DE3012565C2

DE3012565C2 -

Info

Publication number: DE3012565C2
Application number: DE3012565A
Authority: DE
Inventors: Hideo Musashino Tokio/Tokyo Jp Koshiyama; Fumihide Yokohama Jp Sakai; Hiroaki Tokio/Tokyo Jp Ohkuma
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1979-04-02
Filing date: 1980-03-31
Publication date: 1990-11-08
Also published as: ES8104411A1; JPS63139191A; YU41700B; SU999981A3; FI67403B; AR223372A1; DE3012565A1; JPS63139192A; ZA801856B; AU5700280A; NL8001868A; JPH0341157B2; IE800598L; JPH0341475B2; HU184256B; NO155780B; AT371144B; AU533672B2; IL59746A0; DK138780A

Description

Die Erfindung betrifft die Peptide BBM 928 A, B, C und D und ein Verfahren zu ihrer Herstellung gemäß den voran stehenden Patentansprüchen.

Aufgrund der vorliegenden Spektraldaten und der physika lisch-chemischen Eigenschaften scheinen die erfindungsge mäßen antitumor-antibiotischen Peptide strukturell ver wandt zu sein mit der Chinoxalingruppe von Antibiotika, wie z. B. Echinomycin, Dell et al., J. Am. Chem. Soc. 97, 1975, S. 2497, Chinomycine, Shoji et al., J. Antibiotics 14A, 1961, S. 335 und Triostin C, Merck Index, 9. Aufl., 9399. Jedoch unterscheidet sich der antitumor-antibiotische Komplex BBM-928 von diesen Antibiotika in folgender Hin sicht:

1. Der vorliegende Komplex und seine Bestandteile enthalten als Chromophor einen Chinolinkern anstelle von Chinoxa lin, der bei der Actionoleukingruppe von Antibiotika vor handen ist.
2. Der vorliegende Komplex und seine Bestandteile enthalten keinen Schwefel, während in der Struktur der Aktinoleu kin-Antibiotika eine Disulfid- oder Thioacetalbrücke vorhanden ist.
3. Der vorliegende Komplex und seine Bestandteile besitzen nur eine verhältnismäßig geringe antimikrobielle Aktivi tät im Vergleich zu den Actinoleukinen, die starke anti bakterielle Antibiotika sind.

Der Komplex enthält wenigstens sechs Bestandteile und wird gewonnen durch Kultivieren eines BBM-928 produzierenden Actinomycetesstammes (ATCC 31491) oder einer Mutante in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen aeroben Bedingun gen und Trennung des Komplexes in seine bio aktiven Bestandteile durch Gegenstromverteilung oder chromato graphische Techniken.

Von den Zeichnungen zeigt

Fig. 1 ein Infrarot-Absorptionsspektrum von BBM-928A in KBr,

Fig. 2 das Infrarot-Absorptionsspektrum von BBM-928B in KBr,

Fig. 3 das Infrarot-Absorptionsspektrum von BBM-928C in KBr,

Fig. 4 das Infrarot-Absorptionsspektrum von BBM-928D in KBr,

Fig. 5 das NMR-Spektrum von BBM-928A, gelöst in deuteriertem Chloroform mit TMS als internem Standard, aufgezeichnet auf einem 90 MHz NMR-Spektrometer,

Fig. 6 das NMR-Spektrum von BBM-928B, gelöst in deuteriertem Chloroform mit TMS als internem Standard, aufgezeichnet auf einem 90 MHz NMR-Spektrometer,

Fig. 7 das NMR-Spektrum von BBM-928C, gelöst in deuteriertem Chloroform mit TMS als internem Standard, aufgezeichnet mit einem 90 MHz NMR-Spektrometer,

Fig. 8 das NMR-Spektrum von BBM-928D, gelöst in deuteriertem Chloroform mit TMS als internem Standard, aufgezeichnet auf einem 90 MHz NMR-Spektrometer.

Von diesem Komplex wird angenommen, daß er strukturell verwandt ist mit der Actino leukingruppe von Antibiotika. Er wird gebildet durch Fermenta tion von einem Stamm von Actino myceten, der in der Bristol-Banyu-Kulturensammlung als Actinomycetenspecies Stamm Nr. 6455-101 bezeichnet wird. Der Mikroorganismus wurde aus einer auf den Philippinischen Inseln entnommenen Bodenprobe isoliert und wurde bei der American type culture collection of microorganisms als ATCC 31491 hinterlegt.

Der neue antitumor-antibiotische Komplex besitzt mindestens sechs Bestandteile, die als BBM-928A B, C, D, E und F bezeichnet sind. Bestandteile A, B, C und D vom BBM-928-Komplex wurden in kristalliner Form isoliert, wobei die chemischen Strukturen der Bestandteile A, B und C identifi ziert wurden. Wegen der antibakteriellen Aktivität können der Komplex und seine einzelnen Bestandteile als Nahrungszusätze für Tierfutter und als therapeutische Mittel zur Behandlung von bakteriellen Infektionen bei Säugetieren eingesetzt werden. Zusätzlich kön nen die Antibiotika für die Säuberung und Sterilisierung von Laborglasgeräten und chirurgischen Instrumenten eingesetzt wer den und können in Verbindung mit Seifen, Waschmitteln und Wasch lösungen für sanitäre Zwecke verwendet werden. Aufgrund der Antitumor-Eigenschaften sind der Komplex und seine einzelnen Bestandteile speziell wirksam gegen eine Vielzahl von intra peritoneal implantierten Mäusetumoren.

