WO2004074295A1

WO2004074295A1 - チアゾール環状多量体、その製造方法、その合成中間体およびその利用

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Publication number: WO2004074295A1
Application number: PCT/JP2004/001772
Authority: WO
Inventors: Kazunobu Toshima
Original assignee: Keio University
Priority date: 2003-02-21
Filing date: 2004-02-18
Publication date: 2004-09-02
Also published as: JPWO2004074295A1

Description

明細書チアゾール環状多量体、その製造方法、その合成中間体およびその利用技術分野

本発明は、チアゾール環状多量体およびその利用に関する。背景技術

従来の抗癌剤は、正常細胞と癌細胞の選択性が乏しく、そのため副作用が問題となっている。テロメラ一ゼは、染色体末端部に存在するテロメァの伸長反応を司る酵素であり、正常な体細胞では発現していないのに対して、 8 5〜 9 0 %の癌細胞においては高度に発現していることが知られている。したがって、テロメラーゼ阻害剤は、分子標的薬の一つとして、癌細胞選択的な抗癌剤となることが期待される。

テロメラ一ゼによるテロメァ伸長反応の過程において、テロメァ DN Aの 4つのグァニン残基が自己会合することにより高次構造をとることが知られており、この高次構造は G—カルテット構造（図 1 ) と呼ばれている。 G—カルテット構造と相互作用し、テロメラーゼ抑制活性を持つ低分子化合物 (2, 6-diamido anthra u inone^ porphirin、 perylene, ethidium bromide, 3, 3' -diethyloxyadicarbocyanine) 力 s幸艮告されてレ ^ る (TiPS- April 2000 (Vo.21) , pp.136- 141)。

本発明は、テロメラーゼによるテロメァ伸長反応の過程で見られる D NAの G—カルテツト構造と相互作用し、テロメラーゼ活性を阻害する新規な化合物を提供することを目的とする。発明の開示

本発明者は、テロメァグァニン四重鎖に作用し、 G—カルテット構造を安定化させることで、テロメラーゼ活性を阻害する新規人工分子として、チアゾール環をアミド結合により連結した環状多量体を設計し、化学合成した。さらに、この化合物が効果的にテロメラ一ゼ活性を阻害することを TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol) 法により確認した。本発明は、これらの知見により完成されたものである。すなわち、本発明は、式（I)

(式中、 Rは、それぞれ、独立に、水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基、 _CH₂SHで表される基、ホルミル基または力ルポキシル基であり、 nは 1〜 4のいずれかの整数である。）

で表される化合物またはその薬理上許容される塩を提供する。

式（I)において、 Rは、それぞれ、独立に、水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基、 - CH₂SHで表される基、ホルミル基または力ルポキシル基である。 Rの低級アルキル基としては、炭素数 1〜4のアルキル基、例えば、メチル基、ェチル基、 n—プロピル基、 i—プロピル基、 n—ブチル基、 i 一ブチル基、 s—プチル基、 t一ブチル等などを挙げることができ、低級アルキル基の置換基としては、ヒドロキシル基、ァミノ基、ジメチルァミノ基などを挙げることができる。

式（I)で表される化合物またはその薬理上許容される塩は、テロメラ一ゼ阻害剤、テロメラーゼが関与する疾患の予防および Zまたは治療剤などとして利用することができる。本発明の化合物は、テロメラーゼに選択的に作用し（すなわち、テロメラ一ゼへの阻害作用が大きく、 Tad polymeraseや他の逆転写酵素への阻害作用が小さい）、かつ毒性がないあるいは低いので、テロメラーゼに対する選択的阻害剤としての利用価値が高い。

また、本発明は、式（4)

(4) で表される化合物を縮合するとによりチアゾ一ル環状三量体を形成させる工程を含む、式（2)

(2)

で表される化合物またはその薬理上許容される塩の製造方法を提供する上記の縮合反応は、ジイソプロピルェチルァミン（DIPEA)、ペン夕フルオロフェニルジフエニルホスフイネ一ト（FDPP)、ジシクロへキシルカルポジイミド（DCC)、ジイソプロピルカルポジイミド（DIP)、 "ェチル -If -3-ジメチルァミノプロピルカルポジイミド（WSCI)、 -ェチル

