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Verfahren zur Herstellung von antibiotischen Stoffen 1>1e vorliegende
Erfindung befaßt sich mit antibiotischen Substanzen und Verfahren zu ihrer Herstellung.
Insbesondere handelt es sich um ein neues und wirksain-es Antibioticum, das durch
künstliche "Züchtung eines unten näher gekennzeichneten :%likroorganismus gewonnen
werden kann. Dieser Organismus ist eine Spezies der Gattung Streptom_vces, d.li.
er gehört zur Klasse der Actinomyces. 1)er Organismus kann auch als ein Stmptomycesstamin
vom Typ des Streptomyces fradiae bezeichnet werden. Dieser wurde 1915 von Waksman
(einem der Erfinder) und Curtis aus dem Erdboden isoliert. Er wurde damals .als
Actinomyces Fradii bezeichnet, wird jedoch in letzter Zeit im Handbuch von Bergey
als Streptomyces Fradiae aufgezählt. Der bei dieser Erfindung benutzte Stamm derartiger
Organismen" der zum mindesten dem namentlich genannten Organismus stark ähnelt und
der zur Herstellung des neuen Antibioticum, wie unten näher beschrieben, verwendbar
ist, ist in der
Rutgers. Universität; "Abteilutig . Mi'krobioldgie,
Type-Culture-Abteilung, Type-Culture-Sammhzng hinterlegt «-orden. Er wird in der
Amerikanischen Type-Culture-Sammlung auch unter der amtlichen Nummer 3535, die der
Hinterlegung gegeben %%urde,--genannt. Er kann somit in bequemer und genauer Weise
,31s Streptomvces -7r.3535 zeichnet werden.
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Unter den jetzt vielseitig verwendeten Antibiotica hat sich Streptomycin
als ein besonders erfolgreiches chemotherapeutisches Mittel für die verschiedensten
Zwecke erwiesen, und zwar auf Grund seiner Wirksamkeit gegen gram-negative wie auch
gram-positive Bakterieg, _einschließlich .\-fycoliakterien. Es fand wirksame Anwendung
in der Behandlung und Kontrolle gewisser Formen der menschlichen Tuberkulose. Es
gibt jedoch-Stämme einiger Bakterien, die mehr oderweniger widerstandsfähig gegenüber
dem Streptomycin sind" wobei insbesondere auffällig ist, daß diese Widerstandsfähigkeit
irrgewissen Fällen sich erst bei längerer :Anwendung des Mittels entwickelt. Mit
anderen Worten, ein oder mehrere resistente Stämme werden sich in einem solchen
Fall in dem infizierten Orgnismus vielleicht entwickeln oder wachsen, was meistens
der Fall ist, wenn die anfänglichen Behandlungsreihen nur teilweise Erfolg hatten.
Es wird deshalb angenommen; daß ein Atiti@l>iobicum besonders wertvoll sein würde,
wenn es die folgenden. wesentlichen Eigenschaften 1>esi@tzt: a) hohe Wirtksamkeit
gegenüber gräiiinegativen Bakterien und Mycoba'kterien: b) Wirk--,eit gegenüber
streptomycinresistenten Balk-> -anil, terienstämmen, insbesondere gegenüber säurebestän.digen
Bakterien und c) geringe Giftwirkung gegenüber dem Tier. -Es wurde nun gefunden,
daß der oben gekennzeichnete Organismus (Streptomyces N r. 3535) zur Herstellung
eines vollkommen neuen und außerordentlich wertvollen antibakteriellen Stoffes verwendet
werden (kann. Es handelt- sich um einen organischen ,Stoff, der sowohl chemisch
als auch antibiotisch verschieden ist von äiideren 'Stoffen seiner allgemeinen Klasse,
wie z. B. Streptomycin, Streptothricin, Grisein und Actinomycin.
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Das neue Antibioticum, das Neomycin genannt wurde und der Einfachheit
wegen auch in dieser E rfindungsllieschreil>ung so genantvt wird, ist deutlich dadurch
gekennzeichnet, daß es in wesentlichem Umfang die oben genannten, wünschenswerten
Eigenschaften besitzt, woraus sich sein außerordentlicher Wert ergibt. Seine antibakteriellen
Eigenschaften werden unten ausführlicher beschrieben, jedoch soll- bereits hier
bemerkt werden, daß dieser Stoff nicht nur Wirksamkeit gegenüber einerAnza'hl von
streptomycinresistentenBakterienstämmen (einschließlich Mycobakterien) gezeigt hat,
sondern auch die beim Wachstum sich entwickelnde Resistenz unter solchen Bedingungen
weniger begünstigt, wo eine solche in Gegemvart eines anderen Antibioticum, wie
Streptomycin, erwartet werden konnte. Mit anderen «Torten, bei der Untersuchung
einer Zahl von Organ:ismentypen, unter denen sich gegen andere Antibiotica widerstandsfähige
Stämme befanden, wurde kein wesentlicher Unterschied in der Empfindlichkeit gegenüber
Neomycin bemerkt.
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Das neue Antibioticum. \eomycin, wird so 'hergestellt, daß der Orgaiiisinus
Streptomyces \r.3535 auf einem geeigneten \ älirboden in geeigneter \N'eise unter
Luftzufuhr, entweder unbewegt (stationär) oder im Wege des sog. Tiefenwachstums,
innerhalb der \ ä lirlösung (in diesem Falle unter Schütteln) kultiviert wird, worauf
der Stoff, beispielsweise nach dem unten beschriebenen Verfahren. abgetrennt und
gereinigt wird. Zu diesem Verfahren gehören auch verschiedene Verfahrensstufen der
Adsorption, Zurückgewinnung durch Herauslösung, Ahscheidung von Verunreinigungen
und Fällung. Auf diese `''eise 'hergestellt, erweist sich Neomycin als eine basische
Verbindung (d.Ii. sie ist löslich in sauren Lösungen), die bei alkalischer Reaktion
äußerst wirksam ist. Mit anderen Worten, die antimikrobische Wirksamkeit des \eomvcin
neigt dazu. unter sauren Bedingungen beschränkt zti sein, scheint sich aber bei
Annäherung an den \etitralpunkt zu verstärken und wird durch alkalische Reaktion
des --\lediuiris deutlich begünstigt, was im Hinblick auf die allgemein alkalische
Reaktion des Blutes von Vorteil ist. Der abgetrennte Stoff, (las \eomycin, ist leicht
löslich in # Wasser, verdünnten Säurelösungen (z. B. verdünnter Salzsäure). wäßrigem
Methanol und schwach sauer gestelltem Alkohol, wie z. B. _@thanol-Salzsätire- oller
\letliaiiol-Anieisensäure-Lösungen, wie sie zur lIerauslösung des Streptomvcin aus
Adsorptionsinitteln verwendet werden. \eomvcin ist in verschiedenen organischen
Lösungsmitteln, wie z. B. Äther. Chloroform und Aceton, verhält iiisniäßig unlößlich.
