 arányú elegyével folytatjuk. Az (V) képletű 2,4-dodekadiénsavat tartalmazó frakciókat egyesítjük, 300 ml térfogatra bepároljuk, majd 2,0 pH-értékre savanyítjuk. Ezt az oldatot azután 300 ml etil-acetáttal, majd 100 ml n-butanollal extraháljuk. Az etil-acetátos kivonat bepárlása útján olajos maradékot kapunk, ezt 800 ml Sephadex LH-20 oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot metanollal eluáljuk és az eluátumokat a 260 nm-nél mutatott UV abszorpció alapján vizsgáljuk. A kívánt terméket tartalmazó eluátumokat egyesítjük és bepároljuk; maradékként 259 mg tiszta (V) képletű vegyületet kapunk színtelen lemezes kristályok alakjában; hozam: 53%; op.: 48—49°C.

UV: k_max (CH₃OH) nm (ε)=258 (24 000).

IR (KBr): v_max=1680, 1630, 1605, 1410, 1300 cmΉ-NMR (80 MHz, CD₃OD): 6=0,89 (3H, t) 2,0 (1OH), 2,12 (2H, m) 5,75 (1H, d), 6,16 (2H, m), 7,21 (1H, m). A vegyület azonos a BU-2867T A antibiotikum savas hidrolízise utján kapott 2,4-dodekadiénsavval. Az n-butanolos kivonat vákuumban történő bepárlása és a maradék liofilizálása útján 160 mg BU2867T A kiindulási anyagot (11%) nyerünk vissza.

A fentiek alapján nyilvánvaló, hogy a (VIII) és (IX) képletű vegyületek előnyös kiindulási anyagok a találmány szerinti új antibiotikumok előállítására. A szokásos acilezési műveletek, például a karbonsav és valamely szénsav-alkilészter (HOCOOR) vegyes anhidridjével való reagáltatás útján a kívánt peptidkötés könnyen kialakítható; vö.: Advanced Organic Chemistry, Fieser, 1039— 10‘6.old., Reinhold Publishing Corporation, New York, 1965. A hidroxilcsoportok a szokásos módon, például tetrahidropiranil- vagy tere-butil-észter képzése útján védhetők az acrezési reakció során. A (VIII) képletű vegyidet aminocsoportjának a (XII), (ΧΙΠ) illetőleg (XIV) karbonsavakkal való acilezése útján a BU-2867T A, BU-2867/ B illetőleg BU-2867T C antibiotikumhoz jutunk. így például a BU-2867T A antibiotikum a (VII) képletű karbonsav és a (VIII) képletű ciklikus am n, vagy az (V) képletű karbonsav és a (XI) képletű vegyület kapcsolása útján állítható elő, amint ezt az alábbi 2. és 3. példa szemlélteti.

2. példa mg (VII) képletű vegyület, 10 mg N,N’-diciklohexil-karbodiimid és 8 mg 1 hidroxi-1,2,3-benzotriazo! elegyét 2 ml dimetil-formam dban szobahőmérsékleten 2 óra hosszat keverjük, majd 10 mg (VIII) képletű vegyületet adunk hozzá és a keverést éjjelen át folytatjuk. A kapott oldatot bepároljuk és a maradékai fordított fázisú szilícium-dioxid (C₁₃, 40 ml) oszlopon kromatografáljuk, 80%-os metanollal eluálva. A kívánt terméket tartalmazó eluátumokat egyesítjük és bepároljuk, a maradékot preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiával (oszlop: SSD-ODS -842, mobil fázis: 90%-os vizes metanol) tisztítjuk. Az aktív frakció bepárlása utján 7,4 mg BÚ 2867T A antibiotikumot (az elméleti hozam 28%-a) kapunk; a termék minden tekintetben azonos a természetes antibiotikummal.

Vékonyréteg-kromatográfiai vizsgálat/sziláncs, C₂H₆OH : H₂O=55:45/: R_z=0,45.

Nagynyomású folyadékkromatográfiai vizsgálat (Lichrosorb RP-18, C₂H₅OH : H₂O= =65:35/: Rt=6,43 perc.

