WO2004078764A1 - Ｇｍ－９５物質を含む抗腫瘍効果増強剤、抗腫瘍用組み合わせ製剤及び抗腫瘍剤 - Google Patents

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antitumor
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Kazuo Shinya
Tetsuzo Tauchi
Toshiro Morohoshi
Takashi Ono
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Sosei Co., Ltd.
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07D513/22—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for in groups C07D463/00, C07D477/00 or C07D499/00 - C07D507/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings

Definitions

  • the present invention relates to an antitumor preparation in which two or more compounds having antitumor activity are used in combination (combined use). More specifically, the present invention relates to an antitumor preparation using an antitumor compound having a plurality of oxazole rings in combination with another antitumor substance.
  • Tumor cells have a higher growth rate than normal cells, and if the killing effect of the tumor cells is equal to or lower than the growth rate, it will only suppress the progression of cancer, and cannot be a fundamental treatment for cancer .
  • there is an optimal dose for each antitumor agent and administration of a larger amount of the antitumor agent does not necessarily increase the effect of killing tumor cells in proportion to the dose, but usually slightly increases the effect. It just rises.
  • adverse effects such as damage to normal cells due to high dose often appear more strongly, and it is hardly expected that the therapeutic effect will be increased by high dose of one type of antitumor agent.
  • a multidrug combination therapy combining two or more drugs should be performed to improve the antitumor effect and reduce side effects, or to prevent tumor cells from acquiring resistance to the drug. There are many.
  • telomere has been attracting attention as one of new cancer molecular targets. Telomerase is not expressed in normal cells except in some tissues, but it is frequently re-expressed in cancer cells as much as 90% or more. Telomere length is closely related to cell aging, and it is expected that treatment of cancer cells with a telomerase inhibitor will cause human cell aging. On the other hand, 40% of drugs used in clinical practice today are naturally occurring compounds, including microbial metabolites, and are still widely used as a source of drug development.
  • GM-9 also called “five substances.”
  • GM-95 was the most potent telomerase inhibitor currently reported, including synthetic compounds. As a result of examining the effects of GM-95 substances on several types of cancer cells, they induced cell senescence with telomere shortening. In addition, these senescent cells had lost tumorigenicity, suggesting their potential as antitumor agents.
  • Patent Document 1 WO 00/24747 pamphlet
  • An object of the present invention is to provide a synergistically enhanced antitumor effect by using two or more antitumor substances in combination, and to provide an antitumor concomitant agent having such an antitumor effect synergistically enhanced. Aim.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, when the 01 ⁇ _95 substance or a derivative thereof and another antitumor substance are used in combination, remarkably compared to the case where each is used alone. The inventors have found that the antitumor activity is high, and have completed the present invention.
  • the present invention includes the following inventions.
  • the group consisting of the aforementioned antineoplastic substances consisting of alkylating agents, antimetabolites, anticancer antibiotics, microtubule inhibitors, hormonal agents, platinum complexes, topoisomerase inhibitors, biologics and molecular target therapeutics
  • the antitumor effect enhancer according to the above (1) which is selected from the group consisting of:
  • the antineoplastic substance is a mustard drug, a nitrosoprea compound, a folate compound, a pyrimidine compound, a purine compound, an anthracycline compound, pin alkaloid, a taxane, an antiestrogen, an LH-RH agonist, a topoisomerase.
  • the antitumor effect enhancer according to the above (1) which is selected from the group consisting of an I inhibitor, a topoisomerase II inhibitor, an interferon, an interleukin, a molecular target therapeutic agent, cisbratin, carpoplatin and nedaplatin.
  • R ' is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.
  • a pharmaceutically acceptable salt thereof and another antitumor substance wherein the compound of formula (1) and the other antitumor substance are simultaneously, separately or Antitumor combination preparation for sequential administration.
  • the antitumor substance is selected from the group consisting of alkylating agents, antimetabolites, anticancer antibiotics, microtubule inhibitors, hormonal agents, platinum complexes, topoisomerase inhibitors, biologicals and molecular targeted therapeutics.
  • the anti-tumor combination preparation according to the above (5) is selected from the group consisting of alkylating agents, antimetabolites, anticancer antibiotics, microtubule inhibitors, hormonal agents, platinum complexes, topoisomerase inhibitors, biologicals and molecular targeted therapeutics.
  • the antitumor substance is a mustard drug, a nitrosorerea compound, a folate compound, a pyrimidine compound, a purine compound, an anthracycline compound, pin alkaloid, a taxane, an antiestrogen, an LH-RH agonist, a topoisomerase.
  • the antitumor combination preparation according to the above (5) which is selected from the group consisting of an I inhibitor, a topoisomerase II inhibitor, an interferon, an interleukin, a molecular target therapeutic agent, cisbratin, carpoplatin and nedaplatin.
  • R ' is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.
  • An antitumor agent comprising a combination of the compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof and another antitumor substance.
  • the antitumor substance is selected from the group consisting of alkylating agents, antimetabolites, anticancer antibiotics, microtubule inhibitors, hormonal agents, platinum complexes, topoisomerase inhibitors, biologics and molecular targeted therapeutics (9)
  • the antitumor substance is a mustard drug, a nitrosoperia compound, a folate compound, a pyrimidine compound, a purine compound, an anthracycline compound, a pin alkaloid, a taxane, an antiestrogen, an LH-RH agonist (9)
  • R ' is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.
  • a telomerase inhibitor comprising a combination of a compound represented by the formula or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and another antitumor substance.
  • the compound used in the present invention has the following formula (1):
  • R ' is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.
  • the alkyl group having 1 to 5 carbon atoms means, for example, lower alkyl such as methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, tert-butyl group and isobutyl group.
  • Examples of the aryl group include a phenyl group and a naphthyl group.
  • Examples of the aralkyl group include a benzyl group.
  • Examples of the heteroaryl group include nitrogen-containing aromatic ring groups such as imidazolyl group and pyridinyl group, sulfur-containing aromatic ring groups such as thiophene and thiazole, and oxygen-containing aromatic ring groups such as furan and oxazole.
  • Examples of the halogen atom include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • Examples of the pharmaceutically acceptable salt of the compound of the formula (1) include, for example, hydrochloride, Acid addition salts such as inorganic acid salts such as sulfates and phosphates, and organic acid salts such as acetates, maleates, fumarates, tartrates, citrates and lactates.
  • Acid addition salts such as inorganic acid salts such as sulfates and phosphates
  • organic acid salts such as acetates, maleates, fumarates, tartrates, citrates and lactates.
  • telomestatins the compound of the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be referred to as “telomestatins”.
  • GM-95 a compound in which each R is all a hydrogen atom is referred to as “01 [ ⁇ 95 substance” ”or“ telomestin (TMS) ”.
  • TMS telomestin
  • the measurement was performed in methanol (7.39 M solution). The maximum absorption was shown in 259.5 dishes, and the absorbance at that time was 0.288. The molar extinction coefficient ( ⁇ ) is 38982.
  • the GM-95 substance must be produced, for example, by culturing a strain capable of producing this substance (hereinafter referred to as a GM-95 substance producing bacterium) under appropriate conditions as shown below. Can be.
  • Examples of the GM-95 substance producing bacteria include strains belonging to the genus Streptomyces.
  • Examples of strains belonging to the genus Streptomyces include Streptomyces anulatus 3533-SV4 strain or a mutant strain thereof.
  • Streptomyces annuliterus strain 3533-SV4 is a strain belonging to the genus Streptomyces newly isolated from the soil of Tensui-cho, Tamana-gun, Kumamoto Prefecture by the present inventors.
  • Streptomyces anulatus 3533-SV4 (GM95)”, (accession number) “FERM BP-6460”.
  • the identification and bacteriological properties of Streptomyces agnulitas 3533-SV4 were performed according to the method of the International Streptomyces Project (ISP). Is as follows.
  • This strain was cultured in ISP No. 2, 3, 4 and 5 medium at 27 ° C. for 14 days.
  • the results are as follows.
  • Table 2 shows the growth status in various media.
  • the color tones for the media properties listed in the table can be found in "The Color Harmony Manual” (1958 version) of Container Corporation of America. Group,
  • Tyrosine agar one Peptone yeast iron agar: 1
  • the basal hypha of this strain is not broken.
  • the aerial mycelium forms a long main axis, and at its more irregularly branched tip forms a 4 to 9-turn spiral spore chain of 10 to 50 or more.
  • the spores are non-motile, cylindrical or oval, 0.3-0.5 width, 0.7-1. O ⁇ m, and the spore surface is smooth. Sclerotia, sporangia and other special forms are not observed.
  • the cell wall chemical type is type (I). Table 2 shows the culture characteristics.
  • the color tone of the aerial mycelium is yellow.
  • the color of the underlying hyphae is unclear and does not change at pH. No diffusible dye is found overall.
  • the physiological properties are shown in c) above.
  • This strain is mesophilic. Based on the morphological characteristics and cell wall chemical type of the strain, the strain is located in the genus Streptomyces (hereinafter abbreviated as "S.”).
  • the GM-95 substance is, for example, the above-mentioned 3533-SV4 strain or the above-mentioned 3533-
  • the five substance-producing bacteria are cultured in an appropriate medium, then the crude extract containing the substance of the present invention is separated from the culture solution, and the GM-95 substance is isolated and purified from the crude extract. Can be built.
  • the culture solution contains the culture filtrate ⁇ solid bacterial cells.
  • Culture of the above microorganisms is performed in principle according to culture of general microorganisms. However, it is generally preferable to perform culture under aerobic conditions such as a shaking culture method by liquid culture and aeration and stirring culture method.
  • the medium used for the culture may be any medium containing a nutrient that can be used by the GM-95 substance producing bacterium, and any of various synthetic media and natural media can be used.
  • the carbon source of the medium glucose, sucrose, fructose, glycerin, dextrin, starch, molasses, corn steep liquor, organic acids, etc., alone or in combination of two or more;
  • Pharmaceutical media peptone, meat extract, yeast extract, soy flour, casein, amino acids, organic nitrogen sources such as urine, and inorganic nitrogen sources such as sodium nitrate and ammonium sulfate are used alone or in combination of two or more.
  • a sodium salt, a potassium salt, a magnesium salt, a phosphate, and other heavy metal salts are added to the medium as needed.
  • the pH of the medium is preferably around neutral.
  • the cultivation temperature should be maintained at a temperature at which GM-95 substance-producing bacteria grow well, usually around 20 to 32 ° C, especially around 25 to 30 ° C.
  • the cultivation time is preferably about 2 to 6 days for both liquid shaking culture and aeration and stirring culture.
  • the various culture conditions described above can be appropriately changed according to the type and characteristics of the microorganism used, external conditions, and the like, and the optimal conditions can be appropriately selected and adjusted from the above range according to each.
  • the crude extract containing the GM-95 substance can be separated from the culture broth according to a general method for collecting fermentation products, for example, by a conventional method such as solvent extraction, chromatography, or crystallization. Can be used alone or in combination of two or more in any order.
  • the following method can be used. That is, since the GM_95 substance produced by the above-mentioned culture is mainly present in the culture filtrate and the cells, the culture solution is first filtered, centrifuged, etc. according to a conventional method, and the culture filtrate and the cells are collected. Solid content Separate and elute the GM-95 substance from the bacterial solid containing the GM-95 substance using a solvent such as methanol or acetone. Then, the solvent is distilled off under reduced pressure to obtain a crude concentrate containing the GM-95 substance.
  • a solvent such as methanol or acetone
  • the usual methods for isolating and purifying lipophilic low-molecular substances such as activated carbon, silica gel, alumina, macroporous non-ionic
  • lipophilic low-molecular substances such as activated carbon, silica gel, alumina, macroporous non-ionic
  • adsorption chromatography using an adsorbent such as an adsorption resin, or reverse phase chromatography using 0DS-bonded silica gel or the like can be used.
  • silica gel chromatography using a mixed solvent system such as chloroform-form, chloroform-form Z ethyl acetate, chloroform-Z methanol, chloroform-form Z acetone, benzene Z-acetone, and acetonitrile or methanol / 0.
  • Reverse phase chromatography using a mixed solvent system such as 05% trifluoroacetic acid or 10 mM phosphoric acid monolithic medium for elution is particularly preferred.
  • Reverse phase chromatography using a mixed solvent system such as 05% trifluoroacetic acid or 10 mM phosphoric acid monolithic medium for elution is particularly preferred.
  • Reverse phase chromatography using a mixed solvent system such as 05% trifluoroacetic acid or 10 mM phosphoric acid monolithic medium for elution is particularly preferred.
  • further purification is required, repeat the above chromatography, or perform column chromatography using Sephadex LH-20 (Pharmaci
  • GM-95 substance during the purification step is preferably performed in combination with the detection method using thin-layer chromatography and high-performance liquid chromatography.
  • mestatins eg, in the formula (1), each independently represents a hydrogen atom, a lower alkyl group, an aryl group
  • telomere inhibitory activity test was performed on a GM--95 substance using a cell extract containing telomerase according to a conventional method, and the concentration (IC50) at which telomerase activity in the cell extract was inhibited by 50% was determined.
  • the IC50 was 50 nM.
  • Telomerase is rarely present in normal somatic cells and is present in a wide range of malignant tumors (skin, breast, lung, stomach, knee, ovary, cervix, uterus, kidney, bladder, colon, prostate, central nervous system) Telomerase is found in more than 85% of all malignancies, including tumor lineage (CNS), retinal and hematological tumor cell lines.)
  • telomestatin of the formula (1) is useful as a compound for synergistically enhancing its antitumor effect in combination with another antitumor substance, and the antitumor effect of the present invention containing telomestatins
  • the enhancer can be administered before, after, or simultaneously with the administration of the other antitumor agent.
  • the antitumor effect enhancer of the present invention may be further mixed with another antitumor substance to form a mixed preparation.
  • telomestatin of the formula (1) in combination with another antitumor substance.
