CH678855A5

CH678855A5 -

Info

Publication number: CH678855A5
Application number: CH4236/89A
Authority: CH
Inventors: Maximilian Dr Grassberger; Gerhard Dr Schulz; Theodor Dr Fehr
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1988-11-29
Filing date: 1989-11-27
Publication date: 1991-11-15
Also published as: FR2639637A1; JPH02275884A; IT8948610A0; GB2225576A; GB8926787D0; BE1003436A3; GB2225576B; FR2639637B1; IT1237429B

Description


  
 



  Die Erfindung bezieht sich auf substituierte Azatricycloderivate und ihre Metabolite, ihre Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen. 



  Die Verbindungen der allgemeinen Formel 
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  worin R1 für Methyl, Ethyl oder Allyl und n für 1 oder 2 stehen sowie deren Herstellung und immunosuppressive und antimikrobielle Wirkung sind in der Literatur beschrieben. Diese Substanzen werden aus Kulturmedien isoliert, die durch Fermentation von Streptomyces-Stämmen nach an sich bekannten Methoden erhalten wurden. Vorzugsweise wird als Produktionsstamm Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993 (FERM BP-927), wie in der EP 184 162 beschrieben verwendet. Dieser Stamm ist vom Fermentation Research Institute, Tsukuba, Ibaraki 305, Japan unter den Bedingungen des Budapester Abkommens erhältlich. Dieser Stamm wurde am 27. April 1989 beim Agricultural Research Culture Collection International Depository Authority, Peoria, lllinois 61 604, USA, unter den Bedingungen des Budapester Abkommens neuerlich hinterlegt. Die Hinterlegungsnummer ist NRRL 18.488. 



  Es wurde nun gefunden, dass in dieser Fermentationsbrühe eine Anzahl von Metaboliten enthalten ist, die wertvolle pharmakologische Aktivitäten besitzen. Sie können nach einem Verfahren erhalten werden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man aus der Fermentationsbrühe nach Abtrennung der Verbindungen der Formel II nach an sich bekannten Methoden aus den verbleibenden Lösungen und Waschflüssigkeiten die Metabolite isoliert, beispielsweise mit Hilfe von chromatographischen Verfahren. 



  Dieses Verfahren kann analog zu bekannten Methoden durchgeführt werden, z.B. mit Hilfe von chromatographischen Verfahren. 



  Die Aufarbeitung der Fermentationsbrühe kann beispielsweise folgendermassen ausgeführt werden: 



  6200 l Fermentationsbrühe werden mit 6000 l Essigester während 6 Stunden bei Raumtemperatur ausgerührt und anschliessend in einem Separator aufgetrennt. Der Essigesterteil wird darauf unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der resultierende Extrakt wird anschliessend durch Verteilung zwischen 3 x 70 l Methanol/Wasser (9/1) und 3 x 70 l Hexan entfettet. Der Methanol/Wasser-Teil ergibt nach dem Eindampfen zur Trockne am Vakuum weiteren Extrakt. Dieser wird an einer Säule von 25 kg Sephadex LH20 chromatographiert. Die Fraktionen, die laut DC und HPLC die Verbindung der Formel II enthalten, werden vereinigt und zur weiteren Reinigung an einer Säule (Durchmesser 15 cm) von 20 kg Kieselgel Merck (0.04 bis 0.063 mm) mit tert.Butylmethylether chromatographiert. Nach 50 l Eluat werden Fraktionen von 6.2 l gesammelt. Die Fraktionen, die laut DC und HPLC die Verbindung der Formel 
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  enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Daraus wird durch Kristallisation aus Acetonitril die Verbindung der Formel lla als kristallines Produkt gewonnen. Schliesslich wird die Säule mit 90 l Methanol ausgewaschen. Dabei resultieren 91 g Metabolitengemisch, welches durch weitere Chromatographie an 800 g Kieselgel H mit tert.-Butylmethylether/Methanol/Wasser (88/11/1, 80/17,5/2 und 70/25/4) aufgetrennt wird. Sephadexfiltration und anschliessende Chromatographie an Lichroprep RP18 führen zur weiteren Auftrennung des Metabolitengemisches. Mittels DC- und HPLC-Analytik werden die Fraktionen, die gleiche Metabolite enthalten, vereinigt. 



  Auf diese Weise erhält man drei verschiedene Fraktionen mit verschiedenen Retentionszeiten: 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb>Head Col 01 AL=L: Fraktion: 
<tb>Head Col 02 to 03 AL=L: Retentionszeit (Minuten): 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>Gradient 1: 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>Gradient 2: 
<tb> <SEP>A <SEP>10,21 <SEP>17,69 
<tb> <SEP>B <SEP>4,99 <SEP>13,94 
<tb> <SEP>C <SEP>9,65 
<tb> <SEP>HPLC-System: <SEP>Säule, Lichrosorb RP18 Merck, 250 x 4 mm selbst gefüllt. Fluss 2 ml/min, Detektion UV 220 nm/0,1 
<tb> <SEP>Lösungen: <SEP>Triethylamin-Phosphatpuffer pH 3,5, 0,05 M 10% Acetonitril/Acetonitril 
<tb> <SEP>Gradient 1: <SEP>in 20 min von 50:50 auf 10:90 
<tb> <SEP>Gradient 2: <SEP>in 20 min von 90:10 auf 10:90 
<tb></TABLE> 



  Nach nochmaliger chromatographischer Reinigung der Fraktion A an Lichroprep RP18 mit H2O/Methanol (1/4) wird der Metabolit A als HPLC-einheitliche und farblose Festsubstanz gewonnen. Er besitzt die in den Diagrammen 1 und 5 wiedergegebenen IR- bzw. Massen-Spektren. 



