CN112852682A - 与芽孢杆菌属近缘的厚壁菌门细菌菌株及其抗癌应用 - Google Patents

与芽孢杆菌属近缘的厚壁菌门细菌菌株及其抗癌应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供具有抗癌活性的厚壁菌门细菌(Phylum：Firmicutes)菌株及其抗癌用途，其特征在于，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.17886，是一种新发现的与芽孢杆菌属近缘的细菌；本发明还提供了以所述菌株作为活性抗癌细菌的抗癌细菌制剂、由所述菌株产生的代谢产物、包含所述代谢产物的药物、培养所述菌株的方法以及所述制剂、代谢产物和/或药物在抗癌中的应用，实验数据显示，所述菌株能产生抗癌活性代谢产物，由于所述菌株是在人体肠道内发现，因此对于人体的副作用会很低或没有副作用，解决了目前抗癌药物副作用大，病人顺应性差等问题，有望通过调节肠道菌群的平衡达到预防/治疗癌症的目的。

Description

与芽孢杆菌属近缘的厚壁菌门细菌菌株及其抗癌应用
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种与芽孢杆菌属近缘的厚壁菌门细菌(Phylum：Firmicutes)菌株及其在抗癌中的应用。
背景技术
癌症，作为危害人体健康的第一因素，一直以来都是世界医学界难以攻克的难关。现代人生活方式向不良方向的改变，新增危险因素的层出不穷，这些都促进着癌症的发生与发展。
传统对癌治疗手段主要包括放疗化疗等，这类手段存在的显著缺点在于癌细胞的耐药性和对身体和精神的双重摧残。即使近年来免疫疗法兴起，但仍不成熟，存在诸多未解决问题，实行起来多力不从心，因此寻找新的抗癌方法迫在眉睫。
发明内容
发明人结合对本领域近年来在本领域肠道菌群与健康关系的诸多学术成果的研究，发现肠道菌群在抗癌方面扮演重要角色。为了发掘更多有抗癌作用的细菌，提供更多更新更有效的候选抗癌方法，发明人通过肠道微生物群的宏基因组高通量筛查结合传统细菌学以及分子生物学和遗传学方法，分离和鉴定到具有强力抗癌活性的细菌。基于该发现，提供以下技术方案：
本发明在第一方面提供了一种与芽孢杆菌属近缘的厚壁菌门细菌(PhylumFirmicutes) 菌株，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.17886。
作为上述菌株的另一种鉴定标准：革兰氏染色阳性，需氧或兼性厌氧，有荚膜，芽孢椭圆、卵圆、柱状或圆形；与GenBank中已发表细菌序列进行比较，其全基因组序列与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的基因组序列一致性最高，但有明显差异，包含SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的两个特征性序列。
本发明的所述菌株是一株具有高强抗癌活性的厚壁菌门(Phylum:Firmicutes)的细菌，与芽孢杆菌(Bacillus)属的细菌近缘，代号为CCPM7643(又称为天剑5号)，代表以前从未分离得到的细菌物种(species)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.17886，保藏日期为2019年06月03日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)。
CCPM7643菌株的形态特征：由于在基因组上与芽孢杆菌属的细菌近缘，因此其形态也相似，呈革兰氏染色阳性，需氧或兼性厌氧，有荚膜，芽孢椭圆、卵圆、柱状或圆形，能抗许多不良环境。菌落在琼脂培养基上的形态是扁平圆形，白略带灰色，半透明(参见图1)。
CCPM7643的分子生物学特征：通过全基因组序列与GenBank中已发表细菌序列进行比较，与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的细菌基因组序列一致性最高，如图2进化树所示，但有明显差异，例如包含两个特征性序列(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)，因此CCPM7643代表以前未知的细菌新物种。CCPM7643株具有显著和强大的抗癌活性。
本发明在第二方面提供了由本发明第一方面所述菌株产生的代谢产物。
本发明在第三方面提供了一种抗癌细菌制剂，所述制剂以本发明第一方面所述的菌株作为活性抗癌细菌经扩大培养而得。
优选地：所述的细菌制剂，是