  • the term “combination agent” refers to not only a form of a homogeneous mixture containing the telomestatin of formula (1) and another antitumor substance, but also a telomestatin of formula (1). And other anti-neoplastic substances simultaneously, separately or sequentially (use, take
  • the antitumor combination preparation and the antitumor agent of the present invention may be in the form of a homogeneous mixed preparation of telomestatins and another antitumor substance, or may be separately administered to separately administer them. It may be in the form of a combination preparation prepared by combining independent preparations.
  • the other antitumor substance that can be used in the present invention is not particularly limited, and any substance generally having an antitumor activity can be used.
  • Antineoplastic substances are classified into various types according to their chemical structure, mechanism of action, origin, etc., and are roughly classified into alkylating compounds, antimetabolites, plant alkaloids, and anticancer antibiotics. Compounds, platinum complex compounds, hormones, etc., and other types of antitumor compounds. Specific examples include the following compounds and salts thereof (acid addition salts such as hydrochloride and sulfate, and metal salts such as alkali metal salt).
  • alkylating agent-based antitumor compound examples include cyclophosphamide (Cyclophosphamide), ifosfamide, Melphalan, busulfan, and carbocon (CarboQiione).
  • antimetabolite-based antitumor compounds include antifolates, purine antimetabolites, pyrimidine antimetabolites, and specifically, for example, 6-mercaptopurine, methotrexate, and the like. (Methotrexate), 5-Fluorouracil (5-Fluorouracil), Tegafur (Tegaiur), Enocitabine (Enocitabine), Cytarabine (Cytarabine) and the like.
  • anti-microtubule-based antitumor compound examples include bin alkaloids, podophyllins, taxanes and the like, and more specifically, for example, vincristine (Vincristine), vindesine (Vindesine), and pinblastine (Vinblastine) Are listed.
  • antibiotic antitumor compounds examples include actinomycin D (Actinomycin D), daunorubicin, bleomycin, peplomycin, mitomycin C (Mitomycin 0, aclarubicin), and neocarcinosine. Chin (Neocarzinostatin), doxorubicin (Doxorubicin) and epirubicin (Epirubicin).
  • platinum complex-based antitumor compound examples include cisplatin, carboplatin, nedaplatin and the like.
  • topoisomerase inhibitors examples include topoisomerase I inhibitor, topoisomerase II inhibitor, irinotecan, nogitecan, etoposide, and daunorubi And the like.
  • Antitumor substances other than the above include, for example, dimustine (Nimustine), L-asparaginase (L-Asparaginase), procarbazine (Procarbazine), hormones, biologics, molecular targeted therapeutics, mustard drugs Nitrosoprea compounds, anthracycline compounds, pin alkaloids, anti-estrogenic drugs .. LH-RH agonists, quinone feron, interleukin and the like.
  • a platinum complex antitumor compound, a topoisomerase inhibitor or an antibiotic antitumor compound is preferable, and an anthracycline antitumor compound, topoisomerase I inhibitor Particularly preferred are drugs, topoisomerase II inhibitors or platinum complex antitumor compounds.
  • the weight ratio of the compound of the formula (1) to the other antitumor substance depends on the type of the antitumor substance used and the condition of the patient, but is usually 1: 1 to 1: 100. Preferably, it is 1: 1 to 1:10.
  • Various pharmaceutical dosage forms can be used as the pharmaceutical dosage form when using the preparation of the present invention such as an antitumor effect enhancer, an antitumor combination preparation, or an antitumor agent, depending on the purpose.
  • the active ingredient that is, telomestatins and / or the other antitumor substance
  • excipients as required, a binder, a disintegrant, a lubricant, and a coloring agent.
  • a flavoring agent, a flavoring agent and the like tablets, capsules, powders, granules, fine granules and the like can be produced by an ordinary method.
  • Excipients include, for example, lactose, sucrose, starch, talc, magnesium stearate, crystalline cellulose, methylcellulose, carboxymethylcellulose, glycerin, sodium alginate, gum arabic, and the like.
  • Binders include polyvinyl alcohol, polyvinyl ether,
  • Disintegrants include dry starch, sodium alginate, agar powder, sodium bicarbonate, calcium carbonate, sodium lauryl sulfate, monoglyceride stearate, lactose, etc. age
  • Magnesium stearate, talc, etc. can be used, and as a flavoring agent, sucrose, orange peel, citric acid, tartaric acid, etc. can be used.
  • Tablets shall be tablets coated with normal skin as required, for example, sugar-coated tablets, gelatin-coated tablets, enteric-coated tablets, film-coated tablets, and other double or multi-layer tablets. Can be.
  • a flavoring agent When an oral liquid preparation is prepared, a flavoring agent, a buffer, a stabilizer, a deodorant and the like are added to the active ingredient, and an oral solution, a syrup, an elixir and the like can be produced by a conventional method.
  • those mentioned above may be used as the flavoring agents, and sodium citrate or the like may be used as the buffer, and tragacanth, gum arabic, gelatin or the like may be used as the stabilizer.
  • a diluent, pH adjuster, buffer, stabilizer, isotonic agent, local anesthetic, etc. are added to the active ingredient, and intravenous, intramuscular, Subcutaneous, intradermal and intraperitoneal injections can be produced.
  • diluents include water, ethyl alcohol, macrogol, and propylene glycol.
  • Tan fatty acid esters and the like can be used.
  • Sodium citrate, sodium acetate, sodium phosphate and the like can be used as pH adjusting agents and buffers, and sodium pyrosulfite, ethylenediaminetetraacetic acid, thioglycolic acid, thiolactic acid and the like can be used as stabilizers.
  • Sodium chloride, glucose and the like can be used as a tonicity agent, and proforce in hydrochloride, lidocaine hydrochloride and the like can be used as a local anesthetic.
  • a suppository When preparing suppositories, a suppository can be produced by a conventional method after adding a base and, if necessary, a surfactant to the active ingredient.
  • a base for example, oily bases such as macrogol, lanolin, cocoa oil, fatty acid tridalicelide, and witepsol (manufactured by Dynamite Nobels) can be used.
  • Preservatives and the like are blended as necessary, and mixed and formulated according to a conventional method.
  • a base liquid paraffin, white serine, salami beeswax, octyldodecyl alcohol, paraffin, and the like can be used.
  • a preservative methyl paraoxybenzoate, ethyl ethyl paraoxybenzoate, pulpyl paraoxybenzoate, and the like can be used.
  • the active ingredient and the above-mentioned ointment, cream, gel, paste or the like may be applied to a usual support by a conventional method.
  • a woven or non-woven fabric made of cotton, staple, or chemical fiber
  • a non-woven fabric a film made of soft vinyl chloride, polyethylene, polyurethane, or the like, or a foam sheet can be used.
  • each of the above-mentioned preparations may contain a coloring agent, a preservative, a fragrance, and a flavor, if necessary.
  • Sweetening agents and other pharmaceuticals may be included in the pharmaceutical formulation.
  • the amount of the active ingredient (that is, telomestatins and / or the other antineoplastic substance) to be contained in the preparation of the present invention is not particularly limited and is appropriately selected from a wide range. It is better to be 70% by weight.
  • the administration method of the preparation of the present invention is not particularly limited, and is appropriately determined depending on various preparation forms, age and sex of the patient, other conditions, degree of disease, and the like.
  • a pharmaceutical preparation in the form of an injection can be administered by intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal administration and the like. It can be administered intravenously by mixing it with a normal replacement fluid such as pudose or amino acids, if necessary.
  • the antitumor agent of the present invention in a solid form such as a tablet, a pill, a granule, a capsule or a liquid form for oral administration can be administered orally or enterally. Suppositories can be administered rectally.
  • the amount of the active ingredient to be incorporated in each of the above-mentioned dosage unit forms can be appropriately set depending on the symptoms of the patient to which this is to be applied or its dosage form, but generally about 1 to 1000 mg for an oral preparation per dosage unit form. However, for injections, it is desirable to use about 0.1 to 500 mg, and for suppositories to be about 5 to 10 OOiiig.
  • the daily dose of the drug having the above-mentioned dosage form is appropriately selected depending on the patient's condition, body weight, age, gender, other conditions, and the like.
  • the dose may be 1000 mg / kg, preferably about l-100 mg / kg, which can be administered once a day or divided into about two to four times a day.
  • the tumor that can be treated by administering the preparation of the present invention is not particularly limited.
  • This description includes part or all of the contents as disclosed in the description of Japanese Patent Application No. 2003-057663, which is a priority document of the present application. Brief description of drawings ⁇
  • Figure 1 shows the UV absorption spectrum of the GM-95 substance.
  • Figure 2 shows the infrared absorption spectrum of the GM-95 substance.
  • Figure 3 is a 500 band z ⁇ -NMR spectrum of the GM-95 substance.
  • FIG. 4 is a 125 MHz 13 C_NMR spectrum of the GM-95 substance.
  • FIG. 5 shows the growth curves (PDL) of MCF-7 cells and HT-29 cells measured in Example 3.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of measuring the number of viable cells by the MTT method when MCF-7 cells were cultured for 48 hours in the presence of a GM-95 substance and etoposide or cisbratin.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of measuring the number of viable cells by the MTT method when MCF-7 cells were cultured for 72 hours in the presence of a GM-95 substance and etoposide or cisbratin.
  • Fig. 8 is a graph showing the results of measuring the number of surviving cells by the MTT method when HT-29 cells were cultured for 24 hours in the presence of GM-95 substance and etoposide, cisplatin, camptothecin or adriamycin. It is.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of measuring the number of viable cells when SK0V-3 cells were cultured for 24 hours in the presence of a GM-95 substance and etoposide or cisbratin.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of measuring the number of surviving cells when SK0V-3 cells were cultured for 24 hours in the presence of GM-95 substance and camptothecin or adoriamycin.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of measuring the number of surviving cells when SK0V-3 cells were cultured for 48 hours in the presence of GM-95 substance and etoposide or cisbratin.
  • FIG. 12 is a graph showing the results of measuring the number of surviving cells when SK0V-3 cells were cultured for 48 hours in the presence of GM-95 substance and camptothecin or adoriamycin.
  • FIG. 13 is a graph showing the results of measuring the number of surviving cells when HT1080 cells were cultured for 24 hours in the presence of GM-95 substance and etoposide or cisbratin.
  • FIG. 14 is a graph showing the results of measuring the number of viable cells when HT1080 cells were cultured for 24 hours in the presence of the GM-95 substance and adriamycin.
  • FIG. 15 is a graph showing the measurement results of 7-bottle cis induction on K562 cells by the combined use of GM-95 substance and imatinib.
  • FIG. 16 is a graph showing the results of measurement of apoptosis induction in K562 cells by the combined use of GM-95 substance and daunorubicin (DNR).
  • FIG. 17 is a graph showing the results of measurement of apoptosis induction on K562 cells by the combined use of GM-95 substance and mitoxantrone (MIT).
  • FIG. 18 is a graph showing the measurement results of apoptosis induction on K562 cells by the combined use of a GM-95 substance and vincristine (VCR).
  • FIG. 19 is a graph showing the results of Example 5 (A).
  • FIG. 20 is a graph showing the results of Example 5 (B).
  • FIG. 21 is a graph showing the results of Example 5 (C).
  • FIG. 22 is a graph showing the results of Example 6 (D). BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • a test tube 50 ml
  • a pre-culture medium H7.2
  • a pre-culture medium 15% soluble starch, 1.0% polypeptone, 1.0% molasses, and 1.0% beef extract
  • streptomyces anguraitas The 3533-SV4 strain (FERM BP-6460) was inoculated in an amount of one ear, and cultured with shaking on a reciprocating aerator at 27T: for 2 days.
  • a production medium (pH 7.2) consisting of 2.0% glycerin, 1.0% molasses, 0.5% casein, 0.1% polypeptone, and 0.4% calcium carbonate was dispensed into 500 ml Erlenmeyer flasks. After sterilization (121 ° C, 15 minutes), 2% (v / v v) and incubated at 21 ° C for 3 days with rotary shaking (220 times per minute, amplitude 7 cm). Then, the above medium was mixed with three 50L jar amen Yuichi (Marubishi Chemical Co., Ltd.) 30 000 ml each.
  • the eluate containing the active substance was separated off and evaporated to dryness.
  • the residue was dissolved in the above 10 ml mobile phase, and then a PEGASIL 0DS column (Sensyu Scientific Co., Ltd., inner diameter 20 x X 250 mm)
  • the residue was suspended in a 10% aqueous methanol solution, and further applied to a PEGASIL 0DS column (Sensche Ichigaku Co., Ltd., inner diameter 1.0 cm ⁇ 3 cm). After washing with a 10% methanol aqueous solution, elution was carried out with a 70% methanol aqueous solution. The obtained eluate was distilled off under reduced pressure to obtain 95 GM-substances (3.2 nig).
  • the fraction containing the GM-95 substance was detected at each stage of purification by using a PE GASIL 0DS column (Sensiyu Kagaku Co., Ltd., inner diameter 4.6 mm ⁇ 250 mm) (mobile phase: acetonitrile: trifluoroacetic acid: water (70: 0.1: 30 v / v / v), and the flow rate was 1.0 ml / min).
  • the physicochemical properties of the GM-95 substance are as follows.
  • the measurement was performed in methanol (7.399 solution). It showed the maximum absorption at 259.5 nm, and the absorbance at that time was 0.288.
  • the molar extinction coefficient ( ⁇ ) is 38982.
  • a peak is detected at 6.1 minutes under the following analysis conditions.
  • Example 2 Pharmacological test (anti-tumor effect of GM-95 substance and 5-fluorouracil)
  • the tumor cells described in Table 5 were suspended in RPMI 1640 medium supplemented with 10% bovine extermination serum, and placed on a culture plate (38 mm). 2 ⁇ 10 3 cells were inoculated at 37 ° C. and cultured overnight at 37% in a carbon dioxide incubator under 15% CO 2 . Thereafter, test drugs (GM-95 substance and 5-fluorouracil) diluted to various concentrations using RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum were added, and the cells were further cultured for 72 hours.