  Fp: 70-75 DEG C 



  [ alpha ]20_D  = -75,6 DEG (c = 1,17 in Methanol) 



  UV:  lambda max (Methanol) 320 log  epsilon  min  = 1,3074 



  Nochmalige Filtration von Fraktion B über eine Säule von Sephadex LH20 in Methanol ergibt den Metabolit B als HPLC-einheitliche, farblose amorphe Festsubstanz. Er besitzt die in den Diagrammen 2 und 6 wiedergegebenen IR- bzw. Massen-Spektren. 



  Fp: 72-78 DEG C 



  [ alpha ]20_D  = - 71,1 DEG (c = 1,22 in Methanol) 



  UV:  lambda max (Methanol) 225 log  epsilon  min  = 1,1561; 323 log  epsilon  min  = -0.0907 



  <1>H-NMR (CDCl3): Konformerengemisch ca. 2:1 



  Charakteristische Signale [ppm]: 6,70 (m, H-24); 6,11 (d, breit. J = 15Hz, H-23). 



  <1><3>C-NMR (CDCl3): Charakteristische Signale [ppm] des in höherer Konzentration vorliegenden Konformeren:199,9 (C-22); 148,8 (C-24); 137,6 (C-19); 131,8 (C-23); 98,1 (C-10?); 128,1 (C-29); 124,0 (C-20). 



  Der Metabolit B besitzt eine  DELTA <23>-Doppelbindung. 



  Weitere Chromatographie von Fraktion C an Lichroprep RP18 mit Methanol/Wasser (4/1) führt zu Metabolit C als HPLC-einheitliche, amorphe Festsubstanz. Er besitzt die in den Diagrammen 3 und 7 wiedergegebenen IR- bzw. Massen-Spektren. 



  Fp: 55-60 DEG C 



  [ alpha ]20_D  = +7,5 DEG  (c = 1,0 in Methanol) 



  UV:  lambda max (Methanol) 321 log  epsilon  min  = 1.2972 



  Die Nebenfraktionen, die bei der Chromatographie an Kieselgel mit tert.Butylmethylether keine Verbindung der Formel lla enthalten, werden vereinigt, weiter an Kieselgel H und Lichroprep RP18 aufgetrennt und HPLC-analytisch evaluiert. Die Fraktionen mit der Retentionszeit 8,01 Min. (Gradient 1) werden vereinigt. Es resultiert der Metabolit D als farblose amorphe Festsubstanz. Er besitzt die in den Diagrammen 4 und 8 wiedergegebenen IR- bzw. Massen-Spektren. 



  Fp: 74-78 DEG C 



   [ alpha ]20_D  = -131 DEG  (c = 1,02 in Chloroform) 



  UV:  lambda max (Methanol) 256 log  epsilon  min  = 0,3716 



  <1>H-NMR (CDCl3): Charakteristische Signale [ppm] bei 5,33 (d, J = 4Hz, H-26); 5,22 (d, J = 9Hz, H-29); 4,53 (d, breit, J = 15Hz, H-6e); 4,37 (d, breit, J = 4Hz, H-2); 4,19 (ddd, J1 = 2Hz, J2 = 5Hz, J3 = 7Hz, H-24). 



  <1><3>C-NMR (CDCI3): Charakteristische Signale [ppm] bei 208,4 (C-22); 202,6 (C-9); 169,6 (C-1); 167,5 (C-8); 131,6 (C-29); 124,2 (C-20); 135,1 (C-37); 116,6 (C-38); 81,4 (C-26); 68.3 (C-24). 



  Die Erfindung betrifft daher ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung der Metaboliten A, B und C, dadurch gekennzeichnet, dass man nach Abtrennung der Verbindung der Formel IIa aus der Fermentationsbrühe die Säule mit Methanol auswäscht und die erhaltene Lösung des Metabolitengemisches durch mehrfach aufeinander folgende Chromatographieschritte auftrennt. 



  Sie betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung vom Metaboliten D, dadurch gekennzeichnet, dass man die bei der Chromatographie der Fermentationsbrühe mit tert-Butylmethylether zur Abtrennung der Verbindung der Formel IIa erhaltenen Nebenfraktionen durch mehrfach aufeinander folgende Chromatographieschritte auftrennt. 



  Bei der Aufarbeitung der Fermentationsansätze entstehen Randfraktionen, die aufgrund der HPLC-Analytik einen neuen Metaboliten mit der Retentionszeit 11,7 Min. (Gradient 1) enthalten. Chromatographische Trennung und Reinigung an Kieselgel H, Sephadex LH20 und Lichroprep RP18 ergibt 



  a) die Verbindung der Formel 
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  als HPCL-einheitliche amorphe farblose Festsubstanz. 



  Fp: 103-105 DEG C 



  [ alpha ]20_D = -41,8 DEG  (c = 0,95 in Chloroform) 



  <1>H-NMR (CDCI3 + CH3OH 5:1): Zwei Konformere im Verhältnis von ca. 3:1. Charakteristische Signale bei [ppm] 4.37 (d, breit, J = 14Hz, H-6e); 3,91 (d, J = 2Hz, H-26): 4,08 (H-26 min ). 



  <1><3>C-NMR (CDCI3): Charakteristische Signale [ppm] bei 168,8 (C-1); 162,2 (C-8); 189,9 (C-9); 99,8 (C-10); 50,5 (C-18); 210,9 (C-22); 41,2 (C-23); 71,5 (C-24); 37,7 (C-25); 136,3 (C-28); 127,8 (C-29). 



  Die Erfindung betrifft daher ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel Ia, dadurch gekennzeichnet, dass man die bei der Aufarbeitung der Fermentationsbrühe zur Abtrennung der Verbindung der Formel IIa entstehenden Randfraktionen mehrfach aufeinander folgenden Chromatographieschritten unterwirft [Verfahrensvariante a)]. 



