DE2326781B2 - Antibioticum xk-62-2, dessen Sulfat und Verfahren zur Herstellung desselben - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Antibioticum der Formel

	H3C	/	H —C —H \	C — - j	O ,	O
/ HO / \ f		\	IJ :
\ / C
	H	H	H i /' ] / C
	C-	C
		OFI
		NHCH3
NHCH3
CH ι "
ί C- / I
H
H sc-

H NH₂

das als XK-62-2 bezeichnet wird, dessen Sulfat und ein Verfahren zur Herstellung derselben.

Das neue Antibioticum XK-62-2 ist ein wasserlösliches, basisches Antibioticum von sehr starker antibakterieller Aktivität gegen verschiedene grampositive und gramnegative Bakterien. Es besitzt auch starke antibakterielle Aktivität gegen Staphylococcus aureus und Escherichia coli, die gegen verschiedene bekannte Antibiotica resistent sind. Ferner ist das neue Antibioticum sehr wirksam gegen Mikroorganismen des Genus Proteus und Pseudomonas, gegen die nur sehr wenige Antibiotica wirksam sind, und unter den Mikroorganismen des Genus Pseudomonas ist das neue Antibioticum besonders wirksam gegen Stämme, die gegen das Antibioticum Gentamicin C₁., resistent sind (vgl. Cooper und Mitarbeiter, Journal of Chemical Society, 1971, S. 3126 bis 3129).

Es wurde gefunden, daß das Antibioticum XK-62-2 eine ausgezeichnete therapeutische Wirkung auf verschiedene Infektionen (bei Menschen und Tieren) ausübt, die durch die oben beschriebenen phlogogenen Bakterien verursacht werden. In Anbetracht dieser ausgezeichneten antibakteriellen Aktivität kann das Antibioticum XK-62-2 für medizinische Zwecke verwendet werden. Es kann auch als Zusatz zu Tierfutter oder als wuchsförderndes Mittel verwendet werden.

In Anbetracht seiner Natur, die nachstehend im einzelnen beschrieben wird, dürfte das neue Antibioticum /u dem Gentamicin-Komplex gehören.

Die Herstellung des basischen Antibioticums Gentamicin ist in der US-Patentschrift 30 91 572 beschrieben. Es ist bekannt, daß Gentamicin sowie zwei weitere Fraktionen, die als Fraktion A und l-raklion B bezeichnen weiden, duixh Mikroomanis

H H NH-,

■■■- ! I / C-C

HO-C-H H—C—H

/ H H NH,

:—ο men der Species Micromonospora echinospora und Micromonospora purpurea hergestellt werden können. Andere Forscher haben festgestellt, daß der Gentamicin-Komplex weitere sechs Bestandteile enthält (vgl. »Separation, Structural and Physical Studies on the Gentamicin C Complex«, Kersh η er.Rutgers, the State-University of New Jersey, 1971). Diese sechs Bestandteile werden als C₁. C₁.,. C₂-I. C₂-II. C₂-III und C_{1 a} bezeichnet.

Das Antibioticum gemäß der Erfindung ist am engsten mit der Fraktion C_2a verwandt, wird jedoch in Anbetracht bedeutender Unterschiede in den Kernniagnetresonanzspektren, die nachstehend beschrieben werden, als verschieden von der in der Literatur beschriebenen Fraktion C_2a angesehen.

Gemäß der Erfindung wird das Antibioticum XK-62-2 dadurch hergestellt, daß man in üblicher Weise einen das Antibioticum XK-62-2 erzeugenden Mikroorganismus von Micromonospora sagamiensis ATCC 21 826, Micromonospora sagamiensis var. flava ATCC 21 827, Micromonospora sagamiensis var. nonreducans ATCC 21 803 und Micromonospora sugamiensis var. nonreducans Mutanten ATCC 21 949 in einem üblichen Nährmedium bei 25 bis 55 C bei etwa neutralem pH-Wert züchtet, das Antibioticum XK-62-2 in dem Medium in an sieh bekannter Weise, wie durch eine Kationenaustauscher- und anschließend Anionenaustauscherbehandlung. anreichert, es anschließend daraus in üblicher Weise, wie durch Chromatographie, abtrennt und gewünschlenfalls in üblicher Weise in sein Sulfat überführt.

Die Stämme ATCC 2! XTv 21 S03 und 21 S27 werden intern auch als Stämme MK 65. MK 62 und Mm 62S bezeichnet.

Die Stämme haben die folgenden Eigenschaften: 1. Morphologie

Es entsteht ein gut entwickeltes. Verzweigungen aufweisendes Substratmycel ohne Seheidewände mit 5 einem Durehmesser von etwa 0.5 μ. aber kein echtes Luftmycel. Die Sporen sind sehr gut ausgebildet, und einzelne Sporen bilden sieh an den linden von einfachen Sporophoicn (Lange 1.0 bis 2.0 μ), die von dem Substratmycel abzweigen. Viele Sporen bilden sich io um die Enden des Substratmyccls herum. Ausgereifte Sporen haben einen Durchmesser von etwa 1.0 μ, sind in ihrer Form oval bis kugelförmig und haben eine rauhe Oberfläche.

11. Charakteristische Kultureigenschaftcn auf verschiedenen Medien

Der Stamm MK 65

Auf gut züchtenden Agarmedien braune Kultur, die viele Sporen bildet, auf schlecht züchtenden Medien :>uf denen sich Sporen nur schlecht bilden. 25 ist die Kultur orangefarben. Mitunter variiert der Farbton je nach dem Medium.

Der Stamm Mm 628

Auf gewöhnlichen synthetischen Medien ist das Wachstum sehr schlecht; gut gedeiht der Stamm nur auf natürlichen Medien unter Bildung einer Sporenschichl. Der Farbion unterscheidet sieli auf allen Medien deutlich von demjenigen des Stammes MK 65: er ist mostriehfarben bis hellbraun. Im ausgereiften Zustand ist die Kultur infolge der Farbe der Sporen bräunlich bis schwärzlich und mitunter grau.

Der Stamm MK 62

Im allgemeinen werden auf gut züchtenden Agarmedien viele Sporen erzeugt, und die Kultur ist meist dunkelbraun. Auf schlecht züchtenden Medien ist die Kultur jedoch orangefarben, und es bilden sich nicht leicht Sporen. Ferner bildet sich eine schwarze Spore auf Agarmedium, auf dem das Wachstum des Substratmycels schlecht ist. aber sich leicht Sporen bilden. In flüssigen Medien ist die Kultur infolge der Farbe der Substratmedien orangefarben.

Die charakteristischen Kultureigenschaften auf verschiedenen Medien nach 2wöchigem Züchten bei 27 C sind in Tabelle I zusammengestellt. Die Farbangaben entsprechen der Klassifizierung in »Color Harmony Manual« (Container Corporation öl America).

Tabelle

Medium

Stumme

Mieromonospora satiamieiiMs var. nonreducans

MK 6:

Micronionospora saganiicnsis
MK (ö

Micromonospora saga mien sis
var. flava

Mm 62S

Czapeks Agar

Glukose-Asparaginagar

Nähraaar

Medium
Eieralbuminacar

G: mäßig, flach G:

S: hellmclonenfarbiiz S:

(3ia)

bis dunkelbraun (3pn) SP: keines SP:

G: mäßig, flach G:

S: ziegelrot Henna (5ng) S:

SP: keines SP

G: schlecht bis mäßig. G:

flach

S: orange (41a) S:

SP: keines SP: keines

mäßig, flach G: schlecht

aprikosenfarbie

bis dunkelbraun (4nl)

keines schlecht bis mäßiii. G: schlecht

ziegelrot (5nc)

keines

schlecht bis mäßig. G: schlecht bis mäßiii.

flach " flach

hellgoldfarben (2ic) S: hcllwcizenfarbig(2ea)

Stärkeagar

Ci Kullur (Wadislnni)
S lartx* ties SubsiralnivrcK
¹^P lösliches Pigment.

