PL84893B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowego antybiotyku, oznaczonego symbolem G-418, na drodze hodowli nieznanego dotychczas gatunku rodzaju Microimonospora, a mianowicie Miciromonoisp-ara rhodorangea.Wynalazek obejmuje równiez sposób wytwarza¬ nia farmaceutycznie dopuszczalnych pochodnych nowego antybiotyku G-418 takich, jak sole addy¬ cyjne z kwasami i pochodne oksazolidynawe za¬ sady Schiffa, które równiez sa cennymi antybio¬ tykami.Mikroorganizm Micromonospora rhodorangea (czasami w dalszej czesci opisu nazywany M. rho- doirangea) zostal zaklasyfikowany jako nowy ga¬ tunek Miciromonospora ze wzgledu na swoje wla¬ sciwosci taksonomiczne i wlasciwosci wzrostu na róznych standartowych agarowych pozywkach.Kolonie mikroorganizmu na takich pozywkach ma¬ ja wyglad ozerwono-pomairanczowy i dlatego mi¬ kroorganizm nazwano Miciromonospora rhodoran¬ gea. Charakterystyczna cecha tego gatunku jest wytwarzanie antybiotyku G-418. Mikroorganizm Micromonospofra rhodorangea zostal zdeponowany w kolekcji rniikTooTganiizimów w Northern Utiliza- tion Research and Development Division Mini¬ sterstwa Rolnictwa St. Zjedn. Ameryki, Peoria, Illinois, pod numerem NRRL 5326.Wlasciwosci mikroskopowe, makroskopowe i bio¬ chemiczne mikroorganizmu M. rhodorangea opi¬ sano ponizej.Obserwacja makroskopowa 30-dniowej hodowli inkuibawanej w temperaturze 24—26°C na pozyw¬ ce, zawierajacej 3% NZ Aminy Typ A, l°/o dek- strozy i 1,5% agaru wykazuje slaby wzrost bez widocznych cech odrózniajacych. Obserwacja mi¬ kroskopowa tej samej hodowli wykazuje grzybnie o srednicy okolo 0,4—0,8^ i rzadko rozgaleziona.Sporadycznie zaobserwowano chiamydospory, jed¬ nakze nie zaobserwowano prawdziwych zarodni- ków. Stiwierdzono wiec, ze mikroorganizm na¬ lezy do gatunków niezarodnikujacych. Obserwacje mikroskopowe hodowli na agarze Emersona, aga¬ rze Bemetta, wyciagu z dirozdzy-agarze dekstro- zowym i na agacnze skrobiowym sa zasadniczo ta- is kie same„ jak opisano wyzej.Mikroorganizm jest aerobowy i moze byc do¬ godnie hodowany w temperaturze 20—40°C i przy wartosci pH = 6,5—8,5. Korzystna jest tempera¬ tura 28^35°C i zakres pH = 7,2^-8,3. W tempera- turze równej lub wyzszej od 45°C nie ma w ogóle wizrostu. Micrornonoispora irhodoirangea redukuje azotany.Przy opisywaniu mikroorganizmu M. rhodoran¬ gea zastosowano dwa oznaczenia zabarwienia.Pierwsze oznaczenie zaczerpnieto z „Color Ha«r- mony Manual" IV wydanie, 1958, opublikowane przez Container Corporation of America (St. Zjedn.Ameryki), a opis pierwszego oznaczenia zabarwie¬ nia zaczerpnieto z „Descriptive Color Name Di- ctionary" Taylora, Knochea i Granvillea, rów- 8489384893 3 niez opublikowanego przez Conitainer Corporation of America (1960). Drugie oznaczenie zabarwienia jest syntoniimem lub bLLskiim synonimem pierw- szego oznaczenia i jest zaczerpniejte z National Buireau of Standards Circullar Nr 558(1956) St.Zjedn. Ameryki.Charakterystyke mikroorganizimu M. rhodoran- gea zamieszczono *w ponizszych tablicach 1, 2 i 3.Tablica 1 Obserwacje kolonii Micronionospora rhodorangea na róznych pozywkach Pozywka Asparagina t Agar 1 £«iLaixna , Mleko 1 Sacharoza Skrobia 1 Celuloza 1 Sacharoza Czapka Agar (Fidco) 1 Agar Bennetlta Pasta pomidoro¬ wa Majka owsiana Agar ~Glljikaza Wyciag z droz¬ dzy Agar 1 Plaster ziem¬ niaka Sacharoza Azotan Agar Czapka Tyrozyna z diroz- . dzy Agar Tyrozyna z mie^ sa wolowego ((Obserwacje w 2, 7 i 14 dniu wedlug Gordo¬ na i Smitfra, J. Bact. 69 : .147) Pepton Zelazo Agar Obserwacje w 2, 7 i 14 dniu Obserwacje brak wzrostu slabo skraplajaca sie | wzrost dojbry, calkowita hy¬ droliza, kolonia pofaldowa¬ na, zabarwienie gopa ja¬ skrawo koralowo czerwone, zywe czerwonawo pomaran¬ czowe 34 | Zuzytkowana | wzrost dobry, calkowita hy¬ droliza | rozklad | wzrost slaby, plaski, zabar- 1 wlenie g7pl wina