WO2000024747A1

WO2000024747A1 - Substance gm-95, procedes de fabrication et d'utilisation correspondants

Info

Publication number: WO2000024747A1
Application number: PCT/JP1999/005806
Authority: WO
Inventors: Haruo Seto; Kazuo Shin-Ya; Konstanty Wierzba
Original assignee: Taiho Pharmaceutical Co., Ltd.; Sosei Co., Ltd.
Priority date: 1998-10-23
Filing date: 1999-10-20
Publication date: 2000-05-04
Also published as: EP1123937B1; ATE267832T1; PT1123937E; DE69917668D1; EP1123937A1; US6613759B1; EP1123937A9; DK1123937T3; AU6227799A; US20030191165A1; KR100446323B1; CA2346201A1; CA2346201C; US7192763B2; AU770166B2; KR20010103610A; DE69917668T2; ES2217815T3

Description

明細書

G M - 9 5物質、その製造法及びその用途技術分野

本発明は、抗腫瘍作用を有し、医薬品として有用な新規な化合物、その製造法および該物質を産生する微生物に関する。背景技術

ォキサゾ一ル環を複数個有するマクロライドとしては、ゥミゥシ類から抽出された抗腫瘍活性を有するゥラプアライド、 Aおよび B ( Ulapualide A and B) ( Journal of American Chemical Society, 108, 846-847, 1986) 力、また、同じくゥミゥシ類から抽出された抗真菌作用を有する力ビラマイド C ( Kabiramide C) ( Journal of Ameri can Chemical Society, 108, 847-849, 1986) カ、矢口られている o

本発明は、微生物を用いて、抗腫瘍作用を有し医薬品として有用な新規な化合物、その製造法及び抗腫瘍作用を有する新規化合物を産生する能力を有する菌を得ることを目的とするものである。発明の開示

本発明者らは、微生物が産生する化合物を検索していたところ、ストレプトマイセス属に属する 3 5 3 3 — S V 4株の培養液中に、抗腫瘍活性を有する物質が産生されていることを見いだし、その活性物質を単離し、その物理化学的性状および構造を確定し、抗腫瘍作用を確認することにより本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、下記式（ 1 ) ：

で表される化合物を提供するものである。

以下、本明細書中上記化合物を G M - 9 5物質というまた、本発明は、ストレプトマイセス（ S t rept omyce s) 属に属し、上記 G M— 9 5物質を生産する能力を有する菌を培地で培養し、培養液から該物質を単離することを特徴とする G M - 9 5物質の製造法も提供する。

また、上記 G M— 9 5物質を有効成分とする医薬、抗腫瘍剤を提供するものである。

また、本発明は、上記 G M— 9 5物質及び薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物を提供する。

また、本発明は、有効量の上記 G M— 9 5物質を患者に投与することを特徴とする腫瘍の治療方法を提供するものである。

また、本発明は、上記 G M— 9 5物質の医薬への使用を提供するものである。

更に、本発明は、上記 G M— 9 5物質を産生する能力を有する菌、具体的には、ストレブトマイセス（ Strept omyces) 属に属する菌をも提供するものである。図面の簡単な説明

図 1 は、実施例で得られた本発明の化合物の紫外吸収スぺクトル図である。

図 2 は、実施例で得られた本発明の化合物の赤外吸収スぺクトル図である。

図 3 は、実施例で得られた本発明の化合物の ¹ H — N M Rスぺクトル図である。

図 4 は、実施例で得られた本発明の化合物の ¹³ C — N M Rスペクトル図である。発明を実施するための最良の形態

上記式（ 1 ) で表される G M - 9 5物質の物理化学的性質を以下に示す。

1 ) 分子式：高分解能ファーストアトムボンバ一ドメン卜質量分析 (hign- resolution last atomic bombard oment mass spectrometry )で測定した時ヽ

測定値（M + H ) +として、 5 8 3. 0 7 9 0 を示し、これと一致する分子式は C ₂₆H ₁₅N ₈0₇ Sである。

2 ) 分子量：ファーストアトムボンバードメント質量分析 (fast atomic bombardoment mass spectrometry) で測定すると、 5 8 2. 0 7 1 2を示す。

3 ) 融点： 1 3 8 〜 1.4 3 °C (分解）。

4 ) 比旋光度：メタノール中、 C= 0. 1 2 9 g / 1 0 0 m l (メタノール）の濃度で測定。

[ a V ° = - 9 . 3 8 。

5 ) 紫外吸収スペクトル：図 1 に示す。

測定は、メタノール中（ 7. 3 9 ^ M溶液）で行った。 2 5 9. 5 n mで最大吸収を示し、その時の吸光度は 0. 2 8 8であった。モル吸光係数（ £ ) は 3 8 9 8 2であ ο

