HU197915B - Process for producing new antibiotic bbm-1675c and d with antitumor effect and pharmaceutical compositions comprising same - Google Patents

Process for producing new antibiotic bbm-1675c and d with antitumor effect and pharmaceutical compositions comprising same Download PDF

Info

Publication number
HU197915B
HU197915B HU863709A HU370986A HU197915B HU 197915 B HU197915 B HU 197915B HU 863709 A HU863709 A HU 863709A HU 370986 A HU370986 A HU 370986A HU 197915 B HU197915 B HU 197915B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
bbm
antibiotic
spectrum
methanol
acid
Prior art date
Application number
HU863709A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT44035A (en
Inventor
Jerzy Golik
Original Assignee
Bristol Myers Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bristol Myers Co filed Critical Bristol Myers Co
Publication of HUT44035A publication Critical patent/HUT44035A/hu
Publication of HU197915B publication Critical patent/HU197915B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/14—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to a sulfur, selenium or tellurium atom of a saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H11/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by inorganic acids; Metal salts thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/06—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/03—Actinomadura

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás új BBM-1675C és D tumor-ellenes antibiotikumok előállítására.
A találmány szerinti antibiotikumok pontos szerkezetét eddig még nem határoztuk meg, egyedülálló fizikai, kémiai és biológiai tulajdonságaik alapján azonban úgy véljük, hogy a BBM-1675C és BBM-1675D antibiotikumok új anyagok.
Az 1984. december 19-én közrebocsátott, 2 141 425 számú nagy-britanniai szabadalmi leírás szerint az Actinomadura verrucosospora H964-92 (ATCC 39334) vagy az Actinomadura verrucosospora Á1327Y (ATCC 39638) mikroorganizmus törzs fermentációja egy új tumor-ellenes antibiotikum komplexet eredményez, melyet BBM-1675-ként jelöltek. A BBM-1675-nek két, az említett szabadalmi bejelentésben leírt biológiailag aktív komponensét BBM-1675A,-nek és BBM-1675A2nek nevezték. A másnéven esperamicin Α,-ként illetve esperamicin A2-ként is ismert BBM-1675A, és BBM-1675A2 antibiotikumok szerkezetét még nem derítették fel, de mindkét komponens kiváló antimikrobális és tumorellenes hatást mutat.
A 4 530 835 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás egy WP-44 jelű (ATCC 39363), Actinomyces-fajként nem azonosított Actinomycete izolátum fermentá cióját ismerteti, melynek során a CL-1577A és CL-1577B jelű tumor-ellenes antibiotikumok keletkeztek. A CL-1577 antibiotikumok szerkezete egyelőre ugyancsak ismeretlen, de jellemző tulajdonságaik arra utalnak, hogy szerkezetileg a CL-1577A és CL-1577B antibiotikumok hasonlóak a BBM-1675 antibiotikumokhoz, különösen a fentemlített, a 2 141 425. számú nagy-britanniai szabadalmi leírásban szereplő BBM1675A, és A2 antibiotikumokhoz.
R.H. Bunge és munkatársai a J. Antibiotics, 37(12), 1566-1571 (1984) folyóiratban megjelent cikke az Actinomadura sp. (ATCC 39363) fermentációjával foglalkozik, mely két nagyobb komponenst, a PD 114 759 és a PD 115 028 komponenseket, eredményezte. A.J. Chem. Soc. Chem. Commun. 919—920 (1985) folyóiratban Wilton és munkatársai részben azonosították a PD 114 759 és a PD 155 028 antibiotikumok szerkezetét. A PD 114 759 és PD 115 028 antibiotikumok termelése, izolálása és jellemzői azonosnak tűnnek a fent említett CL-1577A, illetve CL-1577B antibiotikumok megfelelő paramétereivel.
A 95 154 számon közrebocsátott európai szabalmi bejelentés szerint Actinomadura pulveraceus sp. nov. No.6049 (ATCC 39100) fermentációja a WS 6049-A és WS 6049-B jelű tumor-ellenes antibiotikumok keletkezéséhez vezet. A WS 6049 antibiotikumok szerkezetét még nem derítették fel, de megadott jellemző tulajdonságaik azt mutatják, hogy a WS 6049-A és WS 6049-B szerkezetileg rokon a 2 141 425 számú nagy-britanniai szabadalmi bejelentésben szereplő BBM-1675 2 antibiotikumokkal és a 4 530 835 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett CL-1577 antibiotikumokkal. A spektrális adatok azonban azt is világosan mutatják, hogy sem a WS 6049-A sem a WS 6049-B nem azonos egyik BBM-1675 komponenssel sem. Ezen kívül, a 95 154 számú európai szabadalmi bejelentésben szereplő termelő mikroorganizmus egyértelműen eltér a 2 141 425 számú nagy-britanniai szabadalmi leírásban használt Actinomadura verrucosospora mikroorganizmustól, a 2.,
3. és 4. számú ISP táptalajokon nőtt légmicélium színében, pozitív tej peptonizációjában és pozitív D-fruktóz, D-mannit, trehalóz és cellulóz hasznosításában.
A találmány olyan új tumor-ellenes, BBM-1675C-nek és BBM-1675D-nek (vagy másnéven BMY-27305-nek és BMY-27307nek) nevezett antibiotikumok előállítására vonatkozik, amelyek a BBM-1675A, (esperamicin A,) vagy a BBM-1675A2 (esperamicin A2) szelektív kémiai hidrolízisével keletkeznek, míg az utóbbiakat az Actinomadura verrucosospora egy BBM-1675 termelő törzse termeli. A BBM-1675C és BBM-1675D bioaktív anyagok, szokásos kromatográfiás eljárásokkal különíthetők el és tisztíthatók, és mindkét anyag kiváló antimikrobiális és tumor-ellenes hatást mutat.
Rájzismertetés
1. ábra: a BBM-1675C ultraibolya abszorpciós spektruma
2.ábra: a BBM-1675D ultraibolya abszorpciós spektruma
3. ábra: a BBM-1675C infravörös abszorpciós spektruma (KBr, film) a BBM-1675D infravörös abszorp-
4. ábra:
ciós spektruma (film) 'a
5. ábra: a BBM-1675C relatív eloszlási tömegspektruma
5. ábra: a BBM-1675D relatív eloszlási tömegspektruma e
7. ábra: a BBM-1675C CDC13 - bán (360 MHz) felvett proton mágneses rezonancia spektruma
8. ábra: a BBM-1675D CDCI3-ben (360 MHz) felvett proton mágneses rezonancia spektruma
9. ábra: a BBM-1675C CDC1S - bán (90,6 MHz) felvett ,3C mágneses rezonancia spektruma
10a. ábra: a BBM-1675D CDC13 + 10%