  • test drugs GM-95 substance and 5-fluorouracil
  • the cells were fixed with 25% dalilaldehyde for 15 minutes and washed three times with water.
  • the cells were stained with 0.05% crystal violet diluted in a 20% aqueous methanol solution, washed three times with water, and dried.
  • Crystal violet was extracted with 100 L of 0.05M sodium dihydrogen phosphate / ethanol (1/1 (v / v)), and the absorbance at 540 nm was measured with an automatic spectrometer.
  • IC50 was defined as the concentration required to reduce the absorbance of the control by 50%. The results are shown below.
  • the compound of the present invention was able to inhibit the growth of various tumor cells in the mouth of in vivo.
  • Example 3 Combined effect of GM-95 substance (telomestatin) and other antitumor substances
  • Etoposide Etoposide
  • cDDP cisplatin
  • cDDP Bristol-Myers-squibb
  • Adoriamycin Adreamyciik ADM
  • camptothecin camptothecin, CTP; SIGMA
  • MCF_7 (breast cancer, ATCC HTB-22), SK0V-3 (ovarian cancer), HT-29 (colorectal cancer) and HT1080 (Zarcoma, ATCC CRL-12012) cells were used as tumor cells. Each cell was provided by Tsuruo Laboratory, Institute for Molecular and Cellular Biology, The University of Tokyo.
  • the MCF-7 cells were cultured in a DMEM (Sigma) medium supplemented with 10% FCS, 200,000 U / L penicillin, and 100 mg / L streptomycin.
  • SK0V-3, HT1080 and HT-29 cells were cultured in RPMI1640 (SIGMA) medium supplemented with 10% FCS, 200,000 U / L benicillin, and 100 mg / L streptomycin.
  • the cells were prepared at 5 x 104 cells / ml, and added to a 12-well plate or a 6-well plate (manufactured by SUMITOMO Bakelite Co., Ltd.) at 500 L and 1 mL, respectively. Each cell was supplemented with GM-95 substance to a final concentration of 2.0 / xM, 1.0 zM and 0.5 M, and cultured until confluent. At the time of subculture, the number of cells in each treatment group was measured, and a growth curve (PDL) was prepared (Fig. 5). Since the sensitivity of each cell to the GM-95 substance was different, the cells were collected every week, and the telomere length of each cell was measured and the effect of combination with each antitumor substance was examined. For combined effect can be formed by preparing a treated cell so that 5Xl0 4 cells / ml, 96-well plates
  • MTT (manufactured by SIGMA) was prepared in PBS to a concentration of 5 g / 100 mL, 10 L was added to each well, and formazan produced was observed with a microscope, and formazan was produced in the supernatant.
  • DMS0 Dimethyl sulfoxide
  • ARV0 SX manufactured by Perkiu Elmer
  • Example 4 Induction of apoptosis in K562 cells by combined use of GM-95 substance and other antitumor substances
  • K562 cells (available from ATC Rockville, MD) were cultured for 10 days in the presence of telomestin (GM-95 substance; Telomestatiii) 2, and the telomestin-treated K562 cells were treated at various concentrations. Incubation was carried out for 72 hours with Imaniitib, Daunorubicin (DNR), Mitoxantrone ( ⁇ ) or Vincristine (VCR). Apoptosis is expressed by flow cytometric analysis using FITC conjugate AP02.7 monoclonal antibody (produced against mitochondrial membrane protein (7A6 antigen) and expressed in apoptotic cells). Was measured by The results are shown in FIGS.
  • control In the figure, “control”, “TMS”, “Imanitib”, “DNR”, “MIT” and “VCR” are control, 0-95 substances (telomestin), imatinib and daunorubicin, respectively. Mitoxantrone and vincristine.
  • telomestatins have various antitumor properties. It can be seen that when used in combination with substances, they act synergistically to significantly enhance the apoptosis-inducing effect of tumor cells.
  • Example 5 Combined effect of GM-95 substance and other antitumor substances (HT1080 Cells)
  • tumor cells were cultured using GM-95 substance and other antitumor substances under the following conditions, and the survival rate of the tumor cells after a certain period of time was measured.
  • DDP Doxorubicin hydrochloride
  • 5-Fluorouracil (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., No. 064-01403);
  • CTP cis-diammine-dichloroplatinum
  • EDP Etoposide phosphate
  • HT1080 cells were used as tumor cells.
  • the tumor cells in medium supplemented with RPMI16 40 (SIGMA, R8758) in 10% FBS, and cultured by C0 2 incubator (temperature 37T, 100% humidity, carbon dioxide concentration of 5%).
  • HT1080 cells were cultured under the following conditions (A) to (0), and after the culture was completed, the survival rate of tumor cells was measured by the MTT method.
  • FIGS. 19 to 21 The results of the above (A) to (C) are shown in FIGS. 19 to 21, respectively.
  • Fig. 19 to Fig. 21 it can be seen that the combination of GM-95 and an antitumor substance (in both simultaneous and sequential combinations) enhances the antitumor effect .
  • GM-95 substance 0.5 M or IM
  • the presence and non-presence of GM-95 substance In all cases, the combined effect with various antitumor substances was remarkable, and even when the combined antitumor substance was used at an extremely low concentration, an excellent combined effect was exhibited (Fig. 20). And Figure 21).
  • FIGS. 19 to Fig. 21 it can be seen that the combination of GM-95 and an antitumor substance (in both simultaneous and sequential combinations) enhances the antitumor effect .
  • GM-95 substance 0.5 M or IM
  • Example 6 Combination effect of GM-95 substance and other antitumor substances (MCF-7 cells) In the same manner as in Example 5, the following were performed using GM-95 substance and other antitumor substances. The tumor cells were cultured under the conditions, and the survival rate of the tumor cells after a certain period was measured.
  • G M As an antitumor substance used in combination with 95 substances,
  • Doxorubicin hydrochloride (concealed) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., No. 040-21521);
  • 5-Fluorouracil (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., No. 064-01403);
  • Etoposide phosphate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., No.058-06341);
  • MCF-7 cells were used as tumor cells.
  • tumor cells were cultured with DMEM in the culture medium added with 10% FBS to (S IGMA, D6046), C0 2 incubator (temperature 37 ° C, 100% humidity, carbon dioxide concentration of 5%).
  • MCF-7 cells were cultured under the following conditions (D) or (E), and after the culture was completed, the survival rate of tumor cells was measured by the MTT method.
  • the GM-95 substance (treated with l ⁇ M or for 7 or 14 days in advance, and then the antitumor substance in the presence of GM-95 substance and in the absence of Z) It was shown that the antitumor effect was enhanced when used in combination with. And ⁇ show the results when the above antitumor substance was used alone.
  • Injectables can be prepared by the usual methods in the following mixing ratios.