Ein Gegenstand der Erfindung ist somit die antitumor antibiotische Verbindung BBM-928A, die dadurch gekennzeichnet ist:

(a) daß sie in Chloroform und Methylenchlorid löslich, in Benzol, Äthanol, Methanol und n-Butanol wenig löslich und in Wasser und n-Hexan im wesentlichen unlöslich ist;
(b) daß sie eine positive Reaktion mit Eisen-(III)-Chlorid und Ehrlich-Reagentien und eine negative Reaktion mit Tollens-, Sakaguchi- und Ninhydrin-Reagentien ergibt;
(c) daß sie ein wirksames Antitumormittel gegen P388-Leukämie, L1210-Leukämie, B16-Melanom, Lewis-Lungen-Karzinom und intraperitoneal in Mäuse implantierte Sarkom 180 Aszites tumore darstellt;
(d) daß sie einen Schmelzpunkt von 246 bis 248°C hat;
(e) daß sie eine spezifische Drehung von [α] = 27° (c 1, CHCl₃) aufweist;
(f) daß sie ein Molekulargewicht von 1427 besitzt;
(g) daß sie eine ungefähre elementare Zusammensetzung von 52,47% Kohlenstoff, 5,48% Wasserstoff, 13,81% Stick stoff und 28,24% Sauerstoff hat;
(h) daß sie bei der Silikageldünnschichtchromatographie mit einem Lösungsmittelsystem n-Butanol-Methanol-Wasser (63 : 27 : 10) einen R_f-Wert von 0,71 besitzt, und daß sie bei Verwendung eines Lösungsmittelsystemes Xylol-Methyl äthylketon-Methanol (5 : 5 : 1) einen R_f-Wert von 0,48 besitzt;
(i) daß sie bei der sauren Hydrolyse wasserlösliche Nin hydrin-positive Substanzen inklusive b-Hydroxy-N-methyl valin, Glycin, Serin und Sarcosin ergibt;
(j) daß sie bei der basischen Hydrolyse das Fragment VI ergibt: wobei Ser für Serin, Gly für Glycin, Sar für Sarcosin, HM-Val für β-Hydroxy-N-methylvalin und das Symbol X für eine Aminosäureneinheit steht;
(k) daß sie ein Infrarot-Absorptionsspektrum in KBr auf weist, das in der Fig. 1 gezeigt ist; und
(l) daß sie in deuteriertem Chloroform gelöst das in Fig. 5 gezeigte Protonen-NMR-Spektrum ergibt.

Die Aminosäureneinheit X besitzt die empirische Formel C₅H₆N₂O₂ und stellt, den Tetrahydropyridazinrest

dar.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die anti tumor-antibiotische Verbindung BBM-928B, die ein Chinolin chromophor enthält und die bei saurer Hydrolyse wasserlös liche Bestandteile inklusive Serin, Glycin, Sarcosin und β-Hydroxy-N-methylvalin ergibt, und die in ihrer im wesent lichen reinen Form dadurch gekennzeichnet ist:

(a) daß sie in Chloroform und Methylenchlorid löslich, in Benzol, Äthanol, Methanol und n-Butanol wenig löslich und in Wasser in und n-Hexan im wesentlichen unlöslich ist;
(b) daß sie mit Eisen-(III)-Chlorid und Ehrlich-Reagentien eine positive Reaktion und mit Tollens-, Sakaguchi- und Ninhydrin-Reagentien eine negative Reaktion ergibt;
(c) daß sie ein wirksames Antitumormittel gegen P388-Leukä mie, intraperitoneal in Mäuse implantiert, darstellt;
(d) daß sie einen Schmelzpunkt von 214 bis 217°C besitzt;
(e) daß sie eine spezifische Drehung von [a] = -74° (c 1, CHCl₃) aufweist;
(f) daß sie eine ungefähre elementare Zusammensetzung von 50,14% Kohlenstoff, 5,29% Wasserstoff, 12,34% Stick stoff und 32,23% Sauerstoff besitzt;
(g) daß sie bei der Silikageldünnschichtchromatographie mit einem Lösungsmittelsystem von n-Butanol-Methanol- Wasser (63 : 27 : 10) einen R_f-Wert von 0,53 und bei Ver wendung eines Lösungsmittelsystemes Xylol-Meethyläthyl keton-Methanol (5 : 5 : 1) einen R_f-Wert von 0,26 aufweist;
(h) daß sie das in Fig. 2 gezeigte in KBr aufgenommene Infrarot-Spektrum aufweist; und
(i) daß sie in deuteriertem Chloroform gelöst im wesent lichen das in Fig. 6 gezeigte Protonen-NMR-Spektrum aufweist.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem die antitumor-antibiotische Verbindung BBM-928C, die ein Chinolinchromophor besitzt und bei saurer Hydrolyse wasser lösliche Bestandteile inklusive Serin, Glycin, Sarcosin und β-Hydroxy-N-methylvalin ergibt und die in ihrer im wesentlichen reinen Form dadurch gekennzeichnet ist:

