DE1219174B - Verfahren zur Gewinnung von d-Cycloserin aus Kulturfluessigkeiten - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. α.:

C12d

Deutsche Kl.: 30 h - 6

Nummer: 1219174

Aktenzeichen: W 36684IV a/30 h

Aomeldetag: 29. April 1964

Auslegetag: 16. Juni 1966

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von d-Cycloserin aus Kulturflüssigkeiten. Cycloserin ist bekanntlich ein wertvolles Heilmittel, das auf die gegenüber dem größten Teil der Tuberkulosepräparate resistenten Stämme wirkt.

Bekannte Verfahren zur Gewinnung von Cycloserin bestehen in der Reinigung der Kulturflüssigkeiten durch Ansäuern sowie einer Behandlung mit Aktivkohle und Filtrieren mit nachfolgender Sorption des d-Cycloserins durch Sulfokationen oder Anionenaustauscher, Desorption (Elution) mittels einer schwachen wäßrigen Ammoniaklösung, einer lyophilen Trocknung, einer Extraktion des getrockneten Pulvers mit Methanol und schließlich einer Behandlung mit Aceton. Nach einem anderen Verfahren wird das d-Cycloserin aus dem Eluat durch Ausfällen mit Hilfe von Silbernitrat und Zerlegung des Salzes mit einer wäßrigen Mineralsäure gewonnen.

Diese Verfahren sind mit einer Reihe wesentlicher Nachteile behaftet, unter welchen besonders die umständliche Vorreinigung der Kulturflüssigkeiten und die Unwirtschaftlichkeit der Gewinnung des Cycloserine aus dem Eluat, verursacht durch den großen Aufwand an organischen Lösungsmitteln, die lyophile Trocknung und die Verwendung des kostspieligen Silbernitrats sowie eine geringe Ausbeute an Endprodukten, bezogen auf die Ausgangskulturflüssigkeit, hervorzuheben ist.

Gemäß einem weiteren Verfahren erfolgt die Vorbehandlung der Kulturflüssigkeit in einem stark sauren Bereich, bedingt durch Zusatz von Phosphorsäure, unter Fällung der in der Kulturflüssigkeit enthaltenen Calciumionen mit Oxalsäure; auch der Sorptionsvorgang erfolgt aus saurer Lösung. Das saure Medium wirkt sich aber ungünstig vor allem auf die Stabilität des Cycloserins aus. Ähnliches gilt für die Durchführung der Sorption und Desorption auf dynamischem Wege, d. h. unter Durchleiten der Behandlungsflüssigkeiten durch eine Kationenaustauscherkolonne. Aus dem sauren Eluat muß das Cycloserin, um ein reines Produkt zu erhalten, als Silbersalz gewonnen werden. Auch dieses Verfahren ist, wie dargelegt, mit verschiedenen Nachteilen verbunden, die sich auf die Ausbeute und Reinheit des Endproduktes auswirken.

Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Beseitigung der angeführten Nachteile. Der Erfindung ist die Aufgabe zugrunde gelegt, ein Verfahren zur Gewinnung von d-Cycloserin mit hoher Ausbeute und hohem Reinheitsgrad zu entwickeln, bei welchem alle Verfahrensstufen, insbesondere die Vorbe-Verf ahren zur Gewinnung von d-Cycloserin aus
Kulturflüssigkeiten

Anmelder:

Wsesojusnyi Nautschno-Issledowatelskij
Institut Antibiotikow, Moskau

Vertreter:

Dipl.-Chem. L. Zellentin, Patentanwalt,

Ludwigshafen/Rhein, Rubensstr. 30

Als Erfinder benannt:
Ljubow F. Jachontowa,
Boris P. Bruns,
Dmitrij M. Trachtenberg,
Anja M. Kan, Moskau;
Julija S. Tschekulaewa,
Moskoskaja ObI. Kostino;
Serafima A. Shukowskaja,
Walerija D. Karzewa, Moskau

handlung und die Abscheidung des Cycloserins aus dem Eluat, vereinfacht wären.

