ES2217815T3 - Sustancia gm-95, procedimiento pra su fabricacion y su utilizacion. - Google Patents
Sustancia gm-95, procedimiento pra su fabricacion y su utilizacion.Info
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Abstract
Compuesto representado por la siguiente fórmula (1). **(fórmula)**. Los inventores de la presente invención han estudiado varios compuestos producidos por microorganismos y han hallado que una sustancia que tiene actividades antitumorales se producía en un caldo de cultivo de la cepa 3533-SV4 que pertenece al género Streptomyces. Subsiguientemente, los inventores tuvieron éxito en aislar el producto activo, determinaron sus propiedades fisicoquímicas y su estructura, y comprobaron sus efectos antitumorales, para así conseguir la presente invención. La presente invención proporciona, además, un procedimiento para producir la Sustancia GM-95, que comprende cultivar un microorganismo que pertenece al género Streptomyces y es capaz de producir la Sustancia GM-95 en un medio de cultivo, y aislar la sustancia a partir del caldo de cultivo resultante.
Description
Sustancia GM-95, procedimiento
para su fabricación y su utilización.
La presente invención se refiere a un nuevo
compuesto que presenta efectos antitumorales y es útil como
medicamento, a un procedimiento para su fabricación y a
microorganismos que producen la sustancia.
Ejemplos conocidos de un macrólido que tiene dos
o más anillos de oxazol incluyen las Ulapualidas A y B (Journal
of the American Chemical Society, 108,
846-847, 1986) que se extraen de los nudibránquios
(caracoles marinos sin concha del suborden Nudibranchia que
tienen unos apéndices respiratorios externos, a menudo ramificados
en el dorso y los lados) y poseen actividades antitumorales, y la
Kabiramida C (Journal of the American Chemical Society,
108, 847-849, 1986) que también se extrae de
los nudibránquios y tiene efectos antifúngicos.
A través de los documentos
US-A-5567709 y
EP-A-269322 se conocen macrólidos
que tienen actividad antitumoral producidos por microorganismos del
género Streptomyces.
Un objeto de la presente invención es obtener,
utilizando un microorganismo, un nuevo compuesto que tiene efectos
antitumorales y que es útil como medicamento, un procedimiento para
producir el mismo, y microorganismos capaces de producir el nuevo
compuesto que tiene efectos antitumorales.
Los inventores de la presente invención han
estudiado varios compuestos producidos por microorganismos y han
hallado que una sustancia que tiene actividades antitumorales se
producía en un caldo de cultivo de la cepa 3533-SV4
que pertenece al género Streptomyces. Subsiguientemente, los
inventores tuvieron éxito en aislar el producto activo,
determinaron sus propiedades fisicoquímicas y su estructura, y
comprobaron sus efectos antitumorales, para así conseguir la
presente invención.
La presente invención proporciona un compuesto de
la siguiente fórmula (1).
El compuesto anterior se denominará en lo
sucesivo "Sustancia GM-95".
La presente invención proporciona, además, un
procedimiento para producir la Sustancia GM-95, que
comprende cultivar un microorganismo que pertenece al género
Streptomyces y es capaz de producir la Sustancia
GM-95 en un medio de cultivo, y aislar la sustancia
a partir del caldo de cultivo resultante.
La presente invención proporciona también un
medicamento y un agente antitumoral que comprende la Sustancia
GM-95 como principio activo.
La presente invención proporciona, asimismo, una
composición farmacéutica que comprende la Sustancia
GM-95 y un portador farmacéuticamente aceptable para
la misma.
La presente invención se refiere, además, a la
utilización de la Sustancia GM-95 para la
fabricación de un medicamento destinado a la terapia de tumores.
Asimismo, la presente invención proporciona
microorganismos capaces de producir la Sustancia
GM-95, más específicamente microorganismos que
pertenecen al género Streptomyces.
La Figura 1 muestra un espectro de absorción en
el ultravioleta del presente compuesto tal como se obtiene en los
Ejemplos.
La Figura 2 muestra un espectro de absorción en
el infrarrojo del presente compuesto tal como se obtiene en los
Ejemplos.
La Figura 3 muestra un espectro de
^{1}H-RMN del presente compuesto tal como se
obtiene en los Ejemplos.
La Figura 4 muestra un espectro de
^{13}C-RMN del presente compuesto tal como se
obtiene en los Ejemplos.
Las propiedades fisicoquímicas de la Sustancia
GM-95 representada por la fórmula anterior (1) son
las siguientes:
1) Fórmula molecular: Cuando se mide por
espectrometría de masas de bombardeo atómico rápido, de alta
resolución, se revela el valor medido de (M+H)^{+} de
583,0790, y la fórmula molecular que corresponde al valor es
C_{26}H_{15}N_{8}O_{7}S.
2) Peso molecular: Cuando se mide por
espectrometría de masas de bombardeo atómico rápido, se revela el
valor medido de 582,0712.
3) Punto de fusión: 138-143ºC
(con descomposición)
4) Rotación específica:
[\alpha]_{D}^{20} = -9,38º, determinada a la
concentración de C = 0,129 g/100 ml (metanol).
5) Espectro de absorción en el ultravioleta:
mostrado en la Figura 1.