burgundz- kiego, ciemno szarawe, czerwonawo brazowe 47 | wzrost dobry, pofaldowany, membranowy, brak grzybni powietrznej, brak przeni- kalnego pigmentu, zabar¬ wienie g 6 pg chinska czer¬ wien, ciemne czerwonawo pomaranczowe 36 | wzrost slaby, nierejestro- walny wzrost umiarkowany, mem- 1 branowy, brak grzybni po¬ wietrznej, brak przenikalne- igo pigmenitu, zabarwienie g 6 pg czerwone, stonowane czerwonawo brazowe 43 brak wzrostu wzrost slaby, plaski, zabar- 1 wienie g 7 1/2 pi ciemnego wina, ciemne czerwonawo brazowe 44 | wzrost dobry, pofaldowany, 1 krysztaly rozpuszczalne, cie¬ mno bursztynowy przeni- kalny pigment | wzrost slaby, plaski, krysz¬ taly nierozpuszczalne, jasny bursztynowy przenikalny pigment brak wzrostu 45 50 55 60 Roztwór glikozy Czapka \ Bromokrezol purpurowe mleko wzrost w 3 i 10 dniu slaby, staiitatura — bardzo sub¬ telny klaczkowaty osad, za¬ barwienie matowe zóltawo- Hpomaranozawe, obecne w bulionie po 10 dniach inku¬ bacji peptyzacja calkowita, za- ! barwienie ciemno kasztano- "" wate Tablica 2 Zastosowanie wejglowodanów Weglowodan L <+) Airabinoza D <—) Arabinoza Celuloza D (+) Glikoza D <—) Galakfcoza B — Laktoza 1 D (—) Lewuioza (Fruktoza) D (+) Mannoza D <+) Rafiinoza L (+) Rarnnoza Skrobia 1 Sacharoza D (+) Ksyloza i — Inozdtoil D <+) Mannitol Sorbital Wzorzec — 0,5% wy¬ ciag drozdzy Obserwacje wzrost umiarkowany wzrost umiarkowany | Wzrost dlostateczny . wzrost dobry wzrost dostateczny 1 wzrost dostateczny 1 wzrost slaby^ | wzrost dobry 1 wzrost slaby | wzrost slaby 1 wzrost dobry 1 wzrost dobry 1 wzrost dobry 1 wzrost slaby 1 wzrost slaby 1 wzrost slaby 1 wzrost slaby | Tablica 3 Zastosowanie zródel azotu 65 Zródlo azotu +\L*/t glikozy 0^5°/o Diifico wyciag drozdzy 1% NZ Amina Typ A l°/o Asparaginy Obserwacje wzirost umiarkowany, mem¬ branowy, brak grzybni po¬ wietrznej, brak przenikal- nego pigmentu, zabarwienie g 6 1/2 pg czerwone, ciem¬ ne czerwonawo brazowe 41 wzrost dostateczny, plaski, z bruzdami, brak grzybni powietrznej, brak przenikal- nego pigmentu, zabarwienie g 6 pc chinska czerwien, ciemne czerwonawo poma¬ ranczowe 36 wzrost slalby, plaski, brak ] grzybni powietrznej, brak przenikalnego pigmentu, za¬ barwienie g 6 pi brazowy mahon, ciemne czerwonawo- -brazowe 41 "84893 6 1% kwas gluta¬ minowy 1% azotanu sodu lVo azotanu amonu wzrost slaby, plaski, brak grzybni powietrznej, brak przenikalnego pigmentu, za¬ barwienie g 7 pi ciemnego wina, ciemne ezerwonawo- -brazowe 44 brak wzrostu 1 brak wzrostu 1 W tablicy 4 podano porównanie M. rhodorangea z innymi Mioromonospora, wytwairzajacymi anty¬ biotyki.Fermentacje Micromonosipora rhodorangea pro¬ wadzi sie znanymi metodami wytwarzania anty¬ biotyków na drodize hodowli mikroorganizmów.Znaczna ilosc" antybiotyków jest wytwarzana w hodowli odpowiedniego mikroorganizmu w wod¬ nej pozywce hodowlanej, zawierajacej zdolne do asymilacji zródla wegla i azotu, w warunkach aerobowych, korzystnie podpowierzchniowych.Przykladami zdolnych do asymilacji zródel wegla Sporofiory dlugie 1 Sporofory rozgalezione Sparofory krótkie 1 Wzrost na agarze odzywiczym 1 Wzrost na ziemniaku I Rozpuszczanie zelatyny 1 Hydroliza skrobi Inwersja sacharozy Rozklad celulozy Przeciwdzialanie Tablica 4 Porównanie Micromonaspora rhodoranges z M. puir- ipuirea NRRL 2063 tak*) itakx) dostatecz¬ ny do slabego slaby tydzien tak .tak atakowa¬ na w sla¬ bym stopniu Genita- mycyny M,. echi- nospora NRRL 2085 tak tak tak dostatecz¬ ny do slabego slaby tydzien tak tak atakowa¬ na w sla¬ bym stopniu Genta- mycyny M. casrbonacea var. carbonacea NRRL 2972 tak tak tak dostateczny do slabego dostateczny tak tak tak atakowana w slabym stopniu Bwerninomy- cyny innymi Micromonspora M. carbonacea var. auiranMaca NRRL 2007 tak tak tak dostateczny do slabego dostateczny tak tak tak atakowana w slabym stopniu