G: schlecht, flache G:

schwarze Sporenschicht

S: SP:

G: müßig, körnig Cj:

S: hcllkupferbriuin (5pg) S: SP: keines SP:

schlecht bis mäßie.
flach

kakaobraun (51g)
keines

mäßig, körnig
tiefbraun (4pl)
keines

SP: keines
G: schlecht

G: schlecht

Fortsetzung

to

Medium

Stämme

MicromoniKpora viii". nonieducans

MK (O

Micromonospora sagamiensis Micromonospora sagamiensis

var. (lava

MK h5

Mm (ON

Malzcxtrakl-Hefccxlrakt- G: mäßig, erhaben agar

S: tiefbraun (5pl)

Hafcrmehlagar

Dcxtrose-Caseinhydrolysat (1 :3)-agar

Bennetts Aiiur

Emersons Auar

SP: keines

G: schlecht, flach S: orange (41a)

SP: keines

G: mäßig, erhaben

S: kofferbraun (4ne)

SP: keines

G: mäßig, erhaben,

geriffelt S' Srtaubmorantiefarben

(41c) " SP: keines G: schlecht, gefaltet G: mäßig, körnig

S: kastanienbraun
(4ni)

G: schlecht, flach
S: orange (41a)

SP: keines

G: mäßig, flach

S: hellgelb (31a)

SP: keines

G: mäßig, körnig

G: gut. erhaben.

geriffelt S: mostrichbraun

(2pl) bis schwarz SP: keines G: schlecht

S: mostrichbraun (2pl)

bis schwarz SP: keines G: schlecht, körnig

S: hellgelb (2ea)

SP: keines

G: mäßiii, flach

S: eichenbraun (4pi) S: mostrichbraun (2pi)

S: hclloranacfarben

(4 na)

SP: keines

Glukose-Hefeextraktagar G: mäßig, erhaben

S: hellorangefarben

(4na) SP: keines

G = Kiiluir (Wachstum).
S = 1 arbc des Substralmvcelx.
SP- Lösliches Pigment.

III. Physiologische Eigenschaften

Die physiologischen Eigenschaften der Stämme MK 62, MK 65^ und Mm 628 sind in Tabelle II angegeben. Die günstigste Temperatur wird nach

Tabelle II

SP: keines

G: schlecht bis mäßig.

körnig
S: orangefarben (41a)

SP: keines

G: mäßig, körnig

S: rotbraunorange

(4 nc)
SP: keines

SP: keines

G: mäßig, körnig

S: hellmelonengelb

(3ia|

SP: keines G: mäßig, körnig S: mostrichbraun

(2pi) SP: keines

5tägiger Züchtung bestimmt, und die Wirkung auf 45 Milch sowie die Zersetzung von Cellulose werden nach einmonatiger Züchtung beobachtet. Die übrigen Beobachtungen werden nach 2wöchiger Züchtung bei 27° C durchgeführt.

Physiologische bigcnschaflcn

Micromonospora Micromonosponi

sagamicnsis var. nonreducans sagamiensis

MK MK 65

Micromonospora sagamiensis var. flava

Mm 6:s

Verflüssigung von Gelatine
Verflüssigung von Milch
Koagulation von Milch
Zersetzung von Cellulose
Hydrolyse von Stärke
Ausnutzung von Kohlensloffqucllen n-Arabinosc

n-Galactosc

n-Glukosc

(langsam)

+ (langsam)

Fortsetzung

Physiologische liigenschaften

MicronioiKispora sagamicnsis var. nonrediicans

MK 62

Micronionospoia
sagamiensis

MK ()5

Miaomonospora
sagamiensis
\ar. llava

Mm (OX

Glycerin D-Laclose

Lävulose + +

L-Inosit —

D-Mannit -

n-Raffmose —

L-Rhamnose -

D-Xylose + +

Saccharose +
Für das Wachstum günstigster pH-Wert 7.0 bis 8.0 Für das Wachstum günstigste Temperatur 35 bis 40¹C

Nitratreduktion -

Tyrosinasebiiduiig -

Melanoidbildung -

Da die Stämme MK 62, MK 65 und Mm 628 kein echtes Luftmycel bilden und auf dem Substratinyccl nur eine einzige Spore ausbilden, werden diese Stämme als dem Genus Micromonospora angehörig betrachtel. Die bekannten Mikroorganismen des Geiyjs Micromonospora können auf Grund der Farbe des Mycels in vier Gruppen eingeteilt werden, nämlich die orangefarbene Gruppe, die violettrote Gruppe, die blaugrüne Gruppe und die braune Gruppe. In Anbetracht der Unterschiede im Farbton und der übrigen, in den Tabellen I und II angegebenen Unterschiede wurde festgestellt, daß die Stämme MK 62, MK 65 und Mm 628 zu einer neuen Species gehören. die ihrerseits dem Genus Micromonospora anaehört.

Der Stamm MK 65 wurde als Sortcnkultur aussjcwählt und als Micromonospora sagamiensis bezeichnet, weil er aus Waldboden in den Vororten von Sagamihara-shi. Kanagawa-ken. Japan, isoliert wurde. Der Stamm MK 62 hat sehr ähnliche Eigenschaften wie der Stamm MK 65 und unterscheidet sich von diesem nur in der Reduktion von Salpetersäure, dem Schmelzen und Koagulieren und der Farbe des Mycels auf verschiedenen Medien. Daher wurde der Stamm MK 62 als Variante der Sortenkultur angesehen und als Micromonospora sagamiensis var. nonreducans bezeichnet, weil er Salpetersäure nicht reduziert. Der Stamm Mm 628 andererseits unterscheidet sich von den ersten beiden Stämmen darin, daß das Wachstum fcuf Agarmcdium im allgemeinen schlechter ist und die Kultur eine mostrichbraunc bis hellgelbe Farbe hat und daß dieser Stamm n-Arabinose. aber nicht Lävulose. ausnutzt. Dieser Stamm wird daher ebenfalls als eine Variante der Sortcnkultur betrachtet und wurde wegen des gelben Farbtons als Micromonospora Sagamicnsis var. Hava bezeichnet.

Die oben beschriebenen Vertreter der neuen Species erzeugen nicht nurdas Antibioticum XK-62-2.sondern auch andere Antibiotic;», die zu dem Gentamicin-C-IKomplex gehören.

Eine durch Einwirkung von N-Methyl-N'-nitro-N-nilrosoguanidin auf eine Kultur von Micromonospora sagamiensis var. nonreducans Al(X' 21 803 7.0 bis 8,0
30 bis 40 C

7.0 bis S.5
30 bis 40 C

erhaltene Mutante des Stammes MK 62 ist der Stamm MK-62-NG-164 (ATCC 21 949).

Wie im Falle von anderen Stämmen von Actinomyceten können auch die zur Durchführung der Erfindung verwendeten Mikroorganismen unter dem Einfluß künstlicher Mittel. wie\jllravioleltbestrahiunc. Bestrahlung :v.\[ Ce,^h0. Röiii^ciiucsiiuniting und unter dem Einfluß verschiedener Chemikalien Mutation erleiden. Im Rahmen der Erfindung können alle diese Stämme, auch wenn sie in dieser Weise mutiert sind, verwendet werden, sofern sie nur die Fähigkeit haben, das Antibiotikum XK-62-2 zu erzeugen.