  In der Verbindung der Formel la ist der Laktonring nicht über die Oxyfunktion in Position 26, sondern über die Oxyfunktion in Position 24 geknüpft. Verbindungen mit dieser isomeren Grundstruktur sind hiernach als "iso" bezeichnet. 



  Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur synthetischen Herstellung der Verbindungen mit dieser isomeren Grundstruktur, nämlich der Verbindungen der Formel I 
EMI7.1
 



  worin X für die Oxo- oder eine gegebenenfalls geschützte Hydroxygruppe, R1 min  für Methyl. Ethyl, n-Propyl oder Allyl und R2 für eine gegebenenfalls geschützte Hydroxygruppe stehen, dadurch gekennzeichnet, dass man 



  b) zur Herstellung der Verbindungen der Formel 
EMI8.1
 



  worin R1 min  und R2 obige Bedeutung besitzen und X min für eine gegebenenfalls geschützte Hydroxygruppe steht, eine Verbindung der Formel 
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  worin X min , R1 min  und R2 obige Bedeutung besitzen, mit einer Base, wie Imidazol behandelt oder 



  c) zur Herstellung von Verbindungen der Formel 
EMI9.1
 



  worin R1 min  obige Bedeutung besitzt und X min  min  für die Oxo- oder Hydroxygruppe steht, aus einr Verbindung der Formel 
EMI9.2
 



  worin X, R1 min  und R2 obige Bedeutung besitzen und R3 für eine gegebenenfalls geschützte Hydroxygruppe steht, mit der Massgabe, dass mindestens eine der Gruppen X, R2 und R3 für eine geschützte Hydroxygruppe steht, die Schutzgruppe (n) nach bekannten Methoden abspaltet. 



  Die Verbindungen mit dieser "Iso-Struktur" sind wichtige Zwischenverbindungen für die Herstellung neuer, biologisch aktiver Derivate. 



  Falls X für gegebenenfalls geschütztes Hydroxy steht, können sie in Stellung 22 die S- oder die R-Konfiguration aufweisen. 



  Die Diastereomeren A besitzen am C-22 die Konfiguration S, die Diastereomeren B die Konfiguration R in dieser Stellung. AIs Schutzgruppen für die Hydroxygruppe können allgemein gebräuchliche Schutzgruppen eingesetzt werden, beispielsweise die tert.Butyldimethylsilylgruppe. 



  Die obigen Verfahrensvarianten können analog zu bekannten Methoden durchgeführt werden. 



  Verfahrensvariante a) wird vorzugsweise wie oben beschrieben durchgeführt. 



  Verfahrensvariante b) ist eine Umlagerung. Sie kann z.B. durch Behandeln einer Verbindung der Formel lla min  in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmittel, beispielsweise in Dimethylformamid, mit einer Base, z.B. mit Imidazol, Carbonyldiimidazol oder 4-Dimethylaminopyridin, vorzugsweise bei erhöhter Temperatur, z.B. bei etwa 50 bis 60 DEG C, durchgeführt werden. Die Abtrennung der gewünschten Endprodukte von gegebenenfalls entstehenden Nebenprodukten kann nach bekannten Methoden, beispielsweise chromatographisch, erfolgen. 



  Verfahrensvariante c) ist eine Schutzgruppenabspaltung. Sie kann ebenfalls nach bekannten Methoden durchgeführt werden, beispielsweise unter Verwendung von HF/Acetonitril, vorzugsweise bei etwa Raumtemperatur. Je nach den Reaktionsbedingungen (Reaktionsdauer, Reaktionstemperatur) kann die Abspaltung derart gelenkt werden, dass entweder alle Schutzgruppen oder nur ein Teil der Schutzgruppen entfernt werden. Diese teilweise Abspaltung von Schutzgruppen ist vor allem dann erwünscht, wenn anschliessend in einer weiteren Reaktion eine bestimmte Hydroxygruppe umgesetzt werden soll. 



  Bei den erfindungsgemässen Verfahren bleibt die Konfiguration, insbesondere an der Position 22, falls X für eine gegebenenfalls geschützte Hydroxygruppe steht, unverändert. Werden die Ausgangsprodukte als diastereomere Gemische eingesetzt, so kann die Auftrennung in die einzelnen Diastereomeren an einer beliebigen Stelle des Reaktionsablaufs nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise chromatographisch, erfolgen. 



  Die Ausgangsprodukte können analog zu bekannten Methoden erhalten werden. 



   Die Ausgangsverbindungen der Formel 
EMI11.1
 



  worin R1 min , R2 und R3 obige Bedeutung besitzen, können durch Oxidation von Verbindungen der Formel 
EMI11.2
 



  worin R1 min , R2 und R3 obige Bedeutung besitzen, erhalten werden. 



  Die als Ausgangsprodukt benötigte Fermentationsbrühe kann beispielsweise folgendermassen erhalten werden: 


 A) Startkultur auf Agar: 
 



  Eine Agarkultur des Stammes Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993 (Hinterlegung entsprechend dem Budapester Vertrag Nr. FERM BP-927, Fermentation Research Institute, Japan) wird 14 Tage bei 27 DEG C in folgendem Medium kultiviert:
 4 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Malzextrakt, 4 g/l Dextrose, 20 g/l Agar, pH = 6,6 (NaOH/H2SO4). 