(a) daß sie in Chloroform und Methylenchlorid löslich, in Benzol, Äthanol, Methanol und n-Butanol wenig lös lich und in Wasser und n-Hexan im wesentlichen unlös lich ist;
(b) daß sie mit Eisen-(III)-Chlorid und Ehrlich-Reagentien eine positive Reaktion und mit Tollens-, Sakaguchi- und Ninhydrin-Reagentien eine negative Reaktion ergibt;
(c) daß sie ein wirksames Antitumormittel gegen P388-Leukä mie, L1210-Leukämie, B16-Melanom, Lewis-Lungen-Karzinom und intraperitoneal in Mäuse implantierte Sarkom 180- Aszites-Tumore darstellt;
(d) daß sie einen Schmelzpunkt von 244 bis 248°C besitzt;
(e) daß sie eine spezifische Drehung von [α] = -91° (c 1, CHCl₃) besitzt;
(f) daß sie ein ungefähres Molekulargewicht von 1470 be sitzt;
(g) daß sie eine ungefähre elementare Zusammensetzung von 51,77% Kohlenstoff, 5,29% Wasserstoff, 13,55% Stick stoff und 29,39% Sauerstoff aufweist;
(h) daß sie bei der Silikageldünnschichtchromatographie mit einem Lösungsmittelsystem von n-Butanol-Methanol- Wasser (63 : 27 : 10) einen R_f-Wert von 0,27 und daß sie mit einem Lösungsmittelsystem von Xylol-Methyläthyl keton-Methanol (5 : 5 : 1) einen R_f-Wert von 0,07 aufweist;
(i) daß sie im wesentlichen das in Fig. 3 gezeigte in KBr aufgenommene Infrarot-Absorptionsspektrum aufweist; und
(j) daß sie in deuteriertem Chloroform gelöst im wesent lichen das in Fig. 7 gezeigte Protonen-NMR-Spektrum aufweist.

Im folgenden wird der den antibiotischen Antitumor komplex BBM-928 produzierende Mikroorganismus generell be schrieben. Die kulturmäßigen, physiologischen und morphologischen Eigenschaften des Organismus wurden nach den üblichen taxonomischen Methoden bewertet, z. B. Shirling et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 16, 313 (1966) und Lechevalier et al., Biol. Actinomycetes Related Org. 11, 78 (1976).

Mikromorphologie

Der Stamm Nr. G455-101 bildet sowohl Substrat- als auch Luft myzele. Das Substratmyzel ist gut entwickelt, lang und ver zweigt (0,5-0,8 µ breit). Eine ausgeprägte Fragmentierung des Substratmyzels wird nicht beobachtet. Im Gegensatz zu gewöhnlichen Specien von Streptomyces bildet der Stamm G455-101 nur kurze oder rudimentäre Luftmyzele. In einigen Agarmedien werden über haupt keine gebildet. In dem Luftmyzel werden kurze oder lange Sporenketten gebildet, die 2-50 ovale Sporen in einer Kette (meistens 5-20 Sporen) enthalten. Die Sporenketten besitzen eine gerade, sich schlängelnde oder gewundene Form. Die Sporen be sitzen eine sphärische (0,3-0,4 µ), ovale oder zylindrische (0,3 × 1,5 - 3,0 µ) Form mit einer glatten Oberfläche. Die Sporen sind oft durch leere Hyphen voneinander getrennt. Ge legentlich wird eine amorphe Sporangium-ähnliche Blase auf dem Luftmyzel beobachtet, die kurze, spiralenförmige Sporen ketten umschließt.

Zellwandzusammensetzung und Gesamtzellzuckerbestandteile

Die Zellwand des Stammes G455-101 enthält Meso-diaminopimelin säure jedoch kein Glycin. Das Hydrolyseprodukt der gesamten Zelle zeigt die Anwesenheit von Glukose, Mannose und Madurose und Madurose (3-o-Methyl-D-galactose). Die zuvor erwähnte Zellwandzusammen setzung und die Gesamtzellzuckerbestandteile deuten darauf hin, daß der Stamm G455-101 eine Actinomycetesspecie des Zellwand typs IIIB ist.

Kulturmäßige und physiologische Charakteristika

Der Stamm G455-101 wächst reichlich, bildet ein blaß-rötliches oder gräulich-blaß-rötliches Luftmyzel und produziert in nährstoff reichen Agarmedien, wie Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar und Hafer mehlagar, ein rötliches, wasserunlösliches Pigment. Im anorgani schen Salz-Stärkeagar, Glycerin-Asparaginagar und Tyrosinagar wächst es spärlich, bildet ein weißes oder beiges rudimetäres Luftmyzel und produziert nur geringe Mengen des rötlichen Pig mentes. Das Melanoidpigment wird in Pepton-Hefe-Eisenagar und Tyrosinagar nicht produziert. Nitrat wird zu Nitrit reduziert. Es wächst reichlich bei 28°C, 37°C und 45°C, jedoch nicht bei 10°C oder 50°C. Pentosen und Hexosen werden gut von dem Stamm verwertet. Kulturmäßige und physiologische Charakteristika des Stammes G455-101 sind in den Tabellen 1 und 2 gezeigt. Die Verwertung von Kohlenstoffquellen ist in der Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 1