Im allgemeinen kann man sich herkömmlicher Methoden zum Züchten von Mikroorganismen der Actinomycctcn bei dem crfinduncssicmäßen Verfahren bedienen. Als Kulturmedien kann" man verschiedene Nährmedien verwenden. Als Kohlcnstoffqucllc kommen Glukose. Stärke. Mannose. Fruktose. Saccharose. Dextrin. Melasse usw. allein oder in Kombination miteinander in Betracht. Ferner können Kohlenwasserstoffe. Alkohole, organische Säuren usw. verwendet werden, sofern sie von den Mikroorganismen genutzt werden können. Es können anorganische und organische Slickstoffquellen. wie Ammoniumchlorid. Ammoniumsulfat. Harnstoff. Ammoniumnitrat. Natriumnitrat usw. sowie auch in der Natur vorkommende Slickstoffqucllen. wie Pepton. Fleischextrakt. Hefeextrakt. Trockenhefe. Maisquclhvasser. Sojabohnen· pulver. Casaminosäure. lösliches Pfianz.cnprotcin usw allein oder in Kombination miteinander verwendet werden. Feiner kann man dem Medium im Bedarfsfalle anorganische Salze, wie Kochsalz. Kaliumchlorid. Calciumcarbonat und -phosphat, zuscl/en. Ebenso kann man organische oder anorganische Stoffe zusetzen, die das" Wachstum der Mikroorganismen fördern.

Am besten eignet sich für das Verfahren gemäl? der Erfindung eine FliissigkeitskulturmeihoJe. insbesondere eine Suhir,crs-Rührkiillurm:thode. Di' /.üchüingstemperatur liegt /wischen 25 und 55 C und es ist /weckmäßig, die Züchtiin<: bei etwa neiij tralem pll-Wcri durch/iifiihivn.

Das Antibioticum gemäß der Erfindung sammelt sich in der Kulturflüssigkeit gewöhnlich nach 1- bis 12tägiger Züchtung an. Wenn die Ausbeute an Antibioticum XK-62-2 in der Kulturfiüssigkcit ihr Maximum erreicht, wird die Züchtung unterbrochen und das Produkt aus dem Kulturmedium isoliert und gereinigt, nachdem die Mikrobcnzellen, z. B. durch AbfiUrieren, entfernt worden sind.

Das Isolieren und Reinigen des Antibioticums aus dem Filtrat erfolgt nach herkömmlichen Isolier- und Reinigungsmethoden für aus Kulturflüssigkeiten gewonnene mikrobiellc Stoffwechsclprodukle.

Da das Antibioticum XK-62-2 basisch und in Wasser sehr löslich, in gewöhnlichen organischen Lösungsmitteln jedoch schwer löslich ist. kann das Produkt nach den gleichen Methoden gereinigt werden, die gewöhnlich zur Reinigung der sogenannten wasserlöslichen basischen Antibiotica angewandt werden. Insbesondere kann es durch eine geeignete Kombination von Adsorption an und Desorption von einem Kationenauslauschharz und Aktivkohle. Säulenchromatographic unter Verwendung von Cellulose, einem Gel aus verälhcrtem Dextren und Kieselsäuregel sowie ähnlichen Methoden gereinigt werden. Da die freie Base in Aceton löslich und das Sulfat in Methanol schwer löslich ist, kann das gewünschte Produkt durch geeignete Ausnutzung dieser Eigenschaften in Lösung gebracht und ausgefüllt werden.

Zum Beispiel wird das Kulturfiltrat zunächst auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und dann an dem Kationenaustauschharz »Amberlilc lRC-50« (in NH₄ ⁺-Form) adsorbiert. Nach dem Auswaschen mit Wasser eiuicri man mit inormalem wäßrigem Ammoniak. Die aktive Fraktion wird unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wird dann mit dem Anionenaustauschharz »Dowex 1 χ 2« (in der OH Form) behandelt und weiter unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wird auf einen pH-Wert von 10,5 eingestellt und mit 5 Raumteilen Aceton versetzt. Der Niederschlag wird abfillricrt und das Filtrat eingeengt und mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt. Sodann setzt man 5 bis 10 Raumteile Methanol zu. Der Niederschlag wird abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Man erhält das Rohprodukt als weißes Pulver.

Das so erhaltene pulverförmigc Rohprodukt wird in der unteren Schicht eines Lösungsmittelgemischcs aus 2 Teilen Chloroform, 1 Teil Isopropanol und 1 Teil wäßrigem Ammoniak gelöst und die Lösung in einer Säule an Kieselsäuregel Chromatographien. Das Eluiercn erfolgt mit dem gleichen Lösungsmittel bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 30 ml/Stunde. Die Fraktionen des Antibioticums XK-62-2 werden aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt. Durch Gefriertrocknen des Konzentrats erhält man die weiße freie Base des Antibioticums. Man kann auch das Konzentrat der aktiven Fraktion mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 einstellen und dann filtrieren. Beim Gefriertrocknen des Filtrals erhält man das weiße Sulfat des Antibioticums XK-62-2.

Das Antibioticum

35

40

45

Die freie Base des Antibioticum^ XK-f.2 2 ist ein weißes basisches Pulver. Die Elcmentaranalyse ergibt: C 51,90. H 8,81, N 15,18 und O 24.11% (durch Difierenz). Der Schmelzpunkt des Sulfats beträgt 260 C (Zersetzung). Die spezifische Drehung der freien Base beträgt [«]', = -1-116" (Konzentration 1% in H_:O).

F i g. 1 zeigt das Ultraviolctt-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung des Antibiolicums XK-62-2. Hieraus ergibt sich, daß kein charakteristisches Absorptionsmaximum zwischen 220 und 36Om μ vorhanden ist. sondern nur endständige Absorptionen.

F i g. 2 zeigt das L'ltrarot-Absorptionsspcktrum des Antibioticums (KBr-Tablette). Wie sich aus F i g. 2 ergibt, zeigt das Antibioticum XK-62-2 Maxima bei den folgenden Wellenlängen, ausgedrückt in cm"¹:

610. 1040, 1110, 1285. 1340, 1390. 1460, 1510. 1620, 2050, 2920, 3030. 3350.

Das KMR-Spektrum des Sulfats ist in Fig. 3 dargestellt. Das KMR-Spektrum wurde mit einem »Varian Associates HA-100«-Spektrometer bestimmt, nachdem die Wasserstoffatome des Antibioticums XK-62-2 durch mehrmaliges Gefriertrocknen in schwerem Wasser durch Deuteriumatome ersetzt worden sind. Die Absorptionen bei 5,60 ppm und 6,32 ppm beruhen auf dem anomeren Proton des am Molekül beteiligten Zuckers. Die Absorptionen der N-Methylgruppe und der tert.C-Methylgruppe werden bei 3,38 nnm bzw. 1.80 ppm bestätigt. Charakteristischerweise wird eine weitere Absorption der N-Methylgruppe bei 3,21 ppm beobachtet, also bei einem Unterschied von 0,17 ppm gegenüber 3.38 ppm.

Als Ergebnis der Messung des Massenspektrums unter Verwendung einer Vorrichtung von hohem Auflösungsvermögen wird festgestellt, daß das AntibiolicuirTxK-62-2 ein Molekularion (M -f I)⁺ mit der Masse 464 und daher ein Molekulargewicht von 463 sowie die Formel C₂₀H₄₁N₅O- aufweist. Infolgedessen ergeben sich für die Elementaranaly.se die berechneten Werte C 51.84, H 8,86. N 15.12 und O 24.19%.

Die freie Base ist gut wasserlöslich, löslich in Methanol, etwas löslich in Äthanol oder Aceton, aber unlöslich in organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform. Benzol, Äthylacetat. Butylacetat. Äther. Butanol. Pctroläthcr, η-Hexan usw. Sein Sulfat ist gut löslich in Wasser, aber unlöslich in organischen Lösungsmitteln, wie Methanol. Aceton usw.

Die bei der Papierchromatographie und der Dünn Schichtchromatographie mit verschiedenen Entwicklern erhaltenen Rf-Werte des Antibioticums XK-62-! sind in Tabelle Hl angegeben.