-3-ジメチルアミノプロピルカルポジィミド · 塩酸塩（WSCI · HC1)、ベンゾ卜リアゾ一ル -卜ィル-トリス（ジメチルァミノ）ホスホニゥムへキサフルォロリン化物塩（B0P)、ジフエニルホスホリルアジド（DPPA)、 N- ヒドロキシスクシンイミド（HONSu)、卜ヒドロキシベンゾトリアゾール (HOB t)、 3-ヒドロキシ -4-ォキソ - 3, 4-ジヒドロ- 1， 2, 3-ベンゾトリアジシン（H00b t)、それらの 2種以上の混合物などの縮合剤を用いて、ァセトニトリル、ジクロロメタン、 THF、 DMF、 1， 4-ジォキサンなどの溶媒中で、 0 〜80°Cの温度条件にて、 1〜 24時間の反応時間で行うとよい。縮合剤の使用量は、式（2)で表される化合物 1モルに対して、 1〜10モル程度であるとよく、好ましくは 1〜5モルであり、より好ましくは 1〜2モルである。さらに、本発明は、式（4)

(4)

で表される化合物を提供する。この化合物は、式（2)で表される化合物またはその薬理上許容される塩を製造するための中間体として利用することができる。

(式中、 Rは、それぞれ、独立に、水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基、 - CH₂SHで表される基、ホルミル基または力ルポキシル基であり、 nは 1〜 4のいずれかの整数である。）

で表される化合物またはその薬理上許容される塩を有効成分として含有するテロメラーゼ阻害剤を提供する。

本発明は、また、式（I)

で表される化合物またはその薬理上許容される塩を有効成分として含有する、医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、テロメラーゼが関与する疾患を予防および/または治療するために使用することができる。テロメラーゼが関与する疾患としては癌を例示することができる。

本明細書において、 Bocは t -ブチルォキシカルポニル基、 E tはェチル基、 Meはメチル基、 TFAはトリフルォロ酢酸、 Acはァセチル基を示す本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願 2003 - 43914号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。図面の簡単な説明

図 1は、テロメァ D N Aの G —カルテット構造を示す。

図 2は、製造例 1で製造した化合物（チアゾール環状三量体）がテロメラーゼの活性を阻害することを T R A P法で確認した実験結果を示す

3は、製造例 1で製造した化合物（チアゾール環状三量体）が TaQ polymeraseの活性を阻害するが、その活性はテロメラーゼの阻害活性より低いことを P C R法で確認した実験結果を示す。

図 4は、製造例 1で製造した化合物（チアゾール環状三量体）の逆転写酵素（ATM) 阻害活性が低いことを RT inhibitionアツセィで確認した実験結果を示す。

図 5は、製造例 1で製造した化合物（チアゾ一ル環状ミ量体）の HeLa S3 細胞に対する細胞毒性が低いことを X T T法で確認した実験結果を示す図 6は、製造例 2で製造した化合物（チアゾール単量体）はテロメラーゼ活性を阻害しないことを TRAP法で確認した実験結果を示す。発明を実施するための最良の形態

式（2)で表される化合物（化合物 2) は、以下に示す反応式に従って、製造することができる。

Et₃N (1.0)

CICOOEt (1.0)

BocHN、 BocHN Lawesson' s reagent (0.5)

0H NH₂ ►

THF CH₂CI₂

-10OC, 1.5 h

12 13 r. t. , 16 h

74% 94¾

B

DIPEA (2.0)

FDPP (1.5)

化合物 2

CH3CN

r. t. , 22.5 h

60¾ (2step) N-( e//-Butoxycarbonyl) glycine^ (東京化成工業（株）より購入）を出発原料とし、 Moodyらの方法（ J. Moody and M. C. Bagley, J. Chem. Soc. , Perkin Trans. I, 1998, 6(H- 607)に準じて、 4行程で化合物 16 を合成する。合成に用いる試薬、反応条件は上記の合成スキーム中に記載してある。