-9197945

3. példa

3,4 mg (V) képletű vegyület, 3,7 mg N,N’-diciklo-hexil-karbodiimid és 2,8 mg 1-hidroxi-1,2,3-benzotriazol elegyét 1 ml dimetil-formamidban szobahőmérsékleten 2 óra hosszat keverjük. Az oldathoz azután 5 mg (XI) képletű vegyületet adunk és a keverést további óra hosszat folytatjuk, majd a reakcióelegyet vákuumban bepároljuk. A maradékot metanolban oldjuk és preparatív nagynyomású íolyadékkromatográfiával tisztítjuk, az előzőekben említettel azonos oszlop és azonos mobil fázis alkalmazásával. Ily módon mg BU-2867T A antibiotikumot (az elméleti hozam 45%-a) kapunk. A termék vékonyrétegés nagynyomású folyadékkromatográfiai vizsgálati adatai egyeznek a 2. példában megadottakkal; a terméknek a természetes BLJ2867T A antibiotikummal való közvetlen öszszehasonlítása is a két anyag azonosságát igazolja.

A kiindulási anyagként alkalmazott (XI) képletű vegyület szokásos módszerek alkalmazásával állítható elő a (VIII) képletű vegyületből. 44 mg N-terc-butoxi-karbonil-L-treonin, 40 mg Ν,Ν’-diciklohexil-karbodiimid és 30 mg l-hidroxi-l,2,3-benzotriazol elegyét 4 ml dimetil-formamidban szobahőmérsékleten keverjük és 40 mg (VIII) képletű vegyületet adunk hozzá. További keverés után a reakcióelegyet vákuumban bepároljuk és a maradékot fordított fázisú szilikagél (C₁₈, 40 ml) oszlopon kromatografáíjuk; metanol és víz 1:9-től 2:3-ig változó arányú elegyével eluálunk. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, vákuumban bepároljuk és a maradékot liofilizáljuk; ily módon 51 mg N-BOC-L-treonil-VIII (=BOC-XI) vegyületet (az elméleti hozam 69%-a) kapunk BOC=butoxi-karbonil-csoport).

IR (KBr): vg=o = 1690 és 1640 cm'¹.

'H-NMR (80 MHz, DMSO-d₆): 0=1,00 (3H, d), 1,22 (3H, d), 1,35 (9H, S), 6,11 (IH, d), 6,33 (IH, dd) stb. ppm.

mg BOC-XI vegyület és 1 ml hangyasav elegyét szobahőmérsékleten 1 óra hosszat keverjük. A reakcióelegyet bepároljuk, 1 ml vízzel hígítjuk, majd 10,0 pH-értékre állítjuk be. Ezt az elegyet fordított fázisú szilikagél (C_l8, 20 ml) oszlopra visszük. Az oszlopot vízzel eluáljuk és az eluátumot ninhidrinnel vizsgáljuk. A kívánt terméket tartalmazó eluátum-frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. Ily módon 25 mg (XI) képletű vegyületet (az elméleti hozam 88%-a) kapunk fehér szilárd termék alakjában.

IR (KBr): voo=1650 cm^-1.

'H-NMR (DMSO-d₆): 6=1,04 (3H, d), 1,22 (3H, d), 6,14 (IH, d), 6,42 (IH, dd), 7,35 (IH, t, NH), 7,98 (IH, d, NH), 8,65 (IH, d, NH) stb. ppm.

EI-MT. M⁺ m/z 342.

így tehát a találmány szerinti új antibiotikumok szintetikusan előálIíthatók bármilyen forrásból kapott (VIII) és (XI) képletű 10 vegyületekből, a megfelelő savakkal történő reagáltatás útján. Továbbá, a (VIII) és (XI) kiindulási anyagokból előállított vegyületekből további, ugyancsak a találmány körébe tartozó antibiotikumok is előállíthatok. így például a szintetikusan előállított vagy nagyobb hozammal fermentáció útján nyerhető BU-2867T A antibiotikum felhasználható a BL-2867T B illetőleg BU-2867T C antibiotikumnak az előállítására, enzimes hidrolízis és a kívánt savval a fent leírt módon történő reagáltatás útján.

A BU-2867T antibiotikumok fermentáció útján történő előállítása során a kapott hozam, valamint az A, B és C frakciók egymás közötti aránya a Polyangium brachysporum K48B101 mikroorganizmussal való fermentáció esetén különféle zsíroknak és olajoknak, továbbá bizonyos felületaktív szereknek a fermentációs közeghez adása útján befolyásolhat). így például, ha szójaolajat, tengericsiraolajat, olívaolajat, hidrogénezett növényi olajat adunk a fermentációs közeghez, a BLJ2867T antibiotikumok összhozama növelhető. Hasonló hatás érhető el kisebb mértékben sertészsír vagy faggyú hozzáadása útján is^-. Linolsavat (C_18;2) nagy mennyiségi arányban tartalmazó zsírok és olajok, mint szójaolaj, tengericsíraolaj vagy sertészsír hozzáadása nö\eli a BU-2867T B antibiotikum mennyiségi arányát a termékben. Oleinsavat (C_I8.,) nagy mennyiségi arányban tartalmazó olajok mint az olívaolaj, a BU-2867T C antibiotikum képződési arányát növelik. Hidrogénezett növéryi olajok, amelyek sztearinsavban (C₁₈.₀) gazdagok, csupán a BU-2867T A antibiotikum mennyiségi arányát növelik.