6 ) 赤外線吸収スぺクトノレ（ F T— I R ) 図 2 に示す m a x c m— ^L) ：

3 4 2 1 , 3 1 4 7 2 9 5 8 , 2 9 2 3 2 8 5 4 , 1 7 3 3 , 1 6 7 0 1 6 5 0 , 1 5 4 4 1 4 9 6 , 1 4 3 8， 1 3 9 2 1 3 5 1 ， 1 3 1 5 1 2 6 7，

1 1 9 9 , 1 1 7 4 1 1 1 8 , 1 0 8 7 1 0 5 8 ,

1 0 3 3， 9 7 5 , 9 4 3 , 9 2 9 , 9 1 4， 8 8 3 , 7 9 8

7 ) 溶剤に対する溶解性

水、アセトンに不溶。

クロ口ホルム：メタノール = 1 ： 1 に溶解する。

8 ) 物質の色：淡黄色粉末 ( white yellowish powders) 9 ) 核磁気共鳴スペクトル

重クロ口ホルム：重メタノ一ノレ = 1 ： 1 の溶液中、 2 5 °Cで測定した 5 0 0 M H z ¹ H— N M Rスぺクトノレ (図 3 に示す）および 1 2 5 M H z ¹³ C — N M Rスぺクトル（図 4 に示す）の化学シフトを下記に示す。表 1

灰素位置 ¹³ C - N M R ¹ H - N M R

1 162.5

2 150.5

3 125.1

4 155.4

5 149.6

6 126.0

7 157.3

8 137.8 8.17(s， 1H)

9 130.4

10 156.8

11 138.8 8.24(s, IH)

12 130.7

13 156.2

14 141.2 8.00(s， IH)

15 136.7

16 156.6

17 139.4 8.28(s, IH)

18 130.9

19 156.6

20 138.1 8.18(s， IH)

21 130.4

22 160.0

23 38.7 3.8(m, IH), 3.46(m, IH) 24 73.2 6.19(br s， IH) 25 11.5 2.47(s, 3H)

26 11, 5 2.64(s, 3H) 1 0 ) 高速液体クロマトグラフィー（HPLC) における保持時間（Rt) ：

分析条件：

カラム； P E G A S I L O D S (内径 4. 6 m m x 2 5 0 m m、株式会社センシュ一科学製）移動相；ァセトニトリルトリフルォロ酢酸ノ水

( 7 0 : 0 . 1 : 3 0 v/v/v) 流速； 1 m 1 /分

検出； 2 5 4 n m

で分析すると、 6 . 1 分にピークが検出される。本発明の G M— 9 5物質は、例えば、本物質の生産能力を有する菌株（以下 G M— 9 5物質生産菌と称する）を、以下に示すような適当な条件下で培養することによつて製造することができる。本発明は、この G M— 9 5 物質生産菌も包含する。

G M— 9 5物質生産菌としては、ストレプトマイセス ( Streptomyces) 属に属する菌株が挙げられる。本発明は、ストレプトマイセス（ Streptomyces) 属に属する菌を培養し、培養液を回収することによって得ることができる上記 G M— 9 5物質も包含する。

ストレプトマイセス（ Streptomyces) 属に属する菌株の一例としては、ストレブトマイセスァニュレイタス

( Streptomyces anulatus ) 3 5 3 3 - S V 4株又はその変異株が例示できる。ストレブトマイセスァニユレィタス 3 5 3 3 — S V 4株は、本発明者らが熊本県玉名郡天水町の土壌から新たに分離したストレブトマイセス属に属する菌株であり、日本国茨城県つくば市東 1 丁目 1 番 3号に住所を有する通商産業省工業技術院生命ェ学工業技術研究所に、 1998年 8月 12日に、微生物の表示. (寄託者が付した識別のための表示）「 Streptomyces a nulatus 3533- SV4(GM95)」、（受託番号）「 F E R M B P — 6 4 6 0」として寄託されている。

ストレプトマイセスァニュレイタス 3 5 3 3 — S V 4の同定及び菌学的性質は、 I S P (インタ一ナショナノレストレプトマイセスプロジェクト（ Interna t ion al Streptomyces Proj ect )の方法 ίこ従ヽ行った ₀ ス卜レプトマイセスァニュレイタス 3 5 3 3 — S V 4株の菌学的性質は、次の通りである。

a ) 形態

本菌株は、 I S P (インタ一ナショナルストレプトマイセスプロジェクト ( International Streptomyces Project)) N o . 2、 3、 4 および 5培地で 2 7 °C、 1 4 日間で培養した。結果は下記の通りである。 1 ) 胞子形成の分枝法；単純分枝

2 ) 胞子形成の形態；螺旋状、胞子形は筒状

3 ) 胞子の数； 1 0 〜 5 0又はそれ以上

4 ) 胞子の表面構造；平滑

5 ) 胞子の大きさ； 0 . 3 — 0 . 5 X 0 . 7 0 μ m

6 ) 鞭毛胞子の有無；無し

7 ) 胞子嚢の有無；無し

8 ) 胞子柄の着生位置；気菌糸

9 ) 菌核形成性の有無；無し

b ) 各種培地上における生育状態：

各種培地における生育状態を、表 2 に示す。表中に記載の培地性状に関する色調名は、コンテイナ一 ' コーポレ一シヨン ' オフ、 ' · ァメリカ (Containner Corporation of America)の「ザ · カラー · ハ一モニー · マニュアル」 (The Color Harmony Manual) ( 1 9 5 8年版） ίこ基づヽて示した。

