CN110283762B - 一株具有强力抗癌活性的链霉菌ccpm7649及其应用 - Google Patents

一株具有强力抗癌活性的链霉菌ccpm7649及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株具有强力抗癌活性的链霉菌CCPM7649及其应用，属于生物制药技术领域。为解决现有抗癌药物副作用大的问题，本发明提供了一株具有强力抗癌活性的链霉菌CCPM7649，属于链霉菌属Streptomyces，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.17112，该菌来源于人体肠道，是一种新发现的放线菌，能产生具有抗癌活性的代谢产物，可利用其代谢产物治疗癌症。由于该菌是在人体肠道内发现，因此对于人体的副作用很低或无，解决了目前抗癌药物副作用大，病人顺应性差等问题，并且有望可以通过调节肠道菌群的平衡达到预防癌症的目的。

Description

一株具有强力抗癌活性的链霉菌CCPM7649及其应用
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，尤其涉及一株具有强力抗癌活性的链霉菌CCPM7649及其应用。
背景技术
癌症是由遗传和环境因素综合作用导致控制细胞生长增殖机制的失常引起的疾病，发病率和死亡率逐年增高，严重威胁人类健康和消耗社会资源。目前主要的治疗方法是手术、化疗、放疗以及免疫疗法。手术治疗虽然可以切除肿瘤，但是对于某些类型的癌症无能为力，例如白血病以及全身转移的癌症，而且任何类型的癌症到了晚期也无法手术治疗。现行的化疗和放疗的方法都会对人体产生严重伤害，且易于产生耐受从而导致癌症复发。同时，免疫疗法针对的癌症类型有限，且因直接干预免疫系统而造成健康隐患。因此，发现不良反应小或无且高效抗癌的药物，就成为了一个全人类关注的热点问题。
发明内容
为解决现有抗癌药物副作用大的问题，本发明提供了一株具有强力抗癌活性的链霉菌CCPM7649及其应用。
本发明的技术方案：
一株具有强力抗癌活性的链霉菌CCPM7649，属于链霉菌属(Streptomyces)，代表一个此前未知的细菌物种(species)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.17112，保藏日期为2019年01月04日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
链霉菌CCPM7649的菌株形态特征：是呈菌丝状生长和以孢子繁殖的原核生物，具有基内菌丝和气生菌丝体，孢子呈现白色，图1为链霉菌CCPM7649三区划线培养所得菌落形态图。
链霉菌CCPM7649的分子生物学特征：链霉菌CCPM7649的特征序列如SEQ ID No：1所示，通过BLAST与GenBank中已发表细菌序列进行比较，与链霉菌属的细菌一致性最高。链霉菌CCPM7649的全基因组序列已经测毕，特征序列是从链霉菌CCPM7649全基因组序列中拔萃出的具有清晰鉴别意义的序列片段。而且链霉菌CCPM7649具有鲜明的生物学特征，在细菌物种判定上具有重要意义，因此将其归为链霉菌属(Streptomyces)；链霉菌CCPM7649代表此前未经报道的链霉菌属新物种。
本发明提供的一株具有强力抗癌活性的链霉菌CCPM7649在制备抗癌药物方面的应用。
进一步的，所述抗癌药物包括用于治疗肺癌、肝癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌和/或白血病的药物。
进一步的，所述应用为链霉菌CCPM7649的发酵液在制备抗癌药物方面的应用。
进一步的，所述应用为链霉菌CCPM7649的代谢产物在制备抗癌药物方面的应用。
进一步的，所述链霉菌CCPM7649的代谢产物的制备方法为：
从平板上取链霉菌CCPM7649单菌落培养物接种到5mL GRC001液体培养基中，在一定培养温度和转速下扩增培养一定时间，再将5mL菌液转移至100mL GRC001液体培养基中，在一定温度和转速下大量扩增培养一定时间，最后将菌液离心，取上清液即可。
进一步的，所述GRC001液体培养基的配方为：
马铃薯粉或其他淀粉20g，KNO31g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水定容至1L，高压蒸汽灭菌。
进一步的，所述链霉菌CCPM7649的液体扩增培养的温度为14-42℃，转速为160转/分钟，培养时间为3-18天。
进一步的，所述链霉菌CCPM7649的大量扩增培养的温度为14-42℃，转速为160转/分钟，培养时间为3-18天。
进一步的，所述离心条件为8000rpm/min离心10min。
本发明的有益效果：
本发明通过肠道微生物群的宏基因组高通量筛查结合传统细菌学以及分子微生物学和遗传学方法，分离和鉴定具有强力抗癌活性的细菌。本发明提供的具有强力抗癌活性的链霉菌CCPM7649来源于健康人体肠道，是一种新来源的放线菌，具备海洋、土壤等其他来源的放线菌不同的性质，能产生具有很强抗癌活性的代谢产物。该代谢产物具有广谱抗癌活性，可用于癌症的治疗，包括用于制备治疗肺癌、肝癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌和/或白血病的药物。