Antimikrobiális aktivitás:

A BU-2867T A, B és C antibiotikumok különféle mikroorganizmusokkal szembeni minimális gátló koncentrációját (MIC) agar-sorozathígítási módszerrel határozhatjuk meg. Eiken-féle agar-tápközeget alkalmaztunk a bal· tóriumok szaporítására és Sabouraud-dextróz agart (Difco) a gombák szaporítására. Az inokulum koncentrációját baktériumok esetében 10⁴ CFU/ml-re, gombák esetében 10⁵—10⁷ CFU/ml-re állítottuk be a meghatározási kísérlet során.

A kapott eredményeket, a BU-2867T A, B és C antibiotikumok in vitro mutatott baktérium' llenes aktivitását az 5. táblázatban foglal! uk össze. Az A és C komponensek nem gátollak a gram-pozitív és gram-negatív baktér umok fejlődését 50 pg/ml koncentrációban, míg a B komponens mérsékelt aktivitást mutatott egyes gram-pozitív baktériumok ellen.

A BU-2867T antibiotikumok gombaellenes aktivitását a 6. táblázat mutatja. A C komponens erős gombaellenes aktivitást mutatott olyan klinikailag fontos patogén gombák ellen, mint a Candida albicans, Cryptococcus necformans, Aspergillus fumigatus, Trichophyton mentagrophytes és Mucor spinosus.

-10197945 ²⁰

Az A és B komponensek valamivel kisebb ak- baellenes spektrumuk azonban hasonló volt a tivítást mutattak, mint a C komponens, gom- ‘3 komponenséhez.

5. tábla'zat

A BU-2867T komponensek	bakteriumellenes	spektruma
Gram-pozitív organizmusok		MIC /pg/ml/
		BU-2867T A	BU-2867T B	BU-2867T C
Staphylococcus aureus	209P	>50	25	>50
11 11	Smith	>50	3,1	>50
tf 11	Bx-1633	>50	50	>50
Staphylococcus
epidermidis	D153	>50	6,3	>50
11 II	A22152	>50	50	>50
Streptococcus
faecalis	A9612	>50	>50	>50
Micrococcus
luteus	PCI-1001	>50	>50	>50
Bacillus subtilis	PCI-219	>50	>50	>50
Gram-negatív organizmusok
Escherichia coli Klebsiella	NIHJ	>50	>50	>50
pneumoniae	D-1 1	>50	>50	>50
Proteus mirabilis	A9554	>50	>50	>50
Proteus vulgáris Morganella	A9436	>50	>50	>50
morganii	A9553	>50	>50	>50
Serratia
marcescens	A20222	>50	>50	>50
Enterobacter
cloacae	A9659	>50	>50	>50
Pseudomonas
aeruginosa	A9930	>50	>50	>50

Közeg: agaros tápoldat

6. táblázat
A BU-2867T komponensek gombaelleaes	spektruma
Organizmusok	MIC /pg/ml/
BU-2867T A	BU-2867T B	BU-2867T C
Candida albicans IÁM 4888 3,1	3,1	1,6
A 9540 1,6	1,6	0,8
Cryptococcus
neoformans D 49 25	25	3,1
IÁM 4514 25	25	3,1

-11197945

22

6. táblázat (folytatás)

Organizmusok			MIC /ug/ml/
		BU-2867T A	BU-2867T B	BU-2867T C
Aspergillus
fumigatus	IÁM 2530	1,6	3,1	0,8
11 ti	IÁM 2034	1,6	3,1	0,8
Aspergillus flavus FA 21436	25	25	50
Fusarium
moniliforme	A 2284	>50	>50	>50
Piricularia
oryzae	A 91	>50	>50	>50
Trichophyton
mentagrophytes	D 155	25	12,5	1,6
11 11	# 4329	25	12,5	6,3
Blastomyces
dermaditis	IFO 8144	50	50	>50
Sporothrix
schenckii	IFO 8158	> 50	>50	>50
Petriellidium
boydii	IFO 8073	>50	>50	>50
Mucor spinosus	IFO 5317	1,6	0,8	0,2
		Közeg:	Sabouraúd-dextro'z agar