Daten von Kulturen des Stammes Nr. G455-101*)

Tabelle 2

Physiologische Daten des Stammes Nr. G455-101

Tabelle 3

Verwertung von Kohlenstoffquellen für Stamm Nr. G455-101

Die Herstellung der erfindungsgemäßen BBM-928-Peptide ist nicht auf den durch die oben genannten Wachstums- und mikroskopischen Daten beschriebenen Actinomyceten specien-Stamm Nr. G455-101 beschränkt. Diese Daten sind nur für beispielhafte Zwecke genannt. Es können auch Mutanten, die durch den oben beschriebenen Organismus mit Hilfe von konventionellen Mitteln des Standes der Technik hergestellt werden, wie Bestrahlung mit Röntgenstrahlen, Ultraviolettbestrahlung, Stickstofflost (Senfgas) oder Phagenbehandlung und die in der Lage sind, den BBM-928-Komplex oder einzelne Bestandteile von ihm herzustellen, verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der antitumor antibiotischen BBM-928-Peptide ist dadurch gekennzeichnet, daß der Actinomycetes-Stamm Nr. G455-101 in einer wäßrigen Lö sung, die eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimi lierbare Stickstoffquelle enthält, durch Fermentation unter submersen aeroben Bedingungen kultiviert wird, bis die Lösung eine beträchtliche antitumor-antibiotische Aktivität aufweist. Konventionelle Fermentationsmethoden werden für die Kultivie rung des Actinomycetes-Stamm Nr. G455-101 angewendet. Die für die Herstellung der erfindungsgemäßen antibiotischen Antitumor peptide zweckdienlichen Medien enthalten eine assimilierbare Kohlenstoffquelle wie Stärke, Glucose, Dextrin, Maltose, Lactose, Sucrose, Fructose, Mannose, Melasse oder Glycerin. Das Nährmedium sollte auch eine assimilierbare Stickstoffquelle enthalten, wie Protein, Proteinhydrolysate, Polypeptide, Amino säuren, Maisquellbrühe, Kasein oder Harnstoff und anorganische Nährsalze, die anorganische Anionen und Kationen liefern wie Kalium, Natrium, Ammonium, Calcium, Sulfat, Carbonat, Phosphat, Chlorid oder Nitrat.

Für die Herstellung des BBM-928-Komplexes kann jede für ein befriedigendes Wachstum des Organismus förderliche Temperatur angewendet werden. Die Temperaturen können zwischen ungefähr 20° und 45°C liegen, wobei die für ein optimales Wachstum des Organismus bevorzugte Temperatur zwischen ungefähr 28° bis 34°C, am besten jedoch zwischen 30° und 32°C liegt. Eine maximale Produktion des BBM-928-Komplexes wird im allgemeinen in ungefähr 4 bis 6 Tagen erhalten. Konventionelle Methoden werden während der Fermentation angewendet. Die Herstellung von klei nen Mengen wird z. B. geeigneterweise in Schüttelkolben oder mit tels Oberflächenkulturen durchgeführt. Die Herstellung von größeren Mengen wird unter submersen aeroben Kultu renbedingungen in sterilen Behältern durchgeführt. Bei der Behälterfermentation wird zuerst ein vegetatives Inoculum in einer Nährbrühe hergestellt. Dies geschieht durch Animpfen der Kulturbrühe mit einer Spore des Organismus, damit eine junge aktive Stammkultur erhalten wird, die dann aseptisch in das Medium des Fermentationsbehälters übertragen wird. Die Be lüftung in den Behältern und Flaschen kann durch Einblasen von steriler Luft durch oder auf die Oberfläche des Fermentie rungsmediums geschehen. Zudem wird das Fermentierungsmedium in den Behältern mit einem mechanischen Rührer gerührt. Anti schaummittel, wie Silikonöl, Sojabohnenöl und Schweinefettöl, können, falls erforderlich, hinzugefügt werden.

Der Antibiotika-Gehalt in der Fermentationsbrühe oder den Extrakten des BBM-928-Komplexes kann durch Papierscheibenagar- Diffusionsanalyse bestimmt werden, indem Sarcina lutea als Testorganismus und ein Nähragar als Analysemedium benutzt wer den. Für die optimale Empfindlichkeit des Analysesystemes, das für die Bestimmung der optimalen Wirksamkeit der Brühe benutzt wird, wird der pH auf 9,0 eingestellt.

Der BBM-928-Komplex wird mit konventionellen Mitteln wie Lösungs mittelextraktion aus der Fermentationsbrühe isoliert. Die Reini gung wird geeigneterweise durch präparative Gegenstromvertei lungs- und Chromatographierverfahren durchgeführt. Diese wer den noch eingehender in den Beispielen 2 und 3 bei der Gewinnung der BBM-928-Bestandteile A, B, C, D, E und F be schrieben.

Dadurch werden BBM-928-Bestandteile mit folgenden R_f-Werten isoliert:

Physikalisch-chemische Eigenschaften der BBM-928-Bestandteile A, B, C und D von Beispiel 3

Die einzelnen Bestandteile von BBM-928 zeigen eine einander ähnliche Löslichkeit und Farbreaktionen. So sind sie z. B. gut löslich in Chloroform und Methylenchlorid, wenig löslich in Benzol, Äthanol, Methanol und n-Butanol und unlöslich in Wasser und n-Hexan. Sie zeigen eine positive Reaktion mit Eisen-(III)- Chlorid un Ehrlich-Reagens und eine negative Reaktion mit Tollens, Sakaguchi und Ninhydrin.