Bwerninomy- cyny M. mega- lomicea NRRL 3274 i 3275 (tak tak tak slaby brak nie tak tak brak Megalo- mycyny M. irhodo- raogea .NRRL 5026 brak ibrak brak slaby slaby tak tak (tak tak Antybdo- 1 tyk G-41B *) zarodnikowanie slabe lub znikajace 55 sa weglowodany takie, jak wymienione w tablicy 2, zwlaszcza glikoza, ksyloza i mannoza. Przylkla- daani zródel azotu sa proteiny i aminokwasy oraz substancje je zawierajace takie, jak wyciag z mie¬ sa wolowego, wyciag z drozdzy i maczka sojowa, so Dobry wzrost i wytwarzanie antybiotyku mozna osiagnac, stosujac przy prowadzeniu fermentacji postepowanie opisane dalej w przykladzie I.Pozywki w celu zwiekszenia wytwarzania anty¬ biotyku mozna uzupelnic sladowymi ilosciami soli nieorganicznych takich, jak siarczan magnezu, siarczan zelaza, a zwlaszcza chlorek kobaltu. Fer¬ mentacje na ogól prowadzi sie w dwóch lub trzech etapach. Pierwszy etap lub dwa pierwsze etapy 60 sa przeznaczone do kielkowania mikroorganizmu w celu wytworzenia wlasciwej szczepionki. Fer^ mentacja w kadzi wymaga dwóch etapów kielko¬ wania, podczas gdy fermentacja we wstrzasanej kolbie wymaga tylko jednego etapu kielkowania, es Kielkowanie prowadzi sie w warunkach aerobo¬ wych, stosujac mieszanie, korzystnie obrotowe np. przy 250—400 obrotach na minute, zazwyczaj w temperaturze 25—36° etap fermentacji (etap produkcyjny) .rozpoczyna sie przez zaszczepienie w sterylnych warunkach odpowiedniej pozywki, za pomoca uprzednio przy¬ gotowanej sizczepionki. Etap ten prowadzi sie w (takiej samej temperaturze, jak etap kielkowania, ii zazwyczaj wymaga on 4—7 dni w celu osiagnie¬ cia maksimum aktywnosci. W odróznieniu od eta¬ pu kielkowania* gdizie wartosc pH jest na ogól istala, etap produkcyjny wymaga regulacji wanto- isci pH w giranicach 7,2—8,3.W czasie fenmentaciji, zwlaszcza po pierwszych 24 godzinach, pobiera sie próbki (np. w kazdej 6—8 godzinie), w celu okreslenia momentu osiag¬ niecia maksimum aktywnosci antylbiotycznej. Pró¬ ba jest korzystnie standardowa próba szczepienia na krazku, przy zastosowaniu standarodowej po-84893 8 zyiwiki i organizmu badanego. Pelny opis korzyst¬ nych prób podano w ostatniej czesci opisu.Gdy osiagnie sie maksimum aktywnosci anty¬ toksycznej, produkt wydziela sie zazwyczaj na drodze kombinacji czynnosci takich, jak zakwa¬ szenie, saczenie, adsorpcja, elucja i odparowanie, np. liofilizacja. W korzystnej metodzie wyodreb¬ niania produktu, wyttrajca sie obecne jony wapnia w postaci nierozpuszczalnej soli, bulion zakwasza sie, korzystnie kwasem mineralnym, a nastepnie mieszanine fermentacyjna klaruje sie przez sa¬ czenie lub wirowanie. Po neutralizacija, antybiotyk adsorfouje sie na odpowiedniej zywicy kationowy- miennej, np. slabo kwasnej zywicy jonowymien¬ nej w postaci soli amoniowej, eluowanej za po¬ moca rozcienczonych alkalii, korzystnie Wodoro¬ tlenku amonu, a nastepnie izoluje przez odparo¬ wanie, np. liofilizacje. W metodzie szczególnie ko- irzystnej, do bulionu, w celu wytracenia wapnia w postaci nierozpuszczalnego szczawianu, dodaje sie 5—8 g/litr roztworu fermentujacego, kwasu szczawiowego i pH doprowadza sie do wartosci = 2 za pomoca mocnego kwasu mineralnego, np. 6n kwasu siarkowego w celu wyodrebnienia anty¬ biotyku z grzybni. Po odsaczeniu, klarowny bulion neutralizuje sie wodorotlenkiem amonu, antybio¬ tyki adsorbuje sie na Airuberfliicie IRC-50 NH4+ —50 mesh (zywica jonowymienna,, Rohm and Haas, Filadelfia, Pensylwania), a wyekstrahowa¬ ny bulion odrzuca sie. Zestaw antybiotyków elu- uje sie z zywicy zasada, korzystnie 2n wodoro¬ tlenkiem amonu, eluat zateza sie do malej objeto¬ sci pod obnizonym cisnieniem/'i odparowuje do sucha, np. na drodze liofiliizacji.Po hodowli Micromonospora rhodorangea, su¬ rowy produkt otrzymany po etapie izolacji, pod¬ dano analizie chromatograficznej i bioautogra- ficznej. Zaobserwowano