Tabelle

1. Rf-Werte des Antibioticums XK-62-2 bei der
aufsteigenden Papierchromatographie (bei 28 C)

lniuickier

Ammoniumchloridlösung.
20 Gewichtsteile Ammoniumchlorid auf 100 Raumteile
Mit Wasser gesättigtes
n-Butanol

Gemisch aus 3 Teilen
n-Butanol. 1 Teil Essigsäure
und 1 Teil Wasser

Mil Wasser gesättigtes
Äthvlacetat

Rf-Wen Kniwick-

(Stuiulcnl

0.98

OA)O

0.06

0.00

15
15

Fortsetzung

Entwickler

Rf-Werl

0,03

Entwick-

Mit Wasser gesättigtes
n-Butanol, das 2 Gewichtsteile
p-Toluolsulfonsäure und
2 Gewichtsteile Piperidin auf
100 Raumteile enthält

2. Rf-Werte von XK-62-2 bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselsäuregel (bei Raumtemperatur)

Die obere Schicht eines Ge- 0.86 3

misches aus 2 Raumteilen

Chloroform, 1 Raumteil

Methanol und 1 Raumteil

17prozentigem wäßrigem

Ammoniak

Gemisch aus gleichen Raum- 0,21 3

teilen lOprozentiger

Ammonii;m;irctiilösunp und

Methanol

(Stunden)

15

IO

<5

20

Ein Vergleich der Rf-Wertc des Antibioticums XK-62-2 mit denjenigen bekannter Antibiotica bei der j , ,. Papierchromatographie unter Verwendung der unteren Schicht eines Gemisches aus 2 Raumieüen Chloroform, 1 Raumteil Methanol und 1 Raumteil 17%igem wäßrigem Ammoniak als Entwickler sind in Tabelle IV zusammengestellt.

Fraktionen angegeben, die als FiJction A und Fraktion B bezeichnet werden. Spater s:nd weitere Fraktionen isoliert worden. Zum Beispiel ist. in der Dissertation von Allan S. K e r s h η e r »Separation Structural and Physical Studies on The Gentamicin C Complex«, Rutgers University, The State University of New Jersey; 1971, eine Reihe von Gemamic.n-Antibiotica als C₁, C₂., C₂-I. C₂-U. C₂-IU bzw. C, identifiziert.

Das Antibioticum gemäß der Erfindung ist zwar ene mit den bekannten Antibiotica des Gentamicin-Komnlexes verwandt, erweist sich aber auf Urund der oben angegebenen charakteristischen Kennwerte, besonders seines Ultraviolett-Absorptionsspektrums. seines Ultrarot-Absorptionsspektrums und semes kernmaenetischen Resonanzspektrums, als ein bisher noch nicht bekanntes Antibioticum. Das Antibioticum oemäß der Erfindung ähnelt am -meßten der Gentamicinfraktion C₁; diese Fraktion hat aber nicht das oleiche kernmagnetische Resonanzspektrum wie das Antibioticum gemäß der Erfindung. Das Antibioticum XK 6^-2 ist daher ein neuer Stoff, der ausgezeichnete antibiotische Eigenschaften aufweist, wie durch die nachstehenden Tabellen nachgewiesen wird.

Das antibakteriell Spektrum des Antibioticums XK-62-2 aegen verschiedene Mikroorganismen ist in Tabelle V angegeben.

Antibakterielles Spektrum des Antibioticums XK-62-2 nach der Agarverdünnungsmethode

35 Untersuchte Mikroorganismen

Tabelle IV

Aufsteigende Papierchromatographie (bei Raumtemperatur); Entwicklungszeit 12 Stunden MindW-

hcmniunuv

kon/cniraih

(■· mil

40

Antibioticum

Gentamicin A
Gentamicin C_{1 a}
Gentamicin C₂
Gentamicin C₁
Antibioticum Nr, 460
Sisomicin

Neomycin A

Neomycin B

Kanamycin A

Kanamycin B

Paromomycin

Nebramycin-Komplex

Tobramycin

Antibioticum XK-62-2

Rf-Wcn

0.00 0.18 0.38 0.59 0.01 0,18 0.00 0.02

0,01

0,00

0.02

0,02

0,00

0.49

45

5°

55

60

Auf Grund der obigen Bestimmungen wird das Antibioticum gemäß der Erfindung als dem Gentamicin-Komplex zugehörig betrachtet. Wie oben erwähnt, ist die Herstellung des Antibioticums Gentamicin in der LJSA.-Patentschrifl 30 91 572 beschrieben. In dieser Patentschrift sind die Eigenschaften vnd die Struktur des Gentaniicins sowie zweier zugehöriger

Streptococcus faecalis ATCC 10 541 1.05

Staphylococcus aureus ATCC 6538,P <0.0041 Staphylococcus aureus KY 8942 0.065

(resistent gegen Kanamycin,
Paromomycin und Streptomycin) Staphylococcus aureus KY 8950 0.0082

(resistent gegen Streptomycin,
Tetracyclin. Penicillin und Sulfonamide) Staphylococcus aureus KY 8953 0,0041

(resislent gegen Streptomycin,

Kanamycin, Paromomycin, Tetracyclin.

Neomycin, Kanendomycin und Erythromycin)

Staphylococcus aureus KY 8956 < 0,001

(resistent gegen Streptomycin,

Paromomycin, Tetracyclin, Erythromycin und Oleandomycin)

Staphylococcus aureus KY 8957

(resistent gegen Chloramphenicol,

Streptomycin. Kanendomycin. Tetracyclin und Paromomycin)

Bacillus subtilis Nr. 10 707

Bacillus cereus ATCC 9634

Bacillus cereus var. mvcoidcs

ATCC 9463

Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 Eseherichia coli ATCC 2(S

0.0021

0.004 0.016 0.0082

0.00X2 0.0082

15

/IO

Fortsetzung

Uniersuchte Mikroorganismen

Escherichia coli KY 8302 (resistent gegen Chloramphenicol, Streptomycin. Kanamycin, Paromo_mycin Tetracyclin und Speciinomycin) Escherichia coli KY 8310 (resistent Hegen Chloramphenicol. Streptomycin. Kanamycin. Gentamicin. Kanendomycin, Paromomycin. Tetracyclin und Spectinomycin) Escherichia coli KY 8314 (resistent gegen Streptomycin) Escherichia coli KY 8315 (resistent gegen Streptomycin. Kanamycin, Paromomycin und Meomycin)

Pseudomonas aeruginosa BMH Nr. Proteus vulgaris ATCC 6897 Shigella sonnei ATCC 9290 Salmonella typhosa ATCC' 9992

Mmdoi-

liemmungs-

kon/emr.iiu

(·■ mli

0.53
0.03
0.07
0.018

10

Die In-vnio-Aktivität des Antibiolicums XK-62-2 gegen eine A'nzahl von grampositiven und gramnegativen Bakterien ist viel höher als diejenige des Streptomycins und des Kanamycins und ist derjenigen des Geniamieins vergleichbar. Die In-vitro-Vergleichs-' aktivitäien dieser Antibiotiea gegen verschiedene Mikroorganismen des Genus Proteus sind in Tabelle Vl angegeben;

Die antibakteriell Aktivität des Antibiolicums XK-62-2 gegen verschiedene, klinisch isolierte Stämme von Pseudoinonas aeruginosa wird mit der Aktivität von Streptomycin. Kanamycin, dem Ger-.»;nicin-Komplex und Gentamicin C_la in Tabelle VlI verglichen.

Außerdem wird die in-viiro-Akiivitäl des AritibioticumsXK-62-2 gegen pathogene bakterielle Infektionen bei Mäusen untersucht. Die Mäuse werden durch intraperitoneale Injektion mit einem Impfgut von Pseudomonas aeruginosa BMH Nr. 1 oder Pseudomonas aeruginosa KY 8510 infiziert. Dann werden sie' mii verschiedenen Dosen des zu untersuchenden Antibiotieums durch subkutane Injektion behandelt. Die Wirkung des Antibiolicums XK-62-2 auf den Schutz gegen Bakterieninfektionen ergibt sich aus Tabelle VIII; für jeden dieser Versuche wurden zehn Mäuse verwendet.