Die charakteristischen physikalisch-chemischen Eigenschaften der BBM-928-Bestandteile des Beispiels 3 sind in der Tabelle 4 gezeigt.

In den Infrarot-Spektren zeigen

BBM-928A, B, C und D die folgenden Absorptionen (Wellen zahl in cm^-1), wobei s = stark, m = mittel, sw = schwach, b = breit, sh = Schulter.

BBM-928A, Fig. 1
ca. 3450 m, b; 3330 m, b; 2970 sh; 2920 m; 2840 sh; 1740 s; 1680 sh; 1640 s; 1530 s; 1490 m; 1420 m; 1395 m; 1340 m; 1290 m; 1230 s; 1195 m; 1150 sw; 1130 sw; 1025 m; 970 sw; 905 m; 830 m; 790 sw; 770 sw;
BBM-928B, Fig. 2
3450 m, b; 3330 m, b; 2950 m; 2930 m; 1740 s; 1670 s; 1640 s; 1530 s; 1480 m; 1420 m; 1340 m; 1290 m;
1230 s; 1195 m; 1150 sw; 1020 m; 970 sw; 905 m; 830 m; 760 m;
BBM-928C, Fig. 3
3380 m, b; 2920 m; 2840 sh; 1740 m; 1670 sh; 1650 s; 1530 s; 1485 m; 1430 m; 1340 m; 1285 m; 1225 m; 1195 sw; 1150 sw; 1025 m; 960 sw; 910 sw; 830 sw;
BBM-928D, Fig. 4
3470 m, b; 3320 m; 2950 m; 2930 sh; 1740 s; 1640 s, b; 1530 s; 1480 m; 1420 m; 1295 m; 1230 s; 1200 1170 sh; 1130 sh; 1040 m; 970 sw; 910 m; 830 m; 810 s 770 m;

In den NMR-Spektren zeigen

BBM-928A, B, C und D die folgenden Absorptionen (ppm):

BBM-928A, Fig. 5
11,7, 9,25, 9,15, 8,8, 7,65, 7,55, 7,45, 7,3, 6,9, 5,7, 5,5, 5,2, 4,45, 4,05, 3,9, 3,6, 3,25, 3,15, 2,9, 2,0, 1,25, 1,05;
BBM-928B, Fig. 6
11,6, 11,55, 9,3, 7,4, 7,25 , 6,9, 5,7, 5,3, 5,2, 4,5, 3,9, 3,25, 3,2, 3,1, 2,9, 2,35, 2,05 , 1,35, 1,05;
BBM-928C, Fig. 7
11,5, 9,3, 9,4, 8,75, 7,7, 7,6, 7,45, 7,25, 6,85, 5,65, 5,4, 5,2, 4,65, 4,2, 3,9, 3,65, 3,5, 3,2, 3,1, 2,85, 2,4, 1,8, 1,35, 1,05;
BBM-928D, Fig. 8
11,6, 9,25, 9,2, 7,65, 7,6, 7,4, 7,2, 7,15, 7,0, 6,9, 6,8, 5,8, 5,7, 5,5, 5,2, 4,4, 4,05, 3,9, 3,6, 3,3, 3,2, 2,95, 2,65, 2,3, 2,05, 1,3, 1,0.

Tabelle 4

Physikalisch-chemische Eigenschaften der BB-928-Bestandteile A, B, C und D

Infrarot-(IR) und kernmagnetische Resonanz-(NMR) Spektren der Bestandteile A, B, C und D werden jeweils in den Fig. 1 bis 4 und Fig. 5 bis 8 der begleitenden Zeichnungen gezeigt. Die NMR-Spektren von BBM-928A (Fig. 5), BBM-928B (Fig. 6) und BBM-928C (Fig. 7) ähneln einander sehr mit dem einzigen Unterschied, daß Acetylgruppen in den Bestandteilen A ( δ: 2,03 ppm, 2 Mol Äqui valente) und B ( δ: 2,05 ppm, 1 Mol Äquivalent) jedoch nicht in C vorhanden sind. Durch Acetylierung mit Acetanhydrid in Pyri din wurden 2, 3 und 4-molare Äquivalente von Acetylgruppen in die jeweiligen Bestandteile A, B und C von BBM-928 eingeführt. Die so erhaltenen Acetylierungsprodukte zeigen identische Eigen schaften in DC, UV, IR und NMR-Spektren, wodurch angezeigt wird, daß BBM-928A ein Monoacetylderivat von BBM-928B und ein Diacetyl derivat von BBM-928C ist.