wiele obszarów hamowa¬ nia. Np. przy uzyciu ukladu chromatograficznego, skladajacego sie z butanonu-2,III-rzedjbutanoiu, metanolu i stezonego amoniaku w stosunku obje¬ tosciowym 16:8:1:6, na papierze Whaitimana nr 4, chromatografia zstepujaca, w ciagu nocy (16 go¬ dzin), wykryto na drodze biioautografii jeden glówny i okolo 5 pobocznych produktów prze¬ ciwko Stapnylococcus aureus ATCC 6638 P. Anty¬ biotyk G-418 (glówny produkt) jest najmniej po¬ larny z calej grupy.Wymienione nizej dane fizykochemiczne i roz¬ pad chemiczny pozwalaja na stwierdzenie, ze struktura antybiotyku G-418 odpowiada wzoro¬ wi 1. Standartowa analiza chromatograficzna czy¬ stego antybiotyku G-418 • daje nastepujace wyniki. 45 50 I. CMoroform-metanol-ste¬ zony amoniak na Ohiro- mar 506 (wstepujaca) XI. bu/tanon-2-III-rzed. bu- tanol-metanolHstezony amoniak (zstepujaca) 1X1. 809/o wodny roztwór fe¬ nolu (wstepujaca) IV. metanol-iwoda+3tyo NaCl (zstepujaca) V. propanol-pirydyna-kwas octowy-woda .(wstepujaca) Rt <,4i0 (16 godz.) •0,24 i0^32 &<34 Rt — 0,611 odleglosc .sitrefy od punktu (wyjsciowego odleglosc od punktu wyjsciowego do konca bibuly w czasie t Antybiotyk G-418 jest antybiotykiem" aminogli- kozydowym i nalezy do klasy antybiotyków, do której naleza gentamycyna, reomycyna, paromo- .mycyna, sizomycyna i kanamycyna. Antybiotyk G-418 dogodnie izoluje sie w postaci amorficz¬ nego bialego ciala stalego, majacego nastepujace stale fizyczne: temperatura topnienia 138—144°C storecalnosc +14ia0±90 (c = .0,3, H£), ciezar cza¬ steczkowy (spektrometria masowa) = 497, wzór empiryczny — C2oH40010N4 (zasada), C2oH40010N4. 2H2SO4 (siarczan).Widmo magnetycznego rezonansu jadrowego (,NMR), otrzymane dla roztworu, zawierajacego IStyo antybiotyku G-418 w deutero-metanolu z do¬ datkiem 3°/o czterometylosilanu jako wewnetrzne¬ go wzorca, przedstawiono na fig. 4.Widmo w podczerwieni (IJt) (próbka w zawie¬ sinie w oleju o nazwie handlowej Nujol) przed¬ stawiono na fig. 3 i ma ono nastepujace charak¬ terystyczne pasma absorpcyjne. 3,yft2 \i i(S) 9,07 [i (,S) 111,06 \i (W) 6,32 ^i i(M) 9,49 \i i(S) \18fi5 \i i(W) 7J6 \i i(W) 9,77 ul i(S) 13,87 \i (W) 8,70 \i (S) — mocne, (M) — srednie, (W) — slabe W tablicach 5 i 6 podano inne wiasciwoisci che¬ miczne i fizyczne antybiotyku G-4tl8.Analize mikrobiologiczna antybiotyku G-418 pro¬ wadzi sie wedlug standartowej analizy zaszcze¬ piania krazków przy zastosowaniu pozywki anty- ibiotycznej Difco nr 5 i Baciilus suibtilis A.T.C.C. 6633 jako organizmu badanego. Fizyczne warunki Tablica 5 Testy klasyfikacyjne antybiotyku Siarczan antybiotyku G-418 Wywoly¬ wanie ininhy- dryna dodatni Reagent Sakaguchi ujemny Podchloryn iskrobi KI dodatni Test Elsona Morgana ujemny9 84893 Tablica 6 Rozpuszczalnosc (Terminologia wedlug Farmakopei St. Zjedn. Ame¬ ryki XVIII sir. 8) Rozpuszczalnik Metanol Chloroform Benzen Antybiotyk G-418 trudno rozpusz- ozalny bardzo slabo roz¬ puszczalny nierozpuisz- czalny Siarczan antybiotyku G-418 nierozpusz¬ czalny bardzo slabo roz¬ puszczalny nierozpusz¬ czalny testu sa opisane przez Grove'a i Randalla dla neomycyny w „Aissay Metliodis of Antibiotics", wydanego przez Medical Encyklopedia Incorpora- ted (1955). Próbe prowadzi sie w porównaniu ze standartowa próbka antybiotyku G-418 o zdefi¬ niowanej mocy równaj' IiOOiO mcg/img. Jeden mi- krogram tego wzorca daje w próbie strefe hamo¬ wania 16,5±1*5 mm. Wzorcowy siarczan antybio¬ tyku ma moc 750 mcg/img w porównaniu z wzor¬ cem antybiotyku w postaci zasady.Wytwarzany sposobem wedlug wynalazku nowy antybiotyk G-418 ma charakter zasadowy i two¬ rzy sole addycyjne z kwasami nieorganicznymi i organicznymi.Przykladami kwasów sa: kwas siarkowy, chlo¬ rowodorowy, fosforowy, p-toluenosulfonowy, bur¬ sztynowy, maleinowy, octowy, propionowy, cyklo- propanokairbokisylowy, adamantanokarboksylowy, piroslazowy, benzoesowy