Tabelle Vl

Mindesthemmungskonzentration. -,· ml (nach der Agarverdünmingsmethode)

Mikroorganismen

Proteus vulgaris KY 4296 Proleus vulgaris KY 4297 Proteus vulgaris ATCC 6897 Proteus vulgaris Abbott .1.1 Proteus mirabilis Finland Proteus mirabilis Nr. 825 Proteus mirabilis Nr. 39 Proteus morganii Jenkins Proteus rettgeri Booth Proteus rettgeri Hambrook Antibioticum \K.-(O-2 Gentamicin-Komplex Strcplotmein

0.021

0.021

0.04

0.021

0.04

0.021

0.04

0.04

0.021

<0.01

>40

>40

% .10

>40

>40

>40

>40

>40

K a na m> ein

0.34 0.16 0.04 0.04 0.33 0.16 0.08 0.08

Tabelle VIl

Mindesthemmungskonzentration. ;■ ml (nach der Agarverdünnungsmethode)

Stämme von Pseudo	Antibioticum
monas aeruginosa	XK-62-2
KY 4276	0.33
KY 8510	0,33
KY 8511	>42
KY 8512	0.33
KY 8514	0.55
KY 8515	>42
KY 8516	0.33
KY 8520	0.33
KY 8562	>42

Gentamicin-Komplex

0.33
1,3
42
0.65
1.3
62
1.3
0.65
62

Gentamicin

0.33
2.6

42
0.33
0.33
.-42
5.2

0.33
-42

Streptomycin

2,6 0.65 -- 2500
42
156
624
0.65

156

Kanamycin

1.63 13 13

3.3 208 416 26 104 167 50? 514/369

Tabelle VIII

DosK. mg je Maus

17

Pseudomonas aeruginosa BMH Nr.

Antibioticum XK-62-2

Gentamicin-Komplex

Pseudomonas

Antibioticum
XK-62-2

18

ο-,η KV X5I0

C'iLMitumicin-Komple\

Prozentuales überleben d^r Mäuse

₂ ,00 100 Κ» «J

I 90 100 "~ 80 -W ¹⁽⁾

0 5 50 70 50 30 0

0 25 10 20 30 ^{I() ()}

0,125 0 0 0 0 0

Wie sich aus den obigen Daten eraibt. hat das Anti- monospora erzeugt. Wie sich jedoch aus den obiger

bioticum XK-62-2 eine sehr starke antibakteriell Kennwerten ergibt 1*^{βι S1}<* _t ^das. .Ant,b,ut,eurr

Aktivität _Begen einen weiten Bereich von »ram- XK-62-2 auf Grund der Rf-Werte bei der Papier-

positiven und aramnegativen Bakterien. Ferner weist 20 Chromatographie deutlich von Gentamicin A. C₁,

es eine starke" antibakterielle Aktivität _Keacn Sta- C₂ und C₁. die alle Bestandteile des Gentamicin-

phylococcus aureus und Escherichia coli auf, die gegen Komplexes sind, von dem Anubjoticum Nr. 460 und

verschiedene bekannte Anlibiotica resistent sind, und von Sisomicin unterscheiden. Wasserlöslichen ba-

es ist besonders wirksam gegen Mikroorganismen der sischen Aminoglucosid-Antibiotica, z. B. Neomycin A

Genera Proteus und Pseudomonas, negen die bisher 25 Neomycin B, Kanamycin A, Kanamycin B. 1 aromo-

nur weniee Antibiolica als wirksam bekannt sind. mycin. Nebramycin-Komplcx und 1 obramycin. wer-

Aus den obigen Tabellen ist ersichtlich, daß es im den ähnliche Eigenschaften wie dem Antibioticum

Vereleich zu dem Gentamicin-Komplex oder zu XK-62-2 zugeschrieben. Es ist jedoch klar, daß das

Gentamicin C₁,. welches einer der Bestandteile des Aniibioticum XK-62-2 sich hinsichtlich der Rl-Weric

Gentamicin-Komplexes ist, eine ausgezeichnete anti- 30 einwandfrei von diesen Antibiotica unterscheidet,
bakterielle Aktivität und therapeutische Wirkung

gegen gewisse (klinisch isolierte) Stämme von Pseudo- Beispiel 1

monas aeruginosa aufweist. Insbesondere zeigt das A. Züchtunn von MK 65
Antibioticum XK-62-2 eine viel höhere antibakterielle

Aktivität neuen Pseudomonas acruainosa KY 8510 35 I" diesem Beispiel wird Micromonospora saga- und KY 8516 als der Gentamicin-Komplex oder miensis MK 65 ATCC 21 826 (FERM-P Nr. l?30) als Gentamicin C_{1 ü}. Auf Grund von enzymologischen Impfstamm verwendet. 30 ml eines ersten Nähr-Untersuchungen wurde gefunden, daß' die Stämme mediums werden in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben KY 8510 und 8516 ein spezifisches Enzymsystem ha- mit einer Schleife voll Impfslamm beimpft. Das Nährben, welches Gentamicin C₁., oder Kanamycin durch 40 medium dieser ersten Impfkultur hat die folgende Acetylierung der 6-ständigen NH,-Gruppe des Pur- Zusammensetzung:

porosamins von Gentamicin C_{1 a} oder der 6'-ständigcn Dextrin 1 "n

ΝΗ,-Gruppe des Kanamycins inaktiv macht. Dies Glukose 1 %

ist die Hauptursache für die Resistenz der Stämme Pepton 0 S" „

IKY 8510 und 8516 besonders gegen Gentamicin C_1?. 45 Hefeextrakl 0 5",,

,lcdoch sind diese beiden Stämme gegen das Anti- Calciumcirbonit ΟΙ'Ί,

bioticum XK-62-2 empfindlieh. Es ist anzunehmen. (pH ■ 7 "" vor der Slerilisierun")
daß dies darauf beruht, daß das Antibioticum XK-62-2

durch dieses inaktivierende Enzym nicht acelylicrt Die Züchtung wird 5 Tage unter Schütteln bei 30 C werden kann, weil seine 6'-ständige NH,-Gruppe 50 durchgeführt. Dann werden mit 30 ml dieser Impfmethyliert ist. Verglichen mit Gentamicin "C₁,, oder kultur 300 ml eines zweiten Nährmediums der gleichen mit dem Gentamicin-Komplex, der Gentamicin C₁,, Zusammensetzung wie das erste Medium in einem mit enthält, ist also das Antibioticum XK-62-2 besonders Scheidewänden versehenen 2-l-Erlenmeyerkolben bewirksam in seiner antibakteriellen Aktivität gegen impft. Die zweite Impfkullur wird 2 Tage bei 30 C Pseudomonas aeruginosa. Escherichia coli und Kleb- 55 unter Schütteln durchgeführt. Mit 1.5 1 der zweiten Siella pneumoniae. die diesen acetylierenden Resistanz- Impfkullur (entsprechend dem Inhalt von 5 Kolben] Mechanismus aufweisen. werden dann 15 1 eines dritten Nährmediums der

Andere Antibiotica, nämlich der Gentamiein-Kom- gleichen Zusammensetzung in einem 30 1 fassenden

plex (M. J. Weinstein und Mitarbeiter: »Anti- Glashafen-Fermenter beimpft. Die Züchtung in dem

inierobial Agents and Chemotherapy« [1963] 1. und 60 Glashafen-Fermenter wird 2 lage lang bei 30 C unter

D. .1. Cooper und Mitarbeiter: ».1. Infect. Dis.«. Belüftung!!? I Min.) und Rühren (350 l^! Min.)durch-

Hd. 119. S. 342 |1969]|. das Antibioticum Nr. 460 geführt. Mit 1 5 1 der dritten Impfkultur werden dann

(hekanntgeniachie japanische Palentanmeldung 60 1 eines \ierien Nährmediums der gleichen /u-