表 2

c ) 生理的性質

1 ) 生育温度範囲； 2 0 〜 3 2 °C

最適温度； 2 0 〜 3 0 °C

2 ) ゼラチンの液化； +

3 ) スターチの加水分解； +

4 ) 脱脂粉乳の凝固、ペプトン化； +

5 ) メラ二ン様色素の生成

チロシン寒天培地；一

ペプトン · ィースト鉄寒天培地；一トリプトン ' イースト ' ブロス培地 +

6 ) 硝酸塩の還元； + 7 ) 炭素源の同化（プリドハム ' ゴトリーブ寒天培地 ( I S P N o . 9 ) )

Lーァラビノース +

D—キシロース +

D— グルコース +

D— フラクトース +

シュクロース +

イノシトーノレ +

L一ラムノース +

ラフイノース +

D— マンニット +

d ) 菌体組成

日本放線菌学会編「放線菌の同定実験法一 6 - 2 一 7 0， 1 9 8 5年」に記載の薄層クロマトグラフィー法により全菌体の酸加水分解物を分析した結果， L L型のジァミノピメリン酸が検出された。

本菌株の基生菌糸は分断しない。気菌糸は長い主軸を形成し、それより不規則に分枝した先端に、 1 0〜 5 0 個またはそれ以上からなる 4〜 9回転の螺旋状の胞子鎖を形成する。胞子は非運動性で、円柱形あるいは楕円形を呈し、幅 0. 3〜 0. 5、長さ 0. 7〜 1 . 0 / mで、胞子表面は平滑である。菌核、胞子のう、その他の特殊形態は観察されない。細胞壁化学型は（ I ) 型である。培養性状を表 2 に示す。気菌糸の色調は、黄色系列である。基生菌糸の色調は不鮮明色を呈し、 p Hで変化しない。拡散性色素は全体としては認められない。生理的性状を、上記 c ) に示す。本菌株は、中温性である。本菌株の形態的性状と細胞壁化学型から、本菌株はストレブ卜マイセス（ Streptomyces，以後、 S . と略す。）属に位す ^。

上述の諸性状を基に、「細菌名承認リスト、 1 9 8 0 」およびそれ以後の有効名リストに記載された S . 属の種について検索し、近縁種を選出した。 S . スフヱ口イデス（S. spheroides) の診断的性状を比較すると、本菌株と S . スフヱロイデスの性状はよく一致しており、炭素源の同化のみ異なっている。

従って、本菌株は S . スフヱロイデスに最も近似な新菌株である。しかしな力ら、ノくージヱイズマニュアルォブシステマテイクパ、クテリオロジー（Bergey' s Manual of Systematic Bacteriology vol. ) において、ウイリアムズ（W i 1 1 i a m s ) 等は、 S . スフヱ口イデスは S . ァニュレイタスのシノニム（異名）としている。従って、本菌株 3 5 3 3 — S V 4株は、 S . ァニュレイタスに含まれるー菌株と同定し、ストレプトマイセスァニュレイタス ( Streptomyces anulatus) 3 5 3 3 — S V 4株と称する。本菌株と近縁種との比較を以下に示す。表 3 本菌株ストレブトマイセス

3533-SV4 スフエロイデス

胞子鎖形態螺旋状 + +

胞子表面平滑 + +

気菌糸の色調黄色 + +

基生菌糸の色調不鮮明色 + +

pH感受性

拡散性色素産生

メラニン色素産生

スターチの加水分解 + +

硝酸塩の還元 + +

生育温度 1 0 °c

45°C

炭素の同化

ァラビノース +

キシロース + +

イノシトール 4- マンニット +

ラムノース + +

ラフイノース +

シュクロース + +

フラクトース + + 本発明の G M— 9 5物質は、例えば上記 3 5 3 3 — S V 4株又は上記の菌学的性質を有する 3 5 3 3 - S V 4 株の変異株などの、例えば、ストレブトマイセス属に属. する各種の G M - 9 5物質生産菌を、適当な培地で培養し、次に培養液から本発明物質を含む粗抽出物を分離し更に、粗抽出物から G M— 9 5物質を単離、精製することにより製造することができる。培養液には、培養濾液ゃ菌体固形分が含まれる。

上記微生物の培養は、原則的に一般の微生物の培養に準じて行われるが、通常、液体培養による振盪培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行うのが好ましい。培養に用いられる培地としては、 G M— 9 5物質生産菌が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成培地、天然培地等をいずれも用いることができる培地の炭素源としては、グルコース、シュ一クロース、フラクトース、グリセリン、デキストリン、澱粉、糖蜜コーン · スティープ · リカー、有機酸等を、単独又は二種以上組み合わせたもの力；窒素源としては、ファーマメディア、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、カゼイン、アミノ酸、尿素などの有機窒素源、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニゥム等の無機窒素源を、単独又は二種以上組み合わせたものが用いられる。また、培地には、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、その他の重金属塩などが必要に応じて適宜添加さる ο