i fenylooctowy. Do soli zalicza sie równiez pochodne metali alkalicznych soli antybiotyków z kwaisaimi dwoi lub trójzasa- dowyimi. Sole sa na ogól rozpuszczalne w woclzie i wytwarza sie je przez dzialanie na wodny roz¬ twór antybiotyku stechiometryczna iloscia kwasu i liofilizowanie otrzymanego roztworu. Sole mozna równiez wytracac z roztworu wodnego przez do¬ danie mieszajacych sie z woda rozpuszczalników talkach, jak nizsze ketony alkilowe np. aceton, niz¬ sze alkohole np. metanol, cykliczne etery np. czte- irowodbrofmrara luib trzeciorzedowe amidy np. dwu- metyloformaimiid lufo diwuetyloacetamid.Antybiotyk G^418 tworzy równiez pochodne oksazolidynowe zaisad Sdhififia z aldehydami. Ko¬ rzystne pochodne tiworzy sie przez kondensacje antybiotyku z alifatycznymi, aiicykilicznymd, aro¬ matycznymi lub heterocyklicznymi aldehydami, zawierajacymi do 12 atomów wegla, nsp. acetal- dehydem, propionaldehydem, furfurolem, cyklo- ipentyloacetaUdehydem, wanilina, prrodokisalem, al¬ dehydem weratrowym, maslowym, akiroleina, sali- dylowym, bursztynowym, krotonowym, benzoeso¬ wym i p-nitirobenzoesowym.Farmaceutycznie dopuszczalne pochodne dksazo- lidynowe zasad Schiffa wytwarza sie przez dzia¬ lanie na alkoholowy roztiwór antybiotyku w po¬ staci zas&dy z wolnym azotem nadmiarem alde¬ hydu lub jego reaktywnej pochodnej takiej, jak acetal, zwlaszcza acetal dwuetylowy, nastepnie mieszanie otrzymanego roztiworu w temperaturze 40 45 50 55 60 otoczenia w ciagu 1 godziny i oziebienie roztworu w celu wytracenia produktu, zazwyczaj w postaci krystalicznej. Jak widac ze wzoru l, antybiotyk G-418 ma 3 pierwszorzedowe grupy aminowe, z których kazda moze tworzyc zasade Sdhdififa. Anty¬ biotyk ma ponadto drugorzejdowa grupe aminowa i sasiadujaca z nia trzeciorzedowa grupe hydro¬ ksylowa, które to grupy w reakcjirz aldehydem tworza pierscien okisaizolijdynowy. Tak wiec, gdy antybiotyk reaguje z nadmiarem aldehydu o wzo¬ rze Ri CHO lub jego reaktywna pochodna, cztery mole aldehydu reaguja z kazdym modern anty¬ biotyku, dajac pochodna oksazolidynowa zasady Schiffa o wzorze 2, w których B,% korzystnie ozna¬ cza rodnik alkilowy o 1—11 atomach wegla, rod¬ nik cykloalkilowy o 3—liii atomach wegla, rodnik cykloalkiioalkilowy o 4—0.1 atomach wegla, albo rodnik aromatycznoheterocykldczny lufo aaroma/tycz- noheterocykloalkdiowy o 5—11 atomach wegla.Pochodne oksazolidynowe zasady Schiffa nie sa dostrzegalnie rozpuszczalne w wodzie, sa nato¬ miast rozpuszczalne w zwyklych rozpuszczalnikach organicznych takich, jak chloroforcm, mefcanol,; ace¬ ton, octan etylu lub podobne. Pochodne te sa nietrwale w rozpuszczalnikach organicznych, za¬ wierajacych slady wody, i przetasztalcaija sie w wolny antybiotyk. Obecnosc sladów kwasu ulatwia te rewersje.W dalszej czesci opisu omówiono wlasciwosci biologiczne wytwarzanego sposobem wedlug wy¬ nalazku antybiotyku G-418. Wyniki standartowych metod badania aktywnosjci przecdiwfoaikiteryjnej in vitro antybiotyku G-418 przeciwko róznym bakte¬ riom gram-dodatnim i gram-aijjemnyim ze&tajwiono w tablicach 7 i 8.Wyniki badan dzialania prizeciiwfolalkteryjnego in vivo antybiotyku G-418 podano w tablicy 9.Badania prowadzono na myszach Garworch Farms CF-1 wagi 18—210 g, podzielonych na 7 grup. Zabezpieczenie (PDM) in vivo okreslano przez wstrzykiiwaoie myszom dootrzewnowe smier¬ telnej dawki patogennych bakterii. Jedna grupa myszy byla grupa kontrolna, pozostale otrzymaly rózne pojedyncze dawki antybiotyku G-418 w go¬ dzine pózniej. Grupa kontrolna zmarla w ciagu 18—«24 godzin. Po 48 godzinach od momentu infek¬ cji obliczono ilosc myszy zyjacych w kazdej gru¬ pie, która otrzymala antylbiotyk G-416. Wyniki Tablica 7 Aktywnosc przeciwbakteryjoa in vitiro Pozywka: tryptoza Bulion fosforanowy o wartosci pH = 7A—7,5 Organdizm Staphylococcus aureus 209P Gray Wood Ziegler Streptococcus sp. C C0O3 Escherichia coli Sc 894 Klebsiella pneumoniae DA20 Pseudomonas aeruginosa VA6 | 37 Minimalne stezenie hamu¬ jace 0,8 V 0,8 •0,8 25 1^*5 3,0 , 7,5 3,0 3.0 17,5 111 84893 12 Tablica 8 Aktywnosc przeaiiwibakteryjna im vitro Bulion Muellera-Hintona o wartosci pH = 7,2—7,5 Organizmi Bacillus subtilis Staphylococcus aureus 1 Streptococcus sp.Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis morgami i rettgeri 6633 12 1257 Sm 1 6 23 26 32 27 16245 6589 3045 777 887 1262 1236 83 12453 8019 9260 Minimalne hamujace stezenie (mog/ml) 3,0 3y0 0,3 0,3 0,3 0,3 3,0 U, 7£ 7,5 7,5 7,5 7,5 3,0 3,0 1 17,5 17,5 3,0 7,5 7,5 0,8 0,3 analizowano standartowymi metodami statystycz¬ nymi dla okreslenia wartosci PDM z &5#/o prawdo¬ podobienstwem prawddlowosci wymilku.W tablicy 10 zestawiono wyniki badan, ilustru- jace dzialanie preeciwpierwotniakowe antybiotyku G-418. Badanie prowadzono na 3—4 tygodniowych samicach szczurów Royal Hart. Test byl mody¬ fikacja testu opisanego przez R. J. Schmitzera w „Exiperiimental Ohemotherapy", str. 355—443, tom 1, Academic Press, Nowy Jork (1963).Tablica 9 Aktywnosc przeeiwibaikteryjna in vivo A. Dzialanie 'zabezpie¬ czajace orgianiizim Staphylococcusaureus szary Escherichia coli Sc 1 Staiphyaococcus aureus St. M nr 1 1 Pseudomonas aerugi- nosa nr 1 B. Chroniczne zatru¬ cie Droga podawania podskórnie doustnie podskórnie podskórnie podskórnie dozylnie PPso mg/kig i 2,5 40 U* 3,0 .0 LD50 imgAkg ' 140 | Jak wykazano powyzej, antybiotyk G-418 oraz jego farmaceutycznie dopuszczalne pochodne sa wysoce aktywnymi antybiotykami, które niepo¬ myslnie oddzialywuja na wzrost gram-dodatnich i gram-ujemnych mikroorganizmów. Np. wykazu¬ ja dzialanie zwalczajace Staphylococcus au/reus, Sitreptococous pyogenes,, Bacillus Subtiiis, Escheri¬ chia coli, Salomonella, Klebsiella, Proteus i Pse¬ udomonas. Antybiotyk G-418 ponadto hamuje roz¬ wój robaków takich, jak Syphacia obvelata i Hy- menolepsia nana oraiz pierwotniaków, zwlaszcza pierwotniaków pasozytujacych takich, jak Tricho- Tabid ca 10 ^Doustne dzialanie antybiotyku G-418 i porównaw¬ czych substancji w zwalczaniu eksperymentalnych zakazen jelita slepego przez E. Hdstolytica u szczu¬ rów Preparat Antybio¬ tyk G-418 1 Paromo- mycyna 1 Metroni- dazol Grupa kontrolna dawkowa¬ nie wody Dawka 1 doustna m(g/1kg/ dzien 26 (12,5 6J5 6,5 6,6 3,6 3,6 12 iliO 6,5 6,5 6,5 3,5 3j5 26 13 6,5 6j5 6t5 Dni dawiko- waniia <6 6 3 1 6 3 1 6 3 6 6 .3 a 6 3 1 6 3 6 6 6 3 1 6 Parazy¬ tolo¬ giczne Leczni- cze/cal- kowiite /19 24/24 7/7 4/7 4/4 4/5 2/6 /6 0/7 6/7 4/8 2/6 0/7 2/4 1/5 0/4 1/6 1/7 IM 2/6 1/4 0/3 0/4 4/45 A.D.I.* 0 0 0 0,7 0 04 1.0 0£ 1,7 0 0,8 1,0 2,1 1,3 w 1,0 1* 0j8 0,8 U 2J2 monas vagdnalis i Entaimoeba hijstolytdca. Anty¬ biotyk G-418 jest jednakze nieaktywny przeciwko drozdzom i nitkowatym grzybom takim, jak Sac- charomyces, Candida, Aspergillus i Trichophyton.Antyfbdotyk G-418 i jego farmaceutycznie dopu¬ szczalne pochodne moga byc stosowane w warun¬ kach in vivo lub in vifcro. Moga byc stosowane do hamowania wzrostu lub niszczenia wrazliwych ga¬ tunków wymienionych wyzej organizmów, a w pola¬ czeniu z mydlami i detergentami do usuwania tych organizmów z powierzchni wyposazenia laborato¬ ryjnego, narzedzi chirurgicznych, laboratoryjnych naczyn szklanych i podobnych. Z uwagi na dziala¬ nie in vivo, antybiotyki i ich farmaceutycznie do¬ puszczalne pochodne moga byc stosowane do nisz¬ czenia lub hamowania wzrostu wrazliwych orga¬ nizmów pasozytujacych u ssaków takich, jak my¬ szy, szczury, koty, psy i bydlo.Antybiotyk i jego farmaceutycznie dopuszczalne pochodne moga byc równiez stosowane do leczenia * A.D.I. oznacza sredni stopien zakazenia, opar¬ ty na calkowitych obserwacjach zmian patologicz¬ nych jelita slepego i makroskopowych obserwa¬ cjach ilosci wykrytych ameb. Obserwacje te sa oceniane wedlug skali 0-^4, przy czym 0 oznacza zasadniczo normalne jelito slepe. Nietraktowane antybiotykiem, lecz zakazone zwierzeta kontrolne wykazuja sredni stopien zakazenia 2—4, podany w tablicy jako srednio 2,2. 