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\eomvcin hat sich. insbesondere bei neutraler oder schwach sauer oder
alkalischer Reaktion, als wärmebeständig erwiesen und kann mindesten einige Minuten
lang auf ioo° C erhitzt werden, _ohne daß seine Wirksamkeit zerstört wird. Auch
in Lösung ist es l)emerkensivert beständig, es kann so z. B. einen Monat oder länger
aufbewahrt werden. Lösungen von \eomycin wurden mindestens drei Monate lang sowohl
hei Raumtemperatur als auch unter Kühlung gehalten, -#x-obei keine Beeinträchtigung
seiner Wirksamkeit eintrat. Diese Beständigkeit ist ein deutliches Unterscheidungsmerkrrval
gegenüber Stoffen wie Penicillin und Aureomycin, deren Lösungen in nach Tagen `bemessenen
Zeiträumen stark abfallen. Bezüglich des _ltireomycin ist `bekannt, daß es sich
in wenigen Tagen'ernstlich verschlechtert, selbst im gekühlten Zustand. Trocken,
(l. h. im kristallinen oder anderen, fein 'verteilten Zustand. kann \eonivcin für
sehr lange Zeiten. d. h. praktisch unbegrenzt. sicher aufbewahrt «-erden. Im Blut
oder in Gegenwart von Serum oder anderen organischen Stoffen verliert es nicht seine
Wirksamkeit.
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Obwohl die genaue chemische Struktur des \eomvcin bisher nicht festgestellt
wurde, so ergibt sich doch seine neuartige Zusammensetzung aus
<ler
einzigartigen Reihe von Eigenschaften, z. B. den vorstelietid oder an anderer Stelle
dieser Beschreil>ung genannten Eigenschaften, wie auch aus dein antibiotischen Spektrum.
Diese Eigenschaften \\erden als gcriiigend eindeutig angesehen, obwohl der Stoff
bisher nicht in vollständig reiner Form hergestellt wurde und somit auch nicht einer
:\nalvse unterworfen werden konnte. Es scheint jedoch, daß Neomycin nicht wie Streptomycin
die \faltolreaktion gibt. Weiterhin gibt es auch nicht die Sakaguchireaktion auf
monosubstituierte Guanidine, so claß das so nachgewiesene Fehlen einer (,uaiiidiri-Gruppe
ein Unterscheidungsmerkmal gegenüber verschiedenen Streptomycinformen darstellt.
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Wie erwähnt wurde, ist das antibiotische Spektrum des Neomycin ein
spezifisches und von ihm untrennbares Charakteristikum, d. h. wenn es zur Identifizierung
gegenüber anderen an@tibiotischen Stoffen verwendet wird. Tatsächlich ist allgemein
anerkannt, daß ein derartiges Spektrum, z. 1i. der bakteriostatischen oder ähnlichen
Wirksanikeit oder L;nwitiksam'keit gegenüber einer Zahl verschiedenartiger Organismen,
ein besonders wirksames Hilfsmittel ist, Stoffe dieser Art zu charakterisieren und
zu identifizieren. Mit anderen \\'orten, jeder antibiotische Stoff zeigt ein klar
lwstininiliares und eindeutiges Spektrum, durch welches er sich klar von anderen
antibiotischen Stoffen unterscheidet, ohne daß die Notwendigkeit Iresteltt, solche
Stoffe bezüglich ihrer absoluten \\'irksanilceit gegenüber einem spezifischen oder
einem der vielen anderenOrganismen,gegen welche sie vielleicht verwendet werden,
zahlenmäßig zu vergleichen. So besteht das Spektrum eines bestimmten .lntibioticum
im wesentlichen aus )'unkten von verhältnismäßig starker oder schwacher Wirksamkeit
(oder Unwit#ks-amkeit) jeweils gegenüber verschiedenen spezifischen Organismen.
wobei die Witiksamkeit nur in der gegenseitigen Beziehung gemessen ist. Solch ein
Spektrum kann graphisch oder tabellenmäßig dargestellt werden, und das Bild oder
die Foren dler sich ergebenden Kombination aus Höhen und Tiefen ermöglicht sozusagen
die positive Identifizierung des Stoffes Lind die Feststellung seiner chemischen
und anti-1riotischen Natur.
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Fin typisches Neomvcinspektrum im Rahmen der hier durchgeführten Versuche
ist unten im einzehnen wiedergegeben. Auf einige Merkmale soll hier schon 'hingewiesen
werden. Im allgemeinen und mit 1iezug auf die bisher durchgeführten Be-Stimmungen
ist zu sagen, daß hTeomycin ein SIrc@ktrum zeigt. das \\'irksamkeit gegenüber densellKii
wichtigen Bakterien (einschließlich Mycohäkterien), auf welche auch Streptomycin
einwirkt, und Unwirksamkeit gegeniil)er Fungi, wiederum entsprechend der relativen
Unwirksamkeit von Strel>trnrivcin gegenüber solchen Organismen, umfal3t. Infolgedessen
unterscheidet sich Neomycin auf (rund seines antibiotischen Spektrums von anderen
Stoffen, wie z. B. Streptothricin, Actinomycin, Grisein, Penicillin, Clavacin, durch
die meisten der allgemeinenKennzeichen, durch welche sich auch Streptomycin von
ihnen unterscheidet. Das Neomycinspektrum enthält auch Wirksamkeitspunkte bezüglich
einer Zahl von Organismen, die gegenüber Streptomycin unempfindlich sind. Diese
Stellen des Spektrums, welche also die Unterscheidung gegenüber Streptomycin ' ermög=
liehen, werden durch streptomycinresistente Stämme von E. Coli und M. Tuberculosis
und durch den sog. BodenheimerschenOrganismus dargestellt.
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Der Organismus, der zur Herstellung von Neornycin verwendet wurde,
wurde aus dem Erd-1)oden isoliert. Wie erwähnt, gehört er zu den Actinomyceten,
ist zum mindesten nahe verwandt mit Streptomyces fradiae und ist Streptomyces N'r.
3535 genannt worden. Er ergibt eingelblich bis bräunliches Wachstum auf synthetischen
und organischen Nährböden,, jedoch kein lösliches Pigment. Er ,gehört demnach zu
der nichtchromogenen Gruppe. Er erzeugt leicht, insbesondere auf synt'hetisc'hen
Nährböden, ein Luftmycel, das weiß bis rosenrot, seeinuschelrosa oder rosa pigmentiert
ist. Die Farbe des Mycels !kann, entsprechend der Ridgwavschen Farbenbezeichnung,
offenbar als ein helles Weinbraun bezeichnet werden. Aus Beobachtungen hat sich
auch ergeben, daß die Sporenfäden gewöhnlich gerade sind und nur -auf gewissen Nährböden
Spiralen bilden.
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Wie ollen bereits erwähnt, wird der neue ant,ibiotische Stoff durch
Kultivierung des genannten Organismus unter künstlichen Bedingungen, erzeugt. z.