CD3OD-ben (90,6 MHz) felvett 13C mágneses rezonancia spektruma (110—200 ppm)
10b. ábra: a BBM-1675D CDC13 + 10%
CD3OD (90,6 MHz) felvett I3C mágneses rezonancia spektruma (0—110 ppm) i la. éhra: a 3A vegyület (alfa-anomer) proton mágneses rezonancia spektruma CDCI3-ban (360 MHz)
Slb. ábra: a 3B vegyület (béta-anomer) proton mágneses rezonancia spektruma CDCl3-ban (360 MHz).
-2197915
A találmány tárgya eljárás az új BBM-1675C, illetve BBM-1675D, vagy másnéven BMY-27305, illetve BMY-27307 tumor-ellenes antibiotikumok előállítására a BBM-I675A, (esperamicin A,) vagy BBM-1675AJ (esperamicin A2) bioaktív komponensek szelektív kémiai hidrolízisével. Az utóbbiak előállítása az Actinomadura verrucosospora egy BBM-1675 termelő törzsének, előnyösen az Actinomadura verrucosospora A1327Y (ATCC 39638) törzsnek vagy ennek valamilyen mutánsa tenyésztésével történik. Közelebbről, a találmány a BBM-1675C előállítására vonatkozik a BBM-1675A, vagy BBM-1675A2 bioaktív komponens szelektív kémiai hidrolízisével. A találmány ezen kívül kiterjed a BBM-1675D előállítására a BBM-1675C vagy — még előnyösebben — a BBM-1675A, vagy BBM-1675A2 bioaktív komponensek szelektív hidrolízisével. A BBM-1675C és BBM-1675D komponensek szokásos kromatográfiás eljárásokkal különíthetők el a reakcióelegyből és tisztíthatók.
A BBM-1675C és a BBM-1675D bioaktív anyagok a mikroorganizmusok széles skálájával szemben antimikrobiális hatást mutatnak, és különböző egér tumor rendszerekben, például P-388 leukémia és B16 melanoma esetében gátló hatást fejtenek ki. A találmány szerint előállított új anyagok ezért antimikrobiális vagy tumor-ellenes, emlősök tumorainak kezelésére alkalmas szerekként hasznosíthatók.
A BBM-1675A, (esperamicin A,) illetve a BBM-1675A2 (esperamicin A2) szerkezetének felderítését célzó degradációs vizsgálatok során olyan komponens-elegy keletkezett, amely két inaktív komponens, az 1. illetve
2. képletű vegyületek izolálásához és azonosításához vezetett. Meglepő módoii azt találtuk azonban, hogy a kémiai degradáció két bioaktív fragmentum, a BBM-1675C és a BBM-1675D lépcsőzetes felszabadulásához vezetett.
Még meglepőbb volt, hogy a két különböző antibiotikum, a BBM-1675A, és A2 azonos bioaktív fragmentumokat eredményeztek, amint ez az 1. reakcióvázlaton látható. Még ennél is meglepőbb, hogy a kisebb molekulatömegű BBM-1675C és D fragmentumokat (amelyek molekulatömege a BBM-1675A,, illetve A2 antibiotikumok molekulatömegének mintegy 70, illetve 55%-a) hatékonyabbnak találtuk, mint a BBM-1675A2-t és hatásukban összevethetőnek a BBM-1675A, gyei, mind a tumor-ellenes, mind az antimikrobiális hatás tekintetében.
A BBM-1675C és a BBM-1675D a BBM-1675A, antibiotikum szelektív kémiai hidrolízisével állítható elő a 2. reakcióvázlaton szemléltetett módon.
A kiindulási BBM-1675A, vegyület előállítása a 2 141 425 számú közrebocsátott nagy-britanniai szabadalmi leírásban ismertetett eljárással történik. A tisztított BBM1675A! komponenst egy ásványi vagy egy szerves savval, például hidrogén-kloriddal, kénsavval, p-toluol-szulfonsavval, benzol-szulfon savval hidrolizáljuk, szerves oldószerben vagy vizes-szerves oldószer elegyében, körülbelül 0°C és az alkalmazott oldószer visszafolyási hőmérséklete közötti hőmérsékleten, míg a kívánt BBM-1675C vagy BBM-1675D jelentős mennyiségben nem keletkezik. A hidrolízist előnyösen 1—6 szénatomos alkoholokban, legelőnyösebben metanolban végezzük. A reakcióhőmérséklet nem kritikus, de a reagáltatást előnyösen szobahőmérséklet és 60°C között, legelőnyösebben 40—60°C-on végezzük.
A BBM-1675A, szelektív hidrolízise lépcsőzetesen megy végbe, melynek első lépésében a BBM-1675C antibiotikum és az 1. képletű inaktív fragmentum keletkezik. A hidrolízis továbbfolytatása azonos körülmények között a 3. képletű tio-cukor alfa- és béta-anomerjei elegyének felszabadulásához és a BBM-1675D antibiotikum keletkezéséhez vezet. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a reakciókörülmények, így az idő, a hőmérséklet és a savkoncentráció megváltozása a BBM-1675C és D antibiotikumok keletkezési arányának megváltozásához vezet. így célszerű a reakció előrehaladását — a későbbi példákban szemléltetett módon — vékonyréteg-kromatográfiásan követni.
Ha a cél kizárólag a BBM-1675D antibiotikum előállítása a szelektív hidrolízist előnyösen egy szerves savval, például p-toluol-szulfonsavval végezzük, és így a BBM-1675D kvantitatív mennyiséghez jutunk.
A BBM-1675C és BBM-1675D anyagok a BBM-1675A2 antibiotikum szelektív kémiai hidrolízisével is előá 11 íthatők, a 3. reakcióvázlaton bemutatott módon.
A BBM-1675A2 kiindulási anyag előállítása a 2 141 425. számú közrebocsátott nagy-britanniai szabadalmi leírás szerint történik. A tisztított BBM-1675A2 szelektív hidrolízise szintén lépcsőzetesen zajlik, és először a BBM-1675C antibiotikumot, és a 2. képletü inaktív fragmentumot eredményezi. A további hidrolízis a 3. képletü tio-cukor alfa- és béta-anomerjei elegyének felszabadulásához és a BBM-1675D antibiotikum keletkezéséhez vezet.
A BBM-1675A2 szelektív kémiai hidrolíziséhez alkalmazott reakciókörülmények lényegében azonosan a BBM-1675A, hidrolízisével kapcsolatban a fentiekben részletezett körülményekkel. A BBM-1675D BBM-1675A,ből történő előállításához hasonlóan, ha csak BBM-1675D antibiotikumot kívánunk előállítani, a BBM-1675A2 hidrolízisét addig végezzük, amíg lényegében minden BBM-1675A2 és BBM-1675C BBM-1675D-vé alakul. A hidrolízist legelőnyösebben egy szerves savval, >gy p-toluol-szulfonsavval hajtjuk végre.
Az a felismerés, hogy ugyanazok a BBM-1675C és D antibiotikumok keletkeznek két különböző antibiotikumból, a BBM-1675A,-ből 3
-3197915 és a BBM-1675A2-ből, két inaktív fragmentum, az 1. és 2. képletű fragmentumok és a
3. képletű tio-cukor egyidejű keletkezése mellett, a találmány szerinti eljárás további előnyét jelenti. Ennék megfelelően, a találmány 5 további tárgya eljárás a BBM-1675A, és A2 elegyének szelektív hidrolízisére a BBM-1675C és D előállítására, a 4. reakcióváziaion szemléltetett módon.