La medición se realizó en metanol (en una
disolución 7,39 \muM). La absorción máxima se hallaba a la
longitud de onda de 259,5 nm y la absorbancia a dicha longitud de
onda era de 0,288. El coeficiente de absorción molar
(\varepsilon) era 38982.
6) Espectro de absorción en el infrarrojo
(FT-IR): mostrado en la Figura 2.
\numax (cm-^{1}): 3421, 3147,
2958, 2923, 2854, 1733, 1670, 1650, 1544, 1496, 1438, 1392, 1351,
1315, 1267, 1199, 1174, 1118, 1087, 1058, 1033, 975, 943, 929, 914,
883, 798
7) Solubilidades en disolventes
\hskip0,9cmInsoluble en agua y en acetona.
\hskip0,9cmSoluble en una mezcla de cloroformo:metanol = 1:1
8) Color de la sustancia: polvos de color blanco
amarillento
9) Espectro de resonancia magnética nuclear
Los desplazamientos químicos del espectro de
^{1}H-RMN a 500 MHz (Figura 3) y el espectro de
^{13}C-RMN a 125 MHz (Figura 4) medidos en
disolución en una mezcla de cloroformo deuterado:metanol deuterado
= 1:1 a 25ºC se muestran a continuación.
(10) Tiempo de retención (Rt) en cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC):
Se detectó un pico a un tiempo de 6,1 minutos en
el análisis bajo las siguientes condiciones.
Condiciones analíticas:
- Columna: ODS PEGASIL (4,6 mm de diámetro interno x 250 mm, Senshu Scientific Co.)
- Fase móvil: acetonitrilo/ácido trifluoroacético/agua (70:0,1:30, v/v/v)
- Velocidad de flujo: 1 ml/minuto
- Detección: 254 nm.
La Sustancia GM-95 de la presente
invención se puede obtener cultivando una cepa de microorganismo
capaz de producir la sustancia de la invención (denominado de aquí
en adelante microorganismo productor de la sustancia
GM-95) bajo condiciones apropiadas, típicamente
bajo las condiciones que se indican más adelante. La presente
invención también abarca el microorganismo productor de la
sustancia GM-95.
Ejemplos del microorganismo productor de la
sustancia GM-95 incluyen cepas de un microorganismo
que pertenece al género Streptomyces. La presente invención
también abarca la Sustancia GM-95 que se puede
obtener cultivando un microorganismo del género Streptomyces
y recuperando el caldo de cultivo.
Un ejemplo de las cepas del microorganismo que
pertenece al género Streptomyces es la cepa
3533-SV4 del Streptomyces anulatus, y
mutantes de la misma. La cepa 3533-SV4 del
Streptomyces anulatus es una cepa de un microorganismo que
pertenece al género Streptomyces y que ha sido recientemente
aislada por los inventores a partir del suelo en
Tensui-machi, Tamana-gun,
Kumamoto-ken, Japón, y ha sido depositada en el
"National Institute of Bioscience and
Human-Technology Agency of Industrial Science and
Technology" (1-3 Higashi 1 chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón) el
12 de agosto de 1998 bajo la designación de microorganismo:
Streptomyces anulatus 3533-SV4(GM95)
(referencia de Identificación dada por el DEPOSITANTE) y el número
de depósito de FERM BP-6460.
La identificación del Streptomyces
anulatus 3533-SV4 y la investigación de sus
características microbiológicas se realizó de acuerdo con el método
del "International Streptomyces Project (ISP)". Las
características microbiológicas de la cepa 3533-SV4
del Streptomyces anulatus son las siguientes.
La cepa se hizo crecer sobre medios ISP
(International Streptomyces Project) nº 2, nº 3, nº 4 y nº 5
a 27ºC durante 14 días. Los resultados son los siguientes:
1) Ramificación de las hifas en proceso de
esporulación: ramificación simple
2) Forma de esporulación: espirales, siendo la
forma de las esporas cilíndrica
3) Número de esporas: de 10 a 50, o más
4) Superficie de las esporas: lisa
5) Tamaño de la espora: 0,3-0,5 x
0,7-1,0 \mum
6) Presencia de flagelados: no presentes
7) Presencia de esporangios: no presentes
8) Sitio de asentamiento de los esporoforos:
micelio aéreo
9) Posesión de capacidad formadora de
esclerocios: ninguna posesión
En la Tabla 2 se muestran las características de
cultivo de la cepa sobre diversos medios. Los tonos de color
relacionados con las propiedades de los medios mostrados en la
Tabla 2 se indican de acuerdo con "The Color Harmony
Manual" (edición de 1958) publicado por la "Container
Corporation of America".
1) Intervalo de temperaturas para el crecimiento:
20 - 32ºC
- Temperatura óptima: 20 - 30ºC
2) Licuefacción de gelatina: +
3) Hidrólisis de almidón: +
4) Coagulación y peptonización de leche
desnatada: +
5) Producción de pigmentos melanoides:
- Medio de agar de tirosina: -
- Medio de agar férrico de levadura y peptona: -
- Medio de caldo de levadura y triptona: +
6) Reducción de nitratos: +
7) Asimilación de fuentes de carbono (medio de
agar de Pridham Gottlieb, (ISP nº9))
| L-arabinosa | + | |
| D-xilosa | + | |
| D-glucosa | + | |
| D-fructosa | + | |
| Sacarosa | + | |
| Inositol | + | |
| L-ramnosa | + | |
| Rafinosa | + | |
| D-manitol | + |
Los productos de la hidrólisis ácida de las
células enteras fueron analizados por cromatografía en capa fina
descrita en "The Society for Actinomycetes, Japan
(ed.)", [``Experimental Method for Identifying
Actinomycetes, 6-2-70, 1985].