Tumorellenes aktivitás:

A BU-2867T A, B és C antibiotikumok tumorellenes aktivitását nőstény CDF, és hím BDF, egereken határoztuk meg. CDF, és BDF, egereket P388 limfocitás leukémiával, továbbá BDF, egereket L1210 limfoid leukémiával oltottunk be, 10® illetőleg 10⁵ sejtet tartalmazó 0,8 ml hígított ascites-folyadék intraperitoneális injekcióban történő beadása útján. BDF, egereket B16 melanózisok melanomával fertőztünk 0,5 ml 10%-os tumor-szuszpenzió intraperitoneális beadása útján. A vizsgált antibiotikumokat 10% dimetil-szulfoxidot tartalmazó 0,9%-os nátrium-klorid-oldatban oldva adtuk be fokozatosan növekvő adagokban az egereknek intraperitoneális úto.n, 24 „ órával a tumorral történő fertőzés után. ösz³³ szehasonlításul NSC 38270 olivomicint vagy

C rnitomicint alkalmaztunk ugyanilyen kísérleti körülmények között.

A BU-2867T A, B és C antibiotikumok tumorellenes aktivitást mutattak a P388 leuké⁴⁰ mia ellen; az antibiotikummal való kézelést napi egyszeri adaggal végeztük a kísérlet 1., 4. és 7. napján. A kapott eredményeket az alábbi 7. táblázatban foglaltuk össze, az átlagos túlélési idő növekvése alapján, a vizsgált állatok és a kontroll állatok túlélésének T/C értékével (T=teszt-állatok, C=kontroll-állatof). Szignifikáns tumorellenes hatásnak a 125 és ennél nagyobb T/C%-értékeket tekintjük.

7. táblázat;

A BU-2867T komponensek tumorellenes aktivitása P388 leukémia ellen

Hatóanyag	Átlagos túlélési idő T/C X
napi adag	mg/kg i.p. 0,3 0,1
3	1
BU-2867T A		140	130 120
BU-2867T B	165	140	120
BU-2867T C	155		130
Olivomicin A	140	135	100

-12197945

Amint a fenti adatokból látható a BU2867T A és C nagyfokú aktivitást mutat a P388 leukémia ellen. Egy további kísérletsorozatban 9 napig tartó kezelést alkalmaztunk, napi egy gyogyszeradag beadásával. Ebben a kisérletsorozatban a BU-2867T A és C ugyancsak igen hatásosnak bizonyult a P388 leukémia ellen, ugyanakkor a BU-2867T A ke²⁴ vésbé bizonyult aktívnak az L1210 leukémia és B16 melanoma ellen. A kísérleti eredményeket az alábbi 8. táblázatban foglaltuk ősz;ze, az átlagos túlélési idő %-os emelkedése szerint; a 125 és ennél nagyobb %-értékeket tekintjük szignifikáns tumorellenes hatás jelének.

8. tábláját

A BU-2867T A és C tumorellenes aktivitása

Átlagos túlélési id# T/’C £

	2	1	napi adag	mg/kg 0,13	i.p. 0,063	0,031
0,5	C,25
P388 leukémia
BU-2867T A	67	288	186	156	147	136	109
BU-2867T C	234	189	175	159	153	123	100
Mitomicin C		290	240	170	150	130	115
L1210 leukémia
BU-2867T A			129	1 18	1 18	106
Mitomicin C		140	141	1 29	129	106
B16 melanoma
BU-2867T A	tox.	125	116	1 13	100
Mitomicin C	63	181	163	141	131

A BU-2867T A és C antibiotikumok akut toxikusságát hím ddY egereken határoztuk meg egyszeri intraperitoneális beadás útján. A BU-2867T A antibiotikum LD₅₀-értéke: 8,1 mg/kg; a BU-2867T C antibiotikumé: 25 mg/kg.