B. nach Impfung eines geeigneten Nährbodens mit Sporen des Organismus oder mit innerliall)
der 'Nährlösung entstandenen Gewächsen. Aus den experimentellen Arbeiten scheint
s'ic'h zu ergeben, daß beträchtliche Änderungen in der Zusam:mensetzung der Nährlösung
möglich sind, insbesondere solange geeignete organische und anorganische Bestandteile
vorhanden sind, die dlas Wachstum des Organismus begünstigen und die Bildung des
Antibioticum anregen. Anscheinend werden die besten Ergebnisse erhalten, wenn die
Kultur in einer Nährflüss-igkeit erzeugt wird, die eine geeignete Stickstoffquelle,
ein Kohlehydrat und organische oder mineralische Stoffe, wie z. B. Natriumchlorid
und andere, unten beschriebene Stoffe enthält. Im folgenden werden die Arten von
Bestandteilen, die mit Vorteil der Kulturnährlösung hinzugefügt werden können, im
einzelnen aufgezählt.
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I. Ein Pepton oder ein verdautes Protein. Gewöhnliche Peptone oder
Proteinabbauprodukte, wie z. B. Kaseinhydrolysate, scheinen zu genügen, jedoch wurden
bessere Ergebnisse mit Stoffen wie z. 13. Sojabohnen-Pepton erzielt. Vorteilhaft
verwendet man einen derartigen Bestandteil im Verhältnis von beispielsweise 1o bis
20g je Liter der Nährflüssigkeit. Dieser Bestandteil scheint für die Erzeugung
des Antibioticum besonders wichtig zu sein.
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1I. Fleischextrakt oder ein ähnlicher Stoff, wie z. B. Hefeextrakt,
in einer Menge von etwa 3 bis 5 g je Liter. Obgleich angenommen wird, daßdieser
Ikstandteil
von -verhältnismäßig geringer Bedeutung ist und in einigen Fällen sogar entbehrlich
ist, so scheint er doch am gewünschten Ergebnis wesentlich beteiligt zu sein. Dieser
Bestandteil kann als Extr@aktnährstoff bezeichnet werden.
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111. Kohlenhydrate, vorzugsweise in der Form von Glucose oder
einem ähnlichen Zucker, wie z. B. Staltose. Glucose o. dgl. kann z., B. in einer
Menge von 5 bis iog je Liter verwendet werden. Sie scheint in erster Linie für ein
gutes Wachstum deb Organismus nützlich zu sein, obwohl sie für die Erzeugung von
Neomycin im eigentlichen Sinn nicht unbedingt wesentlich erscheint.
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IV. Bestimmte mineralische Elemente, insbesondere wenn diese sich
in dem zur Bereitung des Nährmittels oder der Brühe verwendeten Wasser als fehlend
erwiesen haben. Ein anscheinend besonders wichtiges Element ist Zink .in Form eines
Zinksalzes,, wie z. B_ Zinksulfat, und zwar in verhältnismäßig geringer Menge, z.
B. von ungefähr io je Million. Anscheinend ist auch Natriumchlorid ein äußerst wünschenswerter
Bestandteil, und zwar in einer Menge von etwa 5 g je Liter.
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V. Wasser, üblicherweise in Form gewöhnlichen Leitungswassers. Während
zwar destilliertes Wasser, nachdem ihm z. B. ein Zinksalz, wie oben erwähnt, zugefügt
wurde, ebenfalls verwendet werden kann, so hat sich doch Leitungswasser, das eine
Spur gebundenen Zinks natürlicherweise enthält, als vollkommen geeignet erwiesen,
wobei mineralische Zusätze außer Salzen, wie z. B. N atriumchlorid, unnötig sind.
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Bai Verwendung eines Nährbodens der vorstehend beschriebenen Art,
der sämtliche fünf der aufgezählten Bestandteile enthält, ist es zwec'kmäßig,,den
PH-Wert mit Na 0Hauf etwa 7 oder 7,2 einzustellen. Olnwohl es auch möglich ist,
in einem sauren Medium, z. B. bei einem pH-Wert von 6, zu beginnen, zeigt doch die
Erfahrung, daß .sich dann die Bildung des Antibiotioum wesentlich verzögert und
daß eine Erhöhung der Azid'ität die Zerstörung des Organismus zur Folge haben kann.
Tatsächlich scheint Glucose o. dgl. dazu zu neigen, eine Erhöhung der Azidität und
infolgedessen eine Verzögerung der Neomycinbildung zu bewirken oder zu begünstigen.
Diese Wirkung der Glucose konnte durch Verwendung von Pepton .in verhältnismäßig
großen Mengen, d. h. entsprechend der oberen Grenze des vorstehend angegebenen Mengenbereichs,
beseitigt werden. Eine Mil&rung der ungünstigen Wirkungen der Glucose bei der
Erzeugung des Antibioticum kann auch, zum mindesten teilweise, dadurch erzielt werden,
daß man die Glucosemenge vermindert, vorzugsweise durch Vergrößern der Peptonmenge,
wie vorstehend gesagt, oder daß man, ein Neutralisierungsmittel, ,wie z. B. Calziumcarbonat,
besonders hinzufügt. Im letzten Fall hat Calziumcarbonat den weiteren Vorteil',
daß es selbständig neutralisiert. Obwohl es auch möglich ist, d'aß andere Stoffe,
wie z. 1i. Natriumcarlionat, verwendet werden können, so erweist es sich dann doch
als erforderlich, diesen Stoff täglich oder anderswie regelmäßig weiter zuzufügen,
um die für die Erzeugung des AntibioticumgünstigenBedingungen aufrechtzuerhalten.
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Bei Verwendung von Nährböden der vorstehend genannten oder einer gleichwertigen
Art kann Neomycin in stationären oder bewegten Kulturen erzeugt werden. Im Falle
der stationären Kulturen gilt zur Zeit, daß eine befriedigende _lusbeute ,des Antibioticum
eine Bebrütung bei Raumtemperatur, z. B. innerhalb 22 bis 28° C, während einer Zeit
von 7 bis 12 Tagen erfordert. Bei stationären Kulturen sollte der Nährboden sehr
dünnschichtig sein. Selbst in diesem Fall neigen die Sporen des Organismus dazu,
abzusinken, d.h. unterzutauchen und somit für die Erzeugung cjes Antibioticum auszufallen.
Anscheinend ist dieser Organismus durch eine gewisse Schwere oder ein größeres spezifisches
Gewicht gegenüber Organismen, wie Streptomyces griseus, ausgezeichnet, welch letzterer
weniger Schwierigkeiten bei der Bebrütung stationärer Kulturen 'bereitet. Bessere
Ergebnisse sind erhältlich, wenn man ,den Nährboden etwas dicker macht, z. B. durch
Hinzufügen von 1/,1 bis 1/2% Agar, wodurch eine halbfeste oder halbflüssige Beschaffenheit
erzielt wird. Bei Verwendung dierart modifizierter Nährböden scheint der Organismus
einen geeigneten Halt zu haben, so daß die Kultur an der Oberfläche als Häutchen
wächst, wobei sie die für die Ausbildung des antibiotischen Stoffes erforderliche
Luftmenge erhält.