なお、培養中発泡の著しい時は、例えば大豆油、亜麻仁油等の植物油、ォクタデカノール、テトラデカノールヘプタデカノール等の高級アルコール類、各種シリコン化合物などの消泡剤を、適宜培地中に添加することもでさ ^ > o

培地の p Hは、中性付近とするのが好ましい。培養温度は G M - 9 5物質生産菌が良好に生育する温度、通常 2 0 〜 3 2 °C、特に 2 5 〜 3 0 °C付近に保つのがよい。培養時間は、液体振盪培養及び通気攪拌培養のいずれの場合も、 2 〜 6 日間程度が好ましい。

上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類や特性外部条件等に応じて適宜変更でき、またそれぞれに応じて、上記範囲から最適条件を適宜選択、調節することができる。

培養液からの G M - 9 5物質を含む粗抽出物の分離は発酵生産物を採取する一般的な方法に準じて行うことができ、例えば溶媒抽出、クロマトグラフィー、結晶化等の通常の手段を、単独又は二種以上を任意の順序に組み合わせて用いることができる。より詳しくは、以下の方法を用いることができる。すなわち、上記培養により生産される G M— 9 5物質は、主として培養濾液及び菌体中に存在するので、常法に従い、まず培養液を濾過、遠心分離等を行って、培養濾液と菌体固形分とを分離し、得られた G M— 9 5物質を含む菌体固形分について、メタノール、アセトン等の溶媒を用いて G M— 9 5物質の溶出を行う。次いで、減圧下に溶媒を留去すれば、 G M - 9 5物質を含む粗濃縮液を得ることができる。この粗濃縮液に、酢酸ェチル、クロ口ホルム、ブタノ一ル等の水と混合しない有機溶媒を加えて、 G M— 9 5物質を有機溶媒層に転溶させ、得られた溶媒層に芒硝を加えて脱水した後、溶媒を減圧下で留去すれば、 G M— 9 5物質を含む粗抽出物を得ることができる。更に、培養濾液についても有機溶媒層に転溶させる前述と同様の操作をすれば、粗抽出物を得ることができる。また、必要に応じて、水酸化ナトリウム又は塩酸にて p Hを調節したり、工業用食塩を加えることにより、抽出効率を高くしたり、ェマルジヨン生成防止などの方法を講じることができる。

更に、粗抽出物から G M— 9 5物質を単離、精製するためには、通常の脂溶性低分子物質の単離、精製手段、例えば、活性炭、シリカゲル、アルミナ、マクロポーラス非イオン系吸着樹脂等の吸着剤による種々の吸着ク口マトグラフィー、又は O D S —結合型シリカゲル等を用いる逆相クロマトグラフィー等が使用できる。これらのうち、溶出溶媒にクロ口ホルム、クロ口ホルムノ酢酸ェチノレ、クロロホノレム /メタノーノレ、クロ口ホルム Zァセトン、ベンゼン Zアセトン等の混合溶媒系を用いるシリ力ゲルクロマトグラフィー、及びァセトニトリル又はメタノ一ル / 0. 05 %トリフルォロ酢酸又は 1 0 mMリン酸一力リゥム等の混合溶媒系を溶出に用いる逆相クロマトグラフィ一が、特に好ましい。また、更に精製を必要とする場合には、上記クロマトグラフィーを繰り返し行うか、または溶出溶媒としてクロ口ホルム、メタノール等を用いたセフアデックス L H — 2 0 ( フアルマシア社製）によるカラムクロマトグラフィ一等を適宜組み合わせて行うことにより、高純度の G M— 9 5 物質を得ることができ o

なお、精製工程中の G M— 9 5 物質の確認は、薄層クロマトグラフィ一及び高速液体クロマトグラフィーを用いて検出する方法とを併用して行うのがよい。

本発明の G M— 9 5 物質は、抗腫瘍活性を有するので. 抗腫瘍剤としての有効性が確認された。

以上のようにして精製した G M— 9 5 物質を医薬組成物として使用する際の薬学的投与形態としては、目的に応じて各種の薬学的投与形態を採用でき、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、液剤、丸剤、乳剤.、懸濁剤等の経口剤、注射剤、坐剤、軟膏剤、硬膏剤、貼付剤、エアゾール剤、点眼剤等の非経口剤のいずれでもよく、これら投与形態は、それぞれ当業者に公知慣用の製造方法により製造できる。