Ez az előny nyilvánvalóvá válik, ha meggondoljuk, hogy a fermentáció során keletkezett BBM-1675A, és A2 relatív mennyisége változó. A BBM-1675C és D termelés tehát független a BBM-1675A, és A2 kiindulási 15 anyagok relatív mennyiségétől.
Mint említettük, a BBM-l675A,,A2 és C antibiotikumok hidrolízise egy inaktív tio-cukor fragmentum felszabadulásához vezet. Ezt a tio-cukrot izoláltuk, annak érdekében, hogy 20 további információhoz jussunk a BBM-1675C, és ezen keresztül a BM-1675A, és A2 antibiotikumok szerkezetével kapcsolatban. A 3. képletű vegyület egy olyan tio-cukor alfa- és béta-anomerjeinek elegyeként azonosítottuk, 25 amelyek szerkezetét a 2. és 3. reakcióvázlaton mutatjuk be. A további jellemzésre akkor volt lehetőség, amikor az alkoholizis termékeit, al alfa- és béta-anomereket elkülönítettük. A 3A képletű vegyület (alfa-ano- 30 mer) és a 3B képletű vegyület (béta-anomer) proton mágneses rezonancia spektrumát (360 MHz) a 11A és 1 IB ábrákon mutatjuk be. A spektrum adatok analízise alapján a 3. képletű tio-cukor metil-glikozidoknak a (III) képlet szerinti sztereokémiái szerkezetet tulajdonítjuk. Egyelőre az abszolút konfigurációt, tehát, hogy D vagy L konfiguráció-e, még nem határoztuk meg. Ennek megfelelően, a spektrum adatok jelenlegi kiértékeléséből kiindulva arra a következtetésre jutottunk, hogy a 3. képletü tio-cukor (kivéve az anomer metoxicsoport CH3 csoportját, amely a metanolízis során épül be) a BBM-1675C és, ezen keresztül, a kiindulási BBM-1675At és A2 antibiotikumok szerkezeti eleme.
A BBM-1675C fizikai kémiai tulajdonságai
Megjelenés: amorf szilárd anyag
Ultraibolya abszorpciós spektrum: lásd Lábra eszköz: Hewlett-Packard 8458 oldószer: metanol koncentráció: 0,0155 g/1 max. (nm) abszorpciók
210 21 770
274 9 340
313 sh (váll) 4 190
Sav vagy bázis hatására nincs szignifikáns változás.
Infravörös abszorpciós spektrum: lásd 3.ábra eszköz: Nicolex 5DX FT-IR
Fő abszorpciós sávok (KBr, film): 540, 740, 955,990, 1017, 1065, 1080, 1118, 1150, 1250, 1305, 1325, 1340, 1370, 1385, 1440, 1690, 1705, '735, 2900, 2920, 2930, 2970, 3450 cm-1 Tömegspektrum: lásd 5. ábra eszköz: Finigan 4500 TSQ módszer: gyors atom bombázás (FAB) ionizáció
Mátrix m/z Mólekula ion Relatív abundancia
glicerin 856 LM+h]++ 100%
glicerin + NaCl 878 [M+Na] 100%
dithiotreitol:ditioerit-
ritol 856 [μ+ηΓ 100%
(3:1) (s:s) eszköz: Kratos MS-50 nagy feloldóképességű FAB (m/z):
[M+H] +=856,3362 molekulatömeg: vélhetően m.s. = 855 (a fenti tömegspektrum adatokra alapozva) Elemösszetétel: C36H6|N3Oi4S3 (a fenti nagy-feloldású adatokra alapozva) Proton mágneses rezonancia spektrum: lásd
7. ábra eszköz: WM 360 Bruker oldószer: CDC13
Ή NMR 360 MHz δ (ppm): 6,54 (1H, dd, J=7,7, 7,0); 6,21 (1H, brs); 5,87 (1H, d, J=9,6); 5,78 (1H, dd, J=9,6, 1,5); 5,66 (1H, brd, J=2,9); 4,94 (1H, dd, J=10,3, 1,8); 4,61 (1H, d, J=7,7); 4,25 (1H, s); 4,09 (1H, 4 q; J=2,6); 3,97 (1H, t, J=9,6); 3,92—3,53 (10H), 3,45 (1H, dt, J=10,3, 4,0); 3,37 (3H, s); 2,77 (IH, m); 2,69 (1H, dt, J=9,9, 5,2);
2.49 (IH, dd, J=10,3, 2,6); 2,48 (3H, s); 55 2,30 (2H, m); 2,13 (IH, m); 2,09 (3H, s);
1.50 (2H, m); 1,37 (3H, d, J=5,9); 1,32 (3H, d, J=6,3); 1,08 (6H).
HC mágneses rezonancia spektrum: lásd
9. ábra eszköz: WM 360 Bruker oldószer: CDC13 ,3C NMR 90,6 MHz δ (ppm): 13,7, 17,5,
19,8, 22,3, 22,7, 23,5, 34,2, 35,2, 39,5, 47,7,
52.7, 55,8, 56,1, 57,7, 62,4, 64,7, 67,4, 69,3,
69.8, 71,9, 76,1, 77,1, 77,7, 79,7, 83,2, 88,4, bí> 97,3, 99,7, 123,4, 124,6, 130,1, 193,1.
-4197915
A BBM-1675D fizikai-kémiai tulajdonságai Megjelenés: amorf szilárd anyag Ultraibolya abszorpciós spektrum:lásd2.ábra eszköz: Hawlett-Packard 8458 oldószer: metanol koncentráció:
max.(nm)
214
274
325
0,01 g/l abszorpciók 27 000 12 800 5 400
Sav vagy bázis hatására nincs szignifikáns változás:
Infravörös abszorpciós spektrum:lásd4.ábra eszközök: Nicolet 5DX FT-IR
Fő abszorpciós sávok (KBr, film): 735, 755, 910, 960, 1000, 1020, 1085, 1150, 1195, 1250, 1310, 1335, 1365, 1385, 1445, 1510, 1685, 1720, 1735, 2880, 2930, 2960, 3400 cmTömegspektrum: lásd 6. ábra eszköz: Finigan 4500 TSQ módszer: gyors atom bombázás (FAB) ionizáció mátrix: tioglicerol molekuláris ion (m/z): [M+H]^=696 relatív abundancia: 100% eszköz: Kratos MS-50 nagy feloldáséi FAB (m/z):
[M-f-H] +=696,2794 molekulatömeg: vélhetően m.s. = 695 (a fenti tömegspektrum adatokra alapozva) Elemösszetétel: C29H49N3OI2S2 (a fenti nagy feloldáséi adatára alapozva)
Az [M+H] + és [ (M+H) +2]+ relatív abudanciák korrelációja számított értékükkel igazolja a nagy feloldású-FAB mérésekből kapott elem-összetételt.
Proton mágneses rezonancia spektrum: lásd
8. ábra eszköz: WM 360 Bruker oldószer: CDC13+IO% CD3OD ’H NMR 360 MHz δ (ppm): 6,43 (1H, dd, J=4,4, 10,3); 6,13 (1H, s); 5,81 (1H, d, J= =8,8); 5,70 (1H, d, J=8,8); 5,48 (1H, 6 brs); 4,48 (1H, d, J=8,l); 4,02 (1H, d, J=2,0);
3,95—3,80 (oldószer háttér); 3,77 (IH, t,
J=9,0); 3,70—3,40 (11H, brm); 3,35 (IH, m); 3,28 (3H, s); 3,22 (3H, brs); 2,66—2,55 (2H, m); 2,38 (3H, s); 2,23—2,12 (2H, m); 1,42 (IH, brdt); 1,22 (3H, d, J=5,9); 0,94 (3H, d, J=6,6); 0,87 (3H, d, J=5,9).
13C mágneses rezonancia spektrum: lásd 10A és 10B ábrák eszköz: WM 360 Bruker oldószer: CDCI3+10% CD3OD ,3C NMR 90,6 MHz δ (ppm): 17,5, 21,6,
22.2, 23,0, 33,4, 39,2, 46,4, 52,3, 55,8, 62,1,
67.8, 69,8, 70,1, 71,3, 75,8, 77,1, 78,1, 82,4,
83.3, 88,2, 97,4, 99,6, 122,6, 124,8, 130,1,
130.8, 134,3, 148,7, 192,8.
A BBM-1675 anyagok biológiai tulajdonságai