16 153 71) und Sisomicin (M. .1. Weinslein und sammenseizung in einem 300 1 fassenden I V, -meiner

Mitarbeiter: -.1. Antibiotics«. Bd. 23. S. 551. 555. 559 65 beimpft. Die Züchtung in dem Fcrmcnler wird im

I l^l->7()|] sind wasserlösliche, basische Anlibiolica mil Verlaufe \on 2 Tagen bei 30 C untu" Belüftung

einem weitreichenden anlimikrobiellen Spektrum und (60 1 Min.) und Rühren (1501 Min.) liurchgefiihn.

werden durch Mikroorganismen des (ienus Micro- Schließlich werden mil 60 1 der vierten IninlTsultui

IO

$00 1 eines Fermentationsmediums der folgenden Zulammensetzung in einem lOOü I fassenden'Fermenter beimpft:

Dextrin 5"/„

Sojabahnenmehl -. 4%

CdCOi - 0,7%

(pH: 7,2 vor der Sterilisrerung'

Die Züchtung in dem Fermenter wird 5 Tage lanti bei 35 C unter Belüftung (600 1-Min.) and Rühren (150 U Min.) durchgerührt.

B. Isolierung des rohen Antibioticum»

ι

Sobald die Fermentation vollständig ist, wird die Kulturflüssigkeit mit 1 !normaler Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt und 30 Minuten gerührt. Dann setzt man 10 kg Filterhilfsmittel zu und filtriert die Mikrobenzellen ab. Das Filtrat wird mit anormaler Natronlauge auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und durch eine Säule geleitet, die mit 501 Kationenaustauschharz (»Amberlite IRC-50« in der Ammoniumionenform) beschickt ist. Die aktive Substanz wird an dem Harz adsorbiert und das Eluat verworfen. Nach dem Waschen des Harzes mit Wasser wird die aktive Substanz mit 1 normalem wäßrigem Ammoniak eluiert. Die Aktivität des so erhaltenen Eluats gegen Bacillus subtilis Nr. 10 707 wird nach einer Papierscheibenmethode unter Ver-Wendung einer Agarplatlc bestimmt.

Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum auf 5 1 eingeengt. Dann wird das Konzentrat mit anormaler Schwefelsäure aut einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und durch eine Säule geleitet, die mit 1 1 eines Anioncnauslauschharzes (»Dowex 1 χ 2« in der Hydroxylionenform) beschickt ist. Die Säule wird mit 51 Wasser gewaschen und die aktive Substanz auf ',s ihres Volumens eingeengt. Das Konzentrat wird mit onormalcr Natronlauge auf einen pH-Wert von 10,5 eingestellt und mit 5 Raumteilen Aceton versetzt. Der Niederschlag wird abültrieri und das Filtral auf 500 ml eingeengt. Das Konzentrat wird mit önormalcr Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und mit 2,5 1 Methanol versetzt. Nach dem Kühlen erhält man einen weißen Niederschlag. Der Niederschlag wird abfilineri und mit Methanol gewaschen. Nach dem Trocknen im Vakuum erhält man 300 g eines weißen Pulvers. Dieses weiße Pulver ist ein Gemisch aus dem Sulfat von Gentamicin C_u und dem Sulfat des Antibioticums XK-62-2 und zeigt eine Aktivität von 620 F.inheilcn mg (die Aktivität von 1 mg des reinen Produkts ent- ■ spricht 1000 Einheilen).

55 C. Isolierung und Reinigung

100 g des in Stufe B erhaltenen weißen Pulvers werden in einer dünnen, gleichmäßigen Schicht auf dem oberen Teil einer 150 cm langen Säule von 5 cm Durchmesser ausgebreitet, die mit 3 kg Kieselsäuregel beschickt ist, welches zuvor in einem Lösungsmittel aus 2 Raumteilen Chloroform. I Raumleil Isopropanol und 1 Raumleil wäßrigem Ammoniak suspendiert worden ist. Das Linieren erfolgt mit dem gleichen Lösungsmittel bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 250 ml Std. Das Llunl wird in Anteile /u KH) ml /erlesil. Die aktive Fraktion wird der Panierchromalo-

graphic unterworfen, um die eluierten Bestandteile zu untersuchen. Das Antibioticum XK-62-2 wird in den Fraktionen Nr. 53-75 und Gentamicin C₁₄ in den Fraktionen Nr. 85-120 eluiert. Die Fraktionen Nr. 53-75 werden vereinigt und unter vermindertem Druck so weit eingeengt, daß das Lösungsmittel abgerieben wird. Das Konzentrat wird in etwas Wasser gelöst. Nach dem Gefriertrocknen der Lösunu erhält man 38 g reines Antibioticum XK-62-2 als freie Base. Die Substanz hat eine Aktivität von 950 Einheiten mg. Die Fraktionen Nr. 85-120 werden ebenfalls vereinigt und unter vermindertem Druck so weit eingeengt, daß das Lösungsmittel abgetrieben wird. Das Konzentrat wird dann in etwas Wasser gelöst. Nach dem Gefriertrocknen der Lösung erhält man 50 g gereinigtes Präparat von Gentamicin C_{1 a} als freie Base. Die Aktivität dieses Präparats beträgt 9K0 Einheilen mg.

Beispiel 2

In diesem Beispiel wird Micromonospora sagamiensis var. flava Mm 628 ATCC 21 827(FERM-P Nr. 1531) als Impfstamm verwendet. Die Impfkulturen werden in der gleichen Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, mit dem gleichen Nährmedium angelegt. Mit 60 ! der vierten Impfkultur werden 600 1 eines Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung in einem 1000 1 fassenden Fermenter beimpft:

Lösliche Stärke 4%

Maisquellwasser 1 %

Sojabohnenmehl 2%

K₁HPO₄ 0.05%

MgSO₄ -7 H₁O 0,05%

KCl 0,03%

CoCL -2H₁O 0,005%

CaCO₃ 0.1%

Die Fermentation wird 96 Stunden bei 30 C unter Belüftung (600 1 Min.) und Rühren (150 U/Min.) durchgeführt. Nach beendeter Fermentation wird das Rohprodukt von der Kulturfiüssigkeit, wie im Beispiel 1 beschrieben, abgetrennt, und man erhält 400 g eines weißen Pulvers. Durch Papierchromatographie wird gefunden, daß das Pulver Gentamicin C₁. C₂ und Cj., sowie außerdem das Antibioticum XK-62-2 enthält.

Die 400 g des weißen Pulvers werden dann auf den oberen Teil einer zylindcrförmigcn Glassäulc geschüttet, die gleichmäßig mit 8 kg Kieselsäuregel beschickt ist, welches zuvor in einem Lösungsmittel aus 2 Raumleilen Chloroform, 1 Raumteil Isopropanol und 1 Raumteil 17%igem wäßrigem Ammoniak suspendiert worden ist. Nachdem das Pulver auf den oberen Teil der Säule geschüttet worden ist. eluiert man mit dem gleichen Lösungsmitte!gemisch bei einer Geschwindigkeit von 500 ml/Stunde. Das F.lual wird in Anteile zu 500 ml zerlegt. Jede der Fraktionen wird durch Papierchromatographie untersucht. Hierbei wird gefunden, daß die einzelnen Bestandteile in dei folgenden Reihenfolge eluieri werden: Gentamicin C₁ Antibioticum XK-62-2. Gentamicin C, und Gentamicin ( 1 ,. Dieienigen Fraktionen, die den gleicher Bestandteil haben, werden miteinander vereinigt um eingeengt. Das Konzentrat wird in Wasser gelöst unc gefriergetrocknet. und die folgenden BeslandleiK werden in Form tier freien Basen isoliert:

Bestandteil	Akliviliit	Ausbeute
	(HinhcilcM mgl	IgI
Gentamicin C1	880	150
Antibioticum XK-62-2	932	60
Gentamicin C2	925	113
Gentamicin C,.	940	52