 B) Vorkultur: 
 



  Die Sporen und das Mycel von 6 Startkulturen werden in 90 ml einer 0,9% NaCI-Lösung suspendiert. 10 Erlenmayerkolben mit je 1 Liter Vorkulturmedium werden mit je 7 ml dieser Suspension inokuliert. Das Vorkulturmedium hat folgende Zusammensetzung: 10 g/l Glyzerin, 10 g/l Stärke, 5 g/l Glucose, 10 g/l Wollsamenextrakt, 5 g/l Hefeextrakt, 2 g/l CaCO3, pH = 6,8. Die Züchtung dieser Vorkultur wird 96 Stunden bei 27 DEG C und 200 Upm unter Rühren durchgeführt. 


 C) Zwischenkultur: 
 



  Je zwei 500-Liter-Aliquots des Vorkulturmediums werden in einem 750-Liter-Stahlfermenter mit 5 Liter der Vorkultur 48 Stunden bei 27 DEG C, 100 Upm und 0,5 Liter/Minute Durchlüftung inkubiert. 


 D) Hauptkultur: 
 



  6000 Liter des Hauptkulturmediums werden in zwei 4500-Liter-Stahlfermentern mit 600 Liter Zwischenkultur inokuliert. Das Hauptkulturmedium hat folgende Zusammensetzung: 45 g/l lösliche Stärke, 10 g/l Cornsteep, 10 g/l Hefeextrakt, 1 g/l CaCO3, pH = 6,8 (NaOH). Die Inkubation wird 96 Stunden bei 27 DEG C, 50 UpM, 0,5 bar und einer Durchlüftung von 0,5 Liter/Minute durchgeführt. 



  Die übrigen Ausgangsprodukte sind bekannt oder nach bekannten Verfahren, bzw. analog wie in den Beispielen beschrieben herstellbar. 



  Eine Untergruppe der erfindungsgemässen Verbindungen betrifft Verbindungen der Formel 
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  worin X obige Bedeutung besitzt. 


 Erklärung der Figuren: 
 



  Die Diagramme 1 bis 4 stellen die IR-Spektren für die Metaboliten A bis D dar. 



  Diese Diagramme 5 bis 8 stellen die Massenspektren für die Metaboliten A bis D dar. 


 BEISPIELE 
 



  In den nachfolgenden Beispielen, die die Erfindung näher erläutern, ohne jedoch ihren Umfang einzuschränken, sind alle Temperaturen in  DEG C. 



  In den Beispielen werden die folgenden Verbindungen durch Kurzbezeichnungen dargestellt: 
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EMI16.1
 
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 Beispiel 1:33-O-tert.Butydimethylsilyl-22(S)-dihydro-iso-FK 506 (Verfahren b)
 [R1 min  = Allyl, R2 = tert-butyldimethylsiloxy; X = (S)-OH]. (Formel I) 
 



  92 mg 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-22(S)-dihydro-FK 506 (Diastereomeres A) und 12 mg Imidazol werden in 1 ml Dimethylformamid 120 Stunden bei 60 DEG  gerührt. Man dampft ein und reinigt durch Chromatographie an Kieselgel mit Toluol/Essigsäureethylester (2/1). Anstelle von Imidazol können auch andere Basen, z.B. 4-Dimethylaminopyridin oder Carbonyldiimidazol, verwendet werden. 



  Bei Verwendung von Carbonyldiimidazol verfährt man beispielsweise folgendermassen: Zu einer Lösung von 459 mg 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-22(S)-dihydro-FK 506 (Diastereomeres A) in 5 ml wasserfreiem Benzol werden 85 mg Carbonyldiimidazol gegeben und das Gemisch 12 Stunden bei 50 DEG  gerührt. Man dampft im Vakuum ein und isoliert durch Chromatographie an Kieselgel mit Toluol/Essigsäureethylester (3/1) neben dem 22,24-cyclischen Carbonat der Ausgangsverbindung die Titelsubstanz als farblose amorphe Festsubstanz. 



  <1>H-NMR-Spektrum (CDCl3, charakt. Signale, ppm): (5,04 (m, H-24); 3,84 (d, J = 7Hz, H-26): 4,79 (d, breit, J = 10Hz, H-20); 3,28, 3,38 und 3,41 (OCH3); 3,655 (dd, J1 = 2Hz, J2 = 9Hz, H-14). 



  Analog wie in Beispiel 1 beschrieben, können auch folgende Verbindungen der Formel I erhalten werden: 
<tb><TABLE> Columns=5 
<tb>Head Col 01 AL=L: Beispiel 
<tb>Head Col 02 AL=L: R1 min 
<tb>Head Col 03 AL=L: X 
<tb>Head Col 04 to 05 AL=L: R2 
<tb> <SEP>2 <SEP>-CH2.CH=CH2 <SEP>(R)-OH <SEP>O.BDMS <SEP>farbloser amorpher Feststoff 
<tb> <SEP>3<1)> <SEP>-C2H5 <SEP>(S)-OH <SEP>O.BDMS <SEP>farbloser amorpher Feststoff 
<tb> <SEP>4 <SEP>-C2H5 <SEP>(R)-OH <SEP>O.BDMS <SEP>farbloser amorpher Feststoff 
 BDMS = tert.Butyldimethylsilyl
<1)> <1>H-NMR-Spektrum (CDCl3, charakt.

  Signale, ppm) für Beispiel 3: 3.29 + 3.39 + 3.42 (s + s + s, OCH3); 3.59 (dd, J1 =,12Hz, J2 = 2.5Hz, H-15); 3.67 (d, J = 10Hz, H-14); 3.85 (d, J = 7Hz, H-26); 4.49 (d, breit, J = 13 Hz, H-6); 4.76 (d, J = 10Hz, H-20).
  