A találmány szerinti eljárással előállítható új antibiotikumok a szokásos galenikus gyógyszerészeti módszerekkel alakíthatók az emberek és emlős állatok orális vagy parenterális úton történő gyógykezelésére alkalmas gyógyszerkészítményekké. Ezekben a gyógyszerkészítményekben a szokásos, gyógyászati szempontból elfogadható és parenterális, enterális vagy helyi kezelésre alkalmas szervetlen vagy szerves vívőanyagokat és/vagy egyéb gyógyszerészeti segédanyagokat alkalmazzuk· a szokásos gyógyszerkészítési módszerekkel; vívőanyagként a hatóanyaggal kémiailag összeférő, azzal nemkívánt kémiai reakcióba nem lépő szilárd, félszilárd vagy folyékony anyagokat alkalmazunk. Az alkalmas vívőanyagok példáiként a víz, sóoldatok, alkoholok, arabmézga, növényi olajok, polietilén-glikolok, zselatin, tejcukor, amilóz, magnézium-sztearát, talkum, kovasav, petrolátum, illóolajok, zsírsav-monogliceridek és -digliceridek, pentaeritrit-zsírsavészterek, hidroxi-metil-cellulóz, polivinil-pirrolidon és hasonlók említhetők. A gyógyszerkészítmények a szükséghez képest

4Q sterilizálhatok; kívánt esetben egyéb segédanyagok, mint simítószerek, tartósító-, stabilizáló-, nedvesítő- és/vagy emulgeálószerek, az ozmózisos nyomás befolyásolására alkalmas sók, pufferanyagok, színező-, illatósítóés/vagy aromaanyagok és hasonló, a ható⁴$ anyagokkal kémiailag összeférő anyagok is adhatók a készítményekhez.

Parenterális beadás céljaira steril injektálható oldatok, előnyösen olajos vagy vizes oldatok, valamint szuszpenziók, emulziók vagy implantátumok készíthetők; a készítmények adagolási egységeit célszerűen ampullákba tölthetjük.

Rektális beadás céljára végbélkúpok ké„ szEhetők, a szokásos végbélkúp-alapanyagokkal.

Enterális beadásra tabletták, drazsék vagy kapszulák készíthetők, amelyekben a hatóanyag mellett vívőanyag illetőleg hígítószer gyanánt talkumot vagy valamely szénhidráθθ tót, célszerűen tejcukrot, kukoricakeményítőt és/\ragy burgonyakeményítőt alkalmazhatunk. Szirupok, elixirek és hasonlók is készíthetők orális beadás céljaira, célszerűen édesített folyékony vívőanyaggal. Készíthetők a hatóanyagot késleltetetten vagy időben el13

-13197945 nyújtottan felszabadító készítmények is, például különböző módon oldódó bevonatokkal, többszörös bevonatokkal, mikrokapszulázott alakban stb.

A találmány szerinti eljárással előállítható hatóanyagokat általában adagolási egységekként alakítjuk gyógyszerkészítményekké; ezek a kívánt egyszeri adagnak megfelelő mennyiségű hatóanyagot tartalmaznak alkalmas vívőanyag és/vagy segédanyag kísérletében. Az ilyen adagolási egységeket annak figyelembevételével készíthetjük, hogy a találmány szerinti hatóanyagok célszerű napi adagja — 75 kg átlagos súlyú emberekre számítva — általában 5 mg és 250 mg között lehet. Az adott esetben szükséges adagolási módot a hatóanyag aktivitásától, a kezelendő kóros állapot jellegétől és súlyosságától és egyéb szokásos tényezőktől függően az orvos állapíthatja meg.

A fentiekben a találmány szerinti eljárást, valamint a találmány szerinti hatóanyagokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítását általánosságban és konkrét példákban is ismertettük; a szakmabeli számára nyilvánvaló, hogy a leírt konkrét kiviteli módoktól az alábbi igénypontok keretében számos különböző változtatás és módosítás is lehetséges, az adott körülményektől függően.

Claims (9)

1. Eljárás az (A) általános képletű BU2867T A, BU-2867T B és BU-2867T C antibiotikumok — ebben a képletben R CH₃-(CH₂)₆-csoportot (BU-2867T A), CH₃- (CH₂)₄-CH=CH- (CH₂)₂-csoportot (BU2867T B) vagy CH₃-(CH₂)₈-csoportot (BU2867T C) képvisel — előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) egy Polyangium brachysporum fajhoz tartozó mikroorganizmust valamely asszimilálható szénforrást és nitrogénforrást tartalmazó tápközegben, aerob körülmények között szaporítjuk, majd a micéliumot a tápközegből elkülönítjük, és a termelt hatóanyagot a tápközegből kinyerjük; és kívánt esetben a képződött BU-2867T A, B és C antibiotikumokat egymástól elválasztjuk; vagy

b) egy (VIIA) általános képletű vegyületet — ahol R a fent megadott jelentésű — adott esetben diciklohexil-karbodiimid és 1-hidroxi-1,2,3-benzotriazol jelenlétében, a (VIII) képletű vegyülettel reagáltatunk;

c) egy (VA) általános képletű vegyületet — ahol R jelentése egyezik a fent megadottal — adott esetben diciklohexil-karbodiimid és 1-hidroxi-l ,2,3-benzotriazol jelenlétében, a (XI) képletű vegyülettel reagáltatunk. (Elsőbbség: 1986. 08. 29.)