40 45 50 55 6013 84893 M Przyklad II. Wyodrebnianie antybiotyku G-418. Do 20 1 bulionu fermentacyjnego dodaje sie 130 g kwasu szczawiowego przy intensywnym mieszanki.* Waintosc pH bulionu doprowadza sie do 2 za po¬ moca 6 n kiwaisu siarkowego. Mieszanine miesza sie w ciagu 30 minut i przesacza. Osad przemywa sie woda wodociagowa, az przesacz bedzie bez¬ barwny. Wode z przemywania laczy sie z uprzed- w nio otrzymanymi przesaczem i doprowadza pH do wartosci = 7^za pomoca 6 n wodorotlenku amonu.Roztwór przepuszcza sie nastepnie przez kolumne, wypelniona 250 g zywicy jono-wymiennej IRC-60 w postaci amonowej, z szybkoscia 50—^5 md/mi- nute. Zloze zywicy przemywa sie az do otrzymaT nia bezbarwnego przesaczu, a antybiotyk eluuje sie za pomoca 2 n wodorotlenku amonu. Eluat zateza sie pod obnizonymi cisnieniem i liofilizuje. Otrzy¬ muje sie 5 g surowego antybiotyku, który wyka- zuje aktywnosc 106 mcg/mg. Chromatografia bi¬ bulowa tego antybiotyku w ukladzie zstepujacym, skladajacym sie z butanonu-2, Ill-rzed. butanolu, i stezonego wodorotlenku amonu w stosunku 16 : 3 :1: 6, oraz bioautograifia przeciwko Staphy- lococcus auireuiss ATCC 6508 P daje bdoautogram, skladajacy sie zasadniczo z jednej plamy z kil¬ koma slabo widocznymi mniejszymi plamami. Wy¬ nika z tego/ ze antybiotyk G-4,18 jest prawie je¬ dynym zwiazkiem*. *•• Przyklad III. Czesciowe oczyszczenie anty¬ biotyku G-41j8'. 4 g antybiotyku, otrzymanego w przykladzie II, rozpuszcza sie w 100 ml wody.Wartosc pH roztworu doprowadza sie do 4,2 za pomoca 2 , n . kwasu siarkowego i dodaje 250 mg aktywowanego wefife .^drzewnego. (Darco G-60, Atlas Powder Go., Wilimington, Delaware). Zawie¬ sine miesza sie w ciagu okolo 1 godziny i prze¬ sacza. Przesacz zateza sie do objetosci 50 ml i wy¬ traca z niego osad przez dodanie 500 ml metanolu.Osad odsacza sie, przemywa metanolem i roz¬ puszcza w 20 ml wody. Przygotowuje sie kolumne z IRA-401S (Amberlitowa zywica jono-wymienna- -Rohm ahd Haas, Filadelfia, Pensylwania), o na¬ stepujacych wymiarach: wysokosc 65 cm, srednica wewnetrzna 25i cm, -ilosc zywicy 200 g. Roztwór antybiotyku przepuszcza sie przez kolumne, a na¬ stepnie przemywa ja zdejonizowana woda. Eluat zateza sie do objetosci 20 ml pod obnizonym cisnie¬ niem i liofilizuje.; Otrzymuje sie 800 mg —1,2 g antybiotyku G-418 o aktywnosci 480 mcg/mg. chorób spowodowanych przez wymienione organi¬ zmy u ludzi.Do stosowania in vivo antybiotyk G-41)8 oraz jego farmaceutycznie dopuszczalne pochodne for¬ muje sie w odpowiednie postacie do terapeutycz¬ nego podawania, np. w polaczeniu z farmaceuty¬ cznym nosnikiem lub dodatkiem do leków. Prepa¬ raty farmaceutyczne moga byc w postaci jedno¬ stkowych dawek np. o okreslonym ksztalcie. Ko¬ rzystnymi postaciami leków sa preparaty w am¬ pulkach do wstrzykiwania ailbo masci, kremy lub plyny.Pochodne oksazolidyinowe zasady Schiffa anty¬ biotyku G-4,18 moga byc, jesli to pozadane, stoso¬ wane w postaci roztworu w srodowisku organi¬ cznego rozpuszczalnika (np. w postaci nalewki).Moga byc równiez stosowane miejscowo, w postaci kremów i masci, wtedy gdy pozyteczne jest uzycie substancji tluszczowych.Nastepujace przyklady ilustruja sposób wedlug wynalazku.Przyklad I. Kadziowa fermentacja Micro- monospora rhodarangea.A. Pierwszy etap kielkowania. Do 1000 ml wody dodaje sie 3 g wyciagu z miesa wolowego, 5 g tryptozy, 5 g wyciagu z drozdzy, 1 g dekstrozy, 24 g storobii i 2 g weglanu wapniowego. Otrzyma¬ na mieszanine ogrzewa sie, mieszajac, az wszystkie, skladniki stale beda jednolicie rozproszone i/lub rozpuszczone. Nastepnie