Säurehydrolyse von BBM-928A ergab fünf in n-Butanol-lösliche UV-absorbierende Fragmente (I, II, III, IV und V) und fünf was serlösliche Ninhydrin-positive Substanzen (NPS-1, 2, 3, 4 und 5). Letzere Substanzen wurden durch Dowex® 50 × 4 Chromatographie getrennt und als folgende Aminosäuren identifiziert:

Die oben erwähnten fünf UV-absorbierenden Fragmente haben die folgenden Strukturformeln:

Nach Säurehydrolyse (6N HCl) ergeben die Fragmente I, II, III und V die folgenden Abbauprodukte:

Basische Hydrolyse von BBM-928A oder BBM-928C mit 0,1N NaOH bei 25°C für 3 Stunden ergibt Fragment VI (Abkürzungen Ser, HM-Val und Sar wie oben angegeben, wobei Gly = Glycin und das Symbol "X" eine unzugeordnete Einheit darstellen)

Die Behandlung von Fragment VI mit 0,1N HCl bei 110°C für eine Stunde ergibt das Fragment VII plus HM-Val:

Die Behandlung von Fragment VI mit 0,1N NaOH bei 37°C für 40 Stunden ergibt das Fragment VIII plus Fragment I:

X → Gly → Sar → HM-Val Fragment VIII

Die Behandlung von Fragment VII mit 0,1N NaOH bei 37°C für 40 Stunden ergibt das Fragment IX plus Fragment I:

X → Gly → Sar Fragment IX

Die unzugeordnete Einheit (X) besitzt eine Molekularformel von C₅H₆N₂O₂ (in Peptidform), bestimmt durch Mikroanalyse von Fragment IX und anderen Peptidfragmenten, die (X) enthalten, und Spektralanalysen, die weiter unten zusammengefaßt sind.

Gemäß den Spektraldaten für die Fragmente VIII und IX und einem 360 MHz Protonen-NMR-Spektrum von BBM-928A_p des Beispiels 4 scheint die nicht zugeordnete Aminosäureeinheit (X) am besten durch die folgende Tetrahydropyridazinstruktur wiedergegeben werden zu können:

Aufgrund der Ergebnisse der oben beschriebenen Abbauexperimente, Spektraldaten, Mikroanalysen und Molekulargewichtsbestimmungen wir angenommen, daß die nachfolgenden Strukturen BBM-928A, B und C am besten darstellen:

Antimikrobielle Aktivität

Die antimikrobielle Aktivität der BBM-928-Bestandteile wurde gegenüber einer Vielzahl von Bakterien und Pilzen mit Hilfe der Reihenagarverdünnungsmethode in einem Nähragar bei pH 7 bestimmt, wobei Steers Mehrfach-Impfvorrichtung benutzt wurde. Die Größe des Inoculums wurde standardisiert, um ein 0,0025 ml Ali quot des Testorganismus anzuwenden, das etwa 10⁴ Zellen/ml enthält, bezogen auf alle Bakterien und Pilze mit Ausnahme von säure beständigen Bakterien, für die eine Suspension mit 10⁶ Zellen/ml be nutzt wurde. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die Mindesthemmkonzentrationen (MIC) bestimmt, die in Tabelle 5 gezeigt sind. Wie dort zu sehen ist, sind die BBM-928-Bestandteile mäßig bis schwach aktiv gegen gram-positive und säurebeständige Bakterien, jedoch praktisch inaktiv gegen gram-negative Bakterien und Pilze.

Die Aktivität der prophagen Induktion im lysogenen Bakterium (ILB) wurde für die BBM-928-Bestandteile bestimmt. Die BBM-928- Bestandteile A, B und C weisen bis zu einer Konzentration von 100 mcg/ml keine signifikante ILB-Aktivität auf.

Tabelle 5

Antimikrobielle in vitro-Aktivität von BBM-928-Bestandteilen gegen aerobe Bakterien

Antitumor-Aktivität

Für die Antitumor-Aktivität der Bestandteile A, B, C und D von BBM-928 wurden Vergleichstests mit Mitomycin C mit intra peritoneal implantierten Tumoren durchgeführt: P388-Leukämie, L1210-Leukämie, B16-Melanom, Lewis-Lungen(LL)-Karzinom und Sarkom 180 Aszites (S180). Testlösungen von BBM-928-Bestandtei len in 0,9%iger Salzlösung, die 10% Dimethylsulfoxid ent hält, und von Mitomycin C in 0,9%iger Salzlösung wurden ein mal pro Tag entsprechend dem Dosierungsplan verabreicht. Dieser Dosierungsplan reichte von einer einmaligen Behandlung an einem Tag bis zu einer mehrtägigen Behandlung. Durch Variation der Dosis wurde die minimale effektive Dosis (MED) bestimmt, die bei den behandelten Tieren die Überlebenszeit mindestens um den Faktor 1,25 - im Vergleich zur Kontrollgruppe - vergrößert. Diese Aktivität wird als Maß einer signifikanten Antitumor- Aktivität betrachtet. Die Ergebnisse sind zusammen mit den berechneten Aktivitätsverhältnissen in der Tabelle 6 gezeigt, woraus sich ergibt, daß BBM-928A um den Faktor 10 bis 300 in Abhängigkeit von dem Tumorstamm und dem Dosierungsplan aktiver ist als Mitomycin C. Die nach der Methode von Van der Waerden, Arch. Expt. Path. Pharmak., 195, 389 (1940) bestimmten intra peritonealen LD₅₀-Werte von den BBM-928-Komponenten A, B, C und D und von Mitomycin C sind ebenfalls in der Tabelle 6 auf geführt.