化合物 16を、 1， 4 - ジォキサンに溶解し、 0〜40°C (好ましくは 25°C) 攪拌下、 3〜5M (好ましくは 4M) の塩酸を加え、室温で 3〜10時間（好ましくは 6時間）攪拌する。反応終了後、減圧濃縮し、粗化合物 4を得る。粗化合物 4を、ァセトニトリルに溶解し、 0〜40°C (好ましくは 25°C) 攪拌下、ジイソプロピルェチルァミン（DIPEA) とペン夕フルオロフェニルジフエニルホスフィネート（FDPP) を加え、室温にて 12〜24時間（好ましくは 22.5時間）攪拌する。反応終了後、蒸留水を加えて、酢酸ェチルにより抽出する。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、芒硝乾燥後、減圧濃縮する。濃縮残渣をシリ力ゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、化合物 2を得る。化合物 2は、式（I)において、 Rが水素原子であり、 n が 1である化合物である。

式（I)において、 Rが水素原子であり、 nが 2〜 4のいずれかの整数である化合物は、以下のようにして調製することができる。

前述の化合物 1 5の Boc 基を、塩化メチレン中、トリフルォロ酢酸 (TFA) で処理して脱保護し、トリフルォロ酢酸塩を得る。このトリフルォロ酢酸塩とカルボン酸 1 6を、ジイソプロピルェチルァミン存在下、ホスホニゥムへキサフルォロリン化物塩（PyBOP)を用いて縮合し、鎖状の二量体を得る。さらに、この二量体の Boc基を同様の方法で脱保護し、ァミントリフルォロ酢酸塩とした後、再び化合物 1 6 と同様な方法で縮合させることで鎖状の三量体を得る。この一連の操作の繰り返しにより、鎖状の四量体、五量体、六量体が得られる。最後に、それぞれの鎖状化合物のェチルエステル基を水酸化リチウムで加水分解し、 Boc 基を脱保護した後、同様の縮合剤により環化させ、環状の四量体、五量体、六量体を得る。

式（I)において、 Rがメチル基であり、 nが 1である化合物は、以下のようにして調製することができる。 .

D, L_tlireonine を出発原料とし、そのアミノ基を Boc 基で保護後、トリメチルシリルジァゾメタンを用いたメチルエステル化、続く、 Boc 基の脱保護により、化合物 Aを合成する。化合物 Aの化学構造式を以下に示す。

化合物 A この化合物 Aと、 N- (/e/ -Butoxycarbonyl) glycineを、ジフエニルホスホリルアジド（DPPA) により縮合させ、遊離の水酸基を、 Dess- Martin 酸化により酸化しケトンへと変換後、 Lawesson' s試薬を用いてチアゾール中間体を合成する。さらに、このチアゾール体のメチルエステルを加水分解後、 Boc 基の脱保護を行い、環'化前駆体を得た後、ジフエニルホスホリルアジド（DPPA) を用いて縮合させることで下記の化合物 19を合成する。

化合物 1 9より、 1 9のメチル基の二酸化セレンによる酸化でアルデヒドへ変換後、種々のアルキル Witt ig試薬による Wit tig反応、さらには、生じた二重結合の加水素分解による還元により、が、ェチル基、 n— プロピル基、 i 一プロピル基、 n _ブチル基、 i 一ブチル基、 s —プチル基、 t 一ブチル等であり、 nが 1である式（I)で表される化合物を合成することができる。

式（I)において、 Rが置換基（ヒドロキシル基、アミノ基またはジメチルァミノ基）を有する低級アルキル基で、 n = lである化合物は、以下のようにして調製することができる。

化合物 1 9のメチル基を二酸化セレンによる酸化でアルデヒドへと変換後、 NaBH₄で還元することで、 Rがヒドロキシメチル基で表される化合物が合成でき、このものに対して、脱離基としてのトシル基の導入、つづく NaN₃での処理によりアジド基を導入後、 Pd触媒存在下での水素添加によるァミンへの変換および Pd 触媒およびホルムアルデヒド存在化での水素添加によるジメチルァミノ基への変換により、 R がァミノメチル基およびジメチルァミノメチル基で表される化合物が合成できる。