mieszanine dzieli sie na równych czesci objetosciowych i przenosi do wstrzasanych kolb o pojemnosci 300 ml. Pozywke sterylizuje sie w temperaturze iai°C, pod cisnie¬ niem 1,06 kG/cm2 w ciagu 20 minut# a nastepnie ochladza do temperatury pokojowej. Wartosc kaz* dej kolby zaszczepia sie w sterylnych warunkach za pomoca 5 ml przygotowanego uprzednio swie¬ zego bulionu. Hodowle prowadzi sie w ciagu 3 dni w temperaturze 35°C, stosujac mieszanie obrotowe z szybkoscia 3O0 obir/min.B. Drugi etap kielkowania. Do.500 mi sterylnej po¬ zywki, otrzymanej sposobem wyzej opisanym, przenosi sie w sposób aseptyczny 25 ml pozywki po pierwszym etapie kielkowania i hoduje w cia¬ gu 3 dni w temperaturze 2(8°C, stosujac mieszanie obrotowe z szybkoscia 300 obr/min.C. Fermentacja. W kadzi fermentacyjnej o poje¬ mnosci 14 1 przygotowuje sie 10 1 pozywki fer¬ mentacyjnej o nastepujacym skladzie: 350 g maki sojowej, 500 g dekstryny, 50 g dekstrozy^ ¦ 70 g weglanu wapniowego, 130 mag chlorku kobalto¬ wego i 10 1 wody. Zawartosc kadzi sterylizuje sie w temperaturze 12/1/C \ pod cisnieniem 1,05 ikG/cm2 w ciagu 30 minut, a naistejpnie chlodzi do temperatury pokojowej. Pozywke fermentacyjna zaszczepia sie za pomoca 500 ml szczepionki po drugim etapie kielkowania w warunkach asepty- cznych. Fermentacje prowadzi sie w temperatu¬ rze okolo 3i5°C, wprowadzajac powietrze w ilosci 2y5—6 1 na minute. Pozywke miesza sie z szyb¬ koscia 250—500 obr/min. Fermentacje prowadzi sie do osiagmiecia maksimum aktywnosci, która okre¬ sla sie poprzednio opisanymi sposobami. Nastepnie postepuje sie, jak opisano w przykladzie II.Przyklad IV. Dalsze oczyszczenie antybio¬ tyku G-4il8 i wytwarzanie jego siarczanu. 2,6 g antybiotyku G-416, otrzymanego w przykla¬ dzie III, rozpuszcza sie w 260 ml wody i dopro¬ wadza sie pH do wartosci = 4,2 za pomoca roz¬ cienczonego (1—Gnjji]Jowasu siarkowego. Nastepnie do roztworu dodaje sie 5 g Darco G-60 i miesza w ciagu 1 godziny w temperaturze pokojowej. Za¬ wiesine saczy sie i przesacz zateza sie do sucha pod obnizonym cisnieniem. Pozostalosc rozpuszcza sie w 20 ml wody i otrzymany roztwór wkrapla do 500 ml metanolu przy intensywnym mieszaniu.Otrzymana zawiesine saczy sie, osad przemywa sie metanolem i suszy w temperaturze 40°C pod 40 45 50 55 6015 84893 16 obnizonym cisnieniem. Otrzymuje sie 3,36 g siar¬ czanu antybiotyku G-4|18 o aktywnosci 700 mcg/img..Bnzez zastapienie kwasu siarkowego równowazna ilosc innego kwasu nieorgjainiciznego lub organi¬ cznego i zastosowanie acetonu do wytracenia osadu, otrzymuje sie inne sole addycyjne z kwa¬ sami. PL PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenia patentowe ¦1. Sposób wytwarzania nowego antybiotyku G-418 o wzorze 1, ewentualnie w postaci fairma- ceutycznie dopuszczalnych soli addycyjnych z kwa¬ sami lub pochodnych oksaizoiidynowych zasad Sehififa, znamienny tym, ze szczep z nowego ga¬ lo 15 tuniku Micromonosipo«ra rhodarangea, zwlaszcza szczep NRRL 5306 poddaje sie hodowli w srodo¬ wisku odzywczym, w warunkach aerobowych, wy¬ tworzony antybiotyk G-418 wyodrebnia sie, a na¬ stepnie ewentualnie przeprowaidza w sole addy¬ cyjne z kwasami lub pochodne oksaaolidynowe zasad Sdhiffa. 2. Sposób wedlug zaistnz. 1, znamienny tym, ze mikroorgainizm poddaje sie hodowli podpowierz- chniowej w srodowisku odzywczym, w warunkach aeroibowych. 3. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie w temperaturze 2(0—40°C, przy wartosci pH = 6^5—8,5. 4. Sposób wedlug zasttrz. 3, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie w temperaturze 28—36°C, przy wartosci pH = 7, 2^8,3 . CHoCHOH R1CH-NCH3 Wzór N=CHR{ N=CHR1 OH N^CH^ Wzór84893 -— tfCcnf'] 4000 3000 2000 1500 CM"1 tOOO 900 800 700 3 4 S 6 7 8 9 10 II 12 13 K 15 AC/43- FIG.3 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0

1.0 O FIG.4 PL PL PL