Tabelle 6

Antitumor-Aktivität und Toxizität von BBM-928 A,B,C und D und Mitomycin C

Beispiel 1 Herstellung des BBM-928-Komplexes Agarfermentation

Ein gut angewachsener, Schräg-Agar eines Stammes von Actinomycetes Species G455-101 wird für die Animpfung des vege tativen Mediums benutzt, das 2% lösliche Stärke, 1% Glucose, 0,5% Pharmamedien, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NZ-Amin (Typ A) und 0,1% CaCO₃ enthält, wobei der pH vor der Sterilisation auf 7,2 einge stellt wird. Die Saatkultur wird bei 32°C für 72 Stunden auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung (250 Upm) inkubiert. Danach werden 5 ml der gewachsenen Kultur in einen 500 ml-Erlenmeyer- Kolben gegeben, der 100 ml des Fermentationsmediums enthält, bestehend aus 2%iger löslicher Stärke, 1% Pharmamedien, 0,003% ZnSO₄ · 7H₂O und 0,4% CaCO₃. Die Herstellung des BBM-928- Komplexes erreicht normalerweise nach 5 Tagen Schütteln ihr Maximum.

Behälterfermentation

Eine Samenkultur wird für 4 Tage in Erlenmeyer-Kolben geschüt telt und dann in 100 Liter des Keimungsmediums eingeimpft, das aus 2,0% Hafermehl (Quaker, Produkte, Australien), 0,5% Glucose, 0,2% trockene Hefe, 0,0008% MnCl₂ · 4H₂O, 0,0007% CuSO₄ · 7H₂O, 0,0002% ZnSO₄ · 7H₂O und 0,0001% FeSO₄ · 7H₂O besteht. Dieses Medium be findet sich in einem 200 Liter-Saatfermenter der bei 30°C 54 Stunden mit 200 Upm gerührt wird. 15 Liter dieser Saatkultur werden dann in 170 Liter des Fermentationsmediums eingeimpft, das 2,0% lösliche Stärke, 1,0% Pharmamedien, 0,003% ZnSO₄ · 7H₂O und 0,4% CaCO₃ enthält. Dieses Medium be findet sich in einem 400 Liter-Fermentierungstank, der bei 30°C mit 200 Upm gedreht wird, wobei die Belüftungsrate bei 150 Li ter/Minute liegt. Der pH der Brühe steigt schrittweise mit dem Fortschreiten der Fermentation und erreicht nach 100 bis 120 Stunden 8,4 bis 8,5. Zugleich wird ein Antibiotikum- Höchstwert von 30 µg/ml erhalten.

Beispiel 2 Isolation des BBM-928-Komplexes durch Lösungsmittelextraktion

Die aus dem Beispiel 1 erhaltene Brühe (170 Liter, pH 8,5) wird mit einem Klärungsmittel filtriert. Eine Aktivität wird so wohl in dem Myzelkuchen als auch in dem Filtrat beobachtet. Der Myzelkuchen wird zweimal mit einem Lösungsmittelgemisch aus Aceton und Methanol (1 : 1, 30 Liter × 2) extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und unter vermindertem Druck einge engt. Es ergibt sich ein wäßriges Konzentrat, das mit n-Butanol extrahiert wird. Das Filtrat der Brühe wird zweimal mit n-Butanol (40 Liter × 2) extrahiert. Die Einengung der vereinigten n-Butanolextrakte unter vermindertem Druck und die Lyophilisation des Rückstandes ergeben ein festes Rohprodukt (21,4 g). Gemäß der Dünnschichtchromatographie-Analyse enthält diese Material einen Komplex von drei Hauptbestandteilen A, B und C und drei Unterbestandteilen D, E und F, die die in der Tabelle 7 angegebenen R_f-Werte aufweisen.

Tabelle 7

Silikagel DC von DC von BBM-928-Bestandteilen

Beispiel 3 Reinigung des BBM-928-Komplexes

Der Rohkomplex des Beispiels 2 wird in einem präparativen Ge genstromverteilungsapparat (Mitamura, 100 ml/Röhre) gereinigt, wobei ein Lösungsmittelsystem von Tetrachlorkohlenstoff-Chloro form-Methanol-Wasser (5 : 2 : 5 : 1) verwendet wird. Nach 50 Durch gängen werden die Röhren Nr. 5 bis 20 vereinigt und konzentriert, was ein schwach-gelbes Pulver (4,4 g) ergibt, das die Bestand teile A, B, D, E und F enthält. Die Mischung wird in geringen Mengen von Chloroform gelöst und auf eine Säule von Silikagel C-200 (500 ml) gegeben, die mit Äthylacetat vorbehandelt wurde. Die Säule wird mit Äthylacetat entwickelt, wobei der Anteil an Methanol (2 bis 5%, V/V) steigt und die Fraktionen werden durch Messung der optischen Dichte bei 345 nm überwacht. Der geringere Bestandteil D wird zuerst mit Äthylacetat eluiert gefolgt von dem Bestandteil A. Die Bestandteile E, B und F werden danach in dieser Reihenfolge bei einer 3%igen Methanolkonzentration eluiert. Jede Fraktion, die die entsprechenden Bestandteile enthält, wird unter vermindertem Druck eingeengt und der Rück stand wird aus Chloroform-Methanol kristallisiert. In ähnlicher Weise wird die Rohherstellung des Bestandteiles C aus den Röhren Nr. 21 bis 35 der oben beschriebenen Gegenstromverteilung durch geführt. Die Reinigung des Bestandteiles C wird mit Silikagel chromatographie und Kristallisation aus Chloroform-Methanol durchgeführt. Ausbeuten für die Bestandteile A, B, C, D, E und F sind jeweils 988 mg, 420 mg, 848 mg, 130 mg, 119 mg und 114 mg.