9 式（I)において、 Rが- CH₂SHで表される基で、 n = lである化合物は、以下のようにして調製することができる。

化合物 1 9のメチル基を二酸化セレンによる酸化でアルデヒドへと変換後、 NaBH₄で還元し、 Rがヒドロキシメチル基で表される化合物が合成でき、このものに対して、脱離基としてのトシル基の導入、つづく PhCOSH での処理によりチォベンゾィル基を導入後、 NaOMe で加水分解することで、 Rが、 - CH₂SHであり、 nが 1である式（I)で表される化合物を合成することができる。

式（I )において、 Rがホルミル基または力ルポキシル基で、 nが 1である化合物は、以下のようにして調製することができる。

化合物 1 9のメチル基の二酸化セレンによる酸化でアルデヒドを得、さらに、そのアルデヒドを亜塩素酸ナトリゥムで酸化してカルボン酸へ変換することで、それぞれ、 Rが、ホルミル基および力ルポキシル基であり、 nが 1である式（I)で表される化合物を合成することができる。式（I)において、 Rがメチル基で、 nが 2〜 4のいずれかの整数である化合物は、以下のようにして調製することができる。

化合物 Aと、 N- ( /e -Bu t oxyc arbonyl ) glyc i neを、ジフエ二ルホスホリルアジド（DPPA) により縮合させ、遊離の水酸基を、 De s s- Mar t i n 酸化により酸化しケトンへと変換後、 Lawe s son' s試薬を用いてチアゾ一ル中間体を合成する。このチアゾ一ル中間体の Boc基を、塩化メチレン中、トリフルォロ酢酸（TFA) で処理して脱保護し、トリフルォロ酢酸塩を得る。また、このチアゾ一ル中間体のメチルエステルを加水分解してカルボン酸を得る。このようにして得られたトリフルォロ酢酸 _塩とカルボン酸を、ジイソプロピルェチルァミン存在下、ホスホニゥムへキサフルォ口リン化物塩（PyBOP) を用いて縮合し、鎖状の二量体を得る。さらに、この二量体の Boc 基を同様の方法で脱保護し、ァミントリフルォロ酢酸塩とした後、再び上述のカルボン酸と同様な方法で縮合させることで鎖状の三量体を得る。この一連の操作の繰り返しにより、鎖状の四量体、五量体、六量体が得られる。最後に、それぞれの鎖状化合物のメチルェステル基を水酸化リチウムで加水分解し、 Boc 基を脱保護した後、同様の縮合剤により環化させ、環状の四量体、五量体、六量体を得る。

式（I)において、 Rが、 -CH₂SHで表される基、ホルミル基または力ルポキシル基で、 nが 2〜 4のいずれかの整数である化合物は、式（I)において、が、 - CH₂SHで表される基、ホルミル基または力ルポキシル基で、 nが 1である化合物の製造方法と同様の方法で、式 (I)において、 Rがメチル基で、 nが 2〜 4のいずれかの整数である化合物から製造することができる。

式（I)で表される化合物の薬理上許容される塩としては、塩酸塩、リン酸塩などを例示することができる。これらの塩は公知の方法で製造することができ、例えば、式（I)で表される化合物の塩酸塩は、塩酸メタノール溶液で処理することにより得られ、リン酸塩は、ジクロロメタン中、トリェチルアミン存在下、 P0C 1₃と反応させることにより得られる。式（I)で表される化合物およびその薬理上許容される塩は、テロメラーゼ活性を阻害する効果を有する。従って、これらの化合物は、医薬品として、ヒト、その他の動物に投与してもよいし、実験用の試薬として用いてもよい。これらの化合物は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、他の抗癌剤）と組み合わせて使用してもよい。