(i).所述菌株的固体培养物或液体培养物；
(ii).(i)中的液体培养物经过固液分离得到的液体部分；或
(iii).(ii)中的所述液体部分经过进一步提纯得到的产物。
也就是说，所述制剂可以液体制剂，也可以是干粉制剂，还可以是其他适合于所述菌株在胃肠道定植的其他制剂形式。所述制剂可以用于调节胃肠道菌群平衡，或者通过调节胃肠道菌群平衡来达到抗癌的作用。所述抗癌可以是对癌症的预防、抑制或消除。所述抑制可以是减缓癌症的发展或减轻癌症的症状；所述消除可以是消除癌症的部分或全部症状，例如治愈癌症。
优选地，扩大培养所用培养基是淀粉培养基；优选地，所述淀粉培养基中所采用的淀粉来自谷物，或选自由马铃薯、玉蜀黍、大豆和小米组成的组的一种或多种。
本发明的第四方面，提供上述代谢产物或细菌制剂的制备方法，共同特征在于，包括将所述菌株接种至培养基中，在14℃至39℃环境下扩大培养的步骤。
在一些优选的实施方式中，所述培养基选择液体培养基，所述代谢产物或细菌制剂通过包括如下步骤的方法制备：
(1)将所述菌株在液体培养基中以100至150转/分钟(例如120转/分钟)的速度在14℃至39℃(例如15℃、20℃、25℃、30℃或35℃)培养2天至10天(例如5或8 天)，获得培养菌液；
(2)对所述培养菌液进行固液分离，获得作为代谢产物的液体部分。
在另一些优选的实施方式中，所述固液分离采用离心方式进行，优选的是，所述离心的离心速度为8000rpm，离心时间为10分钟。
在另一些优选的实施方式中，所述液体培养基为GRC001液体培养基，所述GRC001液体培养基的配方如下：淀粉20重量份，KNO3 1重量份，K2HPO4 0.5重量份，MgSO4·7H2O 0.5重量份，NaCl 0.5重量份，FeSO4·7H2O 0.01重量份，重铬酸钾0.05重量份。
在另一些优选的实施方式中，所述淀粉来自谷物；更优选的是，所述淀粉来自选自由马铃薯、玉蜀黍、大豆和小米组成的组的至少一种来源。
在一些更具体的实施方式中，所述代谢产物或细菌制剂通过包括如下步骤的方法制备：(1)从经过平板培养的培养基上取单菌落到5mL GRC001液体培养基中，120转/ 分钟，14℃至39℃，扩增2天至10天后，得到待扩大培养菌液；(2)将5mL待扩大培养菌液转移至100mL GRC001液体培养基中，120转/分钟，14℃至39℃，扩增2天至 10天，得到扩大培养菌液；(3)将扩大培养菌液离心(例如8000rpm，离心10min)，取上清液作为代谢产物。
本发明在第五方面提供了一种抗癌药物，其特征在于，所述抗癌药物包含本发明第二方面所述的代谢产物或第三方面提供的细菌制剂。
本发明在第六方面提供了本发明第一方面所述菌株、本发明第二方面所述的代谢产物，本发明第三方面所述的细菌制剂、本发明第五方面所述的药物在抗癌中的应用。
在一些优选的实施方式中，所述癌选自由肺癌、肝癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌和白血病组成的组，更优选为卵巢癌。
本发明在第七方面提供了本发明第一方面所述菌株的培养方法，所述培养方法采用GRC001固体培养基进行。优选的是，所述GRC001固体培养基由如下配方制得：淀粉 20重量份，KNO3 1重量份，K2HPO4 0.5重量份，MgSO4·7H2O 0.5重量份，NaCl 0.5重量份，FeSO4·7H2O 0.01重量份，重铬酸钾0.05重量份，琼脂20重量份。在一些优选的实施方式中，所述淀粉来自谷物。更优选的是，所述淀粉来自选自由马铃薯、玉蜀黍、大豆和小米组成的组的至少一种来源。
本发明在第八方面提供了本发明第一方面所述菌株的扩大培养方法，所述扩大培养方法采用GRC001液体培养基进行。优选的是，所述GRC001液体培养基由如下配方制得：淀粉20重量份，KNO3 1重量份，K2HPO4 0.5重量份，MgSO4·7H2O 0.5重量份， NaCl 0.5重量份，FeSO4·7H2O 0.01重量份和重铬酸钾0.05重量份。在一些优选的实施方式中，所述淀粉来自谷物。优选的是，所述淀粉来自选自由马铃薯、玉蜀黍、大豆和小米组成的组的至少一种来源。
本发明在第九方面提供了本发明第三方面所述的代谢产物的制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)将所述菌株在液体培养基中以100至150转/分钟的速度在14℃至39℃培养2天至10天，获得培养菌液；
(2)对所述培养菌液进行固液分离，获得作为代谢产物的液体部分。
在另一些优选的实施方式中，所述固液分离采用离心方式进行，优选的是，所述离心的离心速度为8000rpm，离心时间为10分钟。