  • GM-95 telomestin
  • the antitumor effect-enhancing agent, antitumor combination preparation or antitumor agent of the present invention can improve the antitumor effect of the antitumor substance by using a GM-95 substance in combination with another antitumor substance. It has enhanced or anti-tumor effects acting synergistically to show significant anti-tumor activity as compared to when used alone. In addition, it can be administered at a low dose, and is therefore excellent in safety.

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Description

G M— 9 5物質を含む抗腫瘍効果増強剤、 抗腫瘍用組み合わせ製剤及び抗腫瘍剤 技術分野
本発明は、 2種以上の抗腫瘍作用を有する化合物を組み合わせて使用 （併用） する抗腫瘍製剤に関する。 より詳細には、 複数個のォキサゾール環を有する抗腫 瘍性化合物と他の抗腫瘍性物質とを併用した抗腫瘍製剤に関する。
明 田
背景技術
腫瘍細胞 （癌細胞） は通常細胞より増殖速度が大きく、 腫瘍細胞の死滅効果が 増殖速度と同等又はそれ以下では癌の進行を抑える程度であり、 癌の根本的な治 療とはなりえない。 また、 各抗腫瘍剤には最適投与量があり、 該投与量より多量 の抗腫瘍剤を投与しても、 それに比例して腫瘍細胞の死滅効果が上昇するという わけではなく、 通常は僅かに上昇するに過ぎない。 しかも多量投与による正常細 胞の損傷等の悪影響の方が強く現れることが多く、 1種類の抗腫瘍剤の多量投与 による治療効果の増大は殆ど望めない。
このようなことから、 抗腫瘍効果の向上及び副作用の軽減のため、 或いは、 腫 瘍細胞が薬剤に対する耐性を獲得することを防止するために 2種以上を組み合せ た多剤併用療法が行なわれることが多い。
近年、 新たな癌分子標的の一つとしてテロメラ一ゼが注目されている。 テロメ ラ一ゼは、 正常細胞では一部の組織を除き発現していないが、 癌細胞では実に 90 %以上にもおよぶ細胞において高頻度に再発現している。 テロメァ長は細胞の老 化と密接に関係しており、 癌細胞をテロメラ一ゼ阻害剤で処理することにより人 ェ的に細胞老化を引き起こすことが期待される。 一方、 現在臨床で使用されてい る薬剤の 40%が、 微生物代謝産物をはじめとする天然由来の化合物であり、 今で も薬剤開発のソースとして広く用いられている。
以前に、 本発明者らは、 土壌分離放線菌 （ストレブトマイセス属に属する 3533
- SV4株） が複数個のォキサゾール環を有する抗腫瘍性化合物 （以下、 「G M— 9 5物質」 とも呼ぶ。 ） を産生することを見出し、 その詳細について既に報告した (例えば、 国際公開第 00/24747号パンフレット） 。 G M— 9 5物質は、 現在報告 されているテロメラーゼ阻害剤のうち、 合成化合物も含め最も強力なものであつ た。 G M— 9 5物質の数種の癌細胞に対する作用を検討した結果、 テロメァの短 縮を伴う細胞老化を誘導した。 またこれらの老化細胞は、 造腫瘍性が消失してい たことから、 抗腫瘍剤としての可能性が示唆された。
しかしながら、 G M - 9 5物質等のテロメラーゼ阻害物質と他の抗腫瘍性物質 とを併用した抗腫瘍医薬及びその併用効果については何ら知られていない。 (特許文献 1 ) 国際公開第 00/24747号パンフレット
発明の開示
本発明は、 2種以上の抗腫瘍性物質を併用することにより抗腫瘍作用を相乗的 に高めること、 及びそのような抗腫瘍作用が相乗的に高められた抗腫瘍併用剤を 提供することを目的とする。
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意検討した結果、 01^ _ 9 5物質 又はその誘導体と他の抗腫瘍物質とを併用すると、 それぞれ単独で用いた場合と 比較して顕著に抗腫瘍活性が高くなることを見出し、 本発明を完成させるに至つ た。
即ち、 本発明は以下の発明を包含する。
( 1 )下記式 （1 ) ：
(1)
Figure imgf000004_0001
(式中、 各 Rは、 それぞれ独立に、 水素原子、 低級アルキル基、 ァリール基、 ァ リル基、 ァラルキル基、 ハロゲン原子、 水酸基、 アミノ基、 R'O-、 R' (C=0)-、 R' (C=0) 0-又は R'0(C=0) -である。 但し、 R'は炭素数 1〜 5のアルキル基である。 ) で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を含む抗腫瘍効果増強剤。
(2)前記抗腫瘍性物質がアルキル化剤、 代謝拮抗剤、 抗癌抗生物質、 微小管阻害 剤、 ホルモン剤、 白金錯体、 トポイソメラ一ゼ阻害剤、 生物製剤及ぴ分子標的治 療剤からなる群より選択されるものである前記（ 1 )記載の抗腫瘍効果増強剤。
(3)前記抗腫瘍性物質がマスタード薬、 ニトロソゥレア系化合物、 葉酸系化合物 、 ピリミジン系化合物、 プリン系化合物、 アントラサイクリン系化合物、 ピンァ ルカロイド、 タキサン、 抗エストロゲン薬、 LH— RH作動薬、 トポイソメラー ゼ I阻害薬、 トポイソメラーゼ II阻害薬、 インターフェロン、 インターロイキン 、 分子標的治療薬、 シスブラチン、 カルポプラチン及びネダプラチンからなる群 より選択されるものである前記（1)記載の抗腫瘍効果増強剤。
(4)頭頸部癌、 食道癌、 胃癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓癌、 胆嚢，胆管癌、 膝臓癌 、 腎臓癌、 肺癌、 乳癌、 卵巣癌、 膀胱癌、 前立腺癌、 睾丸腫瘍、 骨 ·軟部肉腫、 子宮頸癌、 皮膚癌、 脳腫瘍、 悪性リンパ腫及び白血病からなる群より選択される 疾患の治療のための前記（ 1 )〜（3 )のいずれかに記載の抗腫瘍効果増強剤。
(5)下記式 （1) ：
Figure imgf000005_0001
(式中、 各 Rは、 それぞれ独立に、 水素原子、 低級アルキル基、 ァリール基、 ァ リル基、 ァラルキル基、 ハロゲン原子、 水酸基、 アミノ基、 R'O-、 ' (C=0)-、 R' =0)0-又は1^'00=0)-でぁる。 但し、 R'は炭素数 1〜5のアルキル基である。 ） で表される化合物又はその薬学的に許容される塩と他の抗腫瘍性物質とを併用す る、 前記式 （1) の化合物と前記他の抗腫瘍性物質とを同時に、 別々に又は順次 投与するための抗腫瘍用組み合わせ製剤。
(6)前記抗腫瘍性物質がアルキル化剤、 代謝拮抗剤、 抗癌抗生物質、 微小管阻害 剤、 ホルモン剤、 白金錯体、 トポイソメラーゼ阻害剤、 生物製剤及び分子標的治 療剤からなる群より選択されるものである前記（ 5 )記載の抗腫瘍用組み合わせ製 剤。
(7)前記抗腫瘍性物質がマスタード薬、 ニトロソゥレア系化合物、 葉酸系化合物 、 ピリミジン系化合物、 プリン系化合物、 アントラサイクリン系化合物、 ピンァ ルカロイド、 タキサン、 抗エストロゲン薬、 LH— RH作動薬、 トポイソメラー ゼ I阻害薬、 トポイソメラーゼ II阻害薬、 インターフェロン、 インターロイキン 、 分子標的治療薬、 シスブラチン、 カルポプラチン及びネダプラチンからなる群 より選択されるものである前記（5)記載の抗腫瘍用組み合わせ製剤。
(8)頭頸部癌、 食道癌、 胃癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓癌、 胆嚢，胆管癌、 膝臓癌 、 腎臓癌、 肺癌、 乳癌、 卵巣癌、 膀胱癌、 前立腺癌、 睾丸腫瘍、 骨 ·軟部肉腫、 子宮頸癌、 皮膚癌、 脳腫瘍、 悪性リンパ腫及び白血病からなる群より選択される 疾患の治療のための前記（ 5 )〜（ 7 )のいずれかに記載の抗腫瘍用組み合わせ製剤
(9) 下記式 （1) ：
(1)
Figure imgf000006_0001
(式中、 各 Rは、 それぞれ独立に、 水素原子、 低級アルキル基、 ァリール基、 ァ リル基、 ァラルキル基、 ハロゲン原子、 水酸基、 アミノ基、 R'O-、 R' (C=0)-、 R' 0 0)0-又は 0(00)-でぁる。 但し、 R'は炭素数 1〜 5のアルキル基である。 ） で表される化合物又はその薬学的に許容される塩と他の抗腫瘍性物質とを併用す る抗腫瘍剤。
(10) 前記抗腫瘍性物質がアルキル化剤、 代謝拮抗剤、 抗癌抗生物質、 微小管 阻害剤、 ホルモン剤、 白金錯体、 トポイソメラーゼ阻害剤、 生物製剤及び分子標 的治療剤からなる群より選択されるものである前記 （9) 記載の抗腫瘍剤。
(11) 前記抗腫瘍性物質がマスタード薬、 ニトロソゥレア系化合物、 葉酸系化 合物、 ピリミジン系化合物、 プリン系化合物、 アントラサイクリン系化合物、 ピ ンアルカロイド、 タキサン、 抗エストロゲン薬、 LH—RH作動薬、 トポイソメ ラーゼ I阻害薬、 トポイソメラーゼ II阻害薬、 インターフェロン、 インターロイ キン、 分子標的治療薬、 シスブラチン、 カルポプラチン及びネダプラチンからな る群より選択されるものである前記 （9) 記載の抗腫瘍剤。
(12) 頭頸部癌、 食道癌、 胃癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓癌、 胆嚢，胆管癌、 膝 臓癌、 腎臓癌、 肺癌、 乳癌、 卵巣癌、 膀胱癌、 前立腺癌、 睾丸腫瘍、 骨 ·軟部肉 腫、 子宮頸癌、 皮膚癌、 脳腫瘍、 悪性リンパ腫及び白血病からなる群より選択さ れる疾患の治療のための前記 （9) 〜 （11) のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
(13) 下記式 （ 1 ) ：
Figure imgf000007_0001
(式中、 各 Rは、 それぞれ独立に、 水素原子、 低級アルキル基、 ァリール基、 ァ リル基、 ァラルキル基、 ハロゲン原子、 水酸基、 アミノ基、 R'O-、 R' (C=0)-、 ' (C=0)0-又は R'0(C=0)_である。 但し、 R'は炭素数 1〜 5のアルキル基である。 ） で表される化合物又はその薬学的に許容される塩と他の抗腫瘍性物質とを併用す るテロメラーゼ阻害剤。
本発明で用いられる化合物は下記式 （1) ：
Figure imgf000008_0001
(式中、 各 Rは、 それぞれ独立に、 水素原子、 炭素数 1〜 5のアルキル基、 ァリ ール基、 ァラルキル基、 ヘテロァリール基、 ハロゲン原子、 水酸基、 アミノ基、 R'O -、 R' (C=0)-、 R' =0)0_又は^0(00)-でぁる。 但し、 R'は炭素数 1〜5のァ ルキル基である。 ）
で表される化合物である。
本明細書において炭素数 1〜5のアルキル基とは、 例えば、 メチル基、 ェチル 基、 プロピル基、 イソプロピル基、 n-プチル基、 sec-プチル基、 tert-ブチル基 及びィソブチル基等の低級アルキルをいう。
置換基 Rについてより具体的には以下のものが例示される。 ァリール基として は、 フエニル基、 ナフチル基等が挙げられる。 ァラルキル基としては、 ベンジル 基等が挙げられる。 ヘテロァリール基としては、 イミダゾリル基、 ピリジニル基 等の含窒素芳香環基、 チォフェン、 チアゾール等の含硫黄芳香環基、 フラン、 ォ キサゾール等の含酸素芳香環基等が挙げられる。 ハロゲン原子としては、 フッ素 原子、 塩素原子、 臭素原子、 ヨウ素原子が挙げられる。
また、 式 （1) の化合物の薬学的に許容される塩としては、 例えば、 塩酸塩、 硫酸塩、 リン酸塩等の無機酸塩、 酢酸塩、 マレイン酸塩、 フマル酸塩、 酒石酸塩 、 クェン酸塩、 乳酸塩等の有機酸塩等の酸付加塩が挙げられる。
以下、 本明細書において式 （1) の化合物又はその薬学的に許容される塩を 「 テロメスタチン類」 と呼ぶこともある。
上記式 （1) において各 Rが全て水素原子である化合物を 「01[—95物質」 又は 「テロメス夕チン （TMS) 」 と呼ぶ。 GM— 95物質の物理化学的性質を 以下に示す。
1) 分子式：高分解能ファースト アトム ボンバードメン卜質量分析 (high-res olution fast atomic bombardoment mass spectrometry; で測定した時、 測定値
(M+H) +として、 583.0790を示し、 これと一致する分子式は C26H15N807Sである
2) 分子量：ファースト アトム ボンバードメント質量分析 （fast atomic bomb ardoment mass spectrometry) で測定すると、 582.0712を示す。
3) 融点： 138〜143°C (分解） 。
4) 比旋光度：メタノール中、 C==0.129gZ100ml (メタノール） の濃度で測定。
[ ] D20=-9.38°
5 ) 紫外吸収スぺクトル：図 1に示す。
測定は、 メタノール中 （7.39 M溶液） で行った。 259.5皿で最大吸収を示し 、 その時の吸光度は 0.288であった。 モル吸光係数 （ε) は 38982である。
6) 赤外線吸収スペクトル （FT- IR) ：図 2に示す。
レ max (cm—1) ： 3421, 3147, 2958, 2923, 2854, 1733, 1670, 1650, 1544, 1 496, 1438, 1392, 1351, 1315, 1267, 1199, 1174, 1118， 1087， 1058, 1033, 9 75, 943, 929, 914, 883, 798
7) 溶剤に対する溶解性：水、 アセトンに不溶。 クロ口ホルム：メタノール =1:
1に溶解する。 .
8 ) 物質の色：淡黄色粉末 (white yellowish powders)
9) 核磁気共鳴スペクトル 重クロ口ホルム：重メタノール =1:1の溶液中、 25C で測定した 500腿 z Ή-雇 Rスペクトル (図 3に示す) 及び 125MHz 13C-匪 Rスぺクト ル （図 4に示す） の化学シフトを下記に示す。
Figure imgf000010_0001
炭素位置 C - N M R H - N M R
1 162.5
2 150.5
3 125.1
4 155.4
5 149.6
6 126.0
7 157.3
8 137.8 8.17(s, 1H)
9 130.4
10 156.8
11 138.8 8.24(s, 1H)
12 130.7
13 156.2
14 141.2 8.00(s, 1H)
15 136.7
16 156.6
17 139.4 8.28(s, 1H)
18 130.9
19 156.6
20 138.1 8.18(s, 1H)
21 130, 4
22 160.0
23 38, 7 8(m, 1H), 3.46(m, 1H)
24 73.2 6.19(br s， 1H)
25 11.5 2.47(s, 3H)
26 11.5 ― 2.64 (s, 3H)一
