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Verfahren zur Herstellung der Erdalkalisalze des Antibioticums Cycloserin
Die Erfindung betrifft die Herstellung der Erdalkalisalze des antibiotisch wirksamen
Cycloserins.
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Das Verfahren der Erfindung wird durchgeführt, indem man entweder
Cycloserin in wäßriger Lösung mit einer Erdalkalibase umsetzt oder eine wäßrige
Aufschlämmung des Silbercycloserins mit einem wasserlöslichen Erdalkalisalz versetzt,
dessen Anion mit dem Silberion des Silbercycloserins ein wasserunlösliches Silbersalz
bildet, dieses von der Lösung abtrennt und die Cycloserinsalzlösung im Vakuum gefriertrocknet.
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Das Antibioticum Cycloserin ist ein bakterizid wirkendes Mittel von
großer Wirkungsbreite, das sowohl gegen gramnegative als auch grampositive Bakterien,
einschließlich der Mycobakterien, z. B. Mycobacterium ranae, wirksam ist. Das neue
Antibioticum wird durch eine Mikroorganismenart gebildet, der man den Namen Streptomyces
orchidaceus gegeben hat. Das Antibioticum ist eine amphotere Verbindung, die schwach
saure und schwach basische Gruppen besitzt, in Wasser sehr gut löslich, in Glykolen,
Isopropylalkohol, Methanol, Äthanol und Aceton zum Teil löslich und in Hexan, Benzol,
Chloroform, Äther, Petroläther, Dioxan, Butanol-(1), Essigsäureäthylester und Äthylendichlorid
unlöslich ist. Das Cycloserin schmilzt unter Zersetzung bei etwa 152'
und
wird dann durch 1 n-Salzsäure bei 140' hydrolytisch gespalten.
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Zur Herstellung des neuen Antibioticums Cycloserin wird der Mikroorganismus
Streptomyces orchidaceus unter Luftzufuhr bei etwa 20 bis 30' in einer Nährstofflösung
gezüchtet, die eine geeignete Eiweiß- und eine geeignete Kohlehydratquelle enthält.
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Es wurde festgestellt, daß Cycloserin in der freien Form in wäßriger
Lösung verhältnismäßig unbeständig ist. Der größte Teil der Wirksamkeit des Cycloserins
geht nämlich in wäßriger Lösung bei Raumtemperatur schon nach etwa 1 bis
2 Tagen verloren. Diese Tatsache läßt die Anwendung des Antibioticums als nicht
zweckmäßig erscheinen, da nur die frisch bereitete wäßrige Lösung verwendet werden
kann.
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Verhältnismäßig beständig sind die Alkalisalze des Cycloserins. Aber
sie sind so hygroskopisch, daß sie nicht leicht in der Salzform gewonnen werden
können.
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Die nach dem Verfahren der Erfindung herstellbaren Erdalkalisalze
des Antibioticums Cycloserin können leicht und in guter Ausbeute erhalten werden,
sind nicht hygroskopisch, also auch lagerfähig, und sind in wäßriger Lösung lange
beständig. Die neuen Cycloserinsalze können durch Zugabe des Cycloserins in freier
Form zu einem Erdalkalihydroxyd, 20minütiges Rühren der Mischung, Filtrieren und
Gefriertrocknung des Filtrats im Vakuum hergestellt werden. Die neuen Salze können
auch durch Aufschlämmen des Silbersalzes des Cycloserins in Wasser, Zugeben eines
wasserlöslichen Erdalkalisalzes, das ein zur Bildung eines unlöslichen Silbersalzes
befähigtes Anion, z. B. ein Chlorion besitzt, Abtrennen des ausgefällten Silbersalzes,
z. B. des Silberchlorids, von der Lösung des Erdalkalisalzes des Cycloserins und
Trocknen der Salzlösung durch Gefriertrocknung im Vakuum hergestellt werden. Diese
Umsetzung wird bevorzugt mit Calcium-, MLagnesium-, Barium- oder Strontiumchlorid
durchgeführt.
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Das Silbersalz des Cycloserins kann nach verschiedenen Verfahren gewonnen
werden. Nach einem dieser Verfahren wird die filtrierte Nährstofflösung, in welcher
das Antibioticum Cycloserin durch Züchtung des Organismus Streptomyces orchidaceus
gebildet wurde, mit Holzkohle behandelt und nach dem Abfiltrieren Kohle bei einem
pl,-Wert zwischen 5,5 und 9,0 mit Silbernitrat versetzt. Das ausgefällte
Silbersalz des Cycloserins wird sodann von der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt
und getrocknet. Aus dem Silbersalz kann freies Cycloserin durch Zusatz von Salzsäure
zur wäßrigen Aufschlämmung des Silbersalzes und Entfernung des Silberchlorids aus
der sich ergebenden wäßrigen Lösung des Cycloserins und Trocknen der Lösung nach
einem geeigneten Verfahren, z. B. durch Sprühtrocknung oder durch Gefriertrocknung
im Vakuum, gewonnen werden; dabei entsteht trockenes, amorphes, freies Cycloserin.