Beispiel 3

In diesem Beispiel dient Micromonospora sagamiensis var. nonreducans MK 62. ATCC 21 803 (FERM-P Nr. 1477) als Impfslamm. Eine Schleife voll ,₅ impfgut wird zum Beimpfen von 30 ml eines ersten Nährmediums der folgenden Zusammensetzung in einem 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben verwendet:

Dextrin 1 %

Glukose 1%

Pepton 0,5%

Hefeextrakt 0.5%

Calciumcarbonat 0.1 %

(pH: 7,2 vor der Sterilisiei ung)

Die Züchtung wird 5 Tage unter Schütteln bei 30 C durchgeführt. Dann werden mit 30 ml der ersten Impfkultur 300 ml eines zweiten Nährmediums der gleichen Zusammensetzung in einem mil Scheidewänden versehenen 2-l-Erlenmeycrkolbcn beimpft. Die zweite Impfkultur wird 2 Tage bei 30C unter Schütteln durchgeführt. Hierauf werden mit 1.5 1 der zweiten Impfkullur (entsprechend dem Inhalt von 5 Kolben) 15 1 eines dritten Nährmediums der gleichen Zusammensetzung in einem 30 I fassenden Glashafen-Fermenter beimpft. ο

Die Züchtung in dem Glashafcn-Fcrmcntcr wird 2 Tage bei 30^r~C unter Belüftung (15 I, Min.) und Rühren (350 U/Min.) durchgeführt. Dann werden mit 15 I" der dritten Impfkultur 601 eines vierten Nährmediums der gleichen Zusammensetzung in einem 300 1 fassenden Fermenler beimpft. Diese Züchtung erfolgt innerhalb von 2 Tagen bei 30 C unter Belüftung (601Γμϊπ.) und Rühren (150U Min.). Schließlich werden mit 60 I der vierten Impfkultur 600 I eines _4S Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung in einem 1000 1 fassenden Fermenter beimpft.

Dextrin 5"»

Sojabohnenmehl 3.5%

CaCO, 0.7" „

(pH: 7,2 vor der Stcrilisierung)

Die Züchtung in dem Fermenter wird 5 Tage bei 30"C unter Belüftung (500 l/Min.) und Rühren (150 U/Min.) durchgeführt.

Nach Beendigung der Fermentation wird die KuI-turflüssigkcit mit 12normaler Schwefelsäure auf einen pH-Wcrt-von 2,0 eingestellt und 30 Minuten gerührt. Dann setzt man 10 kg Filterhilfsmittel zu und filtriert die Mikrobenzellcn ab. Das Filtrat wird mit önormalcr Natronlauge auf einen pH-Wert von 8.0 eingestellt und durch eine Säule geleitet, die mit 501 des Kationenaustauschharzcs »Ambcrlitc IRC-50« (in der Ammoniumionenform) beschickt ist. Das FJuat wird verworfen. Nach dem Auswaschen des Harzes mit Wasser wird die aktive Substanz mit 1 normaler wäßriger Ammoniumhydroxidlösung cluicrt. Die Aktivität des so erhaltenen Eluats uecen Bacillus subtilis Nr. 10 707 wird nach einer Papierscheibenmethode unter Verwendung einer Agarplatte bestimmt.

Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum auf 5 1 eingeengt. Das Konzentrat wird mil 6normalcr Schwefelsäure auf einen pH-Werl von S.O eingestellt und durch eine Säule geleitet, die mit 1 1 des Anioncnaustauschharzcs »Dowex 1 χ 2« (in der OH -Form) beschickt ist. Die Säule wird dann mit 5 1 Wasser gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen. Die aktive Fraktion wird auf ¹Z₁₅ ihres Volumens eingeengt. Dann wird das Konzentral mit önormaler Natronlauge aul einen pH-Wert von 10,5 eingestellt und mit 5 Raumtcilen Aceton versetzt. Der Niederschlag wird abfiltriert und die Acclonschicht auf 500 ml eingeengt. Das Konzentrat wird mit önormaler Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und mit 2,5 1 Methanol versetzt. Nach dem Kühlen erhält man einen weißen Niederschlag. Der Niederschlag wird abfillricrt und mit Methanol gewaschen. Nach dem Trocknen im Vakuum erhält man 16 bis

20 g weißes Pulver. Das weiße Pulver isi ein Gemisch aus dem Sulfat von Gentamicin C_la und demjenigen des Antibioticums XK-62-2 und zeigt eine Aktivität von SSO Einheiten mg (die Aktivität von 1 mg reinem Produkt entspricht 1000 Einheiten).

5 g des weißen Pulvers werden als dünne, gleichmäßige Schicht auf dem oberen Teil einer 50 cm Fangen und 25 mm weiten Säule ausgebreitet, die mit 300 ml Kieselsäuregel beschickt ist. welches zuvor in einem Lösungsmittel aus 2 Raumtcilen Chloroform. 1 Raumteil Isopropanol und 1 Raumteil wäßriger Ammoniaklösung suspendiert worden ist. Das Eluieren erfolgt mit dem gleichen Lösungsmittel bei einer Strömungsgeschwindigkeit von }r\ rr.l 'StüMvjw. Das F.lual wird in Anteile zu 10 ml zerlegt. Die aktive Fraktion wird durch Papierchromatographic auf die eluierten Bestandteile untersucht. Das Antibioticum XK-62-2 wird in den Fraktionen Nr. 53-75 und Gentamicin C,_a in den Fraktionen Nr. 85-120 eluiert. Die Fraktionen Nr. 53-75 werden vereinigt und unter vermindertem Druck so weit eingeengt, daß das Lösungsmittel abgetrieben wird. Das Konzentrat wird in etwas Wasser gelöst. Nach dem Gefriertrocknen der Lösung erhält man 900 mg gereinigtes Antibioticum XK-62-2 (als freie Base). Die Substanz hat eine Aktivität von 950 Einheiten mg. Ebenso werden die Fraktionen Nr. 85-120 miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck so weit eingeengt, daß das Lösungsmittel abgetrieben wird. Das Konzentrat wird in etwas Wasser gelöst. Nach dem Gefriertrocknen der Lösung erhält man 1,8 g gereinigtes Präparat von Gentamicin C_{1 a} (als freie Base). Die Aktivität des Präparats beträgt 980 Einheiten/mg.

Beispiel 4

In diesem Beispiel wird wiederum Micromonospora sagamiensis var. nonreducans MK 62 (ATCC

21 S03) als impfstamm verwendet. Die Zusammensetzung des Nährmediums ist die folgende:

Lösliche Stärke 2%

Cascinhydrolysat (eßbar) 0.5%

Hefeextrakt 0.5%

Calciumcarbonat 0.1 %

Mit einer Schleife voll von der Impfkultur werden 300 ml Nährmedium in einem 2 I fassenden Frlcnmeyerkolben beimpft. Die erste Impfkuliur wird 4 Tage unter Schütteln bei 30⁰C Hnrrhm-fiihrt Dann

23 24

werden mit dem Inhalt von drei Kolben der ersten jenigen des Antibioticums XK-62-2 und hat eine

Impfkultur 15 1 frisches Nährmedium in einem 30 1 Aktivität von 450 Einheilen mg.

fassenden Glasfermenter beimpft. Die zweite Impf- 60 g dieses rohen Pulvers werden in 10 1 Wasser

kultur wird 2 Tage bei 30° C unter Belüftung und Ruh- gelöst. Die Lösung wird mit 2normaler Natronlauge

rcn durchgeführt. Dann werden 150 1 der dritten 5 auf einen pH-Wert von 8.0 eingestellt und durch eine

Impfkultur in einen 3000 1 fassenden Behalter über- Säule geleitel, die mit 3 1 des Anionenausiauschharzes

führt, der 150 1 eines Fermentationsmediums der »Amberlitc lRA-400« (in der Hydroxylioncnform)

folgenden Zusammensetzung enthält: beschickt ist. Die Säule wird mit 10 1 Wasser ge-

■ ,.·,·, ς.·· κ _A„, waschen, und das Eluat und die Waschflüssiakciten

Losiicne Marne 4 /,, _{iq wcrdcn vcremisll Ulld auf} \ \ cjrmccnui. Das Kon/en-

Maisqucllwasser I/o _{lfal wjrd mh}- _6normalcr Schwefelsäure auf einen

^enme 0"5^0/ pH-Wert von 4,5 eingestellt und mit 10 1 Methanol

w ο^λ *,;i'n n'Xcn" versetzt. Auf diese Weise erhält man 50 u uercinistes

MgSO, · 7H₂O 0,05% _{Sulfal eines Amibioticums}.

r π iun n'nns°/ '⁵ ^O £ des gereinigten Antibioticums werden auf den

C°r O ² a , o/ oberen Teil einer 100 cm langen und 4 cm weiten Säule

^CaL -¹ ' geschüttet, die mit 2,8 1 Cellulosepulver beschickt ist.