Como resultado, se detectó la forma LL- del ácido
diaminopimélico.
El micelio base de esta cepa no está fragmentado.
El micelio aéreo forma un eje principal largo y una cadena de
esporas espiral que consiste en 10-50 o más esporas
y tienen 4-9 rotaciones sobre las puntas de cada
micelio, irregularmente ramificadas a partir del eje. Las esporas
carecen de motilidad, tienen una forma columnar o elíptica, una
anchura de 0,3 - 0,5 \mum, una longitud de 0,7 - 1,0 \mum y una
superficie lisa. No se observan ni esclerocio, ni esporangios ni
otras formas específicas. El quimiotipo de la pared celular es del
tipo (I).
En la Tabla 2 se muestran las propiedades del
cultivo. El tono de color del micelio aéreo pertenece a la gama
cromática de amarillos. El tono de color del micelio base es
incierto y no es afectado por el cambio de pH. No se observa ningún
pigmento soluble en conjunto. Las propiedades fisiológicas son las
que se describen en el apartado anterior c). Esta cepa es mesófila.
De acuerdo con las propiedades morfológicas y el quimiotipo de la
pared celular de esta cepa, se determina que la cepa pertenece al
género Streptomyces (de aquí en adelante abreviado
"S.").
Basándose en las propiedades anteriores, se
buscaron las especies del género S. descritas en
[Approved Lists of Bacterial Names, 1980] y en las listas
subsiguientes de nombres bacterianos disponibles, y se seleccionaron
las especies relacionadas. Comparado con las propiedades de
diagnóstico del S. spheroides, las propiedades de la cepa de
la invención y el S. spheroides son casi iguales, y
distintas sólo en la asimilación de las fuentes de carbono.
De acuerdo con lo expuesto, la cepa de la
invención es una nueva cepa que se parece estrechamente al S.
spheroides. Sin embargo, el S. spheroides viene definido
como un sinónimo del S. anulatus por Williams et al.
en "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology", vol.
4. Por consiguiente, la cepa 3533-SV4 de la
invención se identifica como una cepa que pertenece al S.
anulatus y se denomina cepa 3533-SV4 del
Streptomyces anulatus.
A continuación se incluyen comparaciones entre la
cepa y la especie relacionada.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La Sustancia GM-95 de la presente
invención se puede producir cultivando diversos microorganismos
productores de sustancia GM-95, por ejemplo,
pertenecientes al género Streptomyces, tales como la cepa
3533-SV4 o un mutante de la misma, que tengan las
características microbiológicas anteriores, en un medio adecuado,
separando de un caldo de cultivo un extracto bruto que contiene la
sustancia de la invención, y aislando y purificando la Sustancia
GM-95 a partir del extracto bruto. El caldo de
cultivo contiene un filtrado del cultivo y fracciones celulares
sólidas.
El cultivo del microorganismo de la invención se
lleva a cabo de acuerdo con el procedimiento de cultivo
convencional y, por lo general, se lleva preferentemente a cabo en
condiciones aerobias en un medio fluido por un proceso de cultivo
por vibración o un proceso de cultivo por centrifugación en medio
aerobio, y procesos análogos. Como medio de cultivo que se puede
utilizar, se puede emplear cualquier medio que contenga fuentes de
nutrientes que el microorganismo productor de la sustancia
GM-95 pueda utilizar, y cabe emplear una variedad
de medios sintéticos y medios naturales. La fuente de carbono
agregada al medio incluye glucosa, sacarosa, fructosa, glicerina,
dextrina, almidón, melazas, agua de remojo del maíz, ácidos
orgánicos, etc., y estas fuentes se pueden utilizar solas o en
combinación. La fuente de nitrógeno incluye sustancias nitrogenadas
orgánicas tales como medios Pharma, peptona, extracto de carne,
extracto de levadura, harina de soja, caseína, aminoácidos, urea,
etc., y sustancias nitrogenadas inorgánicas tales como el nitrato
sódico, el sulfato amónico, etc. Estas sustancias también se pueden
utilizar solas o en combinación. Cuando sea necesario, el medio se
puede complementar adecuadamente con sales sódicas, sales
potásicas, sales magnésicas, fosfatos y sales de metales
pesados.
Cuando en el curso del cultivo se produce un
espumado copioso, puede agregarse al medio un agente antiespumante.
Ejemplos de agentes antiespumantes son aceites vegetales como, por
ejemplo, el aceite de soja, el aceite de lino, etc., alcoholes
superiores como, por ejemplo, el octadecanol, el tetradecanol, el
heptadecanol, etc., y diversos compuestos de silicio.