Diese Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß man ein solches Verfahren zur Gewinnung von d-Cycloserin aus Kulturflüssigkeiten durch eine Vorbehandlung, eine Ionenaustauschsorption des Cycloserins aus der Kulturflüssigkeit, eine Elution (Desorption) des Cycloserins aus dem Kationenaustauscher mittels einer schwachen Ammoniaklösung und Abscheidung des Cycloserins aus dem Eluat anwendet, welches erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet ist, daß die Vorbehandlung zunächst durch eine abwechselnde Zugabe von Kalkmilch und Phosphorsäure bei einem zwischen 8,5 und 9,5 schwankenden pH, sodann zwecks vollständiger Entfernung der Calciumionen durch Zugabe von Trinatriumphosphat bis zum pH von 8,2 bis 8,5, nach Abfiltrieren des Myzels und Calciumphosphats die Cycloserinsorption durch Zugabe der Wasserstofform eines stark vernetzten SuI-fokationenaustauschers bis zum pH 4,0 bis 4,2, die Cycloserinelution durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak bis zum pH 10,0 bis 10,5 und die Abscheidung des Cycloserins aus dem neutral gemachten Eluat durch Auskristallisation durchgeführt wird.

Bei der Anwendung des vorgeschlagenen Verfahrens, das im wesentlichen in einer besonderen Vorbehandlung der Kulturflüssigkeit von Cycloserin so-

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wie in der Anwendung eines, stark vernetzten SuIfokationenaustauschers zwecks Sorption 'des^;: Cycloserins aus der nativen Lösung und von wäßrigem Ammoniak zur Elution des Cycloserins besteht, wird ein hoher Reinheitsgrad des Eluats erzielt, wodurch die untere, Cycloserin enthaltende Ölschicht nach Zugabe eines organischen Lösungsmittels zum eingedampften Eluat praktisch verschwindet und das Cycloserin aus dem neutralisierten Filtrat ohne zusätzliches Umkristallisieren sich abscheidet.

Als Ergebnis erhält man das d-Cycloserin mit einem hohen Reinheitsgrad von 98 bis 100 % und in einer Ausbeute von 36 bis 37%, berechnet auf den Gehalt in der eingesetzten Kulturflüssigkeit."

Zu 4,551 einer Kulturflüssigkeit mit/einer Aktivität 2900 y/ml, gewonnen unter Verwendung des Stammes Streptomyces species, werden unter langsamem Umrühren in kleinen Anteilen 54 g CaO in Form von Kalkmilch;zugegeben..Das pH der Kulturflüssigkeit wird ständig auf konstantem Niveau von 8,5 bis 9,0 durch mehrmalige Zugabe von Phosphorsäure gehalten. Nach Abschluß der Behandlung der Kulturflüssigkeit mit CaO und Phosphorsäure ist ihr pH 7,8. : ... .-._. ., -

Danach werden der Kulturflüssigkeit " 14 g Trinatriumphosphat zwecks Ausfällen der Calciumionen hinzugefügt, wobei das pH bei"8;3 liegt. Nach 30 Minuten langsamen Stehenlassens wird die Kulturflüssigkeit mit einer Filtrationsgeschwindigkeit von 60 l/h/m² filtriert. Als Ergebnis ^werden, zusammen mit dem Auswaschwasser, 4,551 einer durchsichtigen nativen Lösung mit. einer Aktivität 2440 y/ml und einem pH von 8,3 erhalten. Die Ausbeute im Vorbehandlungsstadium beträgt 84,5 %, bezogen auf die ursprünglich eingesetzte Kulturflüssigkeit.