経口用固形製剤を調製する場合には、本発明の有効成分に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤等を製造することができる。賦形剤としては、例えば乳糖、蔗糖、澱粉、タノレク、ステアリン酸マグネシウム、結晶セルロース、メチノレセノレロース、カノレボキシメチノレセノレロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム等が、結合剤としてはポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ェチルセルロース、アラビアゴム、シェラック、白糖等が、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、寒天末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラゥリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が、滑沢剤としてはステアリン酸マグネシウム、タルク等が、矯味剤としては白糖、橙皮、クェン酸、酒石酸等が使用できる。その他、着色剤、矯臭剤等は通常公知のものを用いることができる。なお、錠剤は、必要に応じ周知の方法により通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠、その他、二重錠、多層錠とすることができる o

経口用液体製剤を調製する場合は、本発明の有効成分に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて、常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。この場合、矯味剤としては上記に挙げられたもので良く、緩衝剤としてはクェン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が使用できる。

注射剤を調製する場合には、本発明の有効成分に、希釈剤、 p H調製剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により静脈内、筋肉内、皮下、皮内並びに腹腔内用注射剤を製造できる。希釈剤としては、例えば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシィ匕イソステアリノレアノレコ —ル、ポリオキシ化イソステアリノレアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用できる。 p H調製剤及び緩衝剤としては、クェン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジァミン四酢酸、チォグリコール酸、チォ乳酸等が使用できる。等張化剤としては塩化ナトリウム、ブドウ糖等が、局所麻酔剤としては塩酸プロ力イン、塩酸リドカイン等が使用できる o

坐剤を調製する場合には、本発明の有効成分に基剤、さらに必要に応じて界面活性剤等を加えた後、常法により坐剤を製造することができる。基剤としては、例えばマクロゴール、ラノリン、カカオ油、脂肪酸トリグリセライド、ウイテツブゾール（ダイナマイトノーベルズ社製）等の油性基剤を用いることができる。

軟膏剤を調製する場合は、本発明の有効成分に通常使用される基剤、安定化剤、湿潤剤、保存剤等が必要に応じて配合され、常法により混合、製剤化される。基剤としては流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウォクチルドデシルアルコール、パラフィン等が、保存剤としてはパラォキシ安息香酸メチル、パラォキシ安息香酸ェチル、パラォキシ安息香酸プロピル等が使用できる貼付剤を製造する場合は、通常の支持体に前記軟膏、クリーム、ゲル、ペースト等を常法により塗布すれば良い。支持体としては綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布や軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルムあるいは発泡体シ一トが使用できる。

更に、上記各製剤には、必要に応じて、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を医薬製剤中に含有せしめてもよい。

本発明の製剤中に含有されるべき本発明物質の量は、特に限定されず広範囲より適宜選択されるが、通常医薬製剤中 1 〜 7 0 重量％とするのがよい。

かくして得られる本発明の医薬製剤の投与方法は、特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、疾患の程度等に応じて適宜決定される。例えば、注射剤形態の医薬製剤は、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与などにより投与され得る。これは必要に応じてブドウ糖、ァミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与することもできる。錠剤、丸剤、顆粒剤、力プセル剤などの固剤形態や経口投与用液剤形態の本発明医薬製剤は、経口投与又は経腸投与され得る。坐剤は直腸内投与できる。

上記の各投与単位形態中に配合されるべき本発明有効成分の量は、これを適用すべき患者の症状によりあるいはその剤型等により一定ではないが、一般に投与単位形態あたり経口剤では約 1 〜 1 0 0 0 m g、注射剤では約 0 . l 〜 5 0 0 m g、坐剤では約 5 〜 1 O O O m g とするのが望ましい。

また、上記投与形態を有する薬剤の 1 日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別、その他の条件等に応じて適宜選択されるが、通常成人 1 日あたり約 0. 1 〜： L 0 0 0 m g / k g、好ましくは約 1 〜： L O O m g Z k g とすれば良く、これを 1 日 1 回又は 2 〜 4 回程度に分けて投与することができる。

本発明の G M— 9 5物質を含有する製剤を投与することにより治療できる腫瘍としては、特に制限はなく、例えば、頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢 · 胆管癌、脾臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、骨，軟部肉腫、子宮頸癌、皮膚癌、脳腫瘍等の固形の悪性腫瘍、悪性リンパ腫、白血病などが挙げられ、好ましくは固形の悪性腫瘍の ^ 。実施例

以下に実施例及び試験例を挙げて更に具体的に本発明を説明する。

実施例 1 G M - 9 5物質の製造

( a ) 培養工程試験管（ 5 0 m l ) に、可溶性澱粉 1 . 0 %、ポリべプトン 1 . 0 %、糖蜜 1 . 0 %、 1 . 0 %牛肉エキスよりなる培地（pre - culture medium) ( p H 7. 2 ) 1 5 m 1 を加え、滅菌後、ストレブトマイセスァニユレイタス 3 5 3 3 — S V 4菌株（ F E R M B P — 6 4 6 0 ) を一白金耳量接種し、レシプロカルシヱ一力一上にて 2 7 °Cで 2 日間振盪培養した。