10) 高速液体クロマトグラフィー (HPLC) における保持時間 (Rt) 下記の分析条件により 6.1分にピークが検出される。
カラム： PEGASIL ODS (内径 4.6腿 X 250匪、 株式会社センシユー科学製） 移動相：ァセトニトリル Zトリフルォロ酢酸 Z水 （70:0· 1:30 V/V/V)
流 速： lmlZ分
検 出： 254MI
GM- 95物質は、 例えば、 本物質の生産能力を有する菌株 （以下 GM— 9 5 物質生産菌と称する） を、 以下に示すような適当な条件下で培養することによつ て製造することができる。
GM- 95物質生産菌としては、 ストレプトマイセス (Streptomyces) 属に属 する菌株が挙げられる。 ストレブトマイセス属に属する菌株の一例としては、 ス トレプトマイセス ァニュレイタス (Streptomyces anulatus) 3533-SV4株又はそ の変異株が例示できる。 ストレブトマイセス ァニュレイタス 3533-SV4株は、 本 発明者らが熊本県玉名郡天水町の土壌から新たに分離したストレブトマイセス属 に属する菌株であり、 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号に住所を有する通 商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （現 経済産業省産業技術総合研究 所 生命工学工業技術研究所 特許生物寄託センター） に、 1998年 8月 1 2日 に、 微生物の表示 (寄託者が付した識別のための表示） 「Streptomyces anulatu s 3533-SV4 (GM95) 」 、 （受託番号） 「FERM BP- 6460」 として寄託されている。 ストレブトマイセス ァニュレイタス 3533-SV4の同定及び菌学的性質は、 ISP (インターナショナル ストレプトマイセス プロジェクト （International Stre ptomyces Project) の方法に従って行った。 ストレプトマイセス ァニユレイタ ス 3533- SV4株の菌学的性質は、 次の通りである。
a) 形態
本菌株は、 ISP No. 2、 3、 4及び 5培地で 27°Cで 14日間培養した。 結果は下記の 通りである。
1 ) 胞子形成の分枝法；単純分枝
2) 胞子形成の形態；螺旋状、 胞子形は筒状
3) 胞子の数； 10〜50又はそれ以上
4) 胞子の表面構造；平滑
5) 胞子の大きさ ； 0.3〜0· 5 X 0.7〜1.0 rn
6) 鞭毛胞子の有無；無し 7) 胞子嚢の有無；無し
8) 胞子柄の着生位置；気菌糸
9) 菌核形成性の有無；無し
b) 各種培地上における生育状態
各種培地における生育状態を表 2に示す。 表中に記載の培地性状に関する色調 名は、 コンティナー ·コーポレーション ·ォブ 'アメリカ (Containner Corpora tion of America) の 「ザ ·カラー ·ハーモニー ·マニュアル」 (The Color Har mony Manual) (1958年版） に基、
表 2 表 2
Figure imgf000012_0001
C ) 生理的性質
1) 生育温度範囲： 20〜32 最適温度； 20〜3(ΤΌ
2) ゼラチンの液化： +
3) スターチの加水分解： +
4) 脱脂粉乳の凝固、 ペプトン化： +
5) メラニン様色素の生成
チロシン寒天培地：一 ペプトン ·ィースト鉄寒天培地： 一
トリプトン ·イースト ·ブロス培地： +
6 ) 硝酸塩の還元： +
7 ) 炭素源の同化 （プリ ドハム ·ゴトリーブ寒天培地 (ISP No. 9) )
L—ァラビノース + ； D—キシロース + ； D—グルコース + ； D—フラク卜 ース +；シュクロ一ス + ；イノシトール + ； L一ラムノース +； ラフイノー ス +； D—マンニット +
d ) 菌体組成
日本放線菌学会編 「放線菌の同定実験法 -6-2- 70, 1985年」 に記載の薄層クロ マトグラフィ一法により全菌体の酸加水分解物を分析した結果， L L型のジアミ ノピメリン酸が検出された。
本菌株の基生菌糸は分断しない。 気菌糸は長い主軸を形成し、 それより不規則 に分枝した先端に、 10〜50個またはそれ以上からなる 4〜9回転の螺旋状の胞子鎖 を形成する。 胞子は非運動性で、 円柱形あるいは楕円形を呈し、 幅 0. 3〜0. 5、 長 さ 0. 7〜1. O ^ mで、 胞子表面は平滑である。 菌核、 胞子のう、 その他の特殊形態 は観察されない。 細胞壁化学型は （I ) 型である。 培養性状を表 2に示す。 気菌 糸の色調は黄色系列である。 基生菌糸の色調は不鮮明色を呈し、 p Hで変化しな い。 拡散性色素は全体としては認められない。 生理的性状を上記 c ) に示す。 本 菌株は中温性である。 本菌株の形態的性状と細胞壁化学型から、 本菌株はストレ プトマイセス （St reptomyces, 以後、 「S . 」 と略す。 ） 属に位置する。
上述の諸性状を基に、 「細菌名承認リスト、 1980」 及びそれ以後の有効名リス トに記載された S . 属の種について検索し、 近縁種を選出した。 S . スフヱロイ デス (S. sphero ides) の診断的性状を比較すると、 本菌株と S . スフヱロイデス の性状はよく一致しており、 炭素源の同化のみ異なっている。
従って、 本菌株は S . スフヱロイデスに最も近似な新菌株である。 しかしなが ら、 パージエイズ マニュアル ォブ システマティク バクテリオロジ一 (Bergey
' S Manual of Sys temat ic Bac teriology vol. 4) において、 ウイリアムズ (Wi l l iams) 等は、 S . スフヱロイデスは S . アニュレイタスのシノニム (異名) とし ている。 従って、 本菌株 3533- SV4株は、 S . ァニュレイタスに含まれるー菌株と 同定し、 ストレプトマイセス ァニュレイタス (S t reptomyces anul atus 3533 - S
V4株と称する。
本菌株と近縁種との比較を以下に示す。
表 3
¾ 3 本菌株 ス 1' 卜マイセ X
スフヱロ デス
胞子鎮形態 螺旋状 + +
胞子表面 平滑 + +
気菌糸の色調 黄色 + +
基生菌糸の色調 不鮮明色 + +
p H感受性
拡散性色素産生
メラニン色素産生
スターチの加水分解 + +
硝酸塩の還元 + +
生育温度 1 0 °c
4 5 °C
炭素の同化
ァラビノース +
キシロース + +
イノシト一ノレ 十
マンニット +
ラムノース 十 +
ラフイノース 十
シュクロース + +
フラク トース + +
G M - 9 5物質は、 例えば上記 3533- SV4株又は上記の菌学的性質を有する 3533
- SV4株の変異株などの、 例えば、 ストレブトマイセス属に属する各種の G M— 9
5物質生産菌を、 適当な培地で培養し、 次に培養液から本発明物質を含む粗抽出 物を分離し、 更に、 粗抽出物から G M— 9 5物質を単離、 精製することにより製 造することができる。 培養液には、 培養濾液ゃ菌体固形分が含まれる。 上記微生物の培養は、 原則的に一般の微生物の培養に準じて行われるが、 通常 、 液体培養による振盪培養法、 通気攪拌培養法等の好気的条件下で行うのが好ま しい。 培養に用いられる培地としては、 G M - 9 5物質生産菌が利用できる栄養 源を含有する培地であればよく、 各種の合成培地、 天然培地等をいずれも用いる ことができる。 培地の炭素源としては、 グルコース、 シユークロース、 フラク卜 —ス、 グリセリン、 デキストリン、 澱粉、 糖蜜、 コーン ·スティープ · リカー、 有機酸等を、 単独又は二種以上組み合わせたものが；窒素源としては、 ファーマ メディア、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 大豆粉、 カゼイン、 アミノ酸、 尿 素などの有機窒素源、 硝酸ナトリウム、 硫酸アンモニゥム等の無機窒素源を、 単 独又は二種以上組み合わせたものが用いられる。 また、 培地には、 ナトリウム塩 、 カリウム塩、 マグネシウム塩、 リン酸塩、 その他の重金属塩などが必要に応じ て適宜添加される。
なお、 培養中発泡の著しい時は、 例えば大豆油、 亜麻仁油等の植物油、 ォクタ デカノール、 テトラデカノール、 ヘプ夕デカノール等の高級アルコール類、 各種 シリコン化合物などの消泡剤を、 適宜培地中に添加することもできる。
培地の p Hは、 中性付近とするのが好ましい。 培養温度は G M— 9 5物質生産 菌が良好に生育する温度、 通常 20〜32°C、 特に 25〜30°C付近に保つのがよい。 培 養時間は、 液体振盪培養及び通気攪拌培養のいずれの場合も、 2〜6日間程度が好 ましい。
上述した各種の培養条件は、 使用微生物の種類や特性、 外部条件等に応じて適 宜変更でき、 またそれぞれに応じて、 上記範囲から最適条件を適宜選択、 調節す ることができる。
培養液からの G M— 9 5物質を含む粗抽出物の分離は、 発酵生産物を採取する 一般的な方法に準じて行うことができ、 例えば溶媒抽出、 クロマトグラフィー、 結晶化等の通常の手段を、 単独又は二種以上を任意の順序に組み合わせて用いる ことができる。
より詳しくは、 以下の方法を用いることができる。 すなわち、 上記培養により 生産される G M _ 9 5物質は、 主として培養瀘液及び菌体中に存在するので、 常 法に従い、 まず培養液を濾過、 遠心分離等を行って、 培養濾液と菌体固形分とを 分離し、 得られた GM— 9 5物質を含む菌体固形分について、 メタノール、 ァセ トン等の溶媒を用いて GM— 9 5物質の溶出を行う。 次いで、 減圧下に溶媒を留 去すれば、 GM— 9 5物質を含む粗濃縮液を得ることができる。 この粗濃縮液に 、 酢酸ェチル、 クロ口ホルム、 プ夕ノール等の水と混合しない有機溶媒を加えて 、 G M— 9 5物質を有機溶媒層に転溶させ、 得られた溶媒層に芒硝を加えて脱水 した後、 溶媒を減圧下で留去すれば、 G M— 9 5物質を含む粗抽出物を得ること ができる。 更に、 培養濾液についても有機溶媒層に転溶させる前述と同様の操作 をすれば、 粗抽出物を得ることができる。 また、 必要に応じて、 水酸化ナトリウ ム又は塩酸にて p Hを調節したり、 工業用食塩を加えることにより、 抽出効率を 高くしたり、 ェマルジョン生成防止などの方法を講じることができる。
更に、 粗抽出物から GM— 9 5物質を単離、 精製するためには、 通常の脂溶性 低分子物質の単離、 精製手段、 例えば、 活性炭、 シリカゲル、 アルミナ、 マクロ ポ一ラス非イオン系吸着樹脂等の吸着剤による種々の吸着クロマトグラフィー、 又は 0DS-結合型シリカゲル等を用いる逆相クロマトグラフィー等が使用できる。 これらのうち、 溶出溶媒にクロ口ホルム、 クロ口ホルム Z酢酸ェチル、 クロロホ ルム Zメタノール、 クロ口ホルム Zアセトン、 ベンゼン Zアセトン等の混合溶媒 系を用いるシリカゲルクロマトグラフィー、 及びァセトニトリル又はメタノール /0. 05 %トリフルォロ酢酸又は 10mMリン酸一力リゥム等の混合溶媒系を溶出に用 いる逆相クロマトグラフィーが、 特に好ましい。 また、 更に精製を必要とする場 合には、 上記クロマトグラフィーを繰り返し行うか、 または溶出溶媒としてクロ 口ホルム、 メタノール等を用いたセフアデックス LH-20 (フアルマシア社製) に よるカラムクロマトグラフィー等を適宜組み合わせて行うことにより、 高純度の GM - 9 5物質を得ることができる。
なお、 精製工程中の GM— 9 5物質の確認は、 薄層クロマトグラフィー及び高 速液体クロマトグラフィーを用いて検出する方法とを併用して行うのがよい。 また、 公知の化学合成技術等を用いて、 上記の G M— 9 5物質からその他のテ 口メスタチン類 （例えば、 式 （1 ) 中の Rが、 それぞれ独立に、 水素原子、 低級 アルキル基、 ァリール基、 ァリル基、 ァラルキル基、 ハロゲン原子、 水酸基、 ァ ミノ基、 R' 0-、 R' (00) -、 ' (00) 0-又は R' 0 (C=0) _であって、 前記 R'が炭素数 1 〜 5のアルキル基である化合物） を容易に得ることができる。
本発明で用いられるテロメス夕チン類は、 非常に強いテロメラーゼ阻害活性を 有することが分かっており、 該酵素の活性を阻害することにより広いスぺクトル を有する抗腫瘍剤として有用である。 例えば、 G M - - 9 5物質について, 常法に 準じてテロメラーゼを含む細胞抽出物を用いたテロメラーゼ阻害活性試験を行い 、 細胞抽出物中のテロメラーゼ活性を 50 %阻害する濃度 （IC50) を求めたところ 、 I C50は 50nMであった。 テロメラ一ゼは正常体細胞にはほとんど存在せず、 広範 な悪性腫瘍に存在する （皮膚、 乳房、 肺、 胃、 膝臓、 卵巣、 頸部、 子宮、 腎臓、 膀胱、 結腸、 前立腺、 中枢神経系 （CNS) 、 網膜及び血液腫瘍細胞系を含めた全 ての悪性腫瘍のうち 85 %以上でテロメラーゼが見出されている。 ) 。
本発明者らの研究によれば、 テロメスタチン類と他の抗腫瘍性物質とを併用す ることにより、 それぞれ単独で用いた場合よりも抗腫瘍活性が顕著に向上するこ とが見出された。 すなわち、 式 （1 ) のテロメスタチン類は他の抗腫瘍性物質と を併用して、 その抗腫瘍効果を相乗的に増強するための化合物として有用である テロメスタチン類を含有する本発明の抗腫瘍効果増強剤は、 他の抗腫瘍性物質 を投与する前又は後に、 或いは同時に投与することができる。 それらを同時に投 与する場合には、 例えば、 本発明の抗腫瘍効果増強剤に、 さらに、 他の抗腫瘍性 物質を含ませて混合製剤の形態としてもよい。
また、 式 （1 ) のテロメスタチン類と他の抗腫瘍製物質とを併用した抗腫瘍用 組み合わせ製剤又は抗腫瘍剤等の併用剤として用いてもよい。
ここで、 本明細書において 「併用剤」 とは、 式 （1 ) のテロメス夕チン類と他 の抗腫瘍性物質とを含む均一混合物とする形態だけでなく、 式 ( 1 ) のテロメス タチン類と他の抗腫瘍性物質とを、 同時に、 別々に、 又は順次投与 （使用，服用
) するためにそれぞれ独立した別個の製剤を組み合わせた形態も含む意味である
。 したがって、 本発明の抗腫瘍用組み合わせ製剤及び抗腫瘍剤は、 テロメスタチ ン類と他の抗腫瘍性物質との均一混合製剤の形態であってもよいし、 それらを別 個に投与するためにそれぞれ独立に別個の製剤に調製したものを組み合わせた組 み合わせ製剤の形態のいずれであってもよい。 本発明で用いることのできる他の抗腫瘍性物質としては特に限定されるもので はなく、 一般に抗腫瘍活性を有する物質であればいずれのものでも用いることが できる。 抗腫瘍性物質はその化学構造、 作用機序又は由来等により様々なタイプ のものに分類され、 大別すると、 アルキル化剤系化合物、 代謝拮抗剤系化合物、 植物アルカロイド系化合物、 抗癌抗生物質系化合物、 白金錯体系化合物、 ホルモ ン剤等及び前記以外以外のタイプの抗腫瘍性化合物に分類される。 具体的には下 記に示すような化合物及びその塩 （塩酸塩、 硫酸塩等の酸付加塩、 アルカリ金属 塩等の金属塩） が挙げられる。