由于链霉菌CCPM7649是在健康人体肠道内发现，因此将其代谢产物制成抗癌药物后对于人体的副作用会很低或无。
通过调节人体肠道微生物的状态或数量的比例的不同，从而达到预防癌症的目的。
附图说明
图1为链霉菌CCPM7649三区划线培养所得菌落形态图；
图2为多种癌细胞经过链霉菌CCPM7649的代谢产物作用后的形态对比图，其中ES-2：卵巢癌细胞；A2780：卵巢癌细胞；HeLa：子宫颈癌细胞；HCT116：人结肠癌细胞；NB4：早幼粒白血病细胞系；ZYZ：早幼粒白血病原代培养细胞；BC：早幼粒白血病原代培养细胞；
图3为HeLa细胞经过链霉菌CCPM7649的代谢产物作用72h后MTT的结果图；
图4为肿瘤动物模型CCPM7649给药组和PBS对照组的对比图，其中A为肿瘤动物图片对比图，B为肿瘤细胞对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1
一株具有强力抗癌活性的链霉菌CCPM7649，属于链霉菌属(Streptomyces)，代表一个此前未知的细菌物种(species)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.17112，保藏日期为2019年01月04日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2
本实施例提供了一种链霉菌CCPM7649的筛选方法。
一、筛选培养基及有关溶液的配制方法：
(1)GRC001固体培养基配方(1L)：
马铃薯粉或其他淀粉20g，KNO31g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂20g；先溶解或混悬淀粉，然后加入其他成分，高压后要记得摇匀。
(2)重铬酸钾：溶液终浓度50mg/L。贮存液浓度为：5g/L，溶剂为水，现用现配，避光，过滤除菌。有毒，切勿接触皮肤或吸入；配制100mL GRC001固体培养基时，加入1mL重铬酸钾贮存液，待培养基不太热时加入，混匀。
(3)FeSO4·7H2O母液：0.01g/mL。1g FeSO4·7H2O溶于100mLH2O中，每1000mLGRC001固体培养基加入1mL硫酸亚铁母液。
(4)PBS缓冲液配方(1L)：KH2PO40.27g，Na2HPO41.42g，NaCl 8g，KCl 0.2g。
二、链霉菌CCPM7649的筛选方法：
是取自健康人粪便样本的细菌，具体方法如下：
(1)取样说明：交给粪便提供者一个取样包，包括以下物品：50mL离心管x 1；餐用汤匙x 1；PE手套x 2；餐用纸盘x 1；知情同意书x 1；取样说明书x 1。
(2)操作说明：详细阅读知情同意书，详细填写粪便提供者基本信息并签字；将粪便排到一次性餐用纸盘中；带上PE手套，用餐用汤匙挖取粪便中心部分约10g，放入到50mL离心管内，拧紧离心管盖子后，放回自封袋中；个操作过程避免碰触其他不相关物品；将装有粪便的离心管和知情同意书装入自封袋，由实验室人员集中收集回来。
(3)样品处理和细菌分离培养：取样，编号，混悬于10倍体积的PBS缓冲液中，取100μl涂直径90毫米平板，平板内含有含重铬酸钾+的GRC001固体培养基，14-42℃进行培养；取单菌落置于载玻片上与适量水混合后盖上盖玻片，40×可见菌丝体孢子；单菌落三区划线14-42℃培养，菌落形态见图1。
(4)存菌：500μl 50％甘油+500μl GRC001液体培养基，混匀后存菌。
实施例3
本实施例提供了一种链霉菌CCPM7649的扩增方法：
从平板上取链霉菌CCPM7649的单菌落到5mL GRC001液体培养基中，160转/分钟，14-42℃，扩增3-18天后，再将5mL菌液转移至100mL GRC001液体培养基中，160转/分钟，14-42℃，大量扩增3-18天，最后将菌液离心，8000rpm/min离心10min，取上清液做后续抗癌实验。
实施例4
本实施例提供了一种链霉菌CCPM7649抗癌活性验证实验：
(1)HeLa等癌细胞培养，包括ES-2-卵巢癌细胞系；A2780-卵巢癌细胞系；HeLa-子宫颈癌细胞系；HCT116-人结肠癌细胞系；NB4-早幼粒白血病细胞系；ZYZ-早幼粒白血病原代培养细胞和BC-早幼粒白血病原代培养细胞；铺板，每孔100μl，细胞密度为1x105/mL，待癌细胞贴壁后向其中加入实施例3制备的链霉菌CCPM7649的代谢产物5μl，对照组为等体积的GRC001液体培养基，再培养6-48小时后观察。镜下观察癌细胞形态。癌细胞变圆、死亡，见图2。
(2)链霉菌CCPM7649的代谢产物制备：从平板上取单菌落到5mL GRC001液体培养基中，160转/分钟，14-42℃，扩增后将菌液8000rpm/min离心10min，取上清液做后续抗癌细胞实验。
(3)MTT试验：HeLa等癌细胞铺板，每孔100μl，细胞密度为1x105/mL，待HeLa细胞贴壁后向其中分别加入链霉菌CCPM7649的代谢产物5、10、20、40、80和160μl，对照组为GRC001液体培养基，各设6个重复孔，再培养6-72小时后观察。每孔加入20μl MTT溶液，继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD492nm处测量各孔的吸光值。结果如图3所示，链霉菌CCPM7649的代谢产物对于HeLa细胞的抑制作用与浓度呈现梯度。