<tb></TABLE> 


 Beispiel 5: 22(S)-Dihydro-iso-FK 506 (Verfahren c)
 [R1 min  = Allyl, R2 = tert-butyldimethylsiloxy; X = (S)-OH]. (Formel I) 
 



  Zu 1 ml Acetonitril und 20  mu l 40 proz. HF werden 106 mg 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-22(S)-dihydro-iso-FK 506 (Diastereomeres A) in 1,4 ml Acetonitril getropft und das Gemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Man engt anschliessend im Vakuum ein und reinigt durch Chromatographie an Kieselgel mit Essigsäureethylester. Amorphe farblose Festsubstanz. 



  <1>H-NMR-Spektrum (CDCI3, charakt. Signale, ppm): 3,895 (d, J = 6Hz, H-26); 4,80 (d, breit, J = 10Hz, H-20); 3,67 (d, J = 9Hz, H-14); 3,295, 3,39 und 3,42 (OCH3). 



  Analog wie in Beispiel 5 beschrieben können auch folgende Verbindungen der Formel erhalten werden: 
<tb><TABLE> Columns=5 
<tb>Head Col 01 AL=L: Beispiel 
<tb>Head Col 02 AL=L: R1 min 
<tb>Head Col 03 AL=L: X 
<tb>Head Col 04 to 05 AL=L: R2 
<tb> <SEP>6 <SEP>-CH2.CH=CH2 <SEP>(R)-OH <SEP>OH <SEP>farbloser amorpher Feststoff 
<tb> <SEP>7 <SEP>-C2H5 <SEP>(S)-OH <SEP>OH <SEP>farbloser amorpher Feststoff 
<tb> <SEP>8 <SEP>-C2H5 <SEP>(R)-OH <SEP>OH <SEP>farbloser amorpher Feststoff 
<tb> <SEP>9 <SEP>-C2H5 <SEP>Oxo <SEP>OH <SEP>farbloser amorpher Feststoff 
<tb> <SEP>10 <SEP>-CH2.CH=CH2 <SEP>Oxo <SEP>OH <SEP>farbloser amorpher Feststoff 
<tb></TABLE> 



  Die als Ausgangsprodukte benötigten Verbindungen können folgendermassen erhalten werden: 


 A) 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-FR 520 
 



  Zu einer Lösung von 80 mg FR 520 in 3 ml Dichlormethan werden 15 mg Imidazol und 17 mg tert.Butyldimethylsilylchlorid unter Rühren zugefügt. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann mit gesättigter wässriger Ammoniumchloridlösung verdünnt und dreimal mit Diethylether extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser und einer wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, unter vermindertem Druck konzentriert und chromatographisch gereinigt. 


 B) 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-22(S)-dihydro-FK 506 und 
 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-22(R)-dihydro-FK 506 
 



   3,9 g Tetramethylammonium-triacetoxyborhydrid und 2,75 g 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-FK 506 werden bei -20 DEG  in 24 ml Acetonitril/Eisessig (1/1) gelöst und das Gemisch 2 Stunden bei 0-5 DEG  gerührt. Man versetzt anschliessend mit Wasser, rührt 15 Minuten bei 10-15 DEG  und extrahiert dann mit Methylenchlorid. Die organische Phase wird mit Wasser und gesättigter wässriger NaCI-Lösung gewaschen, getrocknet (MgSO4) und eingedampft. Aus dem Rohprodukt werden durch Chromatographie an Kieselgel mit Toluol/Essigsäureethylester (5/1) die beiden diastereomeren Titelverbindungen im Mengenverhältnis von ca. 10:1 als amorphe farblose Festsubstanzen isoliert. 


 Diastereomeres A (Hauptprodukt) 
 



  1H-NMR (CDCl3): Zwei Konformere im Verhältnis von ca. 2:1. 



  Charakteristische Signale [ppm] des überwiegend vorliegenden Konformers bei 5,30 (H-26); 4,66 (m, H-2); 4,44 (d, breit, J = 13Hz, H-6e) Signale für die OCH3-Gruppen der beiden Konformeren findet man bei 3,31, 3,32, 3,335, 3,38, 3,39 und 3,42 ppm. 



  <1><3>C-NMR (CDCI3) Charakteristische Signale des überwiegend vorliegenden Konformers [ppm] bei 195,9 (C-9); 169,1 (C-1) 165,0 (C-8); 137,4 (C-37); 136,4 (C-19); 132,2 (C-28); 128,9 (C-29); 126,1 (C-20); 115,7 (C-38); 98,4 odor 97,0 (C-10). 


 Diastereomeres B (Nebenprodukt): 
 



  <1><3>C-NMR (CDCI3) Charakteristische Signale des überwiegend vorliegenden Konformers [ppm] bei 169,1 (C-1); 165,8 (C-8); 136,2 (C-19); 125,5 (C-20); 98,7 (C-10); 43,3 (C-21) und 36,8 (C-23). 


 C) 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-22(5)-dihydro-FR 520 und 
 33-O-tert. Butyldimethylsilyl-22 (R)-dihydro-FR 520 
 



  Man verfährt, ausgehend von FR 520, analog wie unter B) beschrieben und erhält die Titelverbindungen. 


 D) 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-26-O-trimethylsilyl-iso-FK 506 
 


 a) 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-26-O-trimethylsilyl-22(S)-dihydro-iso-FK 506 
 



  460 mg 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-22(S)-dihydro-iso-FK 506 und 120 mg Bis-trimethylsilylacetamid werden in 5 ml trockenem Toluol 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Man dampft ein und erhält bei der chromatographischen Auftrennung des Rückstandes an Kieselgel mit Toluol/Essigsäureethylester (4/1) die Titelverbindung neben 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-22-O-trimethylsilyl-22(S)-dihydro-iso-FK 506 als farblose, amorphe Substanz. 