在另一些优选的实施方式中，所述液体培养基为GRC001液体培养基，所述GRC001液体培养基的配方如下：淀粉20重量份，KNO3 1重量份，K2HPO4 0.5重量份，MgSO4·7H2O 0.5重量份，NaCl 0.5重量份，FeSO4·7H2O 0.01重量份，重铬酸钾0.05重量份。在另一些优选的实施方式中，所述淀粉来自谷物；更优选的是，所述淀粉来自选自由马铃薯、玉蜀黍、大豆和小米组成的组的至少一种来源。
在一些更具体的实施方式中，所述代谢产物通过包括如下步骤的方法制备：(1)从经过平板培养的培养基上取单菌落到5mL GRC001液体培养基中，120转/分钟，14℃至 39℃，扩增2天至10天后，得到待扩大培养菌液；(2)将5mL待扩大培养菌液菌液转移至100mLGRC001液体培养基中，120转/分钟，14℃至39℃，扩增2天至10天，得到扩大培养菌液；(3)将扩大培养菌液离心(例如8000rpm，离心10min)，取上清液作为代谢产物。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
(1)本发明的CCPM7643菌株来源于健康成人的肠道，是一种新来源的芽孢杆菌，与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的细菌近缘，但具备与其他(例如海洋、土壤等)来源的芽孢杆菌不同的性质，实验数据证明，其产生的代谢产物具有显著抗癌活性。
(2)由于其是在人体肠道内发现，对于人体没有副作用或副作用低，患者顺应性好。
(3)通过调节人体肠道微生物的状态或数量的比例的不同，从而达到预防癌症的目的。
附图说明
图1为CCPM7643菌株三区划线培养后的菌落结果图。
图2为CCPM7643全基因组进化树。
图3为卵巢癌ES2细胞经过CCPM7643菌株的代谢产物作用后的形态学改变，其中图A为CCPM7643作用后的ES2卵巢癌细胞；图B为对照。
图4为卵巢癌ES2细胞经过CCPM7643菌株的代谢产物作用6h的CCK8实验结果图。
图5不同培养基产生的CCPM7651细菌制剂对A549细胞抗癌活性比较。
图6不同培养基产生的CCPM7651细菌制剂对Hela细胞抗癌活性比较。
具体实施方式
下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明。应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
实施例1：CCPM7643菌株的筛选
1材料与方法
1.1筛选培养基及有关溶液
1.1.1 GRC001固体培养基配方(1L)：
淀粉(马铃薯或玉蜀黍或大豆或小米或其他谷物或其他植物)20g，KNO3 1g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂20g；先溶解或混悬淀粉，然后加入其他成分，高压后要记得摇匀。优选地，淀粉还可以被替换为适合碳源的其他例子，包括，但不限于：糖，如葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉水解物、纤维素水解物和糖蜜；有机酸，如乙酸、丙酸、甲酸、苹果酸、柠檬酸、和反丁烯二酸；和醇，如甘油。 KNO3还可以被替换为其它适合氮源的示例性例子，包括，但不限于：氨，包括氨气和氨水；无机或有机酸的铵盐，如氯化铵、磷酸铵、硫酸铵和乙酸铵；和其它含氮物，包括肉膏、胨、玉米浆、酪蛋白水解物、豆饼水解物和酵母提取物。
1.1.2重铬酸钾：浓度50mg/L。贮存液：5g/L(现用现配，避光，过滤除菌。有毒，切勿接触皮肤或吸入)；配制100mL GRC001固体培养基或GRC001液体培养基时，加入 1mL重铬酸钾储存液(待培养基高压灭菌后温度降至40-55℃时加入，混匀)。
1.1.3FeSO4·7H2O母液：0.01g/mL。1g FeSO4·7H2O溶于100mL H2O中，每1000mLGRC001固体培养基或液体培养基加入1mL硫酸亚铁母液。
1.1.4 PBS缓冲液配方(1L)：KH2PO4 0.27g，Na2HPO4 1.42g，NaCl 8g，KCl 0.2g。缓冲盐可以是任何已知的无机盐，但优选是从下组中选择的盐：碱金属的硝酸盐、乙酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硫酸盐、氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐(也称作重碳酸盐)、磷酸盐、硫化物和亚硫酸盐；硝酸铵、乙酸铵、氯化铵、溴化铵、碘化铵、硫酸铵、氢氧化铵、碳酸铵、碳酸氢铵(也称作重碳酸铵)、磷酸铵、硫化铵和亚硫酸铵；碱土金属的硝酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硫酸盐、硫化物和碳酸氢盐；锰、铁、铜和锌的硝酸盐、乙酸盐、氯化物、溴化物、碘化物和硫酸盐；柠檬酸盐和硼酸盐。