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Eine beträchtlich schnellere Behütung zwecks Erzielung einer befriedigenden
?@Teomycinausbeute kann mit geschüttelten Kulturen erzielt werden, d. h. unter Verwendung
von verhältnismäßig tiefschichtigen Nährböden, die in geeigneter Weise zwecks wirksamer
Belüftung geschüttelt werden. Beispielsweise erwiesen sich 3 his 5 Tage hei einer
Temperatur von etwa 25@ C für eine gute Erzeugung als ausreichend. Der Temperaturbereich
wird vorzugsweise zwischen 22 und 28° C gehalten. Es scheint, daß, um beste Ergebnisse
zu erzielen, das Ausmaß der Schüttelurig oder genauer der Belüftung ziemlich sorgfältig
geregelt werden sollte. Die Erfahrung zeigt, daß das-'heftige Schüttelverfahren,
das gewöhnlich zur Herstellung von Streptomycin mittels S.-griseus-Kulturen angewendet
wird, hei _@nw-enciung auf Kulturen von Streptomyces N r. 3-335 unter Umständen
keine guten Neomycinausbeuten liefert. In solchen Fällen wurde eine Ausbeuteverbesserung,
und zwar tatsächlich bis zu einem Optimum, dadurch leicht erzielt, daß die Scliüttelgescliw-in
digkeit herabgesetzt oder daß eine geringe 11eiige Agar (etwa 1/, bis i o/0) zur
Verminderung der Luftdurchdringung hinzugesetzt wurde. --Mit Agar verdickt man zwar
den Nährboden, aber vorzugsweise nicht über einen halbflüssigen Zustand hinaus.
1:s ist natürlich äußerst wichtig, daß man erhebliche Luftmeligen den Nährboden
durcli,dringen läßt. z. h. während ctes Schüttetns. Ob-,volil es unmöglich ist,
die erforderliche Luftmenge oder Belüftung quantitativ zli bestimmen, so ist doch
in der Praxis, evtl. nach einigen einfachen Versuchen. die Durchführung der Belüftung
bis zu dem gewünschten Punkt eine sehr
einfache :\iigelegetilieit,
und zwar im Hinblick auf (lie oben gegel)etie Erläuterung der in Frage kominenden
Faktoren. Obwohl die obengenannten Be-I)riitutigszeiten den bei der experimentellen
Durchführung der Erfindung gefundenen optimalen. Zeiten entsprechen, so können doch
auch andere Zeiten in Einzelfällen verwendet werden oder erforderlich sein. Zum
Beispiel hat die Erfahrung in der Technik der Erzeugung von Antibiotica allgemein
gezeigt, daß die Bebrütungszeit wesentlich verringert werden kann durch Anwendung
von verhältnismäßig viel Impfstoff.
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Obwohl verschiedene Verfahren zur Abtrennung des antibiotischen Stoffes
aus der Kulturbrühe und zur anschließenden Reinigung angewendet werden können, so
sollen hier doch gewisse Verfahren, die sich als besonders bequem erwiesen haben,
einleitend genannt werden. Allgemein gesehen umfaßt <las Verfahren Adsorptions-
und Herauslösungsstufen, einschließlich zusätzlicher Reinigungsverfahren, und kann
;ewiinschtenfalls auch auf die chromatographische Trennung ausgedehnt werd. Man
kann so verfahren, daß die Kulturnährflüssigkeit nach der gewiimschten Bebrütungs,zeit
filtriert und das Filtrat mit einem geeigneten Adsorptionsmittel, wie z. B. aktivierter
Holzkohle oder einer anderen Aktivkohle, die Neomycin adsorbiert, behandelt wird.
Nach Abtrennung des Adsorbats, d. h. der Kohle, kann dieses mit Äthanol, welches
2'/o HC1 enthält, oder mit einem anderen, sauer gestellten Alkohol, wie z. B. Meth-anolameisensäure,
behandelt werden, um das Antibioticum herauszulösen. In den sich anschließenden
Reinigungsverfahren kann die Adsorption und Herauslösung wiederholt werden, worauf
das Antibioticum schließlich mit einer organischen Flüssigkeit, wie z. B. Aceton,
gefällt, gewaschen und bei geeigneter, mäßiger Temperatur getrocknet wird.
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Abweichend hiervon kann die erste Adsorption des Neomy@cin auch mit
einem adisorbierendenMittel der Zeolitklasse, d. h. einem Kationenaustauscher, bewirkt
werden. In einem solchen Fall (wie auch, wenn Kohle zum Adsorbieran des Neomyci.n
verwendet wird) kann flach der Filtration eine Vorbehandlurng der Kulturnährflüssigkeit
eingeschaltet werden, die darin besteht, daß diese stark angesäuert und mit aktivierter
Kohle versetzt wird, um Verunreinigungen zu adsorbieren, wobei zu bedenken ist,
daß Neomycin unter stark sauren Bedingungen nicht adsorbiert wird. Vor Anwendiung
des Adsorptionsmittels der Zeolitklasse (oder in ähnlicher Weise, wenn ein Kohleadsorptionsmitte.l
nach der Vorreinigung verwendet wird) isollite der PH-Wert des Filtrats, das nach
der Abtrennung des die Verunreinigungen enthaltenden Adsorptionsmittels vorliegt,
zunächst auf einen annähernd neutralen Wert gebracht werden. Das Anti,bioticum wird
dann durch Behandlung mit dem genannten Adsorptiornsmittel adsorbiert, das Neomycin
enthaltende Adsorbat wird abfiltriert und zur Abtrennung des Antibioticum einer
Herauslösungsbehandlung unterworfen. Bei Verwendung eines Adsorptionsmittels derZeolitklasse
kann; die Herauslösung mit einer Ammoniumc'hloridlösung durchgeführt werden. Die
so gewonnene Flüssigkeit, in der das Antibioticum gelöst ist, kann darauf weiteren,
aufeinanderfo'genden Adsorbierungs- und. unterworfen werden. Schließlich folgen
geeignete Verfahren zur Fällung, Abtrennung und Trocknung des gewünschten wirksamen
Stoffes, nämlich des Neomycin.
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Es wurde gefunden, daß Neomycin, das z. B. nach diesem Verfahren hergestellt
ist, ein bem-prkenswert breites antibiotisches Spektrum besitzt. Es zeigt äußerst
wertvolle Wirksamkeit sowohl gegenüber gram-positiven als auch gramnegativen Bakterienwie
auch ausgezeichneteWirksam'keit gegen Mycobakterien sowohl des streptomycinempfindlichen
als auch dies streptomycinresistenten Typs. Weiterhin wurde in Versuchen mit Arten,
die mit Streptomycin entgegengesetzte Ergebnisse zeigten, gefunden, daßsich eine
geringere Resistenz gegenüber Neomycin unter den geprüften Organismen entwickelt.