次に、グリセリン 2. 0 %、糖蜜 1 . 0 %、カゼイン 0. 5 %、ポリペプトン 0 . 1 %、炭酸カノレシゥム 0. 4 %よりなる培地 (production medium) ( p H 7. 2 ) を 5 0 0 m l の三角フラスコに 1 0 0 m l ずつ分注し、滅菌後（ 1 2 1 °C、 1 5分）、上記種菌を 2 % ( V / V ) の割合で添加し、 2 7。C、 3 日間、回転振盪培養した (毎分 2 2 0 回、振幅 7 c m ) 。

次に、上記培地を 3個の 5 0 1 用ジャーフアーメン夕一（株式会社丸菱理化学装置研究所）に、それぞれ 3 0， 0 0 0 m 1 ずつ分注した。消泡剤（デイスホーム（CC- 11 8、日本油脂株式会社） 1 5 m 1 、信越シリコーン（KM- 68 - 2F、信越化学工業株式会社） 1 5 m 1 及びサラダオイル (味の素株式会社） 1 5 m l ) を加え、滅菌後（ 1 2 0 °C、 2 0分）、上記種菌を 2 % ( V / V ) の割合で添加し、 2 7 °C、 3 日間培養した（通気攪拌： 4 0 0 rpm (攪拌）、 30 L/rain (通気） ) 。

( b ) 分離工程

上記手順により得られた培養液 8 4 . 0 Lを採取し、 . 培養菌体を遠心分離により分離した。上澄は捨て、培養菌体をアセトン 1 0 . 0 Lで時々攪拌しながら 2 時間抽出する。抽出物を濾過し、再度アセトン 5 . 0 Lで抽出を繰り返し分離する。アセトン抽出液を合わせ、最終容量 2 Lになるまで蒸留濃縮する。減圧下、アセトンと水が完全になくなるまで溶媒を留去する。得られた油状の残渣をメタノール 4 5 O m l に溶解し、濾過後、減圧下蒸発乾固する。

( c ) 単離精製工程

得られた油状の残渣を、クロ口ホルム：メタノール ( 2 0 : 1 ) ( v Z v ) から成る混合溶媒 4 0 0 m l に溶解する。シリカゲルカラム（Wakogel C-200 (粒径 75〜 150 μ in), 内径 6 c m x 4 5 c m ) にふし、最初と同じクロロホルム一メタノール混合溶媒 5 Lで溶出させた。活性物質を含むフラクションは、クロ口ホルム：メタノール（ 1 0 ： 1 v / v ) で溶出した。活性物質を含むフラクシヨンを集め、減圧下、蒸発乾固させる。次に、粗精製物をシリカゲルカラム（粒径 75〜150 m、内径 3. 6 c m x 3 0 c m ) にふし、クロロホノレム：メタノーノレ： 2 9 %アンモニア水溶液（ 7 0 0 ： 1 0 0 ： 1 V / V / V ) の混合溶媒にて溶出させた。

活性物質を含む溶出液を、分取し、蒸発乾固した。残渣を前記 1 0 m 1 の移動相に溶解し、更に P E G A S I L O D S カラム（株式会社センシュ一科学、内径 2 0 m m x 2 5 0 m m ) (移動相をァセトニトリノレ：トリフルォロ酢酸：水（ 7 0 : 0. 1 : 3 0 V / V / V ) 流速を l O . O m l Z分、 2 5 4 n m ( 0. 5 m m U Vセルで検出））を用いての高速液体クロマトグラフィ一にふした。 1 回あたり抽出液 0. 8 m l をインジェクシヨンした。 G M— 9 5物質を含むフラクションを分取し、減圧下蒸発乾固した。

残渣を 1 0 %メタノール水溶液に懸濁し、更に P E G A S I L O D S カラム（株式会社センシュ一科学、内径 1 . 0 c m x 3 c m ) にふした。 1 0 %メタノール水溶液で洗浄させた後、 7 0 %メタノール水溶液で溶出させた。得られた溶出液を減圧下留去し、 G M— 9 5物質を 3 . 2 m g得た。

なお、 G M— 9 5物質を含むフラクションの検出は、精製の各段階において P E G A S I L O D S カラム (株式会社センシュ一科学，内径 4. 6 m m x 2 5 0 m m ) (移動相をァセトニトリノレ：トリフルォロ酢酸：水 ( 7 0 : 0. 1 : 3 0 v Z v Z v ) 、流速を 1 . 0 m 1 Z分）を用いての高速液体クロマトグラフィーを用いて行った o

G M - 9 5物質の物理化学的性質は下記の通りである。 1 ) 分子式：高分解能ファーストアトムボンバードメン卜 ¾量分析 (high - resolution fast atomic bombard oment mass spectrometry )で測疋した時、

測定値（ M + H ) +として、 5 8 3. 0 7 9 0 を示し、これと一致する分子式は C ₂₆H ₁₅N ₈0₇ Sである。

2 ) 分子量：ファーストアトムボンバードメント質量分析 fast atomic borabaraoment mass spectrometry) で測定すると、 5 8 2. 0 7 1 2 を示す。