1.1.5 LB液体培养基配方(1L)：在900mL去离子水中加入胰蛋白胨，10克；酵母提取物，5克；NaCl，10克。摇动容器使溶质溶解，用5mol/L NaOH调pH至7.0，然后加去离子水至1L。在15psi压力下蒸汽灭菌20min。
1.2芽孢杆菌属(Bacillus)CCPM7643菌株的获得：是取自人粪便样本的细菌。
1.2.1取样说明
本发明人交给粪便提供者，优选为健康成人，一个取样包，包括以下物品：50mL离心管x1；餐用汤匙x1；PE手套x2；餐用纸盘x1；知情同意书x1；取样说明书x1。
1.2.2操作说明：详细阅读知情同意书，详细填写粪便提供者基本信息并签字；将粪便排到一次性餐用纸盘中；带上PE手套，用餐用汤匙挖取粪便中心部分约10g，放入到50mL离心管内，拧紧离心管盖子后，放回自封袋中；整个操作过程避免碰触其他不相关物品；将装有粪便的离心管和知情同意书装入自封袋，由实验室人员集中收集回来。
2细菌的分离培养和存菌：
2.1样品处理和细菌分离培养：
将取回的样品进行编号，取离心管内的粪便5g混悬于约10倍体积的PBS缓冲液中，充分震荡混匀，并进行10倍、100倍、1000倍稀释，分别取稀释100倍和1000倍的稀释液100μl混匀后的悬浊液涂布于直径90毫米的平板(GRC001固体培养基(含重铬酸钾))，14-39℃培养5-10天可见明显单菌落；取单菌落置于载玻片上与适量水混合后盖上盖玻片，放大40倍可见菌丝体孢子；单菌落三区划线14-39℃培养5-10天后，结果见图1。
2.2存菌：取单菌落接种于2ml GRC001液体培养基(含重铬酸钾)中，震荡培养8-24h，采用移液枪吸取已灭菌的50％甘油500μl加入500μl菌液，混匀后置于-80℃环境中冷冻保存。
2.3细菌扩大培养：细菌接种于GRC001液体培养基扩大培养，120转/分钟，14-39℃。
2.4鉴定：通过全基因组序列与GenBank中已发表细菌序列进行比较，与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)属的细菌一致性最高，如图2进化树所示，但有明显差异，例如包含如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特征序列，因此CCPM7643代表以前未知的细菌新物种。CCPM7643株具有显著和强大的抗癌活性，其全基因组序列信息可清晰地表明其遗传背景和种系的独特性，在芽孢杆菌属或厚壁菌门的其他菌属均无报道，在细菌物种判定上具有重要意义(关于细菌天然物种的判定申请人向学术界提出了更新的标准，请参见(LeTang and Shu-Lin Liu.2012.The 3Cs provide a novel concept of bacterialspecies:messages from the genome as illustrated by Salmonella.Antonie vanLeeuwenhoek 101(1):67-72；以及Le Tang,Yang Li,Xia Deng,Ang Li,RandalN.Johnston,Gui-Rong Liu, Shu-Lin Liu.2013.Defining natural species ofbacteria:clear-cut genomic boundaries revealed by a turning point innucleotide sequence divergence.BMC Genomics.14:489)，于是本发明人将该菌种归为与芽孢杆菌属(Bacillus)亲缘关系密切的厚壁菌门新物种。
实施例2：CCPM7643菌株的细菌制剂(即细菌培养上清，其中含有代谢产物)的制备
LB固体培养基：在900mL去离子水中加入胰蛋白胨，10克；酵母提取物，5克； NaCl，10克。摇动容器使溶质溶解，用5mol/L NaOH调pH至7.0，然后加去离子水至 1L。加琼脂15克，摇匀，在15psi压力下蒸汽灭菌20min，倒平板，培养基厚度4mm。
LB液体培养基：在900mL去离子水中加入胰蛋白胨，10克；酵母提取物，5克； NaCl，10克。摇动容器使溶质溶解，用5mol/L NaOH调pH至7.0，然后加去离子水至1L。在15psi压力下蒸汽灭菌20min。