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Dem Silbercycloserin gegenüber, das unlöslich ist, sind die Erdalkalisalze
wegen ihrer hohen Löslichkeit in Wasser vorteilhafter, da man Lösungen des Cycloserins
herstellen
kann, die die in Wasser beständigen Erdalkalisalze enthalten,
während freies Cycloserin inWasser unbeständig ist.
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Die Erdalkalisalze des Cycloserins lassen sich medizinisch verwenden.
Es sind große Mengen z. B. des Bariumsalzes an Menschen innerlich verabreicht worden,
ohne daß sich Störungen oder Schädigungen irgendwelcher Art eingestellt hätten.
Vor allem steht aber auch der äußerlichen Anwendung dieser Produkte nichts im Wege.
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Die verschiedenen Erdalkalisalze des Cycloserins haben folgende Eigenschaften.
| Cycloserinsalze des |
| Bariulns Strontiums Magnesiums Caleiums |
| Zersetzungspunkt ..... etwa 195' etwa 200' etwa
200' etwa 200' |
| 0/, Cycloserin ......... 45,7 50,7 48
' 9 56,8 |
| orale tödliche Dosis LDO 4001 mg je kg >4000 mg
je kg >4000 mg je kg 1000 mg je kg |
| LD50 710 ± 35 mg je kg - - 2250 ± 358 mg
je kg |
| LD,00 ............... iooomgjekg 1 4000 mg
je kg |
Zur Bestimmung der Wirksamkeitseinheit des Cycloserins werden Agar-Penicillin-Testplatten
benutzt, die mit M. pyogenes var. aureus PCI 209P oder ATCC
6538P
beimpft
worden sind (vgl. hierzu Teil 141 a der Food and Drug Administration's )Compilation
of Regulations for Tests and Methods of Assay and Certification of Antibiotic and
Antibiotic-containing Drugs<,). Genau abgemessene Mengen Cycloserin, in 111/,igem
Phosphatpuffer, pH-Wert
= 6,0, gelöst, werden auf eine Reihe von Agax-Penicillin-Testplatten
aufgebracht, bei denen nach 16stündiger Bebrütung bei
37' die Durchmesser
der mit den verschiedenen Cycloserinmengen erhaltenen Hemmzonen (auf
0,1
mm genau) festgestellt und mit der Wirkung der Standard-Penicillinmenge verglichen
werden.
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Oder aber die Bestimmung der Wirksamkeitseinheit erfolgt mit Hilfe
eines Farbreagenzes (Natriumnitritpentacyanferrat, NaFe [CNJ" [N 0,#)
und einerEichkurve, mit einem Beckman-Spektralphotometer Modell DU.
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Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung. Beispiel
1
10 g Silbersalz des Cycloserins mit einer Wirkungsmenge von 2,45
Einheiten je mg wurden in 100 cm3 Wasser aufgeschlämmt und mit
2,64g wasserfreiem Calciumchlorid versetzt. Zu dieser Aufschlämmung wurden
unter Rühren 20/, Aktivkohle gegeben, und sodann wurde das Silberchlorid-Aktivkohle-Gemisch
abfiltriert. Die klare Lösung wurde im Vakuum der Gefriertrocknung unterworfen.
Hierbei wurden 4,6 g Calciumsalz des Cycloserins mit 2,3 Einheiten
je mg mit einem Gehalt von 17,310/, Calcium und 15,9 0/, Feuchtigkeit
erhalten.
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500 mg Calciumsalz des Cycloserins wurden in
5 cm3 Wasser
gelöst und die Lösung 456 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt. In regelmäßigen
Abständen wurden Proben zur Prüfung der Cycloserinwirksamkeit entnommen. Die folgende
Tabelle gibt die Ergebnisse der Beständigkeitsprüfung des Calciumsalzes des Cycloserins
in wäßriger Lösung bei Raumtemperatur wieder.
| Tabelle 1 |
| Calciumsalz des Cycloserins |
| Stunden 0 Stunden 4 Stunden
27 Stunden 99 Stuln2de 3 n St unde 147
n St unden 171 Stunden 348 Stunden 456 |
| Einheiten je cm3 ............. 225 216 231 230 228
228 250 230 222 |
Zum Vergleich wurden 40 mg freies amorphes Cycloserin in
1 cm3 Wasser gelöst
und
216 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt. In regelmäßigen Zeitabständen
wurden Proben zur Wirksamkeitsprüfung entnommen. Die folgende Tabelle zeigt die
Ergebnisse der Beständigkeitsprüfung.
| Tabelle 2 |
| Freies amorphes Cycloserin |
| 24 48 72 144 168 216 |
| Stunden Stunden Stunden Stunden Stunden Stunden
Stunden |
| Einheiten je cra3 ........... 205 110 75 55 39 39
29 |
In ähnlicher Weise wurden 120 mg freies kristallisiertes Cycloserin in
1 cm3 Wasser gelöst und
36 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt.