3 ) 融点： 1 3 8 〜 1 4 3 °C (分解）。

[ ]。² ° = — 9 . 3 8 °

5 ) 紫外吸収スぺクトル：図 1 に示す。

測定は、メタノール中（ 7. 3 9 M溶液）で行った。 2 5 9. 5 n mで最大吸収を示し、その時の吸光度は 0. 2 8 8 であった。モル吸光係数（ ε ) は 3 8 9 8 2 である ο

6 ) 赤外線吸収スぺクトノレ（ F T — I R ) ：図 2 に示す。 m a x ( c m一¹)

3 4 2 1 , 3 1 4 7 , 2 9 5 8 , 2 9 2 3， 2 8 5 4

1 7 3 3 , 1 6 7 0， 1 6 5 0 , 1 5 4 4 , 1 4 9 6

1 4 3 8 , 3 9 2 , 1 3 5 1 ， 1 3 1 5 , 2 6 7 , 1 1 9 9， 1 1 7 4 ， 1 1 1 8 , 1 0 8 7， 1 0 5 8， 1 0 3 3 , 9 7 5 , 9 4 3 , 9 2 9 , 9 1 4 , 8 8 3 , 7 9 8

7 ) 溶剤に対する溶解性

水、アセトンに不溶。

クロ口ホルム：メタノール = 1 ： 1 に溶解する。

8 ) 物質の色：淡黄色粉末 ( white yellowish powders)

9 ) 核磁気共鳴スぺクトル

重クロロホノレム：重メタノ一ノレ = 1 ： 1 の溶液中、 2 5 °Cで測定した 5 0 0 M H z ¹ H _ N M Rスぺクトノレ (図 3 に示す）および 1 2 5 M H z ¹³ C _ N M Rスぺクトル（図 4 に示す）の化学シフトを下記に示す。

x ui ui 9 ' ¾M ) S (I O l I S V £) 3 d : マ ^

02

： m 翻 ¾

¾ ¾ 、 oidH) -

( o ι

(H8 's) Ί 9Ζ (H8 ' Ί 9 ·ΐΐ 92 (Ηΐ 's -iq)6T ·9 Ζ '1L Z

(Ηΐ '"09 '8 '(Ηΐ 'm)8 L '22 Ζ

0 ·09ΐ II

.0Π \Ζ

(Ηΐ 's)8T ·8 ΐ ·8 U

9 *99ΐ 6ΐ

6 ·οει 8ΐ

(Ηΐ 's)8S ·8 ·6εΐ 1\

9 '99ΐ 9ΐ

ί ·98ΐ 2ΐ

(Ηΐ 's)00 '8 Ζ .ΐ f ΐ

Ζ ·99Τ ετ 0ΐ

1 'οει ζ\

(Ηΐ 's) 2 ·8 8 *88T ΐΐ

8 *99ΐ οτ

·οει 6

(Ηΐ 's)IT ·8 8 Ί21 8

8 ·19Τ L

0 '^ΖΙ 9

9 *6^ΐ 9

f '99ΐ

ΐ '92ΐ ε

9 Ό9Τ

9 91 ΐ

Η Μ Ν - Η , Η Ν - 3 ε Ϊ 喜 ¾案^

拏 Z

08S0/66df/13d ^ Z/OO ΟΛ\ 2 5 0 m m、株式会社センシユー科学製）移動相；ァセトニトリル/ トリフルォロ酢酸/水

( 7 0 : 0. 1 : 3 0 v/v/v) 流速； 1 m 1 Z分

検出； 2 5 4 n m

で分析すると、 6. 1 分にピークが検出される。

上記物理科学的データから G M - 9 5物質の化学構造は以下の様であると同定された。

薬理試験（抗腫瘍作用）

表 5 に記載の腫瘍細胞を、 1 0 %牛胎児血清添加 R P M I 1 6 4 0培地に浮遊させ、培養プレート（ 3 8 m m ) に各々 2 x 1 0 ³個ずつ播種し、 3 7 °C、 5 % C 0₂ 条件下炭酸ガス培養器にて一晩培養した。その後、 1 0 %牛胎児血清添加 R P M I 1 6 4 0培地を用いて種々の濃度に希釈した被験薬（本発明化合物および 5 — フルォロウラシル）を加え、更に 7 2 時間培養した。培養終了後、細胞を 2 5 %グルタールアルデヒドで 1 5分間固定し、水で 3 回洗浄した。次に、 2 0 %メタノール水溶液に希釈した 0. 0 5 %クリスタルバイオレツトで細胞を染色後、水で 3 回洗浄し、乾燥させた。 0. 0 5 M リン酸二水素ナトリウム/エタノール（ 1 1 ( v/v) ) 1 0 0 β I でクリスタルバイオレツトを抽出し、 5 4 0 n m の吸光度を自動分光器にて測定した。 I C ₅。はコント口一ルの吸光度に対し 5 0 %減じるのに必要な濃度と定義した。結果を下記に示す。