式（I)で表される化合物および薬理上許容されるその塩をヒトに投与する場合には、例えば、 1 日あたり約 10〜100 mg/kg (体重）、好ましくは 1 日あたり約 20〜30 mg/kg (体重）の投与量で、 1回または数回に分けて経口投与するとよいが、その投与量や投与回数は、症状、年齢、投与方法などにより適宜変更しうる。

式（I)で表される化合物および薬理上許容されるその塩は、錠剤、カブセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの製剤にして、経口投与してもよいし、注射剤、坐剤などの製剤にして、腹腔内や静脈内への注射により非経口投与することもできる。製剤中の式（I)で表される化合物または薬理上許容されるその塩（有効成分）の含有率は、 1〜 9 0重量％の間で変動させることができる。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などの形態をとる場合には、有効成分を 5〜 8 0重量％含有させるのが好ましい。シロップ剤などの液剤の場合には、有効成分を 1〜 3 0重量 %含有させるのが好ましい。さらに、非経口投与する注射剤の場合には、有効成分を 1〜 1 0重量％含有させるのが好ましい

式（I)で表される化合物および薬理上許容される塩の製剤化は、賦形剤

(乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトールなどの糖類、バレイショ、コムギ、トウモロコシなどのデンプン、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機物、結晶セルロースなど）、結合剤（デンプンのり液、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、メチルセルロース、ェチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルァルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロ一スなど）、滑沢剤

(ステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール、シリコーン油）、崩壊剤（デンプン、寒天、ゼラチン末、結晶セル口一ス、 CMC · Na、 CMC · C a、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウムなど）、矯味矯臭剤（乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、芳香性精油類など）、溶剤（注射用水、滅菌精製水、ゴマ油、ダイズ油、トウモロコシ油、ォリーブ油、綿実油など）、安定剤（窒素、二酸化炭素などの不活性ガス、 EDTA、チォグリコール酸などのキレート剤、亜硫酸水素ナトリウム、チォ硫酸ナトリウム、 L-ァスコルビン酸、ロンガリットなどの還元物質など）、保存剤（パラォキシ安息香酸エステル、ク口ロブタノ一ル、ベンジルアルコール、フエノール、塩化ベンザルコニゥムなど）、界面活性剤（水素添加ヒマシ油、ポリソルべ一卜 8 0、 2 0 など）、緩衝剤（クェン酸、酢酸、リン酸のナトリウム塩、ホウ酸など）、希釈剤などの製剤添加物を用いて、公知の方法で行われる。

式（I)で表される化合物および薬理上許容されるその塩は、テロメラーゼが関与する疾患（例えば、癌）を予防および/または治療するために利用することができる。また、テロメラーゼの研究に利用することができる。以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。

[製造例 1 ] 化合物 2 (環状三量体）の合成

Et₃N (1.0)

CICOOEt (1.0)

BocHN

BocHN NH₃ し awesson' s reagent (0.5)

NH₂ ►

OH THF CHgC 12

-10OC, 1.5 h r. t. , 16 h

12 13

74¾ 94¾

DIPEA (2.0)

FDPP (1.5)

化合物 2

CH3GN

r. t. , 22.5 h

60% (2step)

N- (^/ -Butoxycarbonyl) glyc ine 12を出発原料とし、 Moodyらの方法 (C. J. Moody and M. C. Bagley, J. Chem. Soc. , Perkin Trans. I, 1998, 601- 607)に準じて、まず、 4行程で化合物 16を合成した。

化合物 16 (0.33 g, 1.55 X 10—³ mol) を、 1， 4 - ジォキサン（9.77 ml ) に溶解し、 0°C攪拌下、 4Mの塩酸（1.94 ml) を加え、室温で 6時間攪拌した。 TLCにて反応終了確認後、減圧濃縮し、粗化合物 4を得た。粗化合物 4 (41.5 mg, 2.62 x 10"⁴ mol) を、ァセトニトリル（26.2 ml) に溶解し、 0°C攪拌下、ジイソプロピルエヂルァミン（DIPEA) (89.2 1, 5.24 X 10-⁴mol) とペン夕フルオロフェニルジフエニルホスフイネ一ト（FDPP .