アルキル化剤系抗腫瘍化合物としては、 例えば、 シクロホスフアミド (Cyclop hosphamide) 、 ィフォスフアミ ド (Ifosfamide) 、 メ レファラン (Melphalan) 、 ブスルファン （Busulfan) 及びカルボコン （CarboQiione) 等が挙げられる。 代謝拮抗剤系抗腫瘍化合物としては、 葉酸代謝拮抗剤、 プリン代謝拮抗剤、 ピ リミジン代謝拮抗剤等が挙げられ、 具体的には、 例えば 6-メルカプトプリン （6 - Mercaptopurine) 、 メ卜トレキサー卜 （Methotrexate) 、 5 -フ レオロウラシル （ 5-Fluorouracil) 、 テガフール （Tegaiur) 、 エノシタビン （Enocitabine) 及び シタラビン （Cytarabine) 等が挙げられる。
微小管阻害薬系抗腫瘍化合物としては、 ビン力アルカロイド系、 ポドフィリン 系、 タキサン系等が挙げられ、 より具体的には、 例えばビンクリスチン （Vincri stine) 、 ビンデシン （Vindesine) 及びピンブラスチン （Vinblastine) 等が挙 げられる。
抗生物質系抗腫瘍化合物としては、 例えば、 ァクチノマイシン D (Actinomyci n D) 、 ダウノルビシン （Daunorubicin) 、 ブレオマイシン （Bleomycin) 、 ぺプ ロマイシン (Peplomycin) 、 マイトマイシン C (Mitomycin 0 、 アクラルビシ ン (Aclarubicin) 、 ネオカルチノス夕チン (Neocarzinostatin) 、 ドキソルビ シン (Doxorubicin) 及びェピルビシン (Epirubicin) 等が挙げられる。
白金錯体系抗腫瘍化合物としては、 例えば、 シスブラチン （Cisplatin) 、 力 ルポプラチン (Carboplatin) 及びネダプラチン等が挙げられる。
トポイソメラーゼ阻害剤としては、 例えば、 トポイソメラ一ゼ I阻害薬、 トポ イソメラーゼ II阻害薬、 イリノテカン、 ノギテカン、 エトポシド及びダウノルビ シン等が挙げられる。
上記以外の抗腫瘍性物質として、 例えば、 二ムスチン （Nimus t ine) 、 Lーァ スパラギナーゼ （L- Asparaginase) 、 プロカルバジン (Procarbaz ine) 、 ホルモ ン剤、 、 生物製剤、 分子標的治療剤、 マスタード薬 ニトロソゥレア系化合物、 アントラサイクリン系化合物、 ピンアルカロイド、 抗エス卜ロゲン薬.. L H - R H作動薬、 ィン夕一フエロン及びィンターロイキン等が挙げられる。
本発明では、 式 （1 ) の化合物と併用する抗腫瘍性物質としては、 白金錯体系 抗腫瘍化合物、 トポイソメラーゼ阻害剤又は抗生物質系抗腫瘍化合物が好ましく 、 アントラサイクリン系抗腫瘍化合物、 トポイソメラーゼ I阻害薬、 トポイソメ ラーゼ I I阻害薬又は白金錯体系抗腫瘍化合物が特に好ましい。 式 ( 1 ) の化合物 と他の抗腫瘍性物質との重量比については、 併用する抗腫瘍性物質の種類や患者 の症状にもよるが、 通常は 1 ： 1〜 1 ： 1 0 0であり、 好ましくは、 1 ： 1〜1 ： 1 0である。
抗腫瘍効果増強剤、 抗腫瘍用組み合わせ製剤又は抗腫瘍剤等の本発明の製剤を 使用する際の薬学的投与形態としては、 目的に応じて各種の薬学的投与形態を採 用でき、 例えば、 錠剤、 カプセル剤、 散剤、 顆粒剤、 細粒剤、 液剤、 丸剤、 乳剤 、 懸濁剤等の経口剤、 注射剤、 坐剤、 軟膏剤、 硬膏剤、 貼付剤、 エアゾール剤、 点眼剤等の非経口剤のいずれでもよく、 これら投与形態は、 それぞれ当業者に公 知慣用の製造方法により製造できる。
経口用固形製剤を調製する場合には、 有効成分 （即ち、 テロメスタチン類及び /又は前記他の抗腫瘍性物質） に賦形剤、 必要に応じて結合剤、 崩壊剤、 滑沢剤 、 着色剤、 矯味剤、 矯臭剤等を加えた後、 常法により錠剤、 カプセル剤、 散剤、 顆粒剤、 細粒剤等を製造することができる。 賦形剤としては、 例えば乳糖、 蔗糖 、 澱粉、 タルク、 ステアリン酸マグネシウム、 結晶セルロース、 メチルセル口一 ス、 カルボキシメチルセルロース、 グリセリン、 アルギン酸ナトリウム、 ァラピ アゴム等が、 結合剤としてはポリビニルアルコール、 ポリビニルエーテル、 ェチ ルセルロース、 アラビアゴム、 シェラック、 白糖等が、 崩壊剤としては乾燥デン プン、 アルギン酸ナトリウム、 寒天末、 炭酸水素ナトリウム、 炭酸カルシウム、 ラウリル硫酸ナトリウム、 ステアリン酸モノグリセリド、 乳糖等が、 滑沢剤とし てはステアリン酸マグネシウム、 タルク等が、 矯味剤としては白糖、 橙皮、 クェ ン酸、 酒石酸等が使用できる。 その他、 着色剤、 矯臭剤等は通常公知のものを用 いることができる。 なお、 錠剤は、 必要に応じ周知の方法により通常の剤皮を施 した錠剤、 例えば、 糖衣錠、 ゼラチン被包錠、 腸溶被錠、 フィルムコーティング 錠、 その他、 二重錠、 多層錠とすることができる。
経口用液体製剤を調製する場合は、 有効成分に矯味剤、 緩衝剤、 安定化剤、 矯 臭剤等を加えて、 常法により内服液剤、 シロップ剤、 エリキシル剤等を製造する ことができる。 この場合、 矯味剤としては上記に挙げられたもので良く、 緩衝剤 としてはクェン酸ナトリゥム等が、 安定化剤としては卜ラガント、 アラビアゴム 、 ゼラチン等が使用できる。
注射剤を調製する場合には、 有効成分に、 希釈剤、 p H調製剤、 緩衝剤、 安定 化剤、 等張化剤、 局所麻酔剤等を添加し、 常法により静脈内、 筋肉内、 皮下、 皮 内並びに腹腔内用注射剤を製造できる。 希釈剤としては、 例えば、 水、 ェチルァ ルコール、 マクロゴール、 プロピレング
ルコール、 ポリオキシ化イソステアリル
Figure imgf000020_0001
タン脂肪酸エステル類等を使用できる。 p H調製剤及び緩衝剤としては、 クェン 酸ナトリウム、 酢酸ナトリウム、 リン酸ナトリウム等が、 安定化剤としてはピロ 亜硫酸ナトリウム、 エチレンジァミン四酢酸、 チォグリコール酸、 チォ乳酸等が 使用できる。 等張化剤としては塩化ナトリウム、 ブドウ糖等が、 局所麻酔剤とし ては塩酸プロ力イン、 塩酸リドカイン等が使用できる。
坐剤を調製する場合には、 有効成分に基剤、 さらに必要に応じて界面活性剤等 を加えた後、 常法により坐剤を製造することができる。 基剤としては、 例えばマ クロゴール、 ラノリン、 カカオ油、 脂肪酸トリダリセライド、 ウイテツプゾ一ル (ダイナマイト ノーベルズ社製） 等の油性基剤を用いることができる。
軟膏剤を調製する場合は、 有効成分に通常使用される基剤、 安定化剤、 湿潤剤
、 保存剤等が必要に応じて配合され、 常法により混合、 製剤化される。 基剤とし ては流動パラフィン、 白色ヮセリン、 サラシミツロウ、 ォクチルドデシルアルコ ール、 パラフィン等が、 保存剤としてはパラオキシ安息香酸メチル、 パラォキシ 安息香酸ェチル、 パラオキシ安息香酸プ口ピル等が使用できる。 貼付剤を製造する場合は、 通常の支持体に有効成分と前記軟膏、 クリーム、 ゲ ル、 ペースト等を常法により塗布すれば良い。 支持体としては綿、 スフ、 化学繊 維からなる織布、 不織布や軟質塩化ビエル、 ポリエチレン、 ポリウレタン等のフ イルムあるいは発泡体シートが使用できる。
更に、 上記各製剤には、 必要に応じて、 着色剤、 保存剤、 香料、 風味剤.。 甘味 剤等や他の医薬品を医薬製剤中に含有せしめてもよい。
本発明の製剤に含有されるべき有効成分 (即ち、 テロメスタチン類及び/又は 前記他の抗腫瘍性物質） の量は、 特に限定されず広範囲より適宜選択されるが、 通常それらの製剤中 1〜 7 0重量％とするのがよい。
かくして得られる本発明の製剤の投与方法は、 特に制限はなく、 各種製剤形態 、 患者の年齢、 性別、 その他の条件、 疾患の程度等に応じて適宜決定される。 例 えば、 注射剤形態の医薬製剤は、 静脈内、 筋肉内、 皮下、 皮内、 腹腔内投与など により投与され得る。 これは必要に応じてプドウ糖、 アミノ酸等の通常の補液と 混合して静脈内投与することもできる。 錠剤、 丸剤、 顆粒剤、 カプセル剤などの 固剤形態や経口投与用液剤形態の本発明の抗腫瘍剤は、 経口投与又は経腸投与さ れ得る。 坐剤は直腸内投与できる。
上記の各投与単位形態中に配合されるべき有効成分の量は、 これを適用すべき 患者の症状によりあるいはその剤型等により適宜設定できるが、 一般に投与単位 形態あたり経口剤では約 l〜1000mg、 注射剤では約 0. l〜500mg、 坐剤では約 5〜10 OOiiigとするのが望ましい。
また、 上記投与形態を有する薬剤の 1日あたりの投与量は、 患者の症状、 体重 、 年齢、 性別、 その他の条件等に応じて適宜選択されるが、 通常成人 1日あたり 約 0. l〜 1000mg/kg、 好ましくは約 l〜100mg/kgとすれば良く、 これを 1日 1回又 は 2〜4回程度に分けて投与することができる。
本発明の製剤を投与することにより治療できる腫瘍としては、 特に制限はなく , 例えば、 頭頸部癌、 食道癌、 胃癌 結腸癌、 直腸癌、 肝臓癌、 胆嚢，胆管癌、 膝臓癌、 腎臓癌、 肺癌、 乳癌、 卵巣癌、 膀胱癌、 前立腺癌、 睾丸腫瘍、 骨 ·軟部 肉腫、 子宮頸癌、 皮膚癌、 脳腫瘍等の固形の悪性腫瘍、 悪性リンパ腫、 白血病な どが挙げられ、 好ましくは固形の悪性腫瘍である。 本明細書は本願の優先権の基礎である特願 2 0 0 3 - 0 57 6 3 2号の明細書 に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明 ·
図 1は、 GM- 9 5物質の紫外吸収スぺクトルである。
図 2は、 GM- 9 5物質の赤外線吸収スぺクトルである。
図 3は、 GM— 9 5物質の 500匪 z Ή-NMRスペクトルである。
図 4は、 GM- 9 5物質の 125MHz 13C_NMRスペクトルである。
図 5は、 実施例 3で測定した MCF- 7細胞と HT-29細胞の増殖曲線（PDL)である。 図 6は、 MCF-7細胞を GM— 9 5物質とエトポシド又はシスブラチンとの存在 下で 48時間培養したときの生存細胞数を MTT法により測定した結果を示すグラフ である。
図 7は、 MCF- 7細胞を GM— 9 5物質とエトポシド又はシスブラチンとの存在 下で 72時間培養したときの生存細胞数を MTT法により測定した結果を示すグラフ である。
図 8は、 HT- 29細胞を GM— 9 5物質とエトポシド、 シスブラチン、 カンプト テシン又はァドリアマイシンとの存在下で 24時間培養したときの生存細胞数を MT T法により測定した結果を示すグラフである。
図 9は、 SK0V-3細胞を GM— 9 5物質とエトポシド又はシスブラチンとの存在 下で 24時間培養したときの生存細胞数を測定した結果を示すグラフである。
図 1 0は、 SK0V- 3細胞を GM— 9 5物質とカンプトテシン又はァドリアマイシ ンとの存在下で 24時間培養したときの生存細胞数を測定した結果を示すグラフで ある。
図 1 1は、 SK0V- 3細胞を GM— 9 5物質とェ卜ポシド又はシスブラチンとの存 在下で 48時間培養したときの生存細胞数を測定した結果を示すグラフである。 図 1 2は、 SK0V- 3細胞を GM— 9 5物質とカンプトテシン又はァドリアマイシ ンとの存在下で 48時間培養したときの生存細胞数を測定した結果を示すグラフで ある。 図 1 3は、 HT1080細胞を GM— 9 5物質とエトポシド又はシスブラチンとの存 在下で 24時間培養したときの生存細胞数を測定した結果を示すグラフである。 図 14は、 HT1080細胞を GM— 9 5物質とァドリアマイシンとの存在下で 24時 間培養したときの生存細胞数を測定した結果を示すグラフである。
図 1 5は、 GM— 95物質とイマニチブとの併用による K562細胞に対する 7ボ 卜一シス誘導の測定結果を表すグラフである。
図 1 6は、 GM— 9 5物質とダウノルビシン（DNR)との併用による K562細胞に 対するアポ卜一シス誘導の測定結果を表すグラフである。
図 1 7は、 GM— 9 5物質とミトキサントロン（MIT)との併用による K562細胞 に対するアポトーシス誘導の測定結果を表すグラフである。
図 1 8は、 GM— 9 5物質とビンクリスチン（VCR)との併用による K562細胞に 対するアポトーシス誘導の測定結果を表すグラフである。
図 1 9は、 実施例 5 (A) の結果を示すグラフである。
図 20は、 実施例 5 (B) の結果を示すグラフである。
図 2 1は、 実施例 5 (C) の結果を示すグラフである。
図 22は、 実施例 6 (D) の結果を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例により更に具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施 例に限定されるものではない。
実施例 1 ： GM— 95物質の製造
(a) 培養工程
試験管 （50ml) に、 可溶性澱粉 1.0%、 ポリペプトン 1.0%、 糖蜜 1.0%、 1.0% 牛肉エキスよりなる培地 （pre— culture medium) ( H7.2) 15mlを加え、 滅菌 後、 ストレブトマイセス ァニュレイタス 3533— SV4菌株 (FERM BP-6460) を一白 金耳量接種し、 レシプロカルシエーカー上にて 27T:で 2日間振盪培養した。
次に、 グリセリン 2, 0%、 糖蜜 1.0%、 カゼイン 0.5%、 ポリペプトン 0.1%、 炭 酸カルシウム 0.4%よりなる培地 （production medium) (pH7.2) を、 500mlの 三角フラスコに 100mlずつ分注し、 滅菌後 （121°C、 15分） 、 上記種菌を 2 % (v/ v) の割合で添加し、 21°C、 3日間、 回転振盪培養した （毎分 220回、 振幅 7cm) 次に、 上記培地を 3個の 50L用ジャーフアーメン夕一 (株式会社丸菱理化学装 置研究所） に、 それぞれ 30， 000mlずつ分注した。 消泡剤 (ディスホ一ム (CC-118 、 日本油脂株式会社) 15ml、 信越シリコーン (KM-68-2F, 信越化学工業株式会社 ) 15ml及びサラダオイル （味の素株式会社） 15ml) を加え、 滅菌後 (120。C、 20 分） 、 上記種菌を 2% (v/v)の割合で添加し、 m：、 3日間培養した （通気攪拌： 400ΓΡ1Π (攪拌） 、 30L/min (通気) ) 。
(b) 分離工程
上記手順により得られた培養液 84.0Lを採取し、 培養菌体を遠心分離により分 離した。 上澄は捨て、 培養菌体をアセトン 10.0Lで時々攪拌しながら 2時間抽出 する。 抽出物を濾過し、 再度アセトン 5.0Lで抽出を繰り返し分離する。 アセトン 抽出液を合わせ、 最終容量 2 Lになるまで蒸留濃縮する。 減圧下、 アセトンと水 が完全になくなるまで溶媒を留去する。 得られた油状の残渣をメタノール 450nil に溶解し、 濾過後、 減圧下蒸発乾固する。
(c) 単離精製工程
得られた油状の残渣を、 クロ口ホルム： メタノール （20:1) (v/v) から成る 混合溶媒 400mlに溶解する。 シリカゲルカラム （Wakogel C-200 (粒径 75〜150 zm
) 、 内径 6cmX45cm) にふし、 最初と同じクロ口ホルム一メタノール混合溶媒 5
Lで溶出させた。 活性物質を含むフラクションは、 クロ口ホルム：メタノール (