Diese Ergebnisse scheinen auf die beschränkte Zahl von Stämmen solcher Organismen
hinzuweisen, die gegenüber Neomyciri spezifisch resistent sind, zum Unterschied
von Streptomycin.
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Die folgende Tafel stellt ein antibiotisches Spektrum des Neomycin
im Vergleich zu solchen des Streptomycin und Streptothricin dar. Pür Neomycin wurden
die Bestimmungen nach dem Agarstreifenverfahren (d. h. einem Agarplattenverdürmungsverfahren)
mit dem isolierten antibiotischen Stoff durchgeführt, der nach dem Verfahren des
unten ausgeführten, speziellen. Beispiels hergestellt worden war. Die spezifischen
Wirksamkeitswerte dieser Tafel sollten natürlich in dem Bewußtsein gelesen werben,
daß die Bestimmungen durch weitere Reinigung des Antibioticum verbessert oder in
anderer Weise graduell beeinträchtigt werden können, und insbesondere, daB unterschiedliche
Stämme der verschiedenartigen Testorganismen einige Unterschiede in der Wirksamkeit
zeigen können. Es ist jedoch anzunehmen, daß das Spektrum im ganzen. genommen durch
solche Abweichungen nicht wesentlich beeinträchtigt wird. Wenn es sich albgemein
um die Identifizierung des Antibioticum mittels seines Spektrums handelt, darin
erscheint es weiterhin verständlich, daß es von uniwesentlicher Bedeutung ist, die
absoluten Wirksamkeiten .des Neömycin einerseits und des Streptomycin oder Streptothricin
andererseits zu vergleichen, d. h. für einen Miebigen Organismus, dem gegenüber
Neomycin und einer oder beide der genannten Antibiotica wesentlich wirksam sind.
Die hauptsächliche Bedeutung des Spektrums liegt darin, für jeden Stoff die allgemeine
Verwandtschaft der verschiedenen Wirksamkeiten und Unwirksamkeitern aufzuzeigen.
Es muß jedoch bemerkt werden, daß Neomycin nach der bisherigen Erfahrung ein hochaktiver
und wirksamer Stoff ist. Dies erlaubt seine vollständige Ausnutzbarkeit und erleichtert,
falls er zur Behandlung verschiedener Infektionen benutzt werden soll, seine tatsächliche
Anwendung.
| Tafel I |
| Antibiotisches Spektrum von rohem Neomycin im Vergleich zu
solchen von rohem Streptomycin und |
| Streptothricin (ausgedrückt in Verdünnungseinheiten je Gramm
des rohen Präparates, die erforderlich |
| sind, das Wachsen der Testorganismen zu verhindern) |
| Neomycin Streptomycin Streptothricin |
| Nr. Organismus mal iooo mal iooo mal iooo |
| 1 Bacillus subtilis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. 150-750 12J5 125 |
| 2 Bacillus mycoides ..... . ...... .
....... 20-150 20 < 0,8 |
| 3 Bacillus cereus . . . . . . . . . . . . . . . . . .
..... 20-6o 30 < o' s |
| Staphylococcus aureus,................ 100-250 15 50 |
| 5 Sarcina lutea......................... 10 100 3715 |
| 6 Escherichia coli SS .................. 25 25 25 |
| 7 Escherichia coli RS .. ................ 20 0 wirksam |
| 8 Pseudomonas aeruginosa . . . . . . . . . . . . . . 2,5 1
< o,8 |
| 9 Proteus vulgaris ..................... 25 10 12,5 |
| io Bodenheimers Organismus ............ 15 o wirksam |
| 11 Serratia marcescens .................. 20 25 1,2 |
| 12 Mycobacterium tuberculosis |
| hominis 607 (SS) . . . . . . . . . . . . . . . . . .
80-250 wirksam wirksam |
| 13 Mycobacter ium tuberculosis |
| hominis 6o7 (RS) . . . . . . . . . . . . . . . . . .
50- 150 unwirksam wirksam |
| 14 Mycobacterium avium . . . . . . . . . . . . ....
50-150 wirksam wirksam |
| 15 Mycobacterium ranae . . . . . . . . . . . . . . . . .
150 wirksam wirksam |
| 16 Mycobacterium phlei ................. 30o Zoo 12,5 |
| 17 Trichophyton metagrophytes . . . . . . . . .. < 0,3 <
0,3 wirksam |
| 18 Cryptococcus albicans ................ < 0,3 < 0,3
wirksam |
| i9 Penicillium notatum . . .. . . . . . .. . . . .. . . <
0,3 < 0,3 wirksam |
,In der@obi.gen Tafel und an anderen Stellen dieser Beschreibung bedeutet das Symbol
SS einen streptomvcinempfind'lichen Stamm und RS einen streptomycinresistenten Stamm.
Es ist zu beachten, daß die Hinweise auf Verdünnungseinheiten, dargestellt durch
die in jedem Fall mit iooo multiplizierten "Zahlen der Tafel, zum Ausdruck bringen,
wie oft eine Wirksamkeitseinheit des betreffenden. Antibioticum verdünnt werden
kann, ohne daß die Wachstumshinderung bei dem untersuchten Organismus aufhört. Eine
Wirksamkeitseinheit i,st jene Stoffmenge, die in einem 1/l000 1 der Nährflüssigkeit
(las Wachsen eines ausgewählten Standardorganisinus unter bestimmten Standardbedingungen
verhindert. Demnach bedeuten hohe Werte in der Tafel starke Wirksamkeit, während
die niedriigstenwerte eine verhäl'tn.isrnäßige Unwirksamkeit bedeuten. Der Bequemlichkeit
und Kürze wegen sollen die verschiedenen Organismen durch die Zahlen bezeichnet
werden, die ihnen in der ersten Kolonne der Tafel willkürlich ,beigelegt wurden.
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Es zeigt sich, daß Neomycin voll wirksam ist gegen alle mit den Nummern
i bis 16 einschließlich t@ezeiclineten Organismen. Innerhalb dieser Reihe zeigt
sich,. d,aß seine Wirksamkeit gegen die Organismen Nr. i bis 6 einschließlich, 8,
9, 11, 12 und i4bis 16 einschließlich der des Streptomycin ähnelt, während Streptothricin
eine verhältnismäßig ;geringe oder überhaupt keine Wirksamkeit gegen die Organismen
Nr. 2, 3, 8 und 11 zeigt. Andererseits ist Streptothricin gegen verschiedene Fungi,
z. B. die Organismen Nr. 17, f8 und i9, wirksam, während Neomycin verhältnismäßig
unwirksam ist. Es mag noch bemerkt werden. daß die Zahlemverte der Tafel sich auf
Bestiniinttugen gründen, die eine zahlenmüßige Angabe rechtfertigen, daß jedoch
einige der \Virksamkeiten, z. B. des Streptomycin und Streptothricin durch andersartige
Versuche oder unter sonstigen Bedingungen bestimmt wurden. In den zuletzt geiiaiinteii
Fällen wurden die Auswertungen einfach mit den `''orten wirksam oder unwirksam wiedergegeben.