A BBM-1675 anyagok antimikrobiális hatását számos Gram-pozitív és Gram-negativ mikroorganizmussal szemben vizsgáltuk. Az I. táblázat egy olyan antimikrobiális szűrő eljárás eredményeit mutatja, amelyben a kiindulási BBM-1675A, komponens és a találmány szerinti BBM-1675C és BBM-1675D anyagok hatását vizsgáltuk. A vizsgálati eljárás során minden vizsgált anyag egységesen 10 gg/ml koncentrációjéi oldatával átitattunk egy papír csíkot, majd ezt a növesztett tenyészetbe helyeztük, és az antibiotikus aktivitás mértékéül a papír csíkon megfigyelt gátlási zónát választottuk. Mint az I. táblázat adataiból látható, a BBM-1675C és D széles spektrumú antimikrobiális hatást mutatott, amely mértékében legalább megegye40 zett a BBM-1675A, komponens hatásával: sőt a BBM-1675C és D anyagok hatékonyabbnak bizonyultak a Gram-negatív mikroorganizmusok inhibitoraiként.
I. táblázat
Vizsgált mikroorganizmus a gátlás zónája (mm)
BBM- -1675Ai BBM-1675C BBM-1675D
Escherichia coli AS 19 22 52 51
Escherichia coli K 12 13 36 35
Escherichia coli P 1373 12 34 33
Escherichia coli R Az aseriné 14 35 34
Escherichia coli R Netrops in 1 1 32 32
Escherichia coli R Mitomycin C 12 35 34
Escherichia coli R Bleomycin 16 38 36
Escherichia coli R Daunomyc in 19 45 44
Escherichia coli R Neomycin 24 53 52
Escherichia coli RSibiromycin 14 32 30
Escherichia coli R Hedamycin 14 30 25
Escherichia coli R. Aclacinomycin 15 41 40
Bacillus subtilis ATCC 6633 34 43 41
Klebsiella pneumoniae 17 35 35
-5197915
10
I. táblázat (folytatás)
Vizsgált mikroorganizmus BBM-1675Ai a gátlás BBM-1675C zónája (mm) BBM-1675D
Staphylococcus 209 P 32 47 44
Staphylococcus E. Actinoleukin 33 35 33
Staphylococcus R. Streptonigrin 37 50 48
Staphylococcus faecalís P1377 30 39 38
Streptococcus aureus Smith P 36 47 45
Strapylococcus aureus Smith R 40 55 53
Actinomycin D
Straphylococcus aureus Smith R 1 7 32 31
Aureolic acid
Ac inetobacter 16 33 32
tlicrococcus luteus 35 57 55
Saccharoiayces cerevisiae petite 22 42 43
R = rezisztens az adott antibiotikummal szemben
A P-388 leukémiával szembeni hatás A II. és III. táblázatban közöljük azokon a CDF, egereken kapott kísérleti eredményeket, amelyekbe ÍO6 P-388 leukémia ascites sejtet implantáltunk intraperitoneálisan, tumor inokulum formájában, és amelyeket a BBM-1675A,, C vagy D anyagok különböző dózisaival kezeltünk. A vizsgált anyagokat intraperitoneális injekció formájában adagoltuk. Minden dózis esetében hat egérből álló csoportokat kezeltünk, és a kezelést az inokulációt követő napon egyetlen dózissal végeztük. Az egyes kísérleti sorozatokban kontrollként tíz, konyhasó-oldattal kezelt egeret használtunk. A BBM-l675A,-gyel kezelt csoportot a III. táblázatban közvetlen kontrollként tüntetjük fel. Az állatokat 30 napig figyeltük, minden egér csoportra meghatározva az átlagos túlélési időt, és feljegyeztük az 5-napos periódus végén még életben lévő állatok számát. Az egereket a kezelés előtt, majd a negyedik napon ismét megmértük. A tömegváltozást a gyógyszer toxicitása mértékének tekintettük. 20 g tömegű egereket használtunk, és a kb. 2 g-ig terjedő tömegveszteséget nem tekintettük jellemzőnek. A vivőanyaggal kezelt állatok (kontroll) rendszerint kilenc napon belül elhullottak. Az eredményeket T/C % formájában határoz25 tűk meg, ami a kezelt csoport átlagos túlélési idejének aránya a vivőanyaggal kezelt kontroll csoportéhoz viszonyítva, százalékban kifejezve. Egy 125-el azonos vagy ennél nanyobb T/C % érték arra utal, hogy szignifikáns tumor-ellenes hatás jelentkezett. A II. táblázatban megadott vizsgálati eredmények a BBM-1675C anyag kezdetben váratlan szin35 tű tumor-ellenes hatását mutatják. A III. táblázatban a BBM-1675A, (esperamicin A,) és a BBM-1675C és D anyagok közvetlen összehasonlításának adatait tüntetjük fel. Az adatok azt mutatják, hogy a BBM-1675C hatásában körülbelül összevethető a BBM-1675A, hatásával, mind erősségét, mind antitumor hatását tekintve, és a hatás nem függ a kísérleti sorozattól. A BBM-1675D pedig csak kismértékben kevésbé hatékony.
Ezen felül, a találmány szerint a BBM1675C és BBM-1675D anyagok a BBM1675A2 (esperamicin A2) komponensből is előállíthatok. A saját, BBM-1675C és BBM1675D anyagra kapott vizsgálati eredményeink és a 2 141 425. számú nagy-britanniai szabadalmi leírásban közzétett adatok összevetéséből az a meglepő tény tűnik ki, hogy a BBM-1675C és D hatékonyabb tumor-ellenes szerek, mint a kiindulási BBM-1675A2 komponens, amelyből származnak.
-6197915
II. táblázat
A BBM-1675C hatása P-388 leukémiára 1 . napi kezelés
Dózis IP MST MST hatás AWC túlélők
Vegyület mg/kg/inj. napok % T/C 4. nap 5. nap
BBM-1675C 3,2 TOX TOX 0/6
0,8 TOX TOX 0/6
0,2 TOX • TOX 0/6
0,05 TOX TOX -1,8 1/6
0,0125 11,0 122 -2,5 5/6
0,003125 13,5 150 -2,5 6/6
Vivöanyag 9,0 100 0,4 10/10
Tumor inokulum: 106 ascites sejt i.p . implantálva
Gazda: CDFj hím egerek
Kiértékelés: MST= a túlélési idő közepéiteké
Hatás: % T/C = (MST kezelt/MST kontroll) x 100
Feltetel: 2 T/C 125-et tekintjük s zignifikans anti-tumor hatásnak<
AWC: átlagos tömegváltozás (kezelt - kontroll) g-ban (a 4. napon)
TOX: toxikus adag (6 egérből nem maradt legalább 4 túlélő)
III. táblázat
A BBM-1675 anyagok batasa P-388 leukémiára
Vegyület Kezele'sí mód Dozzis IP mg/kg/inj. MST napok MST hatás AWC 4. nap Túlélők 5. nap
BBM-1675Ai d. 1 0,0512 TOX TOX 0/6
0,0256 TOX TOX - 0/6
0,0128 TOX TOX -1,8 3/6
0,0064 15,5 1 72 -0,3 6/6
0,0032 15,0 167 -0,6 6/6
0,0016 15,5 1 72 0,6 6/6
0,0008 12,5 139 0,3 6/6
0,0004 12,0 133 1,4 6/6
0,0002 1 1,0 122 0,8 6/6
0,0001 11,5 128 1,4 6/6
BBM-1675C d. 1 0,0256 TOX TOX - 0/6
0,0128 TOX TOX -0,8 3/6
0,0064 11,5 128 -0,3 6/6
0,0032 14,5 161 -0,1 6/6
0,0016 10,5 117 0,0 6/6
0,0008 12,0 133 0,3 6/6
0,0004 11,5 128 0,8 6/6
0,0002 11,0 122 1,4 6/6
0,0001 11,0 122 0,8 6/6
0,0005 10,5 1 1 7 1,3 6/6
BBM-1675D d. 1 0,0256 9,0 100 0,1 6/6
0,0128 11,5 128 0,3 6/6
0,0064 12,5 139 0,3 6/6
0,0032 12,0 133 0,1 6/6
0,0016 11,5 128 0,8 6/6
0,0008 10,0 1 1 1 0,2 6/6
-7197915
III. táblázat (folytatás)
A BBM-1675 anyagok hatása P-388 leukémiára
Kezelési Dózis IP MST MSI AWC Túlélők
Vegyület mo'd mg/kg/inj. na pok ha itás 4. nap 5. nap
0,0004 10,0 11 1 0,5 6/6
0,0002 9,5 106 1,7 6/6
0,0001 9,5 106 1,7 6/6
0,00005 9,0 100 2,0 6/6
BBM-1675C d. 1 5 0,0032 16,0 178 -1,3 6/6
0,0016 13,5 150 -0,3 6/6
0,0003 13,5 150 -0,3 6/6
0,0004 12,0 133 -0,4 6/6
0,0002 12,0 133 -0,4 6/6