In regelmäßigen Zeitabständen wurden Proben zur Wirksamkeitsprüfung ent- i nommen.
Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse der Beständigkeitsprüfung.
| Tabelle 3 |
| Freies kristallisiertes Cycloserin |
| 0 1,5 24 36 |
| Stunden Stunden tunden Stunden |
| Einheiten je cm3 590 1 400 116 71 |
Den Tabellen kann man entnehmen, daß das Calciumsalz des Cycloseri-ns innerhalb
einer Zeitspanne, in der das amorphe und das kristalline Cycloserin praktisch ihre
gesamte antibiotische Wirksamkeit verlieren, beständig bleibt.
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Beispiel 2
zu 50 cm3 Wasser, das
7,75 g Bariumhydroxyd
Ba
(0 H),
- 8 H,
0 enthielt, wurden
5 g Cycloserin in
der freien Form gegeben. Die Mischung wurde 20 Minuten gerührt und sodann filtriert.
Das Filtrat wurde im Vakuum der Gefriertrocknung unterworfen, wobei
7,35 g
Bariumsalz des Cycloserins mit
2,9 Einheiten je mg und einem Gehalt von
39,27 "/, Barium erhalten wurden.
Eine Lösung von
100 mg Bariumsalz des Cycloserins in
1 cm3 Wasser wurde
288 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt. In regelmäßigen Zeitabständen
wurden Proben zur Wirksamkeitsprüfung entnommen. Die folgende Tabelle zeigt die
Ergebnisse der Beständigkeitsprüfung.
| Tabelle 4 |
| Bariumsalz des Cycloserins |
| 0 1 24 144 192 288 |
| Stunden Stunden Stunden Stunden Stunden |
| Einheiten 300 310 |
| 300 280 |
| 292 |
| je cm3 .... |
Beispiel
3
5 g Cycloserin in der freien Form wurden zu
50 cm3
Wasser, das 6,47
g Strontiumhydroxyd Sr
(OH) 2
- 8 H,
0
enthielt, gegeben. Die Mischung wurde 20 Minuten gerührt und sodann filtriert.
Das Filtrat wurde im Vakuum der Gefriertrocknung unterworfen, wobei
6,5 g
Strontiumsalz des Cycloserins mit 3,4 Einheiten
je mg und einem Gehalt von
31,91 "/, Strontium erhalten wurden.
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Eine Lösung von
100 mg Strontiumsalz des Cycloserins in
1 cm.3 Wasser wurde
288 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt. In
regelmäßigen Zeitabständen wurden Proben zur Wirksamkeitsprüfung entnommen. Die
folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse der Beständigkeitsprüfung.
| Tabelle 5 |
| Strontiumsalz des Cycloserins |
| 0 24 144 |
| St192 1 288 |
| Stunden Stunden Stunden unden Stunden |
| Einheiten |
| je cm3 .... 345 350 336 |
| 336 322 |
Beispiel 4
10 g Silbersalz des Cycloserins, in
50 cm.3 Wasser
aufgeschlämmt, wurden mit 4,84g Magnesiumchlorid,
Mg C12 - 6 H,
0, und 2 "/, Aktivkohle versetzt. Dann wurde die Mischung gerührt und filtriert.
Die klare Lösung wurde im Vakuum der Gefriertrocknung unterworfen, wobei 4,65
g Magnesiumsalz des Cycloserins mit
3,8 Einheiten
je mg und
einem Gehalt von 9,430/, Magnesium erhalten wurden.
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Eine Lösung von
100 mg Magnesiumsalz des Cycloserins in
1 cm.3 Wasser wurde
168 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt. In
regelmäßigen Zeitabständen wurden Proben zur Wirksamkeitsprüfung entnommen. Die
folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse der Beständigkeitsprüfung.
| Tabelle 6 |
| Magnesiumsalz des Cycloserins |
| 0 24 48 120 144 168 |
| Stunden Stunden Stunden Stunden Stunden Stunden |
| Einheiten je cm3 ................ 380 310 262
246 260 262 |