Es ist anzunehmen, daß .die so ,niedergegebenen Werte für die Wirksarnkeit und tlnwirksain'keit
ihre volle Bedeutung für die Zw-@ecke des Vergleichs und der spektralen Kennzeichnung
haben.
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Ein besonders bedeutungsvolles Kennzeichen des Spektrums des NeOinvcin,
durch das es sich von dem Streptomycin unterscheidet, ist seine Wirksamkeit bezüglich
der Organismen Nr.7, io und 13, die einer gleichen Wirksamkeit gegenüber vielen
anderen Organismen der Tafel entspricht, und im Vergleich dazu die relative Unwirksamkeit
des Neomycin gegenüber den Organismen Nr. 17, 18 und i9. Bodenheimers Organismus
(Nr. io der Tafel) wurde zuin Auswerten antibiotischer Stoffe verwendet. und zwar
insbesondere, um Streptothricin in Gegenwart von Streptomycin zu bestimmen, das
gegenüber diesem Organismus verhältnismäßig 'keine Wirksamkeit zeigt. Die Empfindlichkeit
der Organismen Nr. 7 und 13 gegenüber Neomycin ist von besonderem Nutzen, d. h.
sie bedeutet die Fähigkeit des Neoniycin, diese streptomvcinresistentenBakterienstämme
zu 'kontrollieren. Wie ersichtlich ist, gehören die Organismen Nr. 12 und 13 zu
jenen, die für die Tuberkulose des
lfen;clien \-crantwortlich sind.
Somit zeigt sich, daß Neomycin einen Wirksamkeitsbereich z. B. gegen resistente
Stämme hat, der dem Streptomycin fehlt.
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Die Feindschaft des Neomycin gegen Organisireustänime, denen gegenüber
Streptomycin unwirksam ist, hat sich auch aus Versuchen erwiesen, die nicht in Tafel
1 wiedergegeben sind. Zum Beispiel wenn Platten, auf denen sich verschiedene Konzentrationen
von Neomycin befanden, mit streptomvcinenipfindfichen, streptomycinresistenten und
streptomycinabhängigen E:-Coli-Stämmen überstrichen wurden, so wurde gefunden, daß
die beiden ersten Neomycin gegenüber gleich empfindlich waren, während die zuletzt
genannten Stämme überhaupt kein Wachstum zeigten. Wurde der gleiche Versuch mit
Streptomycin durchgeführt, dann zeigte nur der erstgenannte Bakterienstamm Empfindlichkeit
gegenüber dem antibiotischen Effekt, der zweite bliel> im wesentlichen unbeeinflußt,
und der dritte lieferte ein Gewächs, für welches, wie vorher gefunden wurde, die
Anwesenheit von Streptomycin erforderlich ist. Diese Versuche weisen 'klar auf den
Unterschied der biologischen und chemischen Natur des Neomycin gegen-Über derjenigen
des Streptomycin hin.
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Wenn Brühe- oder Agarkulturen verschiedener Bakterien mit einem für
die Wachstumshinderung genügenden Neomycingehalt für eine verhältnismäßig lange
Zeit bebrütet wurden, trat keine weitere Entwicklung der Bakterien ein. Derart wurde
weiterhin die Beständigkeit des Antibioticum erwiesen, die im Gegensatz zu anderen
Stoffen, wie z. B. Aureomycin, steht.
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Um weiterhin die Wirkung des Neomycin auf .\fvcobal:terien festzustellen,
wurden Bestiminungen filier die r,-'m,pfindlich@keit verschiedener streptomvcinempfindticher
und streptomycinresistenter Stämme dieser Bakterien:, und' zwar unter Anwendung
turbidimetrischer Verfäh.ren in Dubos-Tween-Nährlösung durchgeführt. Die folgende
Tafel stellt die Ergebnisse solcher Versuche mit einer Zahl von Organismen oder
Organismenstämmen dieser Art, einschließlich der beim Menschen krankheiterzeugenden
Kultur des M. Tuberculosis H 37 Rv, zusammen.
| Tafel 1I |
| Wirkung von Neomycin auf .das Wachstum ver- |
| schiedener Stämme von M. Tuberculosis in Dubos- |
| Nährlösung. Inkubation bei 37° C, 14 Tage lang; |
| Wachstums- |
| Prüforganismus hinderung |
| Einheiten/ccm |
| M. avium (SS) ................. 4,0 |
| M. avium R (RS) . . . . . . . . . . . . . . 4,0 |
| M. tuberculosis H 37 Rv (SS) .... 0,2 |
| M. tuberculosis H 37 RvR (RS) .. 0,2 |
| M. tuberculosis H 37 Rv (SS) .... 0,5- i,o |
| M. tuberculosis H 37 RvR (RS) .. 1,0 |
| M. tuberculosis 607 (SS) . . . . . . . . . 0,i |
| M. tuberculosis 607 R (RS) ...... 0,25 |
Es wurde gefunden, daß Neomycin gegenüber allen der genannten Organismentypen wirksam
war. Wie in der Tafel gezeigt, w aren in jedem Falle die streptomycinresistenten,
RS, und streptomycinempfindlichen, SS, Stämme im wesentlichen gleich empfindlich
gegenüber Neomycin..
-
Die Tatsache, daß Neomycin die leichte gntwicklung resistenter Kulturen,
d. h. Stämme von Orgarismen, die besonders resistent gegenüberNeomycin sind, nicht
zu begünstigen scheint, hat sich aus, verläßlichen Versuchen ergeben. In einer solchen
Versuchsreihe wurde eine 24 Stunden. alte Agarkultur von E. C o 1 i in Wasser suspendiert
und in Nähragar, der verschiedene Mengen Neomycin enthielt, auf Platten gestrichen.
Nach 9tägiger Bebrütungszei.t bei 28°' C entwickelte sich aus 22 Milliarden Zellen
nur eine Kolonie einer Hefe, aber nicht des Bakteriums4 auf einer Platte, die 25
Einheiteniecm (Wirksamkeitseinheiten. je Kubikzentimeter) Neomycin enthielt, weiterhin
entwickelten sich nur zwei Kolonien, ebenfalls nur Hefe- und keine Bakterienkolbnien,
auf einer Platte, die 5 Einlieiten/ccm Neomycin enthielt, während auf einer dritten
Platte mit roEinheiten/ccm überhaupt keine Kolonien beobachtet wurden. Damit war
erwiesen, daß in keinem Falle resistente Kulturen entwickelt waren. Später wurde
jedoch gefunden, daß sich einige wenige Kolonien in Gegenwart von zwei bis vier
Einheiten Neomycin entwickeln" jedoch vieQ weniger (nämlich 1/1o bis 1/l00) als
in Gegenwart ähnlicher Konzentrationen von Streptomycin. Wenn Agarstückchen von
diesen Platten genommen und auf sterile Agarplatten geimpft wurden, zeigten nur
einige dieser ,Stückchen von der Platte, die 5 Einheiten/ccm Neomycin enthalten
hatte, Wachstum. Die Stückchen von den Platten, die to Einheiten/ccm und 25 Einheiten/ccm
Neomycin enthalten hatten, zeigten überhaupt kein Wachstum. Aus diesen Versuchen,
wie auch aus anderen, ergibt sich, daß Neomycin auf Bakterien sowohl stark zerstörend
als auch wachstumshindernd wirkt.