El valor del pH del medio se controla
preferentemente alrededor de la neutralidad. La temperatura de
cultivo debe mantenerse dentro del intervalo adecuado para el
crecimiento del microorganismo productor de la sustancia
GM-95, generalmente 20-32ºC,
preferentemente alrededor de 25-30ºC. El tiempo de
cultivo es preferentemente de 2 a 6 días tanto para el proceso de
cultivo por vibración como para el proceso de cultivo por
centrifugación en medio aerobio.
Las diversas condiciones de incubación explicadas
anteriormente se pueden modificar adecuadamente de acuerdo con el
tipo y las características del microorganismo utilizado, las
condiciones externas, y análogos, y las condiciones óptimas se
pueden seleccionar entre, y controlar dentro de, los intervalos
anteriores.
La separación de un extracto bruto que contiene
la Sustancia GM-95 a partir del caldo de cultivo se
puede lograr de acuerdo con el procedimiento convencional para
aislar productos de fermentación. Por ejemplo, procesos habituales
tales como la extracción con disolventes, la cromatografía, la
cristalización, etc. se pueden utilizar individualmente o en una
secuencia y combinación adecuadas.
Más específicamente, se puede utilizar el
siguiente método. Dado que la Sustancia GM-95
producida en el curso del cultivo existe principalmente en el
filtrado del cultivo y los gránulos de células, el caldo de cultivo
se filtra o se centrifuga de una manera convencional para separar
la fracción celular sólida del filtrado del cultivo. Seguidamente,
la Sustancia GM-95 se eluye de la fracción celular
sólida que contiene la Sustancia GM-95 utilizando un
disolvente tal como metanol, acetona, etc. Subsiguientemente, el
disolvente se elimina por destilación a presión reducida para
proporcionar el concentrado bruto que contiene la Sustancia
GM-95. Al concentrado bruto se agrega acetato de
etilo, cloroformo, butanol o un disolvente orgánico insoluble en
agua, de este tipo, para transferir la Sustancia
GM-95 a la capa de disolvente orgánico, y luego la
capa de disolvente se deshidrata agregando mirabilita. Seguidamente,
el disolvente se elimina por destilación a presión reducida para
proporcionar el extracto bruto que contiene la Sustancia
GM-95. Adicionalmente, la Sustancia GM- 95 contenida
en el filtrado del cultivo también se puede transferir a la capa de
disolvente orgánico, tal como se ha expuesto anteriormente, para
proporcionar el extracto bruto. Opcionalmente, se pueden realizar
etapas tales como ajustar el pH con hidróxido sódico o ácido
clorhídrico, aumentar la eficacia de la extracción y evitar la
producción de emulsiones agregando sal industrial, etc.
La Sustancia GM-95 se puede
aislar y purificar a partir del extracto bruto anterior por el
procedimiento convencional para el aislamiento y la purificación de
sustancias lipófilas de bajo peso molecular, tal como la
cromatografía de adsorción utilizando carbón activado, gel de
sílice, alúmina, resinas adsorbentes macroporosas no iónicas o
adsorbentes análogos, la cromatografía de fase inversa utilizando
gel de sílice ligado a ODS, o análogos. Entre esas técnicas, son
particularmente útiles la cromatografía sobre gel de sílice
utilizando como eluyente cloroformo o una mezcla de
cloroformo/acetato de metilo, cloroformo/metanol,
cloroformo/acetona, benceno/acetona, etc., y la cromatografía de
fase inversa utilizando como eluyente acetonitrilo o una mezcla de
metanol/0,05% de ácido trifluoroacético, o fosfato monopotásico 10
mM etc.. Es más, cuando se precisa una purificación adicional, el
procedimiento cromatográfico anterior se puede repetir o se puede
llevar a cabo en combinación con la cromatografía en columna
utilizando Sephadex LH-20 (Pharmacia) y cloroformo,
metanol etc., como eluyente, o técnicas análogas. Por el
procedimiento anterior, se puede obtener Sustancia
GM-95 de un alto grado de pureza.
Para la identificación de la Sustancia
GM-95 durante el procedimiento de purificación, se
puede llevar ventajosamente a cabo la detección por cromatografía
en capa fina y cromatografía líquida de alta resolución,
combinadas.
La Sustancia GM-95 de la
invención presenta actividades antitumorales, y su eficacia como
agente antitumoral ha sido confirmada.
Para utilizar la Sustancia GM-95,
purificada de la manera descrita anteriormente, en forma de una
composición farmacéutica, se procesa en una forma de dosificación
farmacéuticamente adecuada de acuerdo con la aplicación pretendida.
La forma de dosificación incluye formas de dosificación oral tales
como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, gránulos finos,
líquidos y disoluciones, píldoras, emulsiones, suspensiones, etc.,
y formas de dosificación parenteral, tales como inyecciones, así
como supositorios, pomadas, emplastos, cataplasmas, aerosoles,
soluciones oftálmicas, etc. Estas formas de dosificación se pueden
fabricar por procedimientos conocidos y comúnmente utilizados por
una persona experta en la materia.