实验细菌制剂：利用实施例1扩大培养得到的液体培养物，在GRC001固体培养基(GRC001液体培养基+琼脂)上涂板培养，再从平板上取单菌落接种到5mL高氏一号液体培养基中，120转/分钟，14-39℃，培养2-14天，扩增后将菌液6000-10000rpm，优选 8000rpm，离心5-15min，优选10分钟，收集上清液，得到细菌制剂(淀粉培养基)用于后续抗癌细胞实验。
对照细菌制剂：将GRC001固体培养基替换为LB固体培养基(和GRC001液体培养基替换为LB液体培养基，得到对照细菌制剂用于后续抗癌细胞实验。
实施例3：抗癌活性实验
人卵巢癌细胞系ES2：上皮性卵巢癌细胞系ES2购自武汉普诺赛生命科技有限公司(Wuhan Procell Life Science&Technology Co Ltd).
CCK8：Cell Counting Kit-8细胞计数试剂，碧云天生物技术(BeyotimeBiotechnology)。
3.1 ES2细胞培养：铺板，每孔100μl，细胞密度为1x105/mL，待ES2细胞贴壁后，向其中加入实施例2得到的代谢产物5μl，对照组向其中加入等体积的GRC001液体培养基，再培养6小时后观察。镜下观察ES2细胞形态。
结果如图3所示，其中左图为CCPM7643作用后的ES2卵巢癌细胞；右图为对照处理；经CCPM765细菌制剂处理的ES2细胞，聚合、形状变圆、脱落、死亡，
3.2 CCK8试验：ES2细胞铺板，每孔100μl，细胞密度为1x105/mL，待ES2细胞贴壁后，向其中分别加入实施例2得到的代谢产物5μl、2.5μl、1.25μl、0.625μl、0.313 μl、0.156μl，对照组不加菌株的代谢产物(不加菌株但是对应加入相同体积的经过培养和离心得到的上清液)，各设4个重复孔，再培养6-24小时后观察。每孔加入10μl CCK8 溶液，继续培养0.5-1h后在酶联免疫检测仪OD450nm处测量各孔的吸光值。
结果如图4所示，其中，*P<0.05表示差异水平具有统计学显著性意义，*P<0.01表示差异水平具有统计学极其显著性意义。由图4可以看出，芽孢杆菌属(Bacillus)CCPM7643的代谢产物对于ES2细胞的抑制作用与浓度梯度呈现相关(即在一定浓度范围内，CCPM7643的细菌制剂浓度越高对于ES2细胞的抑制作用越强)，并且能够显著
实施例4：比较不同培养基对CCPM7651菌株制剂抗癌活性的影响
A549细胞：肺癌细胞，购自武汉普诺赛生命科技有限公司(Wuhan Procell LifeScience &Technology Co Ltd)
HeLa细胞：宫颈癌上皮细胞HeLa，购自武汉普诺赛生命科技有限公司(WuhanProcell Life Science&Technology Co Ltd)。
实验试剂：实施例2制备得到的实验细菌制剂对照细菌制剂，
空白对照：未培养过细菌的GRC001液体培养基(无细菌)，
细胞培养：铺96孔培养板，每孔100μl，细胞密度为1x105/mL，待细胞贴壁后，向其中加入实验细菌制剂5μl，对照板采用对照细菌制剂(GRC001液体培养基，无细菌)，分别于培养6、12、18、24小时后，镜下观察细胞形态。
结果如图5所示：加入菌液作用24h后，采用淀粉培养基的培养产物处理的A549细胞发生显著的聚合、脱落、死亡。同样对Hela的试验，如图6也呈现相似的结果。
可以看出：对本发明提供的CCPM7643菌株，相比于空白对照，以及采用LB培养基，采用淀粉培养基的培养产物的抗癌活性更好。
如图显示，经过加入菌液作用24h后，相比于LB培养基，淀粉培养基的抗癌活性更好。淀粉是我们日常吃的食物的重要组成部分。虽然芽孢杆菌的常用培养基中的碳源主要为蔗糖和葡萄糖，但是为了模拟体内肠道细菌对食物中的多糖的分解环境，选用高氏一号培养基；芽孢杆菌的培养基的常用碳源为蔗糖和葡萄糖，选择淀粉，增加了菌体将多糖代谢为单糖的步骤，丰富了初级和次级代谢产物的种类。LB虽营养物质丰富，但是培养基的化学成分很不恒定；淀粉培养基组成成分精确，成分中的无机盐可以提供大量元素和微量元素。
LB培养基营养极为丰富，淀粉培养基营养贫瘠。令人震惊的是，这两株细菌由LB培养基长出来毫无抗癌作用，而由淀粉培养基生长出来，抗癌效果却异常突出。
综上说明从健康成人肠道中筛选出来的CCPM7643菌株对肿瘤细胞具有显著的抑制活性。尤其采用淀粉培养基培养而得的细菌制剂具有更显著的抗癌活性。
实施例5：抗癌组分分离和纯化
5.1对上清液进行高效液相色谱法进行分离纯化
高效液相色谱法：样品经0.22μm微孔滤膜过滤，流动相：乙腈：水(v:v，即体积比)＝3:7，色谱柱为zorboxXDB-C18(4.6mm×150mm，5μm即：管径为4.6毫米，柱长为150毫米，填充物粒径为5微米)；268nm紫外检测，柱温25℃，流速为1.0mL·min-1，进样量为10μL。