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Eine andere, außerordentlich wichtige Eigenschaft des Neomycin ist
seine relative Ungiftigkeit oder äußerst geringe Giftigkeit. Versuche anTieren und
an lebenden Objekten, z. B. am Eiembryo, haben nicht nur die verhältnismäßig starke
Wirksamkeit des Neomycin gegen verschiedene Bakterien 'bestätigt, sondern haben
auch gezeigt, daß die Giftigkeit des Antibioticum gegenüberTieren, wenn überhaupt
vorhanden, sehr schwach ist. Die Wirksamkeit gegen Bakterien in Versuchen am lebenden
Objekt wurde bezüglich gram-,positiver als auch gram-negativer Organismen und .gegenüber
streptomycinempfindlichen als auch streptoTnnycinresisten-.ten Organismen gezeigt.
Als Beispiele werden genannt streptomycinempfm-dl`iche Stämme von Staphylococcus
aureus, Klebsiefla pneumoniae und Shigella pullorum wie auch streptomycinresistente
Stämme von Salmonella sehottmulleri und Staphylococcus aureus. Die Versuche offenbarten
die Fähigkeit des Neomycin, jedes dieser Organismen zu kontrollieren. Bezüglich
der Giftigkeit ergaben die Versuche an Tieren, z. B. :.lausen, daß sich
kei@:e
merklich giftigen oder andere abträgliche Wirkungen einstellen, selbst nachdem die
Behandlung auf die 2o- bis ßofache Menge der wirksamen Dosis verstärkt worden war.
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Aus dem Vorstehenden kann entnommen werden, claß Gier zur Herstellung
des Antibioticum verwendete Kulturnährboden erheblich verschieden sein kann, je
nach den Bedingungen der zur Verfügung stehenden Nährstoffe u. dgl. Praktische Beispiele
sind die beiden folgenden Nährböden, die sich für.dieKultivierung vonStreptomyces
Nr.3535 und Herstellung von 1\Teomycin daraus geeignet erwiesen.
| Kulturnährboden (Beispiel i) |
| 20 g Sojabohnen Pepton |
| 5 g Fleischextrakt |
| 5 bis io g Glucose |
| 5 g Natriumchlorid |
| i 1' Leitungswasser (wie oben beschrieben) |
| Kulturnährboden (Beispiel 2) |
| io g Sojabohnen Pepton |
| 5 g Fleischextrakt |
| io g Glucose |
| io g Calciumcarbonat (feines Pulver) |
| 5 g Natriumchlorid |
| i 1 Leitungswasser (wie oben beschrieben) |
Wie oben erläutert,enthält der Nährhoden gemäß Beispiele, der durch einen verhältnismäßig
niedrigen Peptongehalt und einen verhältnismäßig hohen Glucosegehalt gekennzeichnet
ist, auch eine gewisse Menge Calciumcarbonat, um möglicherweise eintretende unerwünschte
Wirkungen vergrößerter Azidität während der Inkubation zu verhindern. Beide der
oben beschriebenen Nährböden gewährleisten sehr zufriedenstellende Ergebnisse, z.
B. in geschüttelten Kulturen mit geeigneter Belüftungskontrolle, wie diese bereits
erläutert wurde. In jedem Falle wird der PH-Wert auf etwa 7 eingestellt, bevor mit
Sporen oder innerhalb des Nährbodens gezüchteten Gewächsen des Organismus Nr. 3535
geimpft wird.
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Um ein weiteres und genaueres Beispiel für die Verfahren der Trennung
und teilweisen Reinigung des Neomycin zu geben, wird das folgende Verfahren beschrieben.
Nach vorangehender Filtration, um suspendierte, feste Bestandteile zu entfernen,
wird die Kulturnährlösung oder Brühe mit konzentrierter Salzsäure angesäuert und
ihr PH-Wert auf 2,o bis 2,5 vermindert. Aktive Holzkohle, insbesondere die unter
dem Namen Darco G-6o bekannte Sorte, wird in einer Menge von 5 g je Liter hinzugegeben,
und die Mischung wird etwa 30 Minuten lang gerührt. Darauf wird eine geeignete
Filtrierhilfe, z. B. ein Stoff von der Natur der Diatomeen-Erde, insbesondere eine
unter dem Namen Hyflo Super-Cel bekannte Filtrierhilfe in einer Menge von 5 g je
Liter in die Mischung hineingerührt, und die Mischung wird dann durch einen Bausch
gleichen Materials, z. B. Hyflo Super-Cel, und gleicher Menge filtriert. Da Neomycin
bei stark saurer Reaktion nicht adsorbiert wird, so bewirkt diese Behandlung mit
Holzkohle und die anschließende Filtration ei»e vorl:itifige Entfernung gewisser
Unreinheiten, wolxi natürlich bei eiligen Verfahren diese vorläufige Behandlung
in einigen Fällen fortfallen kann.
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Das Filtrat aus der soeben beschriebenen Behandlung ist somit ein
vorläufig gereinigtes Filtrat der Kulturbrühe und enthält das gewünschte Neomyciti.
Der PH-Wert dieser Lösung wird darauf finit 4oo/oiger Natronlauge auf
7,1 ± 0,2 eingestellt. Darauf wird ein Adsorptionsmittel, insbesondere ein.
solches vom Zeolittyp (Natriumaluminiumsilicat) hinzugegeben. Ein geeigneter Stoff
ist das unter dem Namen Decalso bekannte Produkt. Die Menge dieses Adsorptionsmittels
kann verschieden sein. Es ist vorteilhaft, (las Mittel in einer Menge von i g für
je 7000 Wirksamkeitseinheiten des gelösten Neomycin hinzuzufügen. Die Mischung
wird dann etwa 30 Minuten lang gerührt, und das Adsorl>at, d. h. das Neomycin enthaltende
Adsorptionsmittel wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und über Nacht an der Luft
zum Trocknen gestellt.
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Das getrocknete Decalso-Adsorbat wird darauf in eine Säule mit einem
Innendurchmesser von 3o .mm gebracht, in der sich ein Glaswollebausch befindet.