En la fabricación de preparaciones sólidas para
la administración oral, al principio activo de la invención se
agrega un excipiente y opcionalmente un aglutinante, un
desintegrante, un lubricante, un agente colorante, un correctivo,
un correctivo del aroma, etc., y los comprimidos, las cápsulas, los
polvos, los gránulos, los gránulos finos, etc. se pueden fabricar de
la manera habitual. Ejemplos del excipiente incluyen lactosa,
sacarosa, almidón, talco, estearato magnésico, celulosa cristalina,
metilcelulosa, carboximetilcelulosa, glicerina, alginato sódico,
acacia, etc., y del aglutinante incluyen alcohol polivinlílico,
éter polivinílico, etilcelulosa, acacia, laca, azúcar blanco, etc.,
y del desintegrante incluyen almidón seco, alginato sódico, polvo de
agar, bicarbonato sódico, carbonato cálcico, laurilsulfato sódico,
monoestearato de glicerilo, lactosa, etc., y del lubricante
incluyen estearato magnésico, talco, etc., y del correctivo incluyen
azúcar blanco, cáscara de naranja amarga, ácido cítrico, ácido
tartárico, etc. Se pueden utilizar agentes colorantes, correctivos
del aroma y otros aditivos que son conocidos en el estado de la
técnica. En caso necesario, tales comprimidos se pueden acondicionar
adicionalmente en forma de comprimidos recubiertos formando una
película de recubrimiento ordinario por un método conocido, por
ejemplo comprimidos recubiertos de azúcar, comprimidos recubiertos
de gelatina, comprimidos con recubrimientos entéricos, comprimidos
recubiertos de una película, etc., y pueden ser comprimidos de
doble capa, comprimidos de múltiples capas, etc.
En la fabricación de preparaciones líquidas para
la administración oral, al principio activo de la invención se
agrega un correctivo, un tampón, un estabilizador, un correctivo
del aroma, etc. y las disoluciones, los jarabes y los elixires se
pueden fabricar de la manera usual. Arriba se mencionan correctivos
utilizables. El tampón que se puede utilizar incluye citrato sódico,
etc., y el estabilizador incluye goma tragacanto, acacia, gelatina,
etc.
En la fabricación de inyectables, al principio
activo de la invención se agrega un diluyente, un agente de control
del pH, un tampón, un estabilizador, un agente isotónico, un
anestésico local, etc., y las inyecciones para la administración
intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica o
intraperitoneal se pueden fabricar de la manera usual. El diluyente
que se puede utilizar incluye agua, alcohol etílico, macrogoles,
propilenglicol, alcohol isoestearílico etoxilado, alcohol
isoestearílico polioxilado, ésteres de ácidos grasos con
polioxietilensorbitano, etc. El agente de control del pH o el
tampón incluye citrato sódico, acetato sódico y fosfato sódico. El
estabilizador incluye pirosulfito sódico, ácido
etilendiaminotetraacético, ácido tioglicólico y ácido tioláctico,
entre otras sustancias. El agente isotónico que se puede utilizar
incluye cloruro sódico, glucosa, etc., y el anestésico local incluye
clorhidrato de procaína, clorhidrato de lidocaína, etc.
En la fabricación de supositorios, al principio
activo de la invención se agrega una base de supositorios,
opcionalmente un tensioactivo, etc.; los supositorios se pueden
fabricar de la manera usual. La base que se puede utilizar incluye
excipientes grasos tales como los macrogoles, la lanolina, la
manteca de cacao, triglicéridos de ácidos grasos, Witepsol.RTM
(Dynamit Nobel), etc.
En la fabricación de pomadas, al principio activo
de la invención se agrega, según se requiera, una base, un
estabilizador, un agente humectante, un conservante, etc., y la
mezcla y la formulación se procesan de la manera acostumbrada. La
base incluye parafina líquida, parafina blanda blanca, cera de
abejas blanca, alcohol octildodecílico y parafina; y el conservante
incluye p-hidroxibenzoato de metilo,
p-hidroxibenzoato de etilo, p-hidroxibenzoato de
propilo, etc.
En la fabricación de cataplasmas, éstos se pueden
confeccionar recubriendo un soporte convencional con dicha pomada,
crema, gel, pasta, etc. de una manera habitual. Los soportes
incluyen telas tejidas o no tejidas de algodón, estambre de rayón
hilado o fibra química, películas de cloruro de polivinilo,
polietileno, poliuretano, etc., flexibles, y láminas espumadas de
tales materiales.
En caso necesario, las formas de dosificación
anteriormente descritas se pueden complementar con otros aditivos
tales como colorantes, conservantes, perfumes, saborizantes,
edulcorantes, etc., u otros principios medicinalmente activos.
La proporción de la sustancia de la invención en
la composición farmacéutica de la invención no es tan crítica y se
puede seleccionar libremente dentro de un amplio intervalo pero,
hablando de una manera general, constituye preferentemente del
1-70% en peso en la composición farmacéutica.
No hay ninguna limitación sobre el modo de
administración de la composición farmacéutica de la invención
fabricada por los métodos anteriores. Así pues, un modo adecuado se
puede seleccionar de acuerdo con la forma de dosificación
particular, la edad y el sexo y otros factores del paciente, y la
gravedad de la enfermedad. Las preparaciones en forma inyectable se
pueden administrar por vía intravenosa, por vía intramuscular, por
vía hipodérmica, por vía intradérmica o por vía intraperitoneal. En
caso necesario, las inyecciones se pueden administrar por vía
intravenosa íntimamente mezcladas con un líquido de perfusión
intravenosa ordinario tal como una disolución de glucosa o una
disolución de aminoácidos. Las preparaciones sólidas tales como los
comprimidos, las píldoras, los gránulos, las cápsulas, etc. y las
preparaciones líquidas para la administración oral, de la
invención, se pueden administrar por vía oral o enteral. Los
supositorios se pueden administrar en el recto.