5.2代谢产物类别鉴定
将CCPM7643菌株从扩大培养基中划线到LB固体培养基上，并在14-39℃下生长过夜。取菌落接种于加入了5mL的LB液体培养基的14mL无菌培养管中，将其在14-39℃ 120转/分钟，培养12-13h。将培养后的菌液接种于550mL LB液体培养基中至在600nm 的初始光密度(OD600nm)为0.01。使用MultiFlo微孔板分配器(BioTek)将培养物分配到六个无菌的深孔96孔板(每孔0.9mL)中。随后，使用CyBi-Well自动液体转移机器人(CyBio) 从市售的502个成员的天然产物库(Enzo Scientific，目录号BML-2865)添加激发子。每个孔接收2.5μL的激发子(来自10mM的原液浓度)。用透气膜密封板，并在14-39℃，120转 /分钟，培养44h后，将板稍微离心，将上清液上样到96孔Strata C8树脂(Phenomenex) 上，将物质用600μL50％和600μL 100％的MeCN洗脱到新的96孔板中。然后将洗脱液在Speedvac(真空离心浓缩仪)中干燥，并重悬于30μL 40％的MeCN(水中)。
利用激光烧蚀电喷雾电离质谱法(LAESI-MS)对每个孔成像，并且鉴定该图像与来自对照孔的图像之间的差异。然后鉴定与一种或多种差异相关的测试化合物。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Figure BDA0002992479920000111
Figure BDA0002992479920000121
序列表
<110> 刘树林
<120> 与芽孢杆菌属近缘的厚壁菌门细菌菌株及其抗癌应用
<130> 19CN0488F
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 600
<212> DNA
<213> Phylum: Firmicutes(厚壁菌门)
<400> 1
atgaacttat cagatagtat tggactagcc ataatgacta tcatattaac tttcattaca 60
aatattgttt tcaaattaat acagaactca actgattttt tagttgataa gaaaaagttt 120
agaagagagc ataatttcgc tcaattgaaa aatctgtatt tagatttgta tggagtagta 180
tctcaatcag aatatcttag atattattca aagagataca gaaacatagg ctatgaattc 240
cgagcttatc ctttttttga aattatagag agagttaacg gcgaagagat taaaaacggg 300
ataacagaat tcaataaaca acaaatttgc gaaacaatta ttaagaaaag tcaatacgca 360
tctcaagaat tacttaaatt agctgtagct tataggtatg ttaatcacaa ttatttaaaa 420
gatcacagta aaaaagaaga tagggactct ttccagcaag aagagttaag gttaattgct 480
gcaattatta ataaaattgt agaggaatgc aatattttac tcaagaattg tcatatggat 540
tcaaacttaa aagaaattaa aacaaaaaag attgactatg actttttaga tgagatttaa 600
<210> 2
<211> 669
<212> DNA
<213> Phylum: Firmicutes(厚壁菌门)
<400> 2
atgattgagc atacgaatga acattcaatt agcttcatta catgtgtgaa tgacgatacc 60
ctttatgatc tctgtctaag acatattcaa tctctttcag tcccgccgca tatggatgta 120
gaaataatca atatccgaga tgcagacagt atggcctccg gctaccagaa agcaatgcag 180
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aaagtcattg aataccgcag cacgtacagt tatttatcat ttgaagaaat tggtcaaatt 420