4,551 der vorbehandelten Flüssigkeit werden bei einem pH von 8,3 mit 124 g (berechnet auf das absolute Trockengewicht) der Wasserstofform eines stark vernetzten Sulfokationenaustauschers, der 20 % Divinylbenzol enthält, versetzt. Die Sorption des Cycloserins aus der Kulturflüssigkeit wird unter Umrühren im Laufe 1 Stunde durchgeführt. Der Endwert des endgültig sich einstellenden pH beträgt 4,0. Der Kationenaustauscher absorbierte 9 260 000 γ Cycloserin; dies entspricht 84,5% seines Gehalts in der nativen Lösung.

Der mit entsalztem Wasser ausgewaschene Kationenaustauscher wird in ein kleines Volumen (100 bis 150 ml je 100 g fcationenaustauschharz) destillierten Wassers eingebracht, worauf unter Umrühren eine konzentrierte Ammoniaklösung bis zu einem pH von 10,5 zugegeben wird. Das Umrühren dauert eine Stunde; danach wird der Kationenaustauscher von der Lösung abgeschieden und noch einmal mit wäßrigem Ammoniak behandelt. Beide Eluate werden vereinigt. Die Ausbeute im Eluationsstadium beträgt 8 095 000 γ Cycloserin, entsprechend 87,5% des vom Kationenaustauscher absorbierten Cycloserins.

Das Eluat wird mit 5% einer sauren Aktivkohle (berechnet auf das Eluatvolumen) behandelt.
,'■ Die geklärte Lösung wird im Vakuum bei 25° C eingedampft, wobei 66 ml Cycloserinkonzentrat, das

ίο 122 000 y/ml enthält, gewonnen werden. Dem Konzentrat werden 330 ml eines Gemisches gleicher Volumen Äthyl- und Isopropylalkohol beigegeben. Eine untere Schicht bildet sich dabei praktisch nicht. Aus" der~filtrierten wasserälkohölischen Cycloserinlösung werden 364 ml einer Alkohollösung des Cycloserins mit einer Aktivität von 16 200 y/ml, insgesamt 590 000/ erhalten. Das durchsichtige farblose Filtrat· wird bis auf 2⁰C abgekühlt und unter Umrühren mit Essigsäure neutral gemacht.

'Das auskristallisierte Cycloserin" wird abfiltriert, mit Äthanol ausgewaschen und über Phosphorpentoxyd getrocknet: Es werden 4,93 g kristallisches drCycloserin [a]² _D° = + 116 bis + 115° (C = 1,2% in H_?Ö)i mit einer Aktivität von 98Oy/mg und einem

Reinneitsgrad von 98% erhalten. Die Ausbeute beträgt, berechnet auf den ■ Gehalt in der nativen Lösung, 43,6% und, berechnet auf den Gehalt in der eingesetzten Kulturflüsigkeit, 36,8%.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Gewinnung von d-Cycloserin aus Kulturflüssigkeiten duich eine Vorbehandlung, eine Ionenaüstauschsorption des Cycloserins aus der Kulturflüssigkeit, eine Elution (Desorption) des Cycloserins aus dem Kationenaustauscher mittels einer schwachen Ammoniaklösung und Abscheidung des Cycloserins aus dem Eluat, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorbehandlung zunächst durch eine abwechselnde Zugabe von Kalkmilch und Phosphorsäure bei einem zwischen 8,5 und 9,5 schwankenden pH, sodann zwecks vollständiger Entfernung der CaI-ciumionen durch Zugabe von Trinatriumphosphat bis zum pH von 8,2 bis 8,5, nach Abfiltrieren des Myzels und Calciumphosphats die Cycloserinsorption durch Zugabe der Wasserstofform eines stark vernetzten Sulfokationenaustauschers bis zum pH 4,0 bis 4,2, die Cycloserin-Elution durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak bis zum pH 10,0 bis 10,5 und die Abscheidung des Cycloserins aus dem neutral gemachten Eluat durch Auskristallisation durchgeführt wird.

   In Betracht gezogene Druckschriften:
   Deutsche Auslegeschriften Nr. 1118 931,
   1016711.

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