  <1>H-NMR (CDCl3): 3,30 + 3,40 + 3,44 (s+s+s, OCH3); 3,67 (d, J = 9Hz, H-26); 4,52 (d, breit, J = 13Hz, H-6e); 4,81 (d, J = 10Hz, H-20). 


 b) 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-26-O-trimethylsilyl-iso-FK 506 
 



  Zu einer Lösung von 60 mg 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-26-O-trimethylsilyl-22(S)-dihydro-iso-FK 506 in 2 ml trockenem Methylenchlorid werden 100 mg gepulvertes Molekularsieb 4A sowie 12 mg N-Methylmorpholin-N-oxid gegeben. Nach 30 Minuten Rühren bei Raumtemperatur versetzt man mit ca. 10 mg Tetrapropylammonium-perruthenat und rührt weitere 3 Stunden. Man dampft ein, nimmt mit Essigsäureethylester auf, wäscht mit wässriger NaHCO3-Lösung und Wasser, trocknet und dampft ein. Die so erhaltene Verbindung kann durch Chromatographie an Kieselgel mit Toluol/Essigsäureethylester (6/1) gereinigt werden. Man erhält eine farblose amorphe Substanz. 


 E) 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-26-O-trimethylsilyl-iso-FR 520 
 



  Man verfährt analog wie unter D beschriebon und erhält die Titelverbindung als farblosen amorphen Feststoff. 



  Die erfindungsgemässen Metaboliten und Verbindungen besitzen interessante pharmakologische Eigenschaften und können daher als Heilmittel verwendet werden. Insbesondere zeigen sie immunosuppressive und antiinflammatorische Wirkung. Die immunosuppressive Wirkung zeigt sich z.B. in vitro durch die Hemmung der Allogen-stimulierten Hyperproliferation von Lymphozyten (MLR = mixed Iymphocyte reaction) sowie in der Unterdrückung der primären humoralen Immunantwort gegen Schaferythrocyten. Die antiinflammatorische Wirkung kann in vitro durch dio Inhibierung der TPA (12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat) stimulierten PGE2-Freisetzung aus Maus-Makrophagen, bzw. des FMLP- oder Ca-lonophor A23187-stimulierten "oxidative burst" von humanen neutrophilen polymorphkernigen Leukozyten nachgewiesen werden.

  In vivo zeigt sich die antiinflammatorische Wirkung der neuen Verbindungen am Modell der Oxazolon bedingten allergischen Kontakt-Dermatitis an der Maus. 



  Diese Wirksamkeiten können mit den folgenden Testmethoden nachgewiesen werden: 


 1. Prüfung der Wirksamkeit nach topischer Applikation am Modell der Oxazolon-AIIergie an der Maus: 
 



  Dieser Test wird analog wie bei F.M. Dietrich und R. Hess in Int. Arch. Allergy 38/246-259 (1970) beschrieben durchgeführt. 


 2. Inhibierung des "oxidative burst" in humanen neutrophilen polymorphkernigen Leukozyten (Inhibierung der FMLP- bzw. A23187-stimulierten Chemilumineszenz): 
 



  Die Präparation polymorphkerniger Leukozyten (PMNL) und die Bestimmung der Chemilumineszenz wird wie in der Literatur beschrieben (M. Schaude, W. Mlineritsch, B. Mandak, Mycoses 31(5), 259-267 [1988]) durchgeführt, wobei die CL-Reaktion entweder durch Zugabe des Peptids N-Formyl-L-Methionyl-L-Leucyl-L-Phenylalanin (FMLP, 4 x 10<-><6> M oder durch den Calziumionophor A 23 187 (4 x 10<-><6> M) gestartet wird. Als minimale Hemmkonzentration wird jene niedrigste Wirkstoffkonzentration bezeichnet, bei der eine deutliche Hemmung aller 3 Parameter beobachtet werden kann. 


 3. Inhibierung der Makrophagen-Aktivierung (Inhibierung der TPA-induzierten Freisetzung von PGE2): 
 



  Die Inhibierung der PGE2-Synthese durch peritoneale Mausmakrophagen wurde analog wie bei A. Haselberger et. al., Circ. Shock Res. 26/185-192 (1988) beschrieben unter Verwendung von TPA als Stimulans durchgeführt. 


 4. Proliferative Antwort von Lymphozyten auf allogene Stimulation: 
 



  Der Test wird wie in der Literatur beschrieben durchgeführt: T. Meo (1979): The MLR in the mouse. In "Immunological Methods", L. Lefkovits and B. Pernis, Eds., Acad. Press, N.Y., S. 227-239. 


 5. Primäre humorale Immunantwort auf rote Schafsblutzellen in vitro: 
 



  Der Test wird wie in der Literatur beschrieben durchgeführt: R.I. Mishell, R.W. Dutton: Immunization of normal mouse spleen cell suspensions in vitro, Science 153/1004-1006 (1966); R.I. Mishell, R.W. Dutton: Immunization of dissociated spleen cell cultures from normal mice, J. Exp. Med. 126/423-442 (1967). 



   Die Ergebnisse dieser Tests sind in den folgenden Tabellen zusammengefasst: 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb>Title: Tabelle 1:
Inhibierung der Oxazolon bedingten allergischen Kontakt-Dermatitis an der Maus bei topischer Applikation einer 0,01%igen Lösung der Prüfsubstanz in Ethanol: 
<tb>Head Col 01 AL=L: Verbindung: 
<tb>Head Col 02 AL=L: % Inhibierung 
<tb> <SEP>Metabolit A <SEP>44 
<tb> <SEP>Metabolit B <SEP>47 
<tb> <SEP>Metabolit C <SEP>48 
<tb> <SEP>Metabolit D <SEP>44 
<tb></TABLE> 
<tb><TABLE> Columns=5 
<tb>Title: Tabelle 2:
Hemmung der TPA-induzierten PGE2-Freisetzung aus Mausmakrophagen (M phi /PGE2) und des FMLP- bzw.