) (0. 151 g, 3. 93 x 10— ⁴ mol) を加え、室温にて 22. 5時間攪拌した。 TLC にて反応終了確認後、蒸留水（30 ml) を加えて、酢酸ェチル（30 mi x 3 ) により抽出した。有機層を飽和食塩水（30 ml) にて洗浄し、芒硝乾燥後、減圧濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ 3. 7 g, クロ口ホルム：メタノール = 10 ： 1) にて精製し、化合物 2の黄色結晶（22.0 mg , 収率； 59. 8% (2step) ) を得た。

300MHz 'Η-醫 R (CDC1₃) δ (ppm) = 5. 01 (6H, d, J=4. 5 Hz, -CH₂) , 8. 21 (3H, s， thiazole-H) , 8. 60 (3H, br s ， NH)

[試験例 1 ] 化合物 2 (環状三量体）のテロメラーゼ活性阻害効果製造例 1で合成した化合物 2のテロメラーゼ活性阻害効果を TRAPEZE

(登録商標）テロメラーゼ活性検出キット（Intergen Company) で測定した。結果を図 2に示す。レーン 1および 2は、それぞれ、 0. 1および 0.03 gのテロメラ一ゼタンパク質を添加した陽性コントロールであり、レーン 3は、溶解バッファ一を添加した陰性コントロールであり、レーン 4 〜 8は、 0. l 2 gのテロメラ一ゼタンパク質と、それぞれ、化合物 2を 30 、 10、 3、 1および 0. 3 M添加したものである。レーン 1および 2の陽性コントロールにおいては、テロメラ一ゼの作用により、基質のオリゴヌクレオチドが伸長して生じた生成物がラダーを形成している。レーン 4 〜.8においては、化合物 2の濃度に依存して、ラダーの形成が消失している。このことから、テロメラ一ゼ活性は環状三量体を形成している化合物 2の濃度に依存して阻害されていることがわかる。 Κ_5ϋの値は 16 juM であった。

[試験例 2 ] 化合物 2 (環状三量体）の Tad polymerase活性阻害効果 M13mpl8ssDNA (TaKaRa) と Ex Tad polymerase (TaKaRa) を用いて、化合物 2の Taci polymerase活性阻害効果を測定した。結果を図 3に示す。レーン 1は、 Tad polymeraseを作用させて DNAを増幅した陽性コントロールであり、レーン 2〜5は、レーン 1 と同量の Tad polymerase に、ィ匕合物 2 をそれぞれ 100、 30、 10および 3 M添加したものである。レーン 1 の陽性コントロールにおいては、 Tad polymeraseの作用により増幅された DNAがバンドとして現れている。一方、レーン 2、 3 においては、化合物 2の濃度に依存して、 DNA バンドが消失したり薄くなつたりしている。このことから、 Tad polymerase活性は、環状三量体を形成している化合物 2の濃度に依存して阻害されていることがわかる。 IC_5Qは 58 Mであった。

[試験例 3 ] 化合物 2 (環状三量体）の逆転写酵素活性阻害効果

化合物 2 の逆転写酵素活性阻害効果を、 RNA PCR Kit (AMV) Ver.2. 1 (TaKaRa) により測定した。結果を図 4に示す。レーン 1 は、逆転写酵素を作用させて RNAを cDNA とし、増幅させた陽性コントロールであり、レーン 2〜5 は、レーン 1 と同量の逆転写酵素と化合物 2 を、それぞれ 150、 50、 15および 5 μΜ添加したものである。レーン 1の陽性コント口ールにおいては、逆転写酵素の作用により RNAが cDNAに変換された後、 PCR により増幅された DNA がバンドとして現れている。一方、レーン 2 〜5において、レーン 2では、 DNAのバンドがわずかに薄くなっているが、レーン 3〜5 では、コントロールと比較してバンドの濃さに変化はない。このことから、化合物 2の逆転写酵素阻害活性は低いことがわかる。 IC₅₀ は〉100 μΜであった。