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cgaaaagaga tttttgacgg ctggcattta tatgacactt ctcaatgctt tgagttcaga 540
aaaaaaggat atgtagtggg catcccttat caaaaaaatc catgggtctt acatgcatgc 600
ggtaatgagt ttgattcaca ccagtattct tattatcttg gtaaatttat tggtgaatat 660
ttacgttaa 669

Claims (13)

1.一种与芽孢杆菌属近缘的厚壁菌门细菌(Phylum：Firmicutes)菌株，其特征在于，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.17886。
2.一种与芽孢杆菌属近缘的厚壁菌门细菌(Phylum：Firmicutes)菌株，其特征在于，革兰氏染色呈阳性，需氧或兼性厌氧，有荚膜，芽孢椭圆、卵圆、柱状或圆形；与GenBank中已发表细菌序列进行比较，其全基因组序列与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的基因组序列一致性最高，但有明显差异，包含SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的两个特征性序列。
3.由权利要求1或2所述菌株产生的代谢产物。
4.一种抗癌细菌制剂，其特征在于，所述制剂权利要求1或2所述的菌株经扩大培养而得。
5.根据权利要求4所述的细菌制剂，其特征在于，是
(i).所述菌株的固体培养物或液体培养物；
(ii).(i)中的液体培养物经过固液分离得到的液体部分；或
(iii).(ii)中的所述液体部分经过进一步提纯得到的产物。
6.根据权利要求4或5所述的细菌制剂，其特征在于，所述培养基是淀粉培养基；优选地，所述淀粉培养基中所采用的淀粉来自谷物，或选自由马铃薯、玉蜀黍、大豆和小米组成的组的一种或多种。
7.权利要求3所述的代谢产物或权利要求4-6任一所述的细菌制剂的制备方法，其特征在于，包括将所述菌株接种至培养基中，在14℃至39℃环境下扩大培养。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述培养基是液体培养基，包括以下步骤：
(1)将所述菌株接种至液体培养基中，并以100至150转/分钟，优选120转/分钟的速度在14℃至39℃，例如15℃、20℃、25℃、30℃或35℃，培养2天至10天，优选5至8天，获得培养菌液；
(2)对所述培养菌液进行固液分离，取上清；
优选所述固液分离采用离心方式进行，优选的是，所述离心的离心速度为8000rpm，离心时间为10分钟。
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤
(1)从经过平板培养的培养基上取单菌落到5mL GRC001液体培养基中，120转/分钟，14℃至39℃，扩增2天至10天后，得到待扩大培养菌液；
(2)将5mL待扩大培养菌液菌液转移至100mL GRC001液体培养基中，120转/分钟，14℃至39℃，扩增2天至10天，得到扩大培养菌液；
(3)将扩大培养菌液8000rpm，离心10min，取上清液。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述液体培养基为GRC001液体培养基，配方如下：淀粉20重量份，KNO3 1重量份，K2HPO4 0.5重量份，MgSO4·7H2O 0.5重量份，NaCl 0.5重量份，FeSO4·7H2O 0.01重量份，重铬酸钾0.05重量份；
优选所述淀粉来自谷物，或来自由马铃薯、玉蜀黍、大豆和小米组成的组的一种或多种。
11.一种抗癌药物，其特征在于，所述抗癌药物的活性成分包含权利要求3所述的代谢产物，或权利要求4至6中任一项所述的细菌制剂。
12.权利要求1或2所述的菌株、权利要求3所述的代谢产物、权利要求4至6中任一项所述的细菌制剂、权利要求11所述的药物在抗癌中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述癌指肺癌、肝癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌或白血病，优选为卵巢癌。
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