La cantidad del compuesto activo de la invención
que hay que formular en cada unidad de dosificación de las formas
anteriores no se puede definir en términos generales, puesto que
depende del estado clínico del paciente y de la forma de
dosificación. Por lo general, la cantidad en cada forma de
dosificación unitaria es preferentemente de alrededor de
1-1.000 mg para las preparaciones orales, de
alrededor de 0,1-500 mg para las inyecciones, y de
alrededor de 5-1.000 mg para los supositorios.
La posología diaria del compuesto activo en
cualquiera de las formas de dosificación anteriores se puede
seleccionar adecuadamente de acuerdo con el estado, el peso
corporal, la edad, el sexo y otras condiciones del paciente.
Normalmente, la dosis por día para un paciente adulto puede ser de
alrededor de 0,1-1.000 mg/kg y preferentemente de
alrededor de 1-100 mg/kg. Esta posología se puede
administrar en una sola vez o en aproximadamente 2-4
dosis divididas por día.
Los tumores que se pueden tratar administrando
las preparaciones que contienen la Sustancia GM-95
de la invención incluyen, pero no se limitan a, un tumor maligno
sólido tal como el cáncer de cabeza y de cuello, el cáncer
esofágico, el cáncer gástrico, el cáncer de colon, el cáncer rectal,
el cáncer de hígado, el cáncer de la vesícula biliar o colangioma,
el cáncer pancreático, el cáncer renal, el carcinoma pulmonar, el
cáncer de mama, el cáncer de ovario, el cáncer de vejiga, el cáncer
de próstata, el tumor ensayoicular, el osteosarcoma, los tumores de
los tejido blandos, el cáncer cervical, el cáncer de piel, los
tumores del cerebro, etc., un linfoma maligno y la leucemia,
preferentemente un tumor sólido maligno.
Los siguientes ejemplos de trabajo y ejemplos de
ensayo ilustran la invención con mayor detalle.
Un tubo de ensayo (50 ml) se cargó con 15 ml de
un medio de precultivo (pH 7,2) que contenía un 1,0% de almidón
soluble, un 1,0% de polipeptona, un 1,0% de melazas y un 1,0% de
extracto de carne, y después de la esterilización, el medio se
inoculó con un asa impregnada de la cepa 3533-SV4 de
Streptomyces anulatus (FERM BP-6460). El
cultivo inoculado en el tubo de ensayo se sometió entonces a un
proceso de cultivo por vibración a 27ºC sobre un vibrador de vaivén
durante 2 días.
Seguidamente, un medio de producción (pH 7,2) que
contenía un 2,0% de glicerina, un 1,0% de melazas, un 0,5% de
caseína, un 0,1% de polipeptona y un 0,4% de carbonato cálcico se
distribuyo en matraces cónicos de 500 ml de capacidad, a razón de
100 ml por matraz, y después de la esterilización (121ºC, 15
minutos), a cada uno de los matraces se agregó el cultivo de siembra
anterior en una proporción del 2% (v/v). El contenido de los
matraces se sometió a un proceso de cultivo vibratorio a 27ºC sobre
un vibrador rotatorio durante 3 días (220 revoluciones por minuto,
7 cm de carrera).
Seguidamente, cada uno de tres recipientes de
fermentación (Marubishi Bioengineering Co., Ltd.) de 50 litros de
capacidad se cargó con 30.000 ml del medio de producción anterior.
A los recipientes de fermentación se agregó un agente antiespumante
(15 ml de Disfoam (CC-118, Nippon Oil and Fats Co.,
Ltd.), 15 ml de Silicona Shin-Etsu
(KM-68-2F, Shin-Etsu
Chemical Co., Ltd.) y 15 ml de aceite de ensalada (Ajinomoto, Co,
Inc.)), y después de la esterilización (120ºC, 20 minutos), a cada
uno de los recipientes de fermentación se agregó el cultivo de
siembra anterior en una proporción del 2% (v/v). El contenido de los
recipientes de fermentación se sometió a un proceso de cultivo a
27ºC durante 3 días (centrifugador aerobio: 400 rpm (agitación), 30
l/minuto (aireación)).
El caldo de cultivo obtenido por el procedimiento
anterior se cosechó en una cantidad de 84,0 l y se centrifugó para
separar los gránulos de células. Después de desechar el fluido
sobrenadante, los gránulos de células sedimentados se sometieron a
una extracción de dos horas con acetona (10,0 l) bajo agitación
frecuente. El extracto se separó por filtración y luego la
extracción y la separación se repitieron con un volumen adicional
de acetona de 5,0 l. Estos extractos acetónicos se combinaron y
luego se destilaron y se concentraron hasta un volumen final de 2
l. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida
hasta que la acetona y el agua se hubieron evaporado por completo.
El residuo aceitoso obtenido se disolvió en 450 ml de metanol y,
después de filtrar, se evaporó hasta sequedad a presión
reducida.