10:1 v/v) で溶出した。 活性物質を含むフラクションを集め、 減圧下、 蒸発乾固 させる。 次に、 粗精製物をシリカゲルカラム （粒径 75〜150/ m、 内径 3.6cmX30c m) にふし、 クロ口ホルム：メタノール： 29%アンモニア水溶液 (700:100:1 v/v
/v) の混合溶媒にて溶出させた。
活性物質を含む溶出液を、 分取し、 蒸発乾固した。 残渣を前記 10mlの移動相に 溶解し、 更に PEGASIL 0DSカラム (株式会社センシユー科学、 内径 20匪 X 250mm)
(移動相をァセトニトリル： トリフルォロ酢酸：水 (70:0.1:30 v/v/v) 、 流速 を 10.0ml/分、 254腿 (0.5匪 Wセルで検出） ) を用いての高速液体クロマトグラ フィ一にふした。 1回あたり抽出液 0.8mlをインジェクションした。 GM— 9 5 物質を含むフラクションを分取し、 減圧下蒸発乾固した。
残渣を 10%メタノール水溶液に懸濁し、 更に PEGASIL 0DSカラム （株式会社セ ンシュ一科学、 内径 1.0cmX3cm) にふした。 10%メタノール水溶液で洗浄させた 後、 70%メタノール水溶液で溶出させた。 得られた溶出液を減圧下留去し、 GM 一 95物質を 3.2nig得た。
なお、 GM— 95物質を含むフラクションの検出は、 精製の各段階において PE GASIL 0DSカラム（株式会社センシユー科学, 内径 4.6mmX250mm) (移動相をァセ トニトリル： トリフルォロ酢酸：水 (70:0.1:30 v/v/v) 、 流速を 1.0ml/分） を 用いての高速液体クロマトグラフィ一を用いて行った。
GM- 95物質の物理化学的性質は下記の通りである。
1) 分子式：高分解能ファースト アトム ボンバードメント質量分析 （high- res olution fast atomic bombardoment mass spectrometry) で測定した時、 測定値
(M+H) +として、 583.0790を示し、 これと一致する分子式は C26H15N807Sである
2) 分子量：ファースト アトム ボンバードメント質量分析 （fast atomic bomb ardoment mass spectrometry) で測定すると、 582.0712を示す。
3) 融点： 138〜143°C (分解） 。
4) 比旋光度：メタノール中、 C = 0.129gZ100ml (メタノール） の濃度で測定。
[ ] D20— 9.38°
[a] D 20 =一 9. 38°
5) 紫外吸収スペクトル：図 1に示す。
測定は、 メタノール中 （7.39 ζΜ溶液） で行った。 259.5nmで最大吸収を示し 、 その時の吸光度は 0.288であった。 モル吸光係数 （ε) は 38982である。
6) 赤外線吸収スぺクトル (FT-IR) ：図 2に示す。
max (cm— 1) ： 3421, 3147, 2958, 2923, 2854, 1733, 1670, 1650, 1544, 1 496, 1438, 1392, 1351, 1315, 1267, 1199, 1174, 1118, 1087, 1058, 1033, 9 75, 943, 929, 914, 883, 798
7) 溶剤に対する溶解性：水、 アセトンに不溶。 クロ口ホルム：メタノール =1: 1に溶解する。 8) 物質の色：淡黄色粉末 （white yellowish powders)
9) 核磁気共鳴スペクトル 重クロ口ホルム：重メタノール =1:1の溶液中、 25°C で測定した 500腿 z 'H-NMRスペクトル （図 3に示す） 及び 125匪 z 13C - NMRスぺクト ル (図 4に示す) の化学シフ卜を下記に示す。
表 4
表 4 炭素位置 C - N M R H - N M R
1 162.5
2 150.5
3 125.1
4 155.4
5 149.6
6 126.0
7 157.3
8 137.8 8.17(s, 1H)
9 130.4
10 156.8
11 138.8 8.24(s, 1H)
12 130.7
13 156.2
14 141.2 8.00(s, 1H)
15 136.7
16 156.6
17 139.4 8.28(s, 1H)
18 130.9
19 156.6
20 138.1 8.18(s, 1H)
21 130.4
22 160.0
23 38.7 3.8(m 1H), 3.46(m, 1H)
24 73.2 6.19(br s， 1H)
25 11.5 2.47(s, 3H)
26 11.5 ^ 2.64Cs,_3H)
10) 高速液体クロマトグラフィー （HPLC) における保持時間 （Rt)
下記の分析条件により 6.1分にピークが検出される。
カラム： PEGASIL ODS (内径 4.6mm X 250讓、 株式会社センシュ一科学製） 移動相：ァセトニトリル Zトリフルォロ酢酸/水 （70:0.1:30 V/V/V) 流 速： 1ml/分
検 出： 254nm
上記物理科学的デー夕から G M— 95物質の化学構造は以下の様であると同定 された。
Figure imgf000027_0001
実施例 2 ：薬理試験 （GM— 9 5物質及び 5-フルォロウラシルの抗腫瘍作用） 表 5に記載の腫瘍細胞を、 10%牛退治血清添加 RPMI 1640培地に浮遊させ、 培養 プレート （38mm) に各々 2 X 103個ずつ播種し、 37で 15 % C02条件下炭酸ガス培養 器にて一晩培養した。 その後、 10%牛胎児血清添加 RPMI 1640培地を用いて種々の 濃度に希釈した被験薬 （GM— 9 5物質及び 5-フルォロウラシル） を加え、 更に 72時間培養した。 培養終了後、 細胞を 25%ダル夕一ルアルデヒドで 15分間固定し 、 水で 3回洗浄した。 次に、 20%メタノール水溶液に希釈した 0. 05%クリスタル バイオレットで細胞を染色後、 水で 3回洗浄し、 乾燥させた。 0. 05Mリン酸二水 素ナトリウム /エタノール ( 1/1 (v/v) ) 100 Lでクリスタルバイオレットを抽出 し、 540nmの吸光度を自動分光器にて測定した。 IC50はコントロールの吸光度に 対し 50%減じるのに必要な濃度と定義した。 結果を下記に示す。
表 5 表 5
各種腫瘍細胞の 5 0 %発育阻止濃度 （ I C s。 μ Μ)
5—フノ 口
GM-95
(由来) ゥラシノレ
OVCAR-3 3. 41 0. 37
(ヒト難雜
PC— 3 8. 82 5. 7
(ヒト繊？癌)
SKOV-3 8. 73 7. 84
(ヒト麵）
MCF-7 7. 73 1. 12
(ヒト麵）
ZR75-1 4. 04 3. 63
(ヒト糖
PAN- 3 7. 09 8. 82
(ヒ 議)
KM12C-SM 3. 74 1. 32
(ヒトM)
A375SM 7. 04 2. 89
(ヒトメラノーマ）
TMK-1 3. 75 0. 33
(ヒト胃癌）
HT-29 7. 1 2. 1
(ヒト
DLD-1 6. 2 5. 5
(ヒト結
Renca 0. 97 0. 58
(マウス腎鴯）
本発明化合物はインビト口における各種腫瘍細胞の発育を阻止することができ た。
実施例 3 ： GM- 9 5物質 (テロメスタチン： Teloniestatin) と他の抗腫瘍性物 質との併用効果
抗腫瘍性物質
GM- 9 5物質と併用する抗腫瘍性物質として、 エトポシド（ETP；プリストル マイヤーズスクイブ社製）、 シスブラチン（cDDP；ブリストルマイヤ一ズスクイブ 社製）、 ァドリァマイシン（Adreamyciik ADM； SIGMA社製）及びカンプトテシン （ Camptothecin, CTP； SIGMA社製） を用いた。
腫瘍細胞
腫瘍細胞として、 MCF_7(乳癌、 ATCC HTB-22) , SK0V- 3 (卵巣癌）、 HT - 29 (大腸癌 )及び HT1080 (ザルコーマ、 ATCC CRL- 12012)細胞を使用した。 各細胞は東京大学 分子細胞生物学研究所鶴尾研究室より分譲して戴いた。 MCF- 7細胞については DME M(SIGMA社製） 培地に 10%FCS、 200000U/L ペニシリン、 及び 100 mg/L ストレブ トマイシンを添加した培地にて培養した。 SK0V - 3、 HT 1080及び HT- 29細胞につい ては、 RPMI1640 (SIGMA社製） 培地に 10%FCS、 200000U/L ベニシリン、 及び 100 mg/L ストレプトマイシンを添加した培地にて培養した。
GM- 95物質と他の抗腫瘍性物質との存在下での腫瘍細胞の長期培養
上記細胞を 5xi04cells/mlとなるように調製し、 12穴プレート又は 6穴プレー ト （各 SUMITOMOベークライト社製） にそれぞれ、 500 L及び lmLずつ添加した。 各細胞を、 終濃度が 2.0/xM、 1.0 zM及び 0.5 Mとなるように GM— 95物質を添 加し、 コンフルェントになるまで培養した。 植え継ぎ時に各処理群の細胞数を計 測し、 増殖曲線（PDL)を作製した （図 5) 。 それぞれの細胞によって GM— 9 5 物質に対する感受性が異なるため、 各週毎に細胞を回収し、 それぞれの細胞につ いて、 テロメァ長の測定及び各抗腫瘍性物質との併用効果を検討した。 併用効果 については、 処理細胞を 5Xl04cells/mlとなるように調製した後、 96穴プレート
(SUMITOMOベークライト社製） に 100 Lずつ分注し、 12〜15時間インキュベー 卜した後、 GM— 95物質と上記各抗腫瘍性物質とを併用した抗腫瘍製剤を添加 し 24時間毎に経時変化を追った。 各時間ごとに生存細胞を、 MTT(3-(4, 5-ジメチ ルチアゾ一ル- 2-ィル） -2， 5-ジフエ二ル テトラゾリゥム プロミド）法により定量 した。 MTT法は、 次の通り行った。 MTT(SIGMA社製） を PBSで 5g/100mLとなるよう に調製し、 各ゥエルに 10 Lずつ添加し、 産生されるホルマザンを検鏡にて観察 しながら、 -卜分にホルマザンが産生された時点で培地を吸引した。 ジメチルスル ホキシド（DMS0) を各ゥエルに 100 Lずつ添加し、 撹拌後比色定量した。 比色定 量は、 ARV0 SX (Perkiu Elmer社製） を用いて、 570nmの吸光度を測定することで 行った。 GM— 95物質と上記各抗腫瘍性物質との併用効果の結果について図 6 〜14に示した。 なお、 図中、 「TMS」 は 1\^— 95物質 （テロメスタチン） を意味し、 「control」 は対照を意味する。
実施例 4 ： GM- 95物質と他の抗腫瘍性物質との併用による K562細胞のアポト 一シス誘導
K562細胞 （ATC Rockville, MD)より入手可能） をテロメス夕チン （GM— 9 5物質； Telomestatiii) 2 の存在下で 10日間培養し、 次いでそのテロメス夕チ ン処理した K562細胞を各種の濃度のイマニチブ（Inianitib)、 ダウノルビシン (DNR )、 ミトキサントロン（ΜΓΤ)又はビンクリスチン（VCR)とともに 72時間インキュべ 一トした。 アポトーシスの発現は FITCコンジユゲート AP02.7モノクローナル抗体 (ミトコンドリァ膜タンパク質（7A6抗原）に対して産生され、 アポトーシスが起 こっている細胞で発現される） を用いるフローサイトメトリー分析 （flow cytom etric analysis) により測定した。 その結果を図 1 5〜18に示す。 なお、 図中 、 「control」 、 「TMS」 、 「Imanitib」 、 「DNR」 、 「MIT」 及び 「VCR」 は、 それぞれ、 対照、 0 ー 95物質 （テロメス夕チン） 、 イマ二チブ、 ダウノルビ シン、 ミトキサントロン及びビンクリスチンを意味する。
イマ二チブ、 ダウノルビシン、 ミトキサントロン及びビンクリスチンはそれぞ れ作用機序が異なる抗腫瘍性物質であるが、 図 1 5〜1 8の結果から明らかなよ うに、 テロメスタチン類は各種の抗腫瘍性物質と併用することによりそれらが相 乗的に作用して腫瘍細胞のアポトーシス誘導効果が顕著に向上することが分かる 実施例 5 ： GM- 95物質と他の抗腫瘍性物質との併用効果 （HT1080細胞）
実施例 3に準じて、 GM— 95物質と他の抗腫瘍物質とを用いて以下の条件下 で腫瘍細胞を培養し、 一定期間経過後の腫瘍細胞の生存率を測定した。
抗腫瘍性物質
GM- 95物質と併用する抗腫瘍性物質として、
塩酸ドキソルビシン (DDP) (和光純薬工業株式会社、 No. 040-21521) ；
5-フルォロウラシル（5-FU) (和光純薬工業株式会社、 No. 064-01403) ；
cis -ジアンミン-ジクロロ白金（III) (CTP) (和光純薬工業株式会社、 No.047-22511 リン酸エトポシド（ETP) (和光純薬工業株式会社、 No.058-06341) ；
を用いた。
腫瘍細胞
腫瘍細胞として HT1080細胞を用いた。 なお以下の実験では、 腫瘍細胞は RPMI16 40 (SIGMA, R8758) に 10%FBSを添加した培地にて、 C02インキュベーター （温度 37T、 湿度 100%、 二酸化炭素濃度 5%) により培養した。
実験方法
以下の (A)〜 (0の条件で HT1080細胞を培養し、 培養終了後に MTT法により腫瘍 細胞の生存率を測定した。
(A) : 0. 5 Mの GM— 9 5物質と所定濃度の上記抗腫瘍性物質とを同時に添加し て腫瘍細胞を 2日間培養し、 培養後の腫瘍細胞の生存率を測定した。
(B) ：予め 0. 又は 1 xMの GM— 9 5物質とともに腫瘍細胞を 7日間培養し、 次 いで GM— 9 5物質の非存在下で所定濃度の上記抗腫瘍性物質を添加して 2日間 培養し、 培養後の腫瘍細胞の生存率を測定した。
(0 ：予め 0.5 M又は I Mの GM— 9 5物質とともに腫瘍細胞を 7日間又は 14日間 培養し、 次いで GM— 9 5物質の存在下で所定濃度の上記抗腫瘍性物質を添加し て 2日間培養し、 培養後の腫瘍細胞の生存率を測定した （なお、 の GM— 9 5物質で 14日間培養した細胞群は、 生存細胞数が少ないため測定できなかった） 結果
上記（A)〜（C)での結果を、 図 1 9〜図 2 1にそれぞれ示す。 図 1 9〜図 2 1に 示されるように、 GM— 9 5物質と抗腫瘍性物質との併用 （同時併用及び逐次的 な併用のいずれにおいても） により抗腫瘍作用が増強されることが分かる。 特に 、 （B)及び（C)の場合のように予め GM— 9 5物質 （0. 5 M又は I M) で 7日間又 は 14日間処理した場合では、 GM— 9 5物質の存在下及び非存在下のいずれにお いても各種抗腫瘍性物質との併用効果が顕著であり、 また、 併用する抗腫瘍性物 質が極低濃度であっても優れた併用効果を示した （図 2 0及び図 2 1 ) 。 なお、 図 1 9〜図 2 1において、 〇は上記抗腫瘍性物質を単独で使用した場合の結果で ある。 実施例 6 ： GM- 95物質と他の抗腫瘍性物質との併用効果 （MCF- 7細胞） 実施例 5と同様にして、 GM— 9 5物質と他の抗腫瘍物質とを用いて以下の条 件下で腫瘍細胞を培養し、 一定期間経過後の腫瘍細胞の生存率を測定した。
抗腫瘍性物質
G M— 95物質と併用する抗腫瘍性物質として、
塩酸ドキソルビシン (匿) (和光純薬工業株式会社、 No. 040-21521) ；
5 -フルォロウラシル（5-FU) (和光純薬工業株式会社、 No. 064-01403) ；