Eine io°/oige wäßrige Ammoniumchloridlösung wird durch das Adsorbat (nämlich das
Neomycin enthaltende Zeolitmaterial) hindurch filtriert, wobei aufeinanderfolgende
Fraktionen zur :\uswertung entnommen werden. Auf diese Weise wird das Neomycin wirksam
aus dem Adsorptionsmittel herausgelöst. Die Auswertung der verschiedenen Fraktionen
kann entweder nach der Streifenmethode unter Verwendung von E. C o 1 i durchgeführt
werden, oder nach der Agarschalenmethode, wobei man zweckmäßig B. subtilis verwendet.
Die Fraktionen mit der stärksten Wirksamkeit werden zu einer einzigen Lösung vereinigt,
und der pH-Wert dieser .'Mischung wird auf 7,0 eingestellt. Eine weitere
Menge Aktivkohle, z. B. Darco G-6o in einer Menge von io g je ioo ccm, wird 'hinzugegeben,
und die Mischung wird 3o Minuten langgerührt. Das Adsorbat, nämlich das Holzkohle
enthaltende Neomycin, wird ablfiltriert, mit Wasser gewaschen und mit Luft getrocknet.
Das Antibioticum wird aus diesem Adsorbat durch halbstiindigesRühren mit o,o5 n-Salzsäure
in 5o"/oigeni .lethanol' herausgelöst, wobei 5 ccm des verdünnten Säurealkohols
je Gramm Holzkohle verwendet werden. Die ausgewaschene Holzkohle wird abfiltriert
und einer zweiten, gleichartigen Auswaschung unterworfen. Die Auswaschungslösungen
werden vereinigt, und der pH-Wert der Mischung wird dann mit Natronlauge auf 6,o
bis 7,0 Cingestel'f@t. Diese Lösung, die das Neomycin enthält, wird darauf
im Vakuum auf ein Volumen von etwa 3 ccm konzentriert.
-
,Die verbleibende geringe Flüssigkeitsmenge, die das Antibioticum
enthält, wird mit Methanol aufgenommen, und .die entstellende Mischung wird zentrifugiert,
um unlösliche Stoffe, nämlich -weitere Verunreinigungen, abzutrennen. Die aus der
Zentrifuge erhaltene überstehende Methanollösung wird wiederum im Vakuum auf etwa
3 ccm konzentriert.
Dieses zweite Konzentrat wird wieder
in einem Zentrifrigenröhrchen finit so viel Methanol gewaschen, daß das Gesamtvolumen
der so erhaltenen Lösungen io bis 15 ccm beträgt. Wiederum wurde <lcr unlösliche
Bestandteil abzentrifugiert. Die das Neomycin enthaltende Lösung, d. h. die aus
der letzten Zentrifugierung erhaltene überstehende Flüssigkeit, wird dann mit der
8- bis iofachen Volummenge Aceton behandelt, um das Neomycin zu fällen. Die so erhaltene
Suspension bleibt einige Stunden lang hei 5° C stehen und wird dann wieder zentrifugiert.
Der abgetrennte feste Stoff, der das Neomycin darstellt, wird schließlich mit Aceton
gewaschen und im Vakuum getrookrnet. Es entsteht so ein trockenes, ziemlich fein
verteiltes' Produkt, das den isolierten und abgetrennten, wenn auch noch etwas rohen
Grundstoff des neuen Antibioticum Neomvcin darstellt. Wie ollen ausgeführt wurde,
können weitere Reinigungsverfahren angeschlossen werden, welche dann zu einem Produkt
hohen Reinheitsgrades führen, das der Qualität gewisser anderer im Handel erhältlicher
Antibiotica entspricht. Das nach dem hier beschriebenen Verfahren erhaltene Produkt
weist die bereits angegebenen neuen und wertvollen Eigenschaften antibiotischer
und sonstiger Art auf.
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Die Untersuchung des so hergestellten neuen Produktes scheint darauf
hinzuweisen, daß es tatsächlich ein Komplex aus mehreren nahezu identischen Verbindungen
oder Neomycin@formen ist, die sich anscheinend nur sehr unwesentlich voneinander
unterscheiden. Es wurden deshalbanalytische Untersuchungen nach jener Methode durchgeführt,
in der Stoffgemische auf Grund ihrer besonderen relativen Löslichkeiten in zwei
Mitteln, z. B. einem organischen Lösungsmittel und Wasser, getrennt werden. Beispielsweise
wurden, wenn .das salzsaure Salz des Produkts (des Neomycinkomplexes) .durch mehrfaches
Chertragen von Teilen der Lösungen verteilt wurde (nach dem Verfahren von C r a
i g und Mitarbeitern, veröffentlicht in J. Biol. Chem., Bd. 168, S.665, 1947, und
teilweise veröffentlicht von C r a i g in J. Biol. Chem., Bd. 155, S. 519, 1944)
und mit einem Boratpuffersystem (veröffentlicht von E. A. S w a r t in Journal of
the Amer. Chefin. Society August 1949) bei einem PH-Wert von 7,3 gearbeitet wurde,
drei Fraktionen (I, II und 11I) erhalten, die in. dem angegebenen Treilnungsverfahren
verschiedene Verteilungskoeffizienten aufweisen und, entsprechend den Verteilungs'koeffizienten,
55 %, 2o % und I1 % der acitibiotischen Gesamtwirksamkeit des untersuchten Produktes
enthielten.
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Sämtliche der oben ;genannten Eigenschaften des Gesamtproduktes oder
Komplexproduktes sind auch hei den einzelnen Fraktionen vorhanden. Gegenüber einem
einzigen, etwas neomycinresistenten, als Mycobacterium 607 (R N) bekannten
Bakterienstamm zeigte die Fraktion III größere Wirksamkeit als die beiden anderen.
Jedoch ergaben die antibiotischen Spektra aller drei Fraktionen wie auch des Komplexproduktes
qualitativ dasselbe Bild, und zwar so weitgehend. daß der Ktmlplex wie auch seine
Fraktionen als Formen oder Verkörperungen des Neomycin, d. h. eines neuen Grundstoffes,
anzusehen sind. Genau wie Idas Komplexprodukt zeigen die Fraktionen unter verschiedensten
Bedingungen und Temperaturen eine außergewöhnliche Beständigkeit. Sie sind von Natur
aus basisch, bilden Salze, wie z. B. Hydrochloride und Pikrat°, und sind gegenüber
Kationenaustauschern gut adsorptionefähig.
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Es ist zu bemerken, da.B für die Herstellung von Neonivcin, seine
Abtrennung und Reinigung auch andere Verfahren verwendet werden können. Zum Beispiel
können die hier beschriebenen Verfahren abgewandelt werden, oder es können andere
Verfahren angewendet werden, die auf die Natur ,der Stoffe, ihre Lösliichkeit und
Reaktionsfähiglkeit gegenüber den in solchen Verfahren geeigneten Agentien abgestimmt
sind. Die vorliegende Erfindung beschränkt sich daher nicht auf die hierin beschriebenen
speziellen Verfahrensmaßnahmen und Stoffverbindungen, sondern umfaßt auch andere
Verfahren, die sich innerhalb des Erfindungsgedankens bewegen.