El residuo aceitoso obtenido se disolvió en 400
ml de un disolvente mixto que comprendía cloroformo y metanol
(20:1) (v/v). La disolución se aplicó a una columna de gel de
sílice (Wakogel C-200 (tamaño de partícula
75-150 \mum), 6 cm de diámetro interno x 45 cm) y
se eluyó con 5 l de un disolvente mixto de cloroformo/metanol
preparado como anteriormente. Las fracciones que contenían un
producto activo se eluyeron con un disolvente cloroformo/metanol
(10:1) (v/v). Las fracciones que contenían un producto activo se
reunieron y se evaporaron hasta sequedad a presión reducida. La
sustancia purificada bruta se aplicó a una columna de gel de sílice
(tamaño de partícula 75-150 \mum, 3,6 cm de
diámetro interno x 30 cm) y se eluyó con una mezcla de
cloroformo/metanol/ disolución acuosa de amoníaco al 29% (700:100:1)
(v/v/v).
Se recogió un eluato que contenía un producto
activo y se evaporó hasta sequedad. El residuo se disolvió en 10 ml
de la fase móvil anterior y luego se sometió a una cromatografía
líquida de alta resolución utilizando una columna ODS PEGASIL
(Senshu Scientific Co., 20 mm de diámetro interno x 250 mm) (fase
móvil: acetonitrilo/ ácido trifluoroacético/agua 70:0,1:30, v/v/v),
velocidad de flujo: 10,0 ml/minuto, detección: 254 nm (en cubeta de
UV de 0,5 mm)). El extracto se inyectó cada vez en una cantidad de
0,8 ml. Las fracciones que contenían la Sustancia
GM-95 se recogieron y se evaporaron hasta sequedad a
presión reducida.
El residuo se puso en suspensión en metanol al
10%/agua, y luego se aplicó a la columna ODS PEGASIL (Senshu
Scientific Co., 1,0 cm de diámetro interno x 3 cm). Después de que
la columna se hubo lavado con metanol al 10%/agua, la elución se
llevó a cabo con metanol al 70%/agua. El eluato se eliminó por
destilación a presión reducida, para proporcionar 3,2 mg de
Sustancia GM-95.
Las fracciones que contenían la Sustancia
GM-95 en cada etapa de la purificación se
detectaron por cromatografía líquida de alta resolución utilizando
una columna ODS PEGASIL (Senshu Scientific Co., 4,6 mm de diámetro
interno x 250 mm) (fase móvil: acetonitrilo/ácido
trifluoroacético/agua (70:0,1:30, v/v/v)), velocidad de flujo: 1,0
ml/minuto).
Las propiedades fisicoquímicas de la Sustancia
GM-95 son las siguientes.
1) Fórmula molecular: Cuando se midió por
espectrometría de masas de bombardeo atómico rápido, de alta
resolución, se reveló el valor medido de (M+H)^{+} de
583,0790, y la fórmula molecular que corresponde al valor es
C_{26}H_{15}N_{8}O_{7}S.
2) Peso molecular: Cuando se midió por
espectrometría de masas de bombardeo atómico rápido se reveló el
valor medido de 582,0712.
3) Punto de fusión: 138-143ºC
(con descomposición)
4) Rotación específica:
[\alpha]_{D}^{20} = -9,38º, determinada a la
concentración de C = 0,129 g/100 ml (metanol).
5) Espectro de absorción en el ultravioleta:
mostrado en la Figura 1.
La medición se realizó en metanol (en una
disolución 7,39 \muM). La absorción máxima se encontraba a la
longitud de onda de 259,5 nm y la absorbancia a esta longitud de
onda era de 0,288. El coeficiente de absorción molar
(\varepsilon) era 38982.
6) Espectro de absorción en el infrarrojo
(FT-IR): mostrado en la Figura 2.
\numax (cm^{-1}): 3421, 3147, 2958, 2923,
2854, 1733, 1670, 1650, 1544, 1496, 1438, 1392, 1351, 1315, 1267,
1199, 1174, 1118, 1087, 1058, 1033, 975, 943, 929, 914, 883,
798.
7) Solubilidades en disolventes:
\hskip0,7cmInsoluble en agua y en acetona.
\hskip0,7cmSoluble en una mezcla de cloroformo: metanol = 1:1
8) Color de la sustancia: polvos de color blanco
amarillento
9) Espectro de resonancia magnética nuclear
Los desplazamientos químicos del espectro de
^{1}H-RMN a 500 MHz (Fig. 3) y el espectro de
^{13}C-RMN a 125 MHz (Fig. 4) medidos en la
disolución de una mezcla de cloroformo deuterado:metanol deuterado
= 1:1 a 25ºC se muestran a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
(10) Tiempo de retención (Rt) en cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC):
Se detectó un pico a un tiempo de 6,1 minutos en
el análisis bajo las siguientes condiciones.
Condiciones analíticas:
- Columna: ODS PEGASIL (4,6 mm de diámetro interno x 250 mm, Senshu Scientific Co.)
- Fase móvil: acetonitrilo/ácido trifluoroacético/agua (70:0,1:30, v/v/v)
- Velocidad de flujo: 1 ml/minuto
- Detección: 254 nm.
De acuerdo con los datos fisicoquímicos
anteriores, la estructura de la Sustancia GM-95 se
identificó como se indica a continuación.