由图2中癌细胞的形态变化可以看出，链霉菌CCPM7649对于ES-2-卵巢癌细胞；A2780-卵巢癌细胞；HeLa-子宫颈癌细胞；HCT116-人结肠癌细胞；NB4-早幼粒白血病细胞系；ZYZ-早幼粒白血病原代培养细胞；BC-早幼粒白血病原代培养细胞都具有抑制作用。最终证实从健康人肠道中筛选出来的链霉菌CCPM7649对肿瘤细胞具有显著的抑制活性。
(4)肿瘤动物模型试验：裸鼠(SPF级)购买后，适应性饲养一周，温度(25±2)℃，湿度保持在45％至50％。取生长状态良好且处于对数生长期ES-2-卵巢癌细胞，在生物安全柜内用0.25％的胰酶消化，收集细胞，5000r/min离心5分钟，用冷的PBS制成细胞悬液，细胞计数仪计数活细胞数，并将细胞浓度调整为1×106个/mL，将细胞悬液置于冰上待用。消毒裸鼠注射部位皮肤，用注射器吸取细胞悬液50μL，接种于裸鼠皮下，形成小皮丘。注射结束的裸鼠应用耳部打孔器，记号笔等对动物进行标记，对动物体重和成瘤体积进行测量。种瘤后，隔日记录下述指标：动物体重、瘤体积、动物状态等。约10日可见瘤体突出于皮下，开始记录瘤体积，并按照实验设计给药，具体为CCPM7649给药组和PBS对照组动物右后肢肿瘤内分别注射CCPM7649代谢产物(实验组)和PBS缓冲液(对照组)，实验结果如图4所示。22日后处死动物，详细记录体重(g)、瘤重量(g)、瘤体积(V＝0.5ab2，a长径，b短径)、脾重量(g)。ES-2卵巢癌细胞动物肿瘤形成的成功率为100％。随着实验的进程可观察到，与PBS组相比，CCPM7649给药组的肿瘤体积与对照组相比减小了2倍以上，且CCPM7649给药组处理后的癌细胞出现了广泛崩溃。由动物实验结果可以证明链霉菌CCPM7649对肿瘤细胞具有显著的抑制活性，抗癌效果显著。
SEQUENCE LISTING
<110> 哈尔滨天齐人类第二基因组技术开发应用科技有限责任公司
<120> 一株具有强力抗癌活性的链霉菌CCPM7649及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1752
<212> DNA
<213> 链霉菌（Streptomyces sp.）
<400> 1
atggacattg gtgttgtcac ctcagtgtgg ggtgactacg gaaagtacct cccagactgg 60
gtagcatcta tccaggaaca atcgatcaaa ccttcgatga tcaccatcat caacgccgga 120
accgacacca cagaagctca gcaaatcctc cgcacagaaa gaatcccctg gcagatcatc 180
caaatcccct acacaggaat gggagcagcc aggaacgctg ctgtggcgca cacggacacc 240
gagtgggtga tgcatctcga cgctgacgac gttttactcc cgcatgctct ggaggacatt 300
gctcagattc accaggacgc cgacgtggtt tctctgggca tgtccgtcaa cggccgagag 360
gtgacgttcc cacacaccag tacagaacac gtcaaagctg ggggcatagg gtgttattcc 420
tgtgcggcgt accgtcgata cctctgggaa cggcgtccct acatcaccgc caatgactgg 480
attgattccg cgctgtgggt tggctttgct catgaaggtg ccaggttccg ggccacgtca 540
cgggttggag cggtgtaccg gcagcatgat gattcgttct cgcacaggtt gagtgatcgg 600
gatcgtatgt tggcggggga gcagcaccgt gctctgtgtg cgaatccgga gcttcgtctg 660
tgaatgacct atcaggagct ggaacgctgg tgggaagtag attttgaagt cctctgctcg 720
actgcggtag ccgaggctac aggcgaagtc cacgcttccg tccgagaagc actgcgcagc 780
gacgattgga tcgaccagtg ggctgactcc ttgtatgccg catatggagc cctggcttca 840
gctactgaac gcatgctcat tctgaacgac gaccgacttg agaagaacaa gaaggaagcc 900
gggcaagtta ataggcgtcg tggggaggtg aatcgattgg taaacgccaa gaaaaagcgc 960
caaggaatca ccttgatggg caagtatgac agagatgctc atcatgcttc tctttccata 1020