0,0001 1 1,0 122 -0,4 5/6
0,00005 11,0 122 0,9 6/6
0,000025 8,5 94 2,2 6/6
0,0000125 8,0 89 2,4 6/6
0,00000625 8,0 89 2,4 6/6
Vivőanyag - 9,0 100 2,4 10/10
Tumor inokulum: 105 ascites cells i.p. implantálva
Gazda: CDFi nőstény egér
Kie'rtékelés: MST = túlélési idő középértéke
Hatás: 7. T/C = (MST kezelt/MST kontroll) x 100
Feltétel: T/C ^125-et tekintjük szignifikáns anti-tumor hatásnak
AWC: átlagos tömegváltozás (kezelt-kontroll) g (a 4. napon) d.1. csak a kísérlet 1. napján beadott adag
d. 1-5: a kísérletnek mind az 5 napján beadott adag
A B16 melanomával szembeni aktivitás 40
A IV. táblázatban olyan tumor-ellenes vizsgálatok eredményeit foglaljuk össze, amelyeket egérben nőtt B16 melanomán végeztünk. A vizsgálatokhoz BDF, egereket használtunk, amelyeket szubkután úton inokuláltünk a tumor implantátummal. 60 napos jegyzőkönyvet használtunk. Minden vizsgált dózisra tíz egérből álló csoportokat használtunk, és meghatároztuk az egyes csoportok esetében az átlagos túlélési időt. A kontroll 50 állatok, amelyeket a kezelt állatokkal azonos módon, de injekciós vivőanyaggal inokulálIV. táblázat
A BBM-1675 anyagok hatása
1,5 es 9. napi k *unk, 22,5 napos átlagos túlélési időt mutattak. Minden dózis esetében a vizsgált állagokat intraperitoneális injekció formájában az I., 5. és 9. napon kezeltük a vizsgált vegyületekkel. A 125-tel azonos vagy ennél nagyobb T/C % érték azt jelenti, hogy szignifikáns + umor-ellenes hatást értünk el. A IV. táblázatban feltüntetett eredmények azt mutatják, hogy a BBM-1675C közvetlen összehasonlí'ásban a B16 melanomát hordozó egerek esetében is hatékony volt, és hatása összevethető volt a BBM-1675A, hatásával.
B16 melanomára zelesek
Vegyület Dózis mg/kg/inj. MST napok MST hatás AWC 12. nap túlélők 10. nap
BBM-1 675Ai 0,0032 37,5 167 0,3 10/10
0,0016 37,5 167 0,3 10/10
-8197915
IV. táblázat (folytatás)
Vegyület Dózis mg/kg/inj. MST napok MST hatás AWC 12. nap túlélők 10. nap
0,0008 38,5 171 1,4 10/10
0,0004 37,0 164 1,8 10/10·
0,0002 34,5 153 2,0 10/10
0,0001 32,0 142 1,9 10/10
BBM-1675C 0,0008 31,5 140 0,6 10/10
0,0004 37,0 164 1,2 10/10
0,0002 31,0 138 0,6 10/10
0,0001 31,5 140 1,0 10/10
0,00005 27,5 122 0,8 10/10
0,000025 25,0 111 0,5 10/10
Vivöanyag — 22,5 100 0,3 10/10
Tumor inokulum: 0,5 ml 10% brei IP
Gazda: BDFi nőstény eger
Kiértékele's: MST = középes túlélési idő
Hatás: % T/C = (MST kezelt/MST kontroll) x 100
Feltelel: % T/C 7/ 125-et szignifikáns tumorellenes aktivitásnak tekintjük. AUC: átlagos tömegváltozás (kezelt-kontroll) g (a 12. napon)
Amint a fentiekben ismertetett antimikro- 30 biális és egér tumor adatok mutatják, a BBM-1675C és BBM-1675D hasznos antibiotikumok fertőző betegségben szenvedő emlősök és más állatok kezelésében, és egyben tumor-ellenes szerek, amelyek terápiásán gá- 35 tolják emlősök tumorainak növekedését.
Ezért a találmány szerinti vegyületek alkalmasak mikrobiális fertőzésben szenvedő állatok vagy rosszindulatú daganatot hor- 40 dozó állatok kezelésére, amely abban áll, hogy az állatokat a BBM-1675C vagy BBM-1675D antimikrobiális vagy tumor-ellenes hatás szempontjából hatásos mennyiségével vagy egy megfelelő gyógyszerkészítménnyel 45 kezeljük.
A találmány kiterjed olyan gyógyszerké: szítmények előállítására is, amelyek a BBM-1675C vagy a BBM-1675D hatásos antimik- 50 robiális vagy tumorgátló mennyiségét tartalmazzák, inért, gyógyászatilag elfogadható vivőanyagok vagy hígítóanyagok kíséretében. Az ilyen készítmények egyéb hatásos antimikrobiális vagy tumor-ellenes szereket 55 is tartalmazhatnak, és kiszerelhetők bármely, a kívánt adagolási módnak megfelelő gyógyszerkészítmény formájában, ilyen készítmények lehetnek például szilárd, orális adagolásra alkalmas készítmények, így tabletták, θθ kapszulák, pirulák, porok és granulátumok, orális adagolásra alkalmas folyékony készítmények, így oldatok, szuszpenziók, szirupok vagy elixirek, és parenterális adagolásra alkalmas készítmények, így steril vizes vagy nem-vizes oldatok, szuszpenziók vagy emuiziók. Kiszerelhetők olyan steril szilárd készítmények formájában is, amelyek steril vízben fiziológiás sóoldatban vagy más steril, injektálható közegben közvetlenül alkalmazás előtt feloldhatók.
Antimikrobiális szerként történő felhasználásra a BBM-1675C-Í vagy BBM-1675D-Í vagy ezeket tartalmazó gyógyszerkészítményeket úgy adagoljuk, hogy a hatóanyag-koncentráció nagyobb legyen, mint a kezelni kívánt szervezet esetében a minimális gátló koncentráció. Tumor-ellenes szerként a BBM-1675C és BBM-1675D optimális dózisait egy adott emlős esetében szakember könnyen meghatározhatja. Természetesen a BBM-I675C és a BBM-1675D aktuális dózisa az adott készítménynek, az adagolás módjának és az adott állapotnak, gazda szervezetnek és a kezelni kívánt betegségnek megfelelően széles határok között változhat. Sok a gyógyszer hatását befolyásoló tényezőt, így a kort, súlyt, a kezelt állat nemét, az etetésre használt táplálékot, az adagolás idejét, az adagolás módját, a kiválasztás sebességét, a beteg állapotát, a gyógyszer kombinációkat, a reakció érzékenységét és a betegség súlyosságát is figyelembe kell venni. Az adagolás történhet folyamatosan vagy szakaszosan, a maximálisan elviselhető dózison belül. Adott körülmények között az optimális adagolási mód és dózisok megállapítása szakember számára nem okoz problémát, a fenti útmutatások és szokásos vizsgálatok alapján.
Találmányunkat a következő példákkal szemléltetjük.
-9197915
A BBM-1675C és a BBM-1675D kémiai előállítása és izolálása
1. példa