Las células tumorales descritas en la Tabla 5 se
pusieron en suspensión en un medio RPMI1640 que contenía un 10% de
suero fetal de ternera, se sembraron en placas de cultivo (38 mm) a
la densidad de 2 x 10^{3} células cada una y se cultivaron toda
la noche a 37ºC en un incubador con un 5% de CO_{2},.
Seguidamente, a cada una de las placas se añadieron los agentes
experimentales (el compuesto de la invención y
5-fluorouracilo), diluidos a varias concentraciones
utilizando medio RPMI1640 que contenía un 10% de suero fetal de
ternera, y se prosiguió el cultivo por espacio de 72 horas más. Una
vez terminado el cultivo de las células, éstas se fijaron con
aldehído glutárico al 25% durante 15 minutos y se lavaron tres
veces con agua. Después de esto, las células se tiñeron con violeta
cristal al 0,05% diluido en una disolución acuosa de metanol al
20%, se lavaron tres veces con agua y luego se secaron. El violeta
cristal se extrajo con 100\mul de fosfato monosódico 0,05 M/etanol
(1/1 (v/v)) y se determinó su absorbancia a 540 nm por medio de un
espectroscopio automático. ``La IC_{50} se definió como la
concentración requerida para provocar una reducción del 50% en el
crecimiento, en comparación con la absorbancia del control. Los
resultados son los siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
El compuesto de la presente invención podría
inhibir el crecimiento in vitro de diversas células
tumorales.
El compuesto de la invención se sometió al examen
de actividad inhibitoria sobre la telomerasa utilizando extractos
celulares que contenían telomerasa, de acuerdo con la manera
convencional, para proporcionar la concentración necesaria para
inhibir la actividad de la telomerasa en un 50% (IC_{50}) en los
extractos celulares. Se demostró que el compuesto de la invención
tenía un valor de la IC_{50} de 50 nM, y, por consiguiente, que
poseía una actividad inhibitoria sumamente fuerte sobre la
telomerasa.
La telomerasa apenas existe en las células
normales, pero está ampliamente presente en diversos tumores
malignos (hallada en el 85% o más de todos los tumores malignos que
incluyen aquéllos que se originan en la región de la piel, la mama,
el pulmón, el estómago, el páncreas, el ovario, el cuello, el útero,
el riñón, la vejiga, el colon y la próstata, en el sistema nervioso
central (CNS), en la retina y en el sistema de células hemáticas).
El compuesto de la presente invención inhibe la actividad de dicho
enzima, lo que sugiere que es útil como agente antitumoral que tiene
un amplio espectro de aplicación.
\newpage
Ejemplo de formulación
1
| Sustancia GM-95 | 10 mg |
| Lactosa | 50 mg |
| Almidón de maíz | 47 mg |
| Celulosa cristalina | 50 mg |
| Talco | 2 mg |
| Estearato magnésico | 1 mg |
| Por cápsula | 160 mg |
De acuerdo con la receta anterior, se fabricaron
cápsulas de la manera convencional.
Ejemplo de formulación
2
| Sustancia GM-95 | 5 mg |
| Agua destilada para inyectables | cantidad adecuada |
| Por ampolla | 5 ml |
De acuerdo con la receta anterior, se fabricaron
inyectables de la manera convencional.
Ejemplo de formulación
3
| Sustancia GM-95 | 20 mg |
| Witepsol W-35 | |
| (marca registrada de Dynamit Nobel Co. Ltd.) | 1380 mg |
| Por supositorio | 1400 mg |
De acuerdo con la receta anterior, se fabricaron
supositorios de la manera convencional.
La sustancia GM-95 de la presente
invención presenta un efecto antitumoral excelente y es útil como
fármaco terapéutico para tumores malignos. Además, el
microorganismo productor de la sustancia GM-95 es
útil porque es capaz de producir la Sustancia GM-95
que tiene un efecto antitumoral excelente.
Claims (11)
1. Compuesto representado por la siguiente
fórmula (1).
2. Procedimiento para la fabricación de un
compuesto según la reivindicación 1, que comprende cultivar un
microorganismo que pertenece al género Streptomyces y es
capaz de producir el compuesto según la reivindicación 1 en un
medio de cultivo, y aislar el compuesto de un caldo de cultivo.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el
que el microorganismo es la cepa 3533-SV4 del
Streptomyces anulatus o un mutante de la misma.
4. Procedimiento según la reivindicación 2, en el
que el número de depósito del microorganismo es FERM
BP-6460.
5. Medicamento que comprende el compuesto según
la reivindicación 1 como principio activo.
6. Agente antitumoral que comprende el compuesto
según la reivindicación 1 como principio activo.
7. Composición farmacéutica que comprende una
cantidad eficaz del compuesto según la reivindicación 1 y un
portador farmacéuticamente aceptable.
8. Composición farmacéutica según la
reivindicación 7, destinada a la terapia de un tumor.
9. Utilización del compuesto según la
reivindicación 1, para la fabricación de un medicamento destinado a
la terapia de tumores.
10. Microorganismo capaz de producir el
compuesto según la reivindicación 1, que es la cepa
3533-SV4 del Streptomyces anulatus, o un
mutante de la misma.
11. Microorganismo según la reivindicación 10,
que tiene el número de depósito FERM BP-6460.
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