  Ca-Ionophor A23 187 induzierten "oxidative burst" von humanen neutrophilen polymorphkernigen Leukozyten (PMN/FMLP und PMN/A23 187): 
<tb> 
<tb>Head Col 01 AL=L: Verbindung: 
<tb>Head Col 02 to 03 AL=L: M phi /PGE2 
<tb>Head Col 04 AL=L: PMN/FMLP
MHK [ mu M] 
<tb>Head Col 05 AL=L: PMN/A23 187
MHK [ mu M] 
<tb> 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>[ mu M]: 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>% Inhib.: 
<tb> <SEP>Metabolit A <SEP>0,5 <SEP>40 <SEP>0,001 
<tb> <SEP>Metabolit B <SEP>1 <SEP>30 <SEP>0,5 
<tb> <SEP>Metabolit D <SEP>0,5 <SEP>0,5 
<tb> <SEP>iso-FK 506 <SEP>1 <SEP>35 
<tb> 
 MKH = Minimale Hemmkonzentration
  
<tb></TABLE> 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb>Title: Tabelle 3:
Hemmung der Allogen-stimulierten Hyperproliferation von Mauslymphozyten (MLR) und der primären humoralen Immunantwort gegen Schaferythrocyten (MDA = Mishell-Dutton Assay): 
<tb>Head Col 01 AL=L: Verbindung: 
<tb>Head Col 02 to 03 AL=L:

  IC-50 [ mu g/ml] 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>MLR: 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>MDA: 
<tb> <SEP>Metabolit A <SEP>0,1 <SEP>0,1 
<tb> <SEP>Metabolit D <SEP>&lt 0,008 <SEP>0,036 
<tb></TABLE> 



  Die erfindungsgemässen Metalboliten und Verbindungen sind daher als Immunosuppressiva und Entzündungshemmer für die Behandlung und Vorbeugung der Resistenz bei Transplantationen von Organen und Geweben wie Herz, Niere, Leber, Knochenmark, Haut usw. von Graft-versus-Host-Erkrankungen bei Knochenmarktransplantationen, Autoimmunerkrankungen wie Rheumatoider Arthritis, Systemischer Lupus erythematodes, Hashomoto's Thyroiditis,  Multiple Sklerose, Myasthenia gravis, Typ I Diabetes, Uveitis usw., sowie für die Therapie von entzündlichen Hauterkrankungen, wie Psoriasis, atopischer Dermatitis und anderen ekzematösen Dermatitiden, Urticaria, An gioödemen, Vaskulitiden, Erythemen und kutanen "Eosinophilen", Alopecia areata geeignet. 



   Die Verbindungen können topisch oder systemisch, z.B. enteral, z.B. oral verabreicht werden. Die Tagesdosis beträgt von etwa 0,01 mg bis etwa 100 mg. Bei topischer Anwendung genügt im allgemeinen eine 1 bis 3%ige Konzentration, lokal verabreicht. Beispiele von galenischen Formen sind Lotionen, Gels und Cremes. 



  Pharmazeutische Zusammenbereitungen können z.B. durch Mischen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger- oder Verdünnungsmittel hergestellt werden. 



  Die topische Verabreichung kann auch z.B. am Auge erfolgen.

Claims

1. Eine Verbindung der Formel EMI26.1 worin X für die Oxo- oder eine gegebenenfalls geschützte Hydroxygruppe, R1 min für Methyl, Ethyl, n-Propyl oder Allyl und R2 für eine gegebenenfalls geschützte Hydroxygruppe stehen.

2. Die Verbindung gemäss Anspruch 1 der Formel Ia EMI27.1

3. Metabolit A mit einem Schmelzpunkt von 70-75 DEG C, [ alpha ]20_D = -75,6 DEG (c = 1,17 in Methanol) und den in den Diagrammen 1 und 5 angegebenen Massen- und IR-Spektrum.

4. Metabolit B mit einem Schmelzpunkt von 72-78 DEG C, [ alpha ]20_D = -71,1 (c = 1,22 in Methanol), den in den Diagrammen 2 und 6 angegebenen Massen- und IR-Spektrum und den charakteristischen Signalen des <1>H-NMR-Spektrums (CDCI3) von 6,70 (m, H-24) und 6,11 (d, breit, J = 15 Hz, H-23) ppm.

5.

Metabolit C mit einem Schmelzpunkt von 55-60 DEG C, [ alpha ]20_D = -7,5 DEG (c = 1,0 in Methanol) und den in den Diagrammen 3 und 7 angegebenen Massen- und IR-Spektrum.

6. Metabolit D mit einem Schmelzpunkt von 74-78 DEG C, [ alpha ]20_D = -131 DEG (c = 1,02 in Chloroform), den in den Diagrammen 4 und 8 angegebenen Massen- und IR-Spektrum und den charakteristischen Signalen des <1>H-NMR-Spektrums (CDCl3) von 5,33 (d, J = 4Hz, H-26); 5,22 (d, J = 9Hz, H-29); 4,53 (d, breit, J = 15Hz, H-6e); 4,37 (d, breit, J = 4Hz, H-2); 4,19 (ddd, J1 = 2Hz, J2 = 5Hz, J3 = 7Hz, H-24) ppm.

7.

Verfahren zur Herstellung der in Anspruch 2 definierten Verbindung der Formel Ia, dadurch gekennzeichnet, dass man die bei der Aufarbeitung der Fermentationsbrühe von Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993 zur Abtrennung der Verbindung der Formel EMI28.1 entstehenden Randfraktionen mehrfach aufeinanderfolgenden Chromatographieschritten unterwirft.

8. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel EMI29.1 worin R1 min und R2 die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzen und X min für eine gegebenenfalls geschützte Hydroxygruppe steht, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel EMI29.2 worin X min die in diesem Anspruch angegebene und R1 min und R2 die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzen, mit einer Base behandelt.

9.

Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel EMI30.1 worin R1 min die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzt und X min min für die Oxo- oder Hydroxygruppe steht, dadurch gekennzeichnet, dass man aus einer Verbindung der Formel EMI30.2 worin X, R1 min und R2 die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzen und R3 für eine gegebenenfalls geschützte Hydroxygruppe steht, mit der Massgabe, dass mindestens eine der Gruppen X, R2 und R3 für eine geschützte Hydroxygruppe steht, die Schutzgruppe(n) abspaltet.

10.

Verfahren zur Herstellung der in Ansprüchen 3, 4 und 5 definierten Metaboliten A, B und C, dadurch gekennzeichnet, dass man nach Abtrennung der Verbindung der Formel EMI32.1 aus der Fermentationsbrühe von Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993 die Säule mit Methanol auswäscht und die erhaltene Lösung des Metabolitengemisches durch mehrfach aufeinanderfolgende Chromatographieschritte auftrennt.

11. Verfahren zur Herstellung des in Anspruch 6 definierten Metaboliten D, dadurch gekennzeichnet, dass man die bei der Chromatographie der Fermentationsbrühe von Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993 mit tert.Butylmethylether zur Abtrennung der Verbindung der Formel IIa erhaltenen Nebenfraktionen durch mehrfach aufeinanderfolgende Chromatographieschritte auftrennt.

12.

Pharmazeutische Zusammenbereitung, enthaltend eine Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6 zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Träger- und/oder Verdünnungsmitteln. 1. Eine Verbindung der Formel EMI26.1 worin X für die Oxo- oder eine gegebenenfalls geschützte Hydroxygruppe, R1 min für Methyl, Ethyl, n-Propyl oder Allyl und R2 für eine gegebenenfalls geschützte Hydroxygruppe stehen. 2. Die Verbindung gemäss Anspruch 1 der Formel Ia EMI27.1 3. Metabolit A mit einem Schmelzpunkt von 70-75 DEG C, [ alpha ]20_D = -75,6 DEG (c = 1,17 in Methanol) und den in den Diagrammen 1 und 5 angegebenen Massen- und IR-Spektrum. 4. Metabolit B mit einem Schmelzpunkt von 72-78 DEG C, [ alpha ]20_D = -71,1 (c = 1,22 in Methanol), den in den Diagrammen 2 und 6 angegebenen Massen- und IR-Spektrum und den charakteristischen Signalen des <1>H-NMR-Spektrums (CDCI3) von 6,70 (m, H-24) und 6,11 (d, breit, J = 15 Hz, H-23) ppm. 5.

Metabolit C mit einem Schmelzpunkt von 55-60 DEG C, [ alpha ]20_D = -7,5 DEG (c = 1,0 in Methanol) und den in den Diagrammen 3 und 7 angegebenen Massen- und IR-Spektrum. 6. Metabolit D mit einem Schmelzpunkt von 74-78 DEG C, [ alpha ]20_D = -131 DEG (c = 1,02 in Chloroform), den in den Diagrammen 4 und 8 angegebenen Massen- und IR-Spektrum und den charakteristischen Signalen des <1>H-NMR-Spektrums (CDCl3) von 5,33 (d, J = 4Hz, H-26); 5,22 (d, J = 9Hz, H-29); 4,53 (d, breit, J = 15Hz, H-6e); 4,37 (d, breit, J = 4Hz, H-2); 4,19 (ddd, J1 = 2Hz, J2 = 5Hz, J3 = 7Hz, H-24) ppm. 7.

Verfahren zur Herstellung der in Anspruch 2 definierten Verbindung der Formel Ia, dadurch gekennzeichnet, dass man die bei der Aufarbeitung der Fermentationsbrühe von Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993 zur Abtrennung der Verbindung der Formel EMI28.1 entstehenden Randfraktionen mehrfach aufeinanderfolgenden Chromatographieschritten unterwirft. 8. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel EMI29.1 worin R1 min und R2 die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzen und X min für eine gegebenenfalls geschützte Hydroxygruppe steht, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel EMI29.2 worin X min die in diesem Anspruch angegebene und R1 min und R2 die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzen, mit einer Base behandelt. 9.

Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel EMI30.1 worin R1 min die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzt und X min min für die Oxo- oder Hydroxygruppe steht, dadurch gekennzeichnet, dass man aus einer Verbindung der Formel EMI30.2 worin X, R1 min und R2 die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzen und R3 für eine gegebenenfalls geschützte Hydroxygruppe steht, mit der Massgabe, dass mindestens eine der Gruppen X, R2 und R3 für eine geschützte Hydroxygruppe steht, die Schutzgruppe(n) abspaltet. 10.

Verfahren zur Herstellung der in Ansprüchen 3, 4 und 5 definierten Metaboliten A, B und C, dadurch gekennzeichnet, dass man nach Abtrennung der Verbindung der Formel EMI32.1 aus der Fermentationsbrühe von Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993 die Säule mit Methanol auswäscht und die erhaltene Lösung des Metabolitengemisches durch mehrfach aufeinanderfolgende Chromatographieschritte auftrennt. 11. Verfahren zur Herstellung des in Anspruch 6 definierten Metaboliten D, dadurch gekennzeichnet, dass man die bei der Chromatographie der Fermentationsbrühe von Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993 mit tert.Butylmethylether zur Abtrennung der Verbindung der Formel IIa erhaltenen Nebenfraktionen durch mehrfach aufeinanderfolgende Chromatographieschritte auftrennt. 12.

Pharmazeutische Zusammenbereitung, enthaltend eine Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6 zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Träger- und/oder Verdünnungsmitteln.