Beispiel 4 Weitere Reinigung des Bestandteiles BBM-928A des Beispiels 3

Die Dünnschichtchromatographie-Analyse des BBM-928A-Bestand teiles des Beispiels 3 (wobei ein System von 10% Methanol in Toluol benutzt wird) zeigte, daß die Probe nicht vollständig homogen war. Sie enthielt zusätzliche Substanzen, die gerade vor dem BBM-928A-Bestandteil liefen. Die folgenden Schritte wur den unternommen, um eine Reinigung durchzuführen.

(1) Die Probe wird auf Silikagel chromatographiert, wobei ein linearer Gradient von Chloroform nach 6% Methanol in Chloro form eingestellt wird. Die bei 2,4 bis 3,3% Methanol in Chloroform eluierten Fraktionen (den BBM-928A-Bestandteil und etwas Verunreinigung enthaltend) werden für die nächste Stufe zusammengegeben.
(2) Ein konkaver Gradient wird dadurch eingestellt, daß drei Gefäße benutzt werden, die 2% Methanol in Toluol in den beiden ersten und 6% Methanol in Toluol in dem dritten enthalten. Die bei diesem Gradienten chromatographierten zusammengegebenen Fraktionen aus Stufe 1 (Silikagelsäule) ergeben einen kleineren Anteil, der als erstes eluiert wird, dicht gefolgt durch den gereinigten Bestand teil BBM-928A (hier bezeichnet als BBM-928A_p).

Molekulargewicht von BBM-928A_p, bestimmt durch Feld-Desorptions massen-Spektrometrie, beträgt 1427 und entspricht einer empirischen Formel von C₆₄H₇₈N₁₄O₂₄ (MW 1427.417).

Elementaranalyse (Proben getrocknet bei 100°C für 18 Stunden) für C₆₄H₇₈N₁₄O₂₄:
ber.: C 53,85; H 5,51; N 13,74; Oa) 26,90%;
gef.^b): C 52,47; H 5,48; N 13,81; Oa) 28,24a%.

a) durch Differenz
^b) Durchschnitt von drei Bestimmungen.

Claims

1. Peptide BBM-928A, B und C der allgemeinen Formeln in der Ser Serin, Gly Glycin, Sar Sarcosin, HM-Val β-Hy droxy-N-methylvalin und R₁ und R₂ Acetyl bedeuten, und die Verbindung BBM-928D, dadurch gekennzeichnet:
daß sie in Chloroform und Methylenchlorid löslich, in Benzol, Ethanol, Methanol und n-Butanol wenig löslich und in Wasser und n-Hexan im wesentlichen unlöslich ist; eine positive Reaktion mit Eisen-(III)-Chlorid und Ehrlich-Reagentien und eine negative Reaktion mit Tollens-, Sakaguchi- und Ninhydrin-Reagentien ergibt; einen Schmelzpunkt von 224 bis 227°C besitzt; eine spezifische Drehung von [α] = -13° (c 1, CHCl₃) besitzt;
eine ungefähre elementare Zusammensetzung von 50,75% Kohlenstoff, 5,25% Wasserstoff, 12,58% Stickstoff und 31,42% Sauerstoff besitzt;
bei der Silikageldünnschichtchromatographie mit einem Lösungsmittelsystem von n-Butanol-Methanol-Wasser (63 : 27 : 10) einen R_f-Wert von 0,73 und mit einem Lösungs mittelsystem von Xylol-Methylethylketon-Methanol (5 : 5 : 1) einen R_f-Wert von 0,53 aufweist;
ein in KBr aufgenommenes Infrarot-Spektrum mit folgenden charakteristischen Banden aufweist:
3470 m, b; 3320 m; 2950 m; 2930 sh; 1740 s; 1640 s, b; 1530 s; 1480 m; 1420 m; 1340 m; 1295 m; 1230 s; 1200 m; 1170 sh; 1130 sh; 1040 m; 970 sw; 910 m; 830 m; 810 sw; 770 m;
und
in deuteriertem Chloroform ein Protonen-NMR-Spektrum mit folgenden charakteristischen chemischen Verschie bungen aufweist:
11,6, 9,25, 9,2, 7,65, 7,6, 7,4, 7,2, 7,15, 7,0, 6,9, 6,8, 5,8, 5,7, 5,5, 5,2, 4,4, 4,05, 3,9, 3,6, 3,3, 3,2, 2,95, 2,65, 2,3, 2,05, 1,3, 1,0.

2. Verfahren zur Herstellung der Peptide nach An spruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise einen Actinomycetesstamm G455-101 (ATCC 31491) in einer wäßrigen Lösung, die eine assimilier bare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoff quelle enthält, unter submersen aeroben Bedingungen kul tiviert, die Verbindungen BBM-928 aus dem Kulturmedium isloliert und in die Bestandteile trennt.