cis-ジアンミン-ジクロロ白金（ΙΠ) (CTP) (和光純薬工業株式会社、 No.047-22511
) ；
リン酸エトポシド（ETP) (和光純薬工業株式会社、 No.058- 06341) ；
を用いた。
腫瘍細胞
腫瘍細胞として MCF-7細胞を用いた。 なお以下の実験では、 腫瘍細胞は DMEM (S IGMA, D6046) に 10%FBSを添加した培地にて、 C02インキュベーター （温度 37°C 、 湿度 100%、 二酸化炭素濃度 5%) により培養した。
実験方法
以下の（D)又は (E)の条件で MCF- 7細胞を培養し、 培養終了後に MTT法により腫瘍 細胞の生存率を測定した。
(D) ：予め 1 /M又は 2 Mの GM— 9 5物質とともに腫瘍細胞を 7日間培養し、 次い で GM— 9 5物質の非存在下で所定濃度の上記抗腫瘍性物質を添加して 2日間培 養し、 培養後の腫瘍細胞の生存率を測定した。
(E) ：予め I M又は 2 Mの GM— 9 5物質とともに腫瘍細胞を 14日間培養し、 次 いで GM— 9 5物質の非存在下で所定濃度の上記抗腫瘍性物質を添加して 2日間 培養し、 培養後の腫瘍細胞の生存率を測定した。 上記 (D)及び（E)での結果を、 図 2 2にそれぞれ示す。 図 2 2に示されるように
、 MCF - 7細胞の場合においても、 予め GM— 9 5物質 （l^M又は で 7日間又 は 14日間処理し、 次いで GM— 9 5物質の存在下 Z非存在下で上記抗腫瘍性物質 と併用すると、 抗腫瘍作用が増強されることが示された。 なお、 図 2 2において 、 〇は上記抗腫瘍性物質を単独で使用した場合の結果である。
製剤例 1 ：注射剤
下記の配合割合で常法により注射剤を調製することができる。
GM— 9 5物質 5 m g
シスフラチン 5 m g
注射用蒸留水 5 m l 本明細書で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として本 明細書中にとり入れるものとする。 産業上の利用の可能性
GM - 9 5 (テロメス夕チン） を用いる本発明の組み合わせ製剤は、 特に抗腫 瘍剤として有用である。
本発明の抗腫瘍効果増強剤、 抗腫瘍用組み合わせ製剤又は抗腫瘍剤は、 G M— 9 5物質と他の抗腫瘍性物質とを併用することにより、 該抗腫瘍性物質の抗腫瘍 性効果が増強されて、 又は抗腫瘍効果が相乗的に作用してそれぞれ単独で用いた 場合と比較して顕著な抗腫瘍活性を示す。 また、 低用量で投与することが可能と なるため安全性にも優れている。

Claims

1 . 下記式 （ 1 )
請 の
Figure imgf000034_0001
囲
(式中、 各 Rは、 それぞれ独立に、 水素原子、 低級アルキル基、 ァリール基、 ァ リル基、 ァラルキル基、 ハロゲン原子、 水酸基、 アミノ基、 R' O-、 R' (C=0) -、 ' (C=0) 0-又は R' 0 (C=0) -である。 但し、 ITは炭素数 1〜 5のアルキル基である。 ） で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を含む抗腫瘍効果増強剤。
2 . 前記抗腫瘍性物質がアルキル化剤、 代謝拮抗剤、 抗癌抗生物質、 微小管阻害 剤、 ホルモン剤、 白金錯体、 トポイソメラーゼ阻害剤、 生物製剤及び分子標的治 療剤からなる群より選択されるものである請求の範囲第 1項記載の抗腫瘍効果増 強剤。
3 . 前記抗腫瘍性物質がマスタード薬、 ニトロソゥレア系化合物、 葉酸系化合物 、 ピリミジン系化合物、 プリン系化合物、 アン卜ラサイクリン系化合物、 ピンァ ルカロイド、 タキサン、 抗エストロゲン薬、 L H— R H作動薬、 トポイソメラー ゼ I阻害薬、 トポイソメラーゼ I I阻害薬、 インターフェロン、 インターロイキン 、 分子標的治療薬、 シスブラチン、 カルポプラチン及ぴネダプラチンからなる群 より選択されるものである請求の範囲第 1項記載の抗腫瘍効果増強剤。
4 . 頭頸部癌、 食道癌、 胃癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓癌、 胆嚢 ·胆管癌、 膝臓癌
、 腎臓癌、 肺癌、 乳癌、 卵巣癌、 膀胱癌、 前立腺癌、 睾丸腫瘍、 骨 ·軟部肉腫、 子宮頸癌、 皮膚癌、 脳腫瘍、 悪性リンパ腫及び白血病からなる群より選択される 疾患の治療のための請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれか 1項記載の抗腫瘍効果 増強剤。
5 . 下記式 （1 ) ：
Figure imgf000035_0001
(式中、 各 Rは、 それぞれ独立に、 水素原子、 低級アルキル基、 ァリール基、 ァ リル基、 ァラルキル基、 ハロゲン原子、 水酸基、 アミノ基、 R' O-、 R' (C=0) -、 R' (C=0) 0_又は R' O (OO) -である。 但し、 R'は炭素数 1〜 5のアルキル基である。 ） で表される化合物又はその薬学的に許容される塩と他の抗腫瘍性物質とを併用す る、 前記式 （1 ) の化合物と前記他の抗腫瘍性物質とを同時に、 別々に又は順次 投与するための抗腫瘍用組み合わせ製剤。
6 . 前記抗腫瘍性物質がアルキル化剤、 代謝拮抗剤、 抗癌抗生物質、 微小管阻害 剤、 ホルモン剤、 白金錯体、 トポイソメラーゼ阻害剤、 生物製剤及び分子標的治 療剤からなる群より選択されるものである請求の範囲第 5項記載の抗腫瘍用組み 合わせ製剤。
7 . 前記抗腫瘍性物質がマスタード薬、 ニトロソゥレア系化合物、 葉酸系化合物 、 ピリミジン系化合物、 プリン系化合物、 アン卜ラサイクリン系化合物、 ピンァ ルカロイド、 タキサン、 抗エストロゲン薬、 L H— R H作動薬、 トポイソメラー ゼ I阻害薬、 トポイソメラ一ゼ I I阻害薬、 インタ一フエロン、 インターロイキン
、 分子標的治療薬、 シスブラチン、 カルポプラチン及びネダプラチンからなる群 より選択されるものである請求の範囲第 5項記載の抗腫瘍用組み合わせ製剤。
8 . 頭頸部癌、 食道癌、 胃癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓癌、 胆嚢 ·胆管癌、 膝臓癌 、 腎臓癌、 肺癌、 乳癌、 卵巣癌、 膀胱癌、 前立腺癌、 睾丸腫瘍、 骨 ·軟部肉腫、 子宮頸癌、 皮膚癌、 脳腫瘍、 悪性リンパ腫及び白血病からなる群より選択される 疾患の治療のための請求の範囲第 5項〜第 7項のいずれか 1項記載の抗腫瘍用組 み合わせ製剤。 -
9 . 下記式 （1 ) ：
Figure imgf000036_0001
(式中、 各 Rは、 それぞれ独立に、 水素原子、 低級アルキル基、 ァリール基、 ァ リル基、 ァラルキル基、 ハロゲン原子、 水酸基、 アミノ基、 R' O-、 R' (C=0) -、 R' (C=0) 0-又は R' 0 (C=0) -である。 但し、 R'は炭素数 1〜 5のアルキル基である。 ） で表される化合物又はその薬学的に許容される塩と他の抗腫瘍性物質とを併用す る抗腫瘍剤。
1 0 . 前記抗腫瘍性物質がアルキル化剤、 代謝拮抗剤、 抗癌抗生物質、 微小管阻 害剤、 ホルモン剤、 白金錯体、 トポイソメラーゼ阻害剤、 生物製剤及び分子標的 治療剤からなる群より選択されるものである請求の範囲第 9項記載の抗腫瘍剤。
1 1 . 前記抗腫瘍性物質がマスタード薬、 ニトロソゥレア系化合物、 葉酸系化合 物、 ピリミジン系化合物、 プリン系化合物、 アントラサイクリン系化合物、 ピン アルカロイド、 タキサン、 抗エス卜ロゲン薬、 L H— R H作動薬、 トポイソメラ
—ゼ I阻害薬、 トポイソメラーゼ I I阻害薬、 インターフェロン、 インタ一ロイキ ン、 分子標的治療薬、 シスブラチン、 カルポプラチン及びネダプラチンからなる 群より選択されるものである請求の範囲第 9項記載の抗腫瘍剤。
12. 頭頸部癌、 食道癌、 胃癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓癌、 胆嚢 '胆管癌、 塍臓 癌、 腎臓癌、 肺癌、 乳癌、 卵巣癌、 膀胱癌、 前立腺癌、 睾丸腫瘍、 骨 ·軟部肉腫
、 子宮頸癌、 皮膚癌、 脳腫瘍、 悪性リンパ腫及び白血病からなる群より選択され る疾患の治療のための請求の範囲第 9項〜第 1 1項のいずれか 1項記載の抗腫瘍 剤。
13. 下記式 (1) ：
Figure imgf000037_0001
(式中、 各 Rは、 それぞれ独立に、 水素原子、 低級アルキル基、 ァリール基、 ァ リル基、 ァラルキル基、 ハロゲン原子、 水酸基、 アミノ基、 R'0-、 ' (C=0)-、 R' (( 0)0-又は1('0(じ=0)-でぁる。 但し、 R'は炭素数 1〜 5のアルキル基である。 ） で表される化合物又はその薬学的に許容される塩と他の抗腫瘍性物質とを含むテ ロメラーゼ阻害剤。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010030999A (ja) * 2008-06-25 2010-02-12 Tokyo Univ Of Agriculture & Technology テロメラーゼ阻害剤

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2665818A1 (en) * 2006-04-25 2007-11-08 Rutgers, The State University Of New Jersey Therapeutic compounds
US8093235B2 (en) 2006-04-25 2012-01-10 Rutgers, The State University Of New Jersey Macrocyclic compounds which stabilize G-Quadruplex DNA and RNA
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US8796300B2 (en) 2009-11-05 2014-08-05 Rutgers, The State University Of New Jersey Therapeutic compounds

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11228451A (ja) * 1998-02-10 1999-08-24 Kureha Chem Ind Co Ltd 抗癌性増強医薬組成物
WO2000024747A1 (fr) * 1998-10-23 2000-05-04 Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. Substance gm-95, procedes de fabrication et d'utilisation correspondants
US20030166660A1 (en) * 2001-10-18 2003-09-04 Tetsuzo Tauchi Combinations comprising N-{5-[4-(4-methyl-piperazino-methyl)-benzoylamido]-2-methylphenyl}-4-(3-pyridyl)-2-pyrimidine-amine and at least one telomerase inhibitor

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE440618T1 (de) * 2000-06-22 2009-09-15 Univ Iowa Res Found Kombination von cpg und antikírpern gegen cd19, cd20,cd22 oder cd40 zur prävention oder behandlung von krebs.
US6773897B2 (en) * 2000-09-29 2004-08-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Method of predicting the clinical response to chemotherapeutic treatment with alkylating agents
ES2186484B1 (es) * 2000-10-10 2004-07-01 Lipotec, S.A. Liposomas encapsulando farmacos anticancerosos y uso de los mismos en el tratamiento de tumores malignos.
JP4006589B2 (ja) * 2000-12-12 2007-11-14 株式会社そーせい Ｇｍ−９５物質の製法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11228451A (ja) * 1998-02-10 1999-08-24 Kureha Chem Ind Co Ltd 抗癌性増強医薬組成物
WO2000024747A1 (fr) * 1998-10-23 2000-05-04 Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. Substance gm-95, procedes de fabrication et d'utilisation correspondants
US20030166660A1 (en) * 2001-10-18 2003-09-04 Tetsuzo Tauchi Combinations comprising N-{5-[4-(4-methyl-piperazino-methyl)-benzoylamido]-2-methylphenyl}-4-(3-pyridyl)-2-pyrimidine-amine and at least one telomerase inhibitor

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MURAKAMI J. ET AL: "Inhibition of telomerase activity and cell proliferation by a reverse transcriptase inhibitor in gynaecological cancer cell lines", EUROPEAN J. OF CANCER, vol. 35, no. 6, 1999, pages 1027 - 1034, XP002979529 *
TAUCHI T. ET AL: "Activity of a novel telomerase inhibitor, telomestatin, against Glivec-resistant BCR-ABL-positive cells", BLOOD, vol. 98, no. 11, 16 November 2001 (2001-11-16), pages 616A, XP002979528 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010030999A (ja) * 2008-06-25 2010-02-12 Tokyo Univ Of Agriculture & Technology テロメラーゼ阻害剤

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