A BBM-1675A, 50 mg-os mintáját feloldjuk 2,5 ml metanolban, majd hozzáadják hidrogén-klorid 0,1 mólos metanolos oldatának 2,5 ml-ét. A reagáltatást körülbelül 50°C-on végezzük, és a kiindulási anyag eltűnését (körülbelül 30 perc) minden 5—10 percben vékonyréteg-kromatográfiásan (TLC) követjük, szilikagél lapon (Analtech, 250 mikron, GF), az eluáláshoz toluol és aceton 3:2 térfogatarányú elegyét használva. Miután a kiindulási anyag elfogyott, a reakcióelegyet nátrium-hidrogén-karbonát telített metanolos oldatával semlegesítjük, majd csökkentett nyomáson bepároljuk A kapott száraz maradék tartalmazza a bioaktív fragmentumokat. A BMM-1675C-Í „flash“ oszlop-kromatográfiás módszerrel, egy 2 cm belső átmérőjű, 10 cm-es, Woelm szilikagéllel töltött (32—63 mikronos részecske méret) oszlopon izoláljuk a maradékból. Az oszlopot toluol és aceton 3:2 térfogatarányú elegyével eluáljuk, 3 ml-es frakciókat gyűjtve. Minden frakciót TLC-ve! analizálunk (szilikagél, toluohaceton 3:2 tf/tf), és a TLC foltokat 24 nm-es UV fényforrással és ce'rium-szulfát-spray-vel (1% cérium-szulfát és 2,5% molibdénsav 10%-os kénsavban) tesszük láthatóvá. A 6—12. frakciókat összegyűjtjük (Ráérték a BBM-1675Cre 0,28), és szárazra pároljuk. 12 mg (35%) lényegében tiszta BBM-1675C-t kapunk.
A BBM-1675C fizikai-kémiai tulajdonságait már megadtuk a leírásban, az ultraibolya, infravörös, tömeg, ’H-NMR és l3C-NMR spektrum adatok pedig az 1,3, 5, 7. és
9. ábrákon szerepelnek.
2. példa
Ha az i. példa szerinti reakcióban növeljük a reakcióidőt, a BBM-1675C mennyisége csökken, és két új termék: a 3. képletű vegyület (Rf=0,65) és a BBM-1675D (Rp az alapszinten marad) (TLC: szilikagél, toluohaceton 3:2 (tf/tf) jelenik meg, és idővel jellemzővé válik.
A BBM-1675D vegyületet, amely szokásosan a BBM-1675C keletkezését kíséri az 1. példában ismertetett kromatográfiás oszlopon izoláljuk, az eluáláshoz kloroform és metanol 5:1 térfogatarányú elegyét használva. Az alkalmas frakciókat összegyűjtjük, és szárazra pároljuk. 18 mg lényegében tiszta BBM-1675D-t kapunk az 1. példában ismertetett reakció eredményeképpen.
A BBM-1675D egy nagyobb foltot ad Rp=0,37-nél a reverz fázisú TLC mérésnél (Whatman MKClgF, 200 mikron), az eluáláshoz 30%-os vizes metanol oldatot használva, és R/=0,22-nél normál fázisú szilikagél TLC mérésben, eluálószerként kloroform és metanol 5:0,5 térfogatarányú elegyét használva.
3. példa
A BBM-1675D hozamában lényeges javulás érhető el, ha a BBM-1675A2 vagy BBM-1675A, kémiai hidrolízise során hidrogén-klorid helyett p-toluol-szulfonsavat használunk, amint ezt a 3. és 5. példák szemléltetik.
A BBM-1675A2 15,2 mg-os mintáját 1 ml 0,03 mólos metanolos p-toluol-szulfonsav oldattal hidrolizáljuk körülbelül 63°C-os hőmérsékleten, mintegy egy órán keresztül. Ezután a reakcióelegyet szárazra pároljuk, csökkentett nyomáson, körülbelül 30°C-on. A száraz maradékból a BBM-1675D-Í flash oszlopkromatográfiával izoláljuk, Woelm szilikagéllel töltött oszlopon (részecske méret: 32—63 mikron). Az oszlopot kloroform és metanol 5:0,5 térfogatarányú elegyével eluáljuk, majd az összegyűjtött frakciókat TLC-vel analizáljuk (szilikagél, kloroforrmmetanol 5:0,5 tf/ /tf). Az alkalmazott kromatográfiás körülmények között a (2) és (3) inaktív vegyületek elegye (7 mg) elkülöníthető a BBM-1675D bioaktív anyagtól, amelynek R/-értéke 0,22. Az alkalmas frakciókat összegyűjtjük és szárazra pároljuk. 8 mg lényegében tiszta BBM-1675D-t kapunk, csaknem kvantitatív kitermeléssel.
A BBM-1675D fizikai-kémiai tulajdonságait már megadtuk. Ultraibolya, infravörös, tömeg, Ή-NMR és 13C-NMR spektruma a 2, 4, 6, 8. és 10A és 10B ábrákon látható.
4. példa
A BBM-1675A2 40 mg-os mintáját hidrogén-klorid 0,5 mólos metanolos oldatának 5 ml-ével kezeljük, körülbelül 50°C-on, 2 órán keresztül, az 1. példában ismertetett általános eljárást és izolálást módszert követve. Nátrium-hidrogén-karbonáttal végzett semlegesítés és szárazra párlás után a BBM-1675C-t flash oszlop-kromatográfiával izoláljuk a maradékból (Woelm szilikagéllel töltött oszlop, 32—63 mikronos részecskeméret, toluohaceton 3:2 tf/tf). Az alkalmas frakciókat egyesítjük és szárazra pároljuk. 8,4 mg lényegében tiszta BBM-1675C-t kapunk, amely azonos az 1. példában izolált termékkel.
A fenti kromatográfiás oszlopot ezután kloroform és metanol 5:0,25 térfogatarányú elegyével eluáljuk, és az összegyűjtött frakciókat szárazra pároljuk. BBM-1675D-t kapunk. A BBM-1675D-t újabb flash kromatográfiás oszlopon (szilikagél, kloroforrmmetanol 5:0,5 tf/tf.) tovább tisztítjuk. Az alkalmas frakciókat összegyűjtjük és szárazra pároljuk. 6,3 mg lényegében tiszta BBM-1675D-t kapunk, amely azonos a 3. példában kapott termékkel.
5. példa
A BBM-1675A, 49,3 mg-os mintáját 1,5 ml 0,03/ mólos metanolos p-toluol-szulfonsav oldattal hidrolizáljuk, körülbelül 60°C-on, 1,5 órán keresztül. A reakcióelegyet csökkentett nyomáson és körülbelül 30°C-on szárazra pá-10197915 roljuk, amikor a BBM-1675D-t, az 1. és 3. inaktív vegyületeket tartalmazó maradékot kapunk. A BBM-1675D bioaktív anyagot flash oszlop-kromatográíiásan izoláljuk a maradékból, Woelm szilikagéllel töltött oszlopon (32—63 mikronos részecskeméret), eluensként kloroform és metanol 5:0,25 térfogatarányú elegyét használva. Az alkalmas frakciókat összegyűjtjük, és szárazra pároljuk. 27 mg lényegében tiszta BBM-I675D-Í kapunk amely azonos a 3. példában izolált termékkel.
6. példa
A BBM-1675C 5,1 mg-os mintáját 1 ml
0,5 mólos metanolos hidrogén-klorid oldattal hidrolizáljuk, körülbelül 40—50°C-on, egy éjszakán keresztül. Nátrium-hidrogén-karbonáttal végzett semlegesítés és szárazra párlás után a BBM-1675D bioaktív anyagot flash oszlop-kromatográfiával izoláljuk a maradékból, Woelm szilikagéllel töltött oszlopon (32—63 mikronos részecskeméret), eluálószerként kloroform és metanol 5:0,25 térfogatarányú elegyét használva. Az alkalmas frakció összegyűjtésével lényegében tiszta BBM-I675D-Í eredményez, amely azonos a 3. példában izolált termékkel.
7. példa
Ha az 1. és 2. példában leírt eljárást ismételjük, de kiindulási anyagként BBM-1675A, helyett egy BBM-1675A,-et és BBM-1675A2-t tartalmazó elegy ekvimoláris menynyiségét használjuk, BBM-1675C és BBM-1675D keletkezik.
8. példa
Ha az 5. példa szerinti eljárást ismételjük, de a BBM-1675A, kiindulási anyag helyett egy BBM-I675A,-et és BBM-1675A2-t tartalmazó elegy ekvimoláris mennyiségét használjuk, a BBM-1675D-hez jutunk.