Die Fermentation wird 4 Tage bei 30'C unter Das Eluieren erfolgt allmählich mit der unteren Schicht Belüftung und Rühren durchgeführt. Die Erzeugung eines Lösungsmittclgemisches aus 2 Raumteilen der aktiven Substanz erreicht nach 4tägjger Fennen- 20 Chloroform, 1 Raumteil Methanol und 1 Raumteil tation ein Maximum, und die Aktivität füll einige Zeit 17%igcr Ammoniaklösung. Die Geschwindigkeit des lang nicht ab. Eluierens wird so gesteuert, daß die einzelnen Anteile Wenn die Fermentation vollständig ist, wird die 100 ml nicht überschreiten. Das Eluat wird in Anteile Kulturfiüssigkeil mil Oxalsäure auf einen pH-Wert zu 20 ml zerlegt, und das Antibioticum XK-62-2 von 2,0 eingestellt und 1 Stunde gcrü irt. Auf diese 25 sowie Gentamicin C₁., werden gesondert in den Weise wird der größte Teil der in den Iviikrobenzellen Fraktionen Nr. 62-86 bzw. in den Fraktionen Nr. enthaltenen aktiven Substanz in die Flüssigkeit extra- 95-130 eluiert. Die Fraktionen eines jeden Bestandteils hiert. Dann setzt man 20 kg Filterhilfsmittel zu und werden miteinander vereinigt, unter vermindertem filtriert die Mikrobenzellen sowie das Calciumoxalat Druck eingeengt, um das Lösungsmittel abzutreiben, ab. Das Piltrat wird mil 6normaler Natronlauge auf 30 und das Konzentrat wird in etwas Wasser gelöst, einen pH-Wert von 6,8 eingestellt und durch eine Diese Lösung wird mit !normaler Schwefelsäure auf Säule geleitet, die mit 100 1 des Kationenaustausch- einen pH-Wert von 4.5 eingestellt. Nach dem Gefrierharzes »Amberlite IRC-50« (in der Natriumionen- trocknen erhält man 8,7 g des Sulfats des Antiform) beschickt ist. Die Säule wird mil Wasser pe- bioticJms XK-62-2 ("7Q¹ Finhoiten'mg) und 1.8 g waschen. Der Ablauf und die Waschflüssigkeitcn ent- 3? Sulfat von Gentamicin C₁., (787 Einheiten mg) jeweils halten Verunreinigungen und Stoffe, die nichl an dem in Form eines weißen Pulvers. Um die freie Base Harz adsorbiert worden sind und nur eine Aktivität herzustellen, wcrdcn 5 g des Sulfats des Antibioticums gegen grampositive Mikroorganismen aufweisen. XK-62-2 zu 500 ml Wasser und einer Säule mil 70 ml Das Eluieren erfolgt mit 3001 !normaler Schwefel- des Anioncnaustauschharzes »Dowcx 1 χ 2« (in der säure, und die aktiven Bestandteile werden in den 40 Hydroxylionenform) gegeben. Nach dem Auswaschen Eluatfraktioncn gewonnen. Die Fraktionen wcrdcn der Säule mil 500 ml Wasser wird das eine Aktivität vereinigt und mit !normaler Natronlauge auf einen aufweisende Eluat unter vermindertem Druck auf pH-Wert von 7.0 eingestellt. Die so erhaltene Lösung 100 ml eingeengt. Durch Gefriertrocknen des Konzcnwird unter vermindertem Druck auf 20 1 eingeengt irats erhält man 3.3 g freie Base XK-62-2 (990 Ein- und das Konzentrat mit !normaler Natronlauge auf 45 heiten mg),
einen pH-Wert von 10.5 eingestellt. Nach Zusatz von

5 Raumteilen Aceton unterführen TaIh ein Nieder- Beispiel 5

schlag aus. der abriltricrt und mit Aceton gewaschen MK-62-NG-164 (ATCC 21 949) wird in der gleicher

wird. Das FUtrat und die Waschflüssigkeiten werden Weise wie im Beispiel 3 beschrieben gezüchtet, wöbe

vereinigt und unter Druck auf 11 eingeengt. Das 50 man 95 g (750 Einheiten mg) einer Mischung dei

Konzentrat wird mit finormalcr Schwefelsäure auf Antibiotika von C,j und XK-62-2 erhalt. Die Mischung

einen pH-Wert von 4,5 eingestellt. Dann setzt man wird in gleicher Weise wie in Stufe C des Beispiels !

unter Rühren 5 1 Methanol zu und läßt das Gemisch behandelt, wobei man 49 g des Antibioticums XK-62-!

in einem kalten Raum stehen. Der weiße Niederschlag (975 Einheiten mg) erhält.

wird abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Nach 55 Die Mutante MK-62-NG-164 war erhalten wordei

dem Trocknen des Niederschlages im Vakuum erhält durch Einwirkung von N-Methyl-N'-nitro-N-nitroso

man (ö g rohes Antibioticum. Das rohe Pulver isi ein guanidin auf eine Kultur von Micromonospora saga

Gemisch aus dem Sulfat von Gentamicin C₁., und dem- micnsis var. nonrcducans ATCC 21 803.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

1. Patentansprüche:

   I. Antibioticum XK-62-2 der Formel

   HO

   H,C

   C-C \ C-C I \ H H NH, /! !\ OH \l I/ " / H H NH, c—c NHCH, . / \ HO—C-H H—C—H NHCH, \ CH, C-O

   H-C-H

   H /
   j / \ ι
   C- H J /
   -C
   j i
   C- NH, H -O

   mit einem Molekulargewicht von 463, der Bruttoformel C₂₀H₄₁N₅O₇, einem Ultraviolettabsorptionsspektrum gemäß Fig. 1. einem Ultrarotabsorptionsspektrum gemäß F i g. 2 und einem kernmagnetischen Resonanzspektrum gemäß F i g. 3 und dessen Sulfat.
2. 2. Verfahren zur Herstellung des Antibioticums XK-62-2 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in üblicher Weise einen das Antibioticum XK-62-2 erzeugenden Mikroorganismus von Micromonospora sagamiensis ATCC 21 826, Micromonospora sagamiensis var. flava ATCC 21 827, Micromonospora sagamiensis var. nonreducans ATCC 21 803 und Micromonospora sagamiensis var. nonreducans-Mutanten ATCC 21 949 in einem üblichen Nährmedium bei 25 bis 55^CC bei etwa neutralem pH-Wert züchtet, das Antibioticum XK-62-2 in dem Medium in an sich bekannter Weise, wie durch eine Kationenauslauscher- und anschließend Anionenaustauscherbehandlung. anreichert, es anschließend daraus in üblicher Weise, wie durch Chromatographie, abtrennt und gewünsehtenfalls in üblicher Weise in sein Sulfat überführt.