2. Eljárás az (A) általános képletű BU2867T A, BU-2867T B és BU-2867T C antibiotikumok — ebben a képletben R CH₃- (CH₂)₆-csoportot (BU-2867T A), CH₃- (CH₂)₄-CH=CH- (CH₂)₂-csoportot (BU14

2867T B) vagy CH₃-(CH₂)₈-csoportot (BU2867T C) képvisel — előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely Polyangium brachysporum fajhoz tartozó mikroorganizmust valamely asszimilálható szénforrást és nitrogénforrást tartalmazó tápközegben, aerob körülmények között szaporítjuk, majd a micéliumot a tápközegböl elkülönítjük és a termelt hatóanyagot a tápközegből kinyerjük; és kívánt esetben a képződött BU-2867T A, B és C antibiotikumokat egymástól elválasztjuk. (Elsőbbség: 1985. 08. 30.)

3. Eljárás az (A) .általános képletű vegyületek — ebben a képletben R CH₃-(CH₂)₆-, CH₃-(CH₂)₄-CH=CH-(CH₂)₂- vagy CH₃(CH₂)₈-csoportot képvisel — előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) egy (VIIA) általános képletű vegyületet — ahol R a fent megadott jelentésű — adott esetben diciklohexil-karbodiimid és I-t idroxi-1,2,3-benzotriazol jelenlétében, a (VIII) képletű vegyülettel reagáltatunk;

b) egy (VA) általános képletű vegyületet — ahol R jelentése egyezik a fent megadottal — adott esetben diciklohexil-karbodiiriid és I-hidroxi-1,2,3-benzotriazol jelenlétében, a (XI) képletű vegyülettel reagáltatunk. (Elsőbbség: 1986. 04. 25.)

4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorgnizmusként az ATCC 53080 sz. alatt deponált Polyangium brachysporum nova sp. K481-BI01 törzset akalmazzuk. (Elsőbbség: 1985. 08. 30.)

5. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a termelt micéliumot a tápközegből történő elválasztás után valamely szerves oldószerrel extraháljuk, és a szerves oldószeres kivonatot hozzáadjuk a micéliumtol elkülönített tápközeghez a hatóanyag kinyerése előtt. (Elsőbbség: 1985. 08. 30.)

6. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a termelt hatóanyagot szerves oldószerrel történő extrakció útján nyerjük ki a tápközegből. (Elsőbbség: 1985. 08. 30.)

7. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hatóanyagnak a tápközegben történő termelését Candida albicans mikroorganizmussal végzett próbákkal ellenőrizzük. (Elsőbbség: 1985. 08. 30.)

8. Eljárás gombás fertőzések ellen hatásos, valamint tumorellenes gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy legalább egy, a 2. igénypont szerint előállít ott (A) általános képletű antibiotikumot — ahol R jelentése egyezik a 2. igénypontban megadott — egy vagy több gyógyszerészetiszempontból elfogadható vívőanyag és/vagy egyéb gyógyszerészeti segédanyag hozzákeverése útján orális, rektális, parenterális vagy helyi alkalmazásra felhasználható gyógyszerkészítménnyé alakítjuk. (Elsőbbség: 1985. 08. 30.)

9. Eljárás gombás fertőzések ellen hatásos, valamint tumorellenes gyógyszerkészítméryek előállítására, azzal jellemezve, hogy legalább egy, a 3. igénypont szerint előállított

-14197945 (A) általános képletű vegyületet — ahol R jelentése egyezik a 3. igénypontban megadott — egy vagy több gyógyszerészeti szempontból elfogadható vívőanyag és/vagy egyéb gyógyszerészeti segédanyag hozzákeverése útján orális, rektális, parenterális vagy helyi alkalmazásra felhasználható gyógyszerkészítménnyé alakítjuk. (Elsőbbség: 1986 04 25.)