Claims (4)

1. Eljárás a BBM-I675C tumor-ellenes antibiotikum — amely (a) amorf szilárd anyag formájában jelenik meg;
(b) oldható metanolban, etanolban, etil-acetátban, acetonban, tetrahidrofuránban és kloroformban;
(c) szilikagél vékonyréteg-kromatográfiában 0,28 R/-értéket mutat, oldószer-rendszerként toluol és aceton 3:2 térfogatarányú elegyét használva;
(d) nagy feloldási FAB tömegspektrumetriásan meghatározva 855 molekulatömeget mutat;
(e) metanolban felvett ultraibolya spektruma az 1. ábrán feltüntetett, amely 210 nm (a=21 770), 274 nm (a=9 340) és 313 nm (váll) (a=4 190) értékeknél mutat ultraibolya abszorpciós maximumot, amely sav vagy bázis hozzáadására nem mutat szignifikáns változást;
(f) infravörös abszorpciós spektruma (KBr, film) a 3. ábrán feltüntetett, és a következő értékeknél mutat alapvető abszorpciós csúcsokat:
540, 740, 955, 990, 1017, 1065, 1080, 1118, 1150, 1250, 1305, 1325, 1340, 1370, 1385, 1440, 1690, 1705, 1735, 2900, 2920, 2930, 2970 és 3450 cm-';
(g) kis felbontású tömegspektruma az 5. ábrán feltüntetett, amely 856-os (M+H) + molekula iont mutat (h) 360 MHz-es mágneses rezonancia spektruma CDCl3-ban a 7. ábrán megadott, amely a következő jeleket mutatja:
6,54 (IH, dd, J=7,7, 7,0); 6,21 (IH, brs); 5,87 (IH, d, J=9,6); 5,78 (IH, dd, J= =9,6, 1,5) 5,66 (IH, brd, J=2,9); 4,94 (IH, dd, J=10,3, 1,8); 4,61 (IH, d, J= =7,7); 4,25 (IH, s); 4,09 (IH, q, J=2,6); 3,97 (IH, t, J=9,6); 3,92—3,53 (10H), 3,45 (IH, dt, J=I0,3, 4,0); 3,37 (3H, s); 2,77 (IH, m); 2,69 (IH, dt, J=9,9, 5,2);
2.49 (IH, dd, J=10,3, 2,6); 2,48 (3H, s); 2,30 (2H, m), 2,13 (IH, m); 2,09 (3H, s);
1.50 (2H, m); 1,37 (3H, d, J=5,9); 1,32 (3H, d, J=6,3); és 1,08 (6H) ppm (tetrametil-szilán);
(i) 90,6 MHz-nél C-13 mágneses rezonancia spektruma CDCl3-ban a 9. ábrán feltüntetett, amely a kővetkező jeleket tartalmazza:
13.7, 17,5, 19,8, 22,3, 22,7, 23,5, 34,2,
35,2, 39,5, 47,7, 52,7, 55,8, 56,1,57,7, 62,4,
64.7, 67,4, 69,3, 69,8, 71,9, 76,1, 77,1,
77.7, 79,7, 83,2, 88,4, 97,3, 97,3, 99,7,
123,4, 124,6, 130,1 és 193,1 ppm (tetrametil-szilán) — valamint a BBM-1675D tumor-ellenes antibiotikum — amely (a) amorf szilárd anyag formájában jelenik meg;
(b) oldható metanolban, etanolban, acetonban tetrahidrofuránban, kissé oldódik kloroformban.
(c) szilikagél vékonyréteg-kromatográfiásan 0,22 Rf értéket mutat, oldószer-rendszerként kloroform és metanol 5:0,5 térfogatarányú elegyét használva, és fordított fázisú szilikagél vékonyréteg-kromatográfiásan meghatározva Rf-értéke 0,37, oldószer-rendszerként metanol és víz 70:3 térfogatarányú elegyét használva;
(d) nagy feloldású FAB tömegspektrométerrel meghatározva molekulatömege 695nek adódik;
(e) metanolos oldatban felvett ultraibolya abszorpciós spektruma a 2. ábrán feltüntetett, amely 214 nm (a=27 000), 274 nm (a=12 800) és 325 nm (a=5400) értékeknél mutat abszorpciós maximumot, amely sav vagy bázis hozzáadására nem mutat szignifikáns változást;
(f) infravörös abszorpciós spektruma (KBr, film) lényegében a 4. ábra szerinti, amely a következő értékeknél mutat alapvető abszorpciós csúcsokat:
735, 755, 910, 960, 1000, 1020, 1085, 1150,
-11197915
1195, 1250, 1310, 1335, 1365, 1385, 1445, 1510, 1685, 1720, 1735, 2880, 2930, 2960 és 3400 cm-1;
(g) kis felbontású tömegspektruma a 6. ábrán megadott, amely 696-os (M-(-H) + molekula iont mutat;
(h) 360MHz-en meghatározott proton mágneses rezonancia spektruma CDC13+1O% CD3OD-ben a 8. ábra szerinti, amely a következő értékeknél mutat jeleket:
6,43 (1H, dd, J=4,4, 10,3); 6,13 (1H, s); 5,81 (1H, d, J=8,8); 5,70 (1H, d, J=8,8); 5,48 (1H, 6 brs); 4,48 (1H, d, J=8,l); 4,02 (1H, d, J=2,0); 3,95—3,80 (oldószer háttér); 3,77 (1H, t, J=9,0); 3,70— 3,40 (11H, brm); 3,35 (1H, m); 3,28 (3H, s); 3,22 (3H, brs); 2,66—2,55 (2H, m); 2,38 (3H, s); 2,23—2,12 (2H, m); 1,42 (1H, brdt); 1,22 (3H, d, J=5,9); 0,94 (3H, d,J=6,6); és 0,87 (3H, d, J= =5,9) ppm (tetrametil-szilán) (i) 90,6 MHz-es C-13 mágneses rezonancia spektruma CDC1,3+1O% CD3OD-ban a
10. ábra szerinti (10A+10B ábra) amely a következő értékeknél mutat jeleket:
17.5, 21,6, 22,2, 23,0, 33,4, 39,2, 46,4,
52,3, 55,8, 62,1, 67,8, 69,8, 70,1, 71,3,
75,8, 77,1, 78,1, 82,4, 83,3, 88,2, 97,4,
99.6, 122,6, 124,8, 130,1, 130,8, 134,3, 148,7 és 192,8 ppm (tetrametil-szilán) — előállítására, azzal jellemezve, hogy a BBM-1675A, vagy BBM-1675A2 antibiotikumot vagy ezek elegyét ásványi vagy szerves savval — adott esetben fokozatosan, szelektív módon — hidrolizáljuk, és a képződött BBM-1675C és BBM-1675D antibiotikumot — célszerűen kromatográfiával — elkülönítjük; és kívánt esetben a képződött BBM-1675C
5 antibiotikumot további ásványi vagy szerves savas hidrolízissel BBM-1675D antibiotikummá alakítjuk át.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás BBM-1675C antibiotikum előállítására, azzal jel10 lemezve, hogy a fokozatos — előnyösen ásványi savval lefolytatott — hidrolízis során elsőként keletkező BBM-1675C antibiotikum képződése után a hidrolízist megszakítjuk és a képződött BBM-1675C antibiotikumot
15 a reakcióelegyből — célszerűen kromatográfiával — elkülönítjük.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás BBM-1675D antibiotikum előállítására, azzal jellemezve, hogy a fokozatos — előnyösen szer20 vés savval, különösen p-toluol-szulfonsavval lefolytatott — hidrolízist a BBM-1675C antiobiotikum képződése után illetőleg az abból keletkező BBM-1675D antibiotikum képződéséig folytatjuk, és a képződött BBM-1675D
25 antibiotikumot a reakcióelegyből kinyerjük.
4. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1—3. igénypontok bármelyike szerint előállított BBM3Q -1675C vagy BBM-1675D antibiotikumot gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyaggal és/vagy egyéb gyógyszerészeti vivőanyaggal összekeverve gyógyszerkészítménynyé alakítjuk.
HU863709A 1985-08-27 1986-08-27 Process for producing new antibiotic bbm-1675c and d with antitumor effect and pharmaceutical compositions comprising same HU197915B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US77033585A 1985-08-27 1985-08-27