表 5 各種腫瘍細胞の 5 0 %発育阻止濃度（ I C ₅。 μ Μ )

綳灘本翻 5—フルォロ

_ (由来) 化^/ ゥラシノレ

OVCAR-3 3. 41 0. 37

(ヒ Hi麵）

PC - 3 8. 82 5. 7

(ヒト腿）

SKOV-3 3. 73 7. 84

(ヒ卜麵）

MCF-7 7. 73 1. 12

(ヒト麵

ZR75-1 4. 04 3. 63

(ヒト孚,

PAN— 3 7. 09 8. 82

(ヒト謹）

KM12C-SM 3. 74 1. 32

(ヒト

A375SM 7. 04 2. 89

(ヒトメラノーマ）

TMK-1 3. 75 0. 33

(ヒト胃癌）

HT-29 7. 1 2. 1

(ヒト »g)

DLD-1 6. 2 5. 5

(ヒト結鶸）

Rene a 0. 97 0. 58

一（マウス »g) 本発明化合物はィンビト口における各種腫瘍細胞の発育を阻止することができた。

薬理試験（テロメラーゼ阻害作用）

本発明化合物について、常法に準じてテロメラーゼを含む細胞抽出物を用いたテロメラーゼ阻害活性試験を行い、細胞抽出物中のテロメラーゼ活性を 5 0 %阻害する濃度（ IC₅。）を求めた。その結果、本発明化合物の IC₅₀ は、 50nMであり、本発明化合物が非常に強いテロメラーゼ阻害活性を有することが判明した。

テロメラーゼは、正常体細胞にはほとんど存在せず、広範な悪性腫瘍に存在する（皮膚、乳房、肺、胃、脾臓、卵巣、頸部、子宮、腎臓、膀胱、結腸、前立腺、中枢神経系（CNS)、網膜及び血液腫瘍細胞系を含めた全ての悪性腫瘍のうち 85%以上で見出されている。）。本発明化合物は、該酵素の活性を阻害することにより、広いスぺクトルを有する抗腫瘍剤として有用であることが示唆される。製剤例 1 . カプセル剤

G M— 9 5物質 1 0 m g

乳糖 5 0 m g

トウモロコシデンプン 4 7 m g

結晶セルロース 5 0 m g

タルク 2 m g ステアリン酸マグネシウム 1 m g

1 カプセル当たり 1 6 0 m g

上記配合割合で、常法に従いカプセル剤を調製した製剤例 2. 注射剤

G M - 9 5物質 5 m g

注射用蒸留水 ―

1 アンプル中 0 m 1

上記配合割合で、常法従い注射剤を調製した製剤例 3. 坐剤

G M— 9 5物質 2 0 m g

ウイテツプゾ一ル W— 3 5 1 3 8 0 m g

(登録商標、ダイナマイトノーベル社製）

1 個当たり 1 4 0 0 m g

上記配合割合で、常法に従い座剤を調製した産業上の利用可能性

本発明の G M— 9 5物質は、優れた抗腫瘍作用を有し悪性腫瘍の治療薬として有用である。また、 G M— 9 5 物質生産菌は、優れた抗腫瘍作用を有する G M - 9 5物質を産生させることができ非常に有用である。

Claims

請求の範囲

下記式（ 1 ) ：

で表される化合物。

2. ストレプ卜マイセス（ Streptomyces) 属に属し、請求項 1 に記載の化合物を生産する能力を有する菌を培地で培養し、培養液から該化合物を単離することを特徴とする請求項 1 に記載の化合物の製造法。

3 . 該菌が、ストレプトマイセスァニュレイタス

( Streptomyces anulatus) 3 5 3 3 - S V 4 菌株又はその変異株である請求項 2 に記載の製造法。

4. 該菌が、受託番号「 F E R M B P — 6 4 6 0」の菌である請求項 2 に記載の製造法。

5 . 請求項 1 に記載の化合物を有効成分とする医薬。

6. 請求項 1 に記載の化合物を有効成分とする抗腫瘍剤。

7. 有効量の請求項 1 に記載の化合物及び薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物。

8 . 腫瘍治療用である請求項 7 に記載の医薬組成物。

9. 有効量の請求項 1 に記載の化合物を患者に投与することを特徴とする腫瘍の治療方法。

10. 請求項 1 に記載の化合物の医薬への使用。

11. 医薬が腫瘍治療剤である請求項 10に記載の使用。

12. 請求項 1 に記載の化合物を産生する能力を有する

13. ストレプトマイセス（ Streptomyces) 属に属する請求項 12に記載の菌。

14. ストレプトマイセスァニュレイタス（Streptom yces anulatus) 3 5 3 3 — S V 4菌株又はその変異株である請求項 12又は 13に記載の菌。

15. 受託番号「 F E R M B P — 6 4 6 0 」の請求項

14に記載の菌。