[試験例 4〗化合物 2 (環状三量体）の細胞毒性効果

化合物 1 の細胞毒性効果を、ヒト子宮頸部癌由来、 HeLa S3 細胞（大日本製薬）を用いて、 XTT法（ロシュ - ダイァグノスティック（株））により測定した。結果を図 5に示す。横軸は化合物 2 の濃度、縦軸はコントロールに対する細胞生存率を表している。化合物 2が 100 μΜの時に初めて、細胞生存率がコントロールよりもわずかに低下している。このこと力ゝら、 HeLa S3細胞に対する化合物 2の細胞毒性は低いことがわかる。 IC₅₍₎は〉 100 μΜであった。 [製造例 2 ] 化合物 1 8 (単量体）の合成

4M HCI (6.0) さ -

BocHN、 _¾0 HCIH₂Nゝ ^ ^O

1 ,4-dioxane

OEt r.t., 8.5 h OEt

15 17

S- 0 '² 編ヽ

Prydine 。

0。C, 10 min OEt

18 67% (2step)

N- (/e/Z-Butoxycarbonyl) glycinel2 を出発原料とし、 Moody らの方法 (C. J. Moody and M. C. Bagley, J. Chem. Soc. , Perkin Trans. I, 1998, 601-607)に準じて、まず、 3行程で化合物 15を合成した。

化合物 15 (8.5 mg, 2.97 x 10"⁵ mol) を、 1， 4 - ジォキサン（0.255 ml) に溶解し、 0°C攪拌下、 4Mの塩酸（44.4 l, 8.91 X 10— ⁵ mol) を加え、室温にて 8.5 時間攪拌した。 TLC にて反応終了確認後、減圧濃縮することにより、粗化合物 17を得た。粗化合物 Π (5.88 mg, 2.97 x 10"⁵ mol) を、ピリジン（0. 176 ml) に溶解し、 0で攪拌下、無水酢酸（3.36 1) を加え、そのまま 0°Cで 10分間攪拌した。 TLC にて反応終了確認後、蒸留水（2 ml) を加え、酢酸ェチル（2 ml x 3) にて抽出した。芒硝乾燥後、減圧濃縮し、トルエンで共沸した。濃縮残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー (2.2 g, クロ口ホルム：メタノール =4 ： 1) にて精製し、化合物 18の黄色結晶（4.8 mg, 収率； 67.4% (2step) ) を得た。 SOOMHz'H-NMRiCDCls) δ (ppm) 1.47 (3H, t, J = 8.5Hz, -CH₃-Et) , 2.06 (3H, s, -CH₃-Ac), 4.4K2H, Q, J = 8.5HZ, -CH₂-Et), 4.76(2H, d, J = 5.7Hz, - CH₂匪) , 8. 14 (1H, s， NH)

[試験例 5 ] 化合物 1 8 (単量体）のテロメラーゼ活性阻害効果の測定製造例 2で合成した化合物 18のテロメラーゼ活性阻害効果を TRAPEZE (登録商標）テロメラーゼ活性検出キット（Intergen Company) で測定した。結果を図 6に示す。レーン 1および 2は、それぞれ、 0. 1および 0. 03 gのテロメラ一ゼ夕ンパク質を添加した陽性コントロールであり、レーン 3は、溶解バッファーを添加した陰性コントロールであり、レーン 4 〜 1 0は、 0. 1 / gのテロメラーゼタンパク質と、それぞれ、化合物 1 8 を 1 000、 300、 100、 30、 10、 3、 1および 0. 3 M添加したものである。レ —ン 1および 2の陽性コントロールにおいては、テロメラ一ゼの作用により、基質のオリゴヌクレオチドが伸長して生じた生成物がラダーを形成している。同様に、レーン 4〜 1 0においても、ラダ一の形成が見られた。このことから、単量体である化合物 1 8はテロメラ一ゼ活性を阻害しないことがわかる。本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。産業上の利用可能性

本発明により、テロメラ一ゼ活性を阻害する新規な化合物が提供された。本発明の化合物は、テロメラ一ゼ阻害剤として、また、癌などのテ口メラーゼに関与する疾患を予防および/または治療するための医薬として、有用である。