attgtacgcc agtacgagaa tgagtacctt tccatccgtg agcgtactta caggaaacac 1080
aatctgccaa atctggaaga tgtggaagaa ccctacgcgg acaacttgca ggctgtggag 1140
cactgcgtct ctcgtggata catcacggca ccactcactc aggaagtaga atacctgctt 1200
tcctcacaga atcatgtatt ggcagacatt gtagcccgcg acgtagtgaa acaggatgat 1260
agatgtgacg agctacgcca ccctcttttg ctaaggaaat ggcgtgacgg ccttgcacat 1320
ctacgagata gacactgtga gcttgccggg ctgccacctc tctattcagt agatcttccc 1380
acactcgacg tgaataagat tctctccatg agaatcgaag aagcgcgaac gatcattaac 1440
cgtcgtcggt tcatccggag tatcgcacaa cggcatcggg aatgtcagat gtacattgtg 1500
caactcagtc gtcttgccgc aataaaaatc aatgaacacc gtaagccctg gcatatggca 1560
aaccaggaag cacgcgatga actaggacgc cgacaccagg atgagcttga tgcgcttacc 1620
agagggctag cactcttctg cgtacccgga acaaccgaat tcgatctcga aagattcgca 1680
cataaggatc gaaaagaagc aatccgcatg atgaaagaag cgctccgcga cggaacctgg 1740
aaaaatctgt ag 1752

Claims (8)

1.一株具有强力抗癌活性的链霉菌 CCPM7649，其特征在于，它属于链霉菌属(Streptomyces)，代表一个新的链霉菌物种，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 17112，保藏日期为2019年01月04日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一株如权利要求1所述的具有强力抗癌活性的链霉菌 CCPM7649在制备抗癌药物方面的应用，所述抗癌药物是用于治疗子宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌和/或白血病的药物。
3.根据权利要求2所述一株具有强力抗癌活性的链霉菌 CCPM7649在制备抗癌药物方面的应用，其特征在于，所述应用为链霉菌 CCPM7649的发酵液在制备抗癌药物方面的应用。
4.根据权利要求2所述一株具有强力抗癌活性的链霉菌 CCPM7649在制备抗癌药物方面的应用，其特征在于，所述应用为链霉菌 CCPM7649的代谢产物在制备抗癌药物方面的应用。
5.根据权利要求4所述一株具有强力抗癌活性的链霉菌 CCPM7649在制备抗癌药物方面的应用，其特征在于，所述链霉菌 CCPM7649的代谢产物的制备方法为：
从平板上取链霉菌 CCPM7649单菌落培养物接种到5 mL GRC001液体培养基中，在一定培养温度和转速下扩增培养一定时间，再将5 mL 菌液转移至100 mL GRC001液体培养基中，在一定温度和转速下大量扩增培养一定时间，最后将菌液离心，取上清液即可；
所述GRC001液体培养基的配方为：
马铃薯粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，蒸馏水定容至1L，高压蒸汽灭菌。
6.根据权利要求5所述一株具有强力抗癌活性的链霉菌 CCPM7649在制备抗癌药物方面的应用，其特征在于，所述链霉菌 CCPM7649的液体扩增培养的温度为14-42℃，转速为160 转/分钟，培养时间为3-18天。
7.根据权利要求5所述一株具有强力抗癌活性的链霉菌 CCPM7649在制备抗癌药物方面的应用，其特征在于，所述链霉菌 CCPM7649的大量扩增培养的温度为14-42℃，转速为160 转/分钟，培养时间为3-18天。
8.根据权利要求5所述一株具有强力抗癌活性的链霉菌 CCPM7649在制备抗癌药物方面的应用，其特征在于，所述离心条件为8000 rpm 离心10 min。
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Anticancer potential of metabolic compounds from marine actinomycetes isolated from Lagos Lagoon sediment;Olabisi Flora Davies-Bolorunduro 等;《Journal of Pharmaceutical Analysis》;20190314;第9卷;第201-208页 *

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