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT44035A HUT44035A (en) 1988-01-28
HU197915B true HU197915B (en) 1989-06-28

Family

ID=25088206

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU863709A HU197915B (en) 1985-08-27 1986-08-27 Process for producing new antibiotic bbm-1675c and d with antitumor effect and pharmaceutical compositions comprising same

Country Status (26)

Country Link
JP (2) JPH0733393B2 (hu)
KR (1) KR920010226B1 (hu)
AT (1) AT392971B (hu)
AU (1) AU604464B2 (hu)
BE (1) BE905332A (hu)
CA (1) CA1307256C (hu)
CH (1) CH668598A5 (hu)
CY (1) CY1676A (hu)
DE (1) DE3629052C2 (hu)
DK (1) DK170671B1 (hu)
ES (1) ES2002728A6 (hu)
FI (1) FI83422C (hu)
FR (1) FR2586686B1 (hu)
GB (1) GB2179649A (hu)
GR (1) GR862160B (hu)
HK (1) HK793A (hu)
HU (1) HU197915B (hu)
IE (1) IE59204B1 (hu)
IL (1) IL79519A0 (hu)
IT (1) IT1229176B (hu)
LU (1) LU86562A1 (hu)
NL (1) NL8602165A (hu)
PT (1) PT83261B (hu)
SE (2) SE469632B (hu)
SG (1) SG109692G (hu)
ZA (1) ZA865796B (hu)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1215212A3 (en) * 1987-01-30 2003-05-21 Wyeth Holdings Corporation Dihydro derivatives of LL-E33288 antibiotics
US4916065A (en) * 1988-06-10 1990-04-10 Bristol-Myers Company BU-3420T Antitumor antibiotic
US5028536A (en) * 1989-03-15 1991-07-02 Bristol-Myers Squibb Company Antitumor antibiotic BMY-41339
US5086045A (en) * 1989-03-15 1992-02-04 Bristol-Myers Squibb Company Antitumor antibiotic
CA2027601A1 (en) * 1989-11-06 1991-05-07 Koko Sugawara Antitumor antibiotic bu-3983t
CA2039789A1 (en) * 1990-04-27 1991-10-28 Samuel J. Danishefsky Calicheamicinone, derivatives and analogs thereof and methods of making the same
US5116845A (en) * 1990-05-04 1992-05-26 Bristol-Myers Company BU-3420T antitumor antibiotic
US5264586A (en) * 1991-07-17 1993-11-23 The Scripps Research Institute Analogs of calicheamicin gamma1I, method of making and using the same

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3148023A1 (de) * 1981-12-04 1983-06-09 Rudolf Dipl.-Ing. 8901 Oberottmarshausen Fischer Heizungskessel fuer heisse rauchgase
US4578271A (en) * 1982-05-24 1986-03-25 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Biologically active WS 6049 substances, a process for the production thereof and their pharmaceutical compositions
NZ208013A (en) * 1983-05-16 1987-07-31 Bristol Myers Co Antitumour antibiotic bbm-1675 and production by cultivating actinomadura verrucosospora
JPS606194A (ja) * 1983-06-23 1985-01-12 Meiji Seika Kaisha Ltd 新規抗生物質ｓｆ−２２８８及びその製造法
US4530835A (en) * 1983-07-08 1985-07-23 Warner-Lambert Company CL-1577 Antibiotic compounds and their production

Also Published As

Publication number Publication date
GR862160B (en) 1986-12-31
DK170671B1 (da) 1995-11-27
LU86562A1 (fr) 1987-03-06
NL8602165A (nl) 1987-03-16
IE59204B1 (en) 1994-01-26
FI863405A (fi) 1987-02-28
FR2586686A1 (fr) 1987-03-06
SE469632B (sv) 1993-08-09
SG109692G (en) 1992-12-24
IT1229176B (it) 1991-07-23
BE905332A (fr) 1987-02-26
ES2002728A6 (es) 1988-10-01
PT83261A (en) 1986-09-01
CA1307256C (en) 1992-09-08
FR2586686B1 (fr) 1990-02-02
IT8621527A0 (it) 1986-08-26
AU6175186A (en) 1987-03-05
FI83422C (fi) 1991-07-10
SE9200428D0 (sv) 1992-02-13
JPS62116589A (ja) 1987-05-28
HK793A (en) 1993-01-15
HUT44035A (en) 1988-01-28
FI83422B (fi) 1991-03-28
JPH0733393B2 (ja) 1995-04-12
AU604464B2 (en) 1990-12-20
PT83261B (pt) 1989-05-12
FI863405A0 (fi) 1986-08-22
DK406086D0 (da) 1986-08-26
CY1676A (en) 1993-10-10
SE8603597L (sv) 1987-02-28
GB8620118D0 (en) 1986-10-01
IL79519A0 (en) 1986-10-31
DE3629052C2 (de) 1995-09-28
AT392971B (de) 1991-07-25
GB2179649B (hu) 1989-10-25
SE9200428L (sv) 1993-08-14
DK406086A (da) 1987-02-28
KR870002269A (ko) 1987-03-30
ATA231786A (de) 1990-12-15
GB2179649A (en) 1987-03-11
KR920010226B1 (ko) 1992-11-21
CH668598A5 (de) 1989-01-13
JPH07233186A (ja) 1995-09-05
ZA865796B (en) 1987-04-29
IE862280L (en) 1987-02-27
DE3629052A1 (de) 1987-05-07
SE8603597D0 (sv) 1986-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kiyoto et al. A NEW ANTITUMOR ANTIBIOTIC, FR-900482 II. PRODUCTION, ISOLATION, CHARACTERIZATION AND BIOLOGICAL ACTIVITY
EP1437359B1 (en) Novel 3,6-Hemiketals from the Class of 9a-Azalides
US4837206A (en) Esperamicin derivatives
HU197915B (en) Process for producing new antibiotic bbm-1675c and d with antitumor effect and pharmaceutical compositions comprising same
Toscano et al. New fluorinated erythromycins obtained by mutasynthesis
IE57825B1 (en) Bbm-2478 antibiotic complex
Kinumaki et al. Macrolide antibiotics M-4365 produced by Micromonospora II. Chemical structures
Saito et al. Studies on Lignan Lactone Antitumor Agents. I.: Synthesis of Aminoglycosidic Lignan Variants Related to Podophyllotoxin
US4540662A (en) Semisynthetic macrolidic antibiotics, intermediate compounds for their preparation and related pharmaceutical compositions containing compounds for their preparation and related pharmaceutical compositions containing them
HU205932B (en) Process for producing triacetate derivative of bu-3420t antibioticum and pharmaceutical compositions containing them
US4921700A (en) BBM-1675c and d antitumor antibiotics
US20160367585A1 (en) Novel aminoglycoside antibiotics, process for producing the same, and pharmaceutical use thereof
Mitscher et al. 5-Hydroxy-7-chlortetracycline
US5091523A (en) Mitomycin derivatives having reduced bone marrow toxicity, processes for their preparation, and the uses thereof
Bargiotti et al. Synthesis, biological and biochemical properties of new anthracyclines modified in the aminosugar moiety
HU210499B (en) Process for preparing 6-o-alkylelsamicin a deriv.s and pharmaceutical compn.s contg. them
EP2151448A1 (en) Glycosylate derivatives of mithramycin, method of preparation and uses thereof
US5639735A (en) Antitumor antibiotic compounds: hayumicins and analogs thereof
EP0423247B1 (en) Coumamidine compounds
NZ225662A (en) Antibiotic a80577, microorganism which produces it, and compositions
EP0431323A1 (en) Antitumor antibiotic BU-3983T
MXPA01009025A (es) L-arabino-disacaridos de antraciclinas, proceso para su preparacion, y composiciones farmaceuticas que los contienen..

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee