Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer neuen anti- biot.ischen Substanz, nämlich von D-4-Amino- 3 - isoxazolidon, auch Cycloserin oder 0iamycin genannt..
Diese Substanz, welcher die Formel
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zukommt, wird erhalten in Form von farb losen Kristallen, Schmelzpunkt 154-155 C, [a]D = + 116 (c = 7.,17, Wasser), (Was ser) = 226 mic (E i m = 402).
Die Entdeckung der antibiotischen Eigen schaften des Penieillins erregte auf diesem Gebiete grosses Interesse und hat zur Auffin- diing von andern wertvollen antibiotischen Substanzen geführt, welche durch Fermenta tion hergestellt werden können, wie Strepto- thriein, Streptomyein,. Gramieidin, Subt.ilin, Bacitracin, ilureomycin,
Terramycin und ähn- lielie. Im allgemeinen sind solche Antibiotika besonders wirksam in bezug auf die. Hemmung des Wachstums bestimmter Bakterien, können aber gegenüber andern Organismen völlig inaktiv sein.
Beispielsweise sind einige dieser Produkte aktiv gegen gramnegative Orga nismen, andere sind aktiv gegen grampositiv e Organismen und einige. von ihnen sind so wohl gegen gramnegative, als auch gram positive Organismen wirksam. Im allgemeinen jedoch ist die Wirksamkeit dieser bekannten Antibiotika- auf einige wenige pathogene Orga nismen, beschränkt, und daher sind die Unter suchungen auf diesem Gebiet fortgesetzt wor den, in dem Bestreben, andere Antibiotika auf zufinden,
welche gegenüber einem grösseren Bereich von Pathogenen wirksam sind.
Ausser der Tatsache, dass einige dieser Antibiotika sich für die Behandlung verschie dener Krankheiten als wertlos erwiesen haben, wurde auch noch gefunden, dass bestimmte Stämme mancher pathogener Organismen eine Widerstandsfähigkeit gegenüber bestimm- ten antibiotischen Substanzen entwickelte kön nen, mit dem Ergebnis, d'ass die Antibiotika gegenüber diesen Organismen nicht länger wirksam sind.
Diese Schwierigkeiten bei den bekannten antibiotischen Substanzen haben weitere Untersuchungen angeregt, mit dem Ziel, Antibiotika aufzufinden, welche sowohl gegen einen grösseren Bereich von Pathogenen als auch gegen die Ausbildung widerstands fähiger Stämme besonderer Organismen wirk sam sind.
Das neue Antibiotikum Cyeloserin besitzt eine hohe Wirksamkeit in bezug auf die Hem inung des Wachstums verschiedener patho- gener Bakterien, und zwar sowohl gramnega- tiver als auch grampositiver Organismen.
Es wurde festgestellt, dass das Cycloserin durch Kultivierung eines bisher unbekannten Mikroorganismus in wässrigem Medium unter Luftzufuhr gewonnen werden kann. Dieser Mikroorganismus wurde als eine neue Art von Streptomyces identifiziert und hat den Namen S. garyphalus erhalten.
S. garyphalus isst ein weit verbreitet auf tretender Mikroorganisrrius, und Stämme da von sind aus den Mustern von Böden sowohl aus gemässigtem als auch tropischem Klima auf dem üblichen Wege der Bodenverdün- nungstechnik gewonnen worden.
Beispielsweise wurden Verdünnungen von Böden aus Chi- cacao (Guatemala.), Nahualate Road (Guate mala) und dem Staate New York auf Dextrose- Spargel-Agar verpflanzt und ergaben nach einer entsprechenden Inkubationszeit viele verschiedene Actinomy ceten, welche gesam- melt und auf ihre- Fähigkeit., antibiotische Substanzen zu erzeugen, geprüft wurden.
Der Mikroorganismus Nr. 106-7 aus dem Boden von Chicacao ((luatemala), die Mikroorga nismen Nr. 190-8, 190-9 und 190-33 aus dem Boden von Nahualate Road (Guatemala) und die Mikroorganismen Nr. 540-30, 540-34 aus dem Boden aus dem Staate New York wurden isoliert und erwiesen sich als fähig, beträcht liche antibiotische Wirksamkeit zii entfalten.
Diese Mikroorganismen erwiesen sieh als im wesentlichen von gleichartigen morpholo gischen und physiologischen Eigenschaften. Wenn jeder dieser Mikroorganismen in Schüt telflaschen kultiviert wurde und die Kultur filtrate auf ihre a.ntibiotisehe Wirksamkeit nach dem Sehalentestverfahren, das im Jour nal of Bacterio@logv, Bd. 50, Seite 701 (1945), beschrieben ist, geprüft wurden, ergab sich das aus Tabelle 1 ersichtliche mikrobiologische Spektrum.
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<I>Tabelle <SEP> 1</I>
<tb> Durchmesser <SEP> der <SEP> Zone <SEP> der <SEP> Waehstums'hemmung, <SEP> welche <SEP> den <SEP> Zylinder <SEP> um-.gibt,
<tb> der <SEP> das <SEP> zu <SEP> prüfende <SEP> Kulturfiltrat <SEP> enthält
<tb> Stamm <SEP> <B>#','</B> <SEP> KP <SEP> SD <SEP> SS <SEP> ET <SEP> EC <SEP> PA <SEP> MP <SEP> DP <SEP> SF <SEP> SP
<tb> 106-7 <SEP> 21 <SEP> 25 <SEP> 24 <SEP> 22 <SEP> 28 <SEP> 13 <SEP> 28 <SEP> 28 <SEP> 24 <SEP> 23
<tb> 190-8 <SEP> 20 <SEP> 24 <SEP> 22 <SEP> 21 <SEP> 25 <SEP> 11 <SEP> 35 <SEP> 25 <SEP> 17 <SEP> 22
<tb> 190-9 <SEP> 16 <SEP> 24 <SEP> 25 <SEP> 21 <SEP> 26 <SEP> 1.3 <SEP> 28 <SEP> 27
<tb> <B>1</B>90-33 <SEP> 20 <SEP> 26 <SEP> 26 <SEP> 19 <SEP> 27 <SEP> + <SEP> 30 <SEP> 27 <SEP> 21 <SEP> 24
<tb> 540-33 <SEP> 15 <SEP> 22 <SEP> 23 <SEP> 20 <SEP> 24 <SEP> - <SEP> 25 <SEP> 23 <SEP> 1.7 <SEP> 25
<tb> 540-34
<SEP> 18 <SEP> 24 <SEP> 23 <SEP> 20 <SEP> 27 <SEP> 11 <SEP> <B>2</B>9 <SEP> 32 <SEP> 22 <SEP> 25
<tb> "\ <SEP> KP <SEP> - <SEP> Klebsiena <SEP> pneumoniae <SEP> PA <SEP> - <SEP> Pseudomonas <SEP> aeruginosa
<tb> SD <SEP> - <SEP> Shigella <SEP> dysenteriae <SEP> MP <SEP> - <SEP> Nicrococcus <SEP> pyrogenes <SEP> var.
<SEP> aureus
<tb> SS <SEP> = <SEP> Salmonella <SEP> shottmulleri <SEP> DP <SEP> - <SEP> Diplococcus <SEP> pneumoniae
<tb> ET <SEP> = <SEP> Eberthella <SEP> typhosa <SEP> SF <SEP> = <SEP> Streptococcus <SEP> faecalis
<tb> EC <SEP> - <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> SP <SEP> = <SEP> Streptococcus <SEP> pyogenes Eine Prüfung der Stämme der Mikroorga nismen, welche in Tabelle 1 angegeben sind, zeigte, dass es -,ich um eine bisher unbekannte Strepto@myces-Art handelt, die in Bergeys Manual of Determinative Baeteriology, 6. Aus gabe, nicht beschrieben ist.
Dieser neuen Art von Mikroorganismen wurde der Name Strepto- mvces garyphalus gegeben. Dieser Mikroorga nismus -unterscheidet sich von andern Strepto- mycesarten durch Bildung gerader Sporen hyphen, die rosa gefärbt sind, und durch seine Fähigkeit, Nitrate zu Nitriten zu red'ti- zieren.
Andere sekundäre Eigenschaften, wel che klar zeigen, da.ss Streptomyces garyphalus eine neue Art von Streptomy ces darstellt, be stehen in seiner Fähigkeit, Milch zu peptoni- sieren, Gelatine zu verflüssigen und Stärke zu hydrolysieren.
Die charakteristischen K ultureigensehaften eines Stammes von Streptomy ces garyphalus, der für die- Gewinnung von Cycloser in wert voll ist., sind in der folgenden Tabelle zusam- mengestellt. <I>Tabelle 2</I> llorphologisehe und Kultureigenschaften des Streptomy ees-garyphalus-Stammes Nr. 1.06-7, isoliert aus C'xuatemala-Boden Morphologie:
Gerade sporenbildende Hyphen. Keine Spiralen beobachtet.. Conidia stabförmig, 0,8-1,1 auf 1,7-1,9 Mikron.
CTel@atine: Verflüssigung tritt nach 6 Tagen Inkuba tionszeit bei 28 C ein. Grauweisser Ring und, grauweisse ein;getauehte Pollikel. Dun kelbraune Pigmentsehicht, die sieh nach 1-2 Tagen ausbildet. Nach dem Schütteln nimmt sie eine grünliehbraune Farbe an. Stärke-Agar Wird hydrolysiert. Ausgezeichnetes Wachs tum. Graue Kanten mit weissem Luft- inycel. Unterseite eremefarbig. Schwach braunes lösliches Pigment.
(llueose-Spargel-Agar: Gutes farbloses Wachstum. Weisses Luft- my cel. Unterseite weiss. Kein lösliches Pigment.
Modifizierter Glueose-Spargel-Agar: Ausgezeichnetes, puderförmiges, rötlich.. weisses Wachstum. Musehel-rosafarbenes Luftmycel. Unterseite braungelb. Kein lösliches Pigment.
Nährbrühe: Grauweisses Häutehen und Ring. Kein lösliches Pigment.
Nähr-Agar Gutes farbloses Wachstum. Grauweisses Luftmycel. Wachstum auch unter der Oberfläche. Unterseite cremefarbig. Sehwachbraunes lösliches Pigment. Laekmtis-14Iilch: Wird langsam peptonisiert. Milch wird zunä.eh:st dunkelrot. und später braunrot. 7)ü = 6,4. Schwach grauweisser Ring.
Braunes Sediment am Boden des Rohres. Nitrat-Agar: Starke Produktion von Nitriten aus Nitraten, Ind:ol-Mediuin: Es wird kein Indol produziert.
Czapeks Saccharoselösung: Kein Wachstum. Czapeks Saccharose-Agar: Gutes farbloses Wachstum. Grauweisse.', Luftmveel. Unterseite farblos. Kein Wachs tum unter der Oberfläche. Kein lösliches Pigment. Die Kultur erzeugt Hämolyse in Gehirn, Herzabsud-Blut-Agar.
Kartoffelbrei: Schweres faltenförmiges Wachstum. Luft mycel sehr dunkel sehwarzgrau. Die Kar toffeln dunkeln.
Cal,ium.malat-Agar Farbloses Wachstum. Kein Luftmycel. Cellulose Wird nicht zersetzt. G lueose-Brühe Grauweisser Ring. Untergetauchtes grau weisses Häutchen. Schwachbraunes Pigment. Nach zwei Wochen schwach sauer.
lief e-Extrakt-Dextrose-Agar Ausgezeichnetes Wachstum. Luftmycel an fangs grauweiss, später rötlichgrau und schliesslich musehelrot. Schwachbraunes lösliches Pigment.
Stärke-Trypton-Agar: Gutes Wachstum. Graues Luftmvcel. Dunkelbraunes lösliches Pigment.
Pepton-G lucose-Agar Cremefarbiges Wachstum. Luftmycel grau weiss, später rosa.. Schwachbraunes lösliches Pigment.
Optimale Temperatur: Gutes Wachstum bei 24, 26, 28 und 37 C. Kein Wachstum bei 47 C.
Optimaler pH-Wert : 7,0-7,2. Wachstum in Luft.
Ausser diesem Stamm können auch andere Stämme von S. garyphaltis, welche Cyclöserin produzieren, verwendet werden, beispielsweise diejenigen, welche durch natürliche Auswahl, wie in Tabelle 1 angegeben, erhalten werden, oder solche, die durch künstliche Mutation, etwa durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen, mit Ultraviolettlicht und dergleichen erhalten werden. Ferner ist mit. der Möglichkeit zti rechnen, dass das erfindungsgemäss hergestellte , Antibiotikum auch von andern Mikroorga nismen ausser S. ga.ryphalüs erzeugt wird und aus den betreffenden Kulturen in analoger Weise gewonnen werden kann.
Die Kultivierung von S. garyphalus kann in den gleichen wässrigen Medien erfolgen, wie sie für die Herstellung anderer Anti biotika benutzt werden. Solche Medien ent halten Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, welche von den 1VIikroorganismen assimiliert werden können, sowie anorganische Salze. Ausserdem enthalten die Fermentationsmedien zweckmässig Spuren von Metallen, welche für das Wachstum der Organismen notwendig sind.
Diese in Spuren vorhandenen Elemente werden gewöhnlich in Form der Verunreini gungen ei'ngebra'cht, die in den Bestandteilen des Mediums enthalten sind'.
Im allgemeinen stellen Kohlehydrate, wie Zucker, beispielisweise Dextrose, Saccharose, DTaltose, Lactose, Dextrin sowie Stärke geeig nete Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff dar.
Die günstigste Menge der Kohlenstoff quelle hängt zum Teil von den andern Be standteilen des Mediums ab, aber gewöhnlich ist ein Betrag an Kohlehydraten zwischen 1 und 3 Gewichtsprozenten des Mediums: hin reichend. Diese Kohlenstoffquellen können sowohl für sich allein als auch in Mischung benutzt werden.
Verschiedene Stickstoffquellen, wie Kasein- hydrolysate, Sojabohnenmehl, welches mit Papain verdaut wurde, unverdautes Soja bohnenmehl, Erdnussmeh'1, noch einen Teil des Öls enthaltendes Erdnussmehl, Schlempe, Ma.is-- absud, Natriumnitrat, Ammoniumchlorid', Am- moniumstilfat und dergleichen,
werden leicht vom Streptomyces garyphalus assimiliert und können im Fermentationsmedium für die Ge winnung des neuen Antibiotikums benutzt werden. Im allgemeinen ist festgestellt wor- der, da,ss organische Stickstoffquellen. insbe- sondere Sojabohnenmehl und Schlempe, be sonders m%,eekmässig für die Herstellung des Cyeloserins benutzt werden können.
Die ver schiedenen organischen oder anorganischen Stickstoffquellen können, entweder für sich allein oder in Kombination miteinander in Beträgen von 0,2-5 Gewichtsprozenten des wässrigen Mediums angewendet werden.
Es ist festgestellt worden, dass ein Zusatz von Natriumchiörid zu einem Medium, wel ehes Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff und Stickstoff enthält, in einem. Betrag von 0,1 bis 1% für eine gute Pro,dtiktion des neuen Antibiotikums zweckmässig ist.
Im all gemeinen erweist sich ein Zusatz von Natrium- chl'orid von etwa 1/.1% vom Gewicht des Nähr- mediums als besonders wirksam.
Die Fermentation kann bei Temperaturen ausgeführt werden, welche von etwa 24 bis 37 C reichen. Für optimale Ergebnisse ist es vorteilhaft, die Fermentation bei Temperatu ren von ungefähr 28 C auszuführen. Der pij-Wert des Nährmediums kann zwischen 6 und 7 schwanken.
Obgleich Cycloserin sowohl bei Oberflä chenwachstum als auch submers wachsen kann, wird die submerse Fermentation bevorzugt. Fermentationen in kleinem Massstab werden zweckmässig ausgeführt, indem man die Nähr medien in Erlenmeyer-Kolben einbringt und den Inhalt der Kolben bei l20 C sterilisiert. Dann werden die Kolben entweder mit Sporen oder mit vegetativen Zellgeweben eines Cyelo- serin produzierenden Stammes von S.
gary- phalus geimpft. Die Kolben werden dann mit Baumwollpfropfen leicht, verschlossen. Man lässt die Fermentation am besten in Räumen von gleichmässiger Temperatur bei etwa n8 C auf einem Schüttler während 2-1 Tagen vor sieh gehen.
Bei Fermentationen in grösserem Massstab ist e45 zwe'ckmä'ssig, den Organismus in Behäl tern zu züchten, die mit einem Rührwerk und Mitteln zur Belüftung versehen sind. Bei die ser Methode wird das Nährmedium im Behäl ter hergestellt und durch Erhitzen auf 120 C sterilisiert. Nach der Abkühlung wird das sterilisierte Medium mit einer geeigneten Quelle von vegetativem Zellgewebe eines Cy eloserin produzierenden Stammes von S.
garyphalus geimpft., und die Fermentation wird während 2-4 Tagen unter Belüftung und/oder Rühren des Nährmediums bei einer Temperatur von etwa 28 C durchgeführt. Diese Methode zur Herstellung von Cycloserin isst besonders für die Gewinnung grosser Quan iitäten dieses neuen Antibiotikums geeignet.
Es wurde festgestellt, dass ein wässrzges Nährmedium, welches ungefähr 3% Soja- bohnenmehl, 2% Dextrose, 0,75% Schlempe und 0.25% Natriumchlorid enthält., besonders geeignet für die Herstellung des Antibioti kums durch subm,erse Kultivierung ist.
Die grösste Ausbeute an Antibiotikum in einem solchen Medium wird gewöhnlich nach einer Inkubationsfrist von etwa 65 Stunden bei un- r;efähr 28 C erhalten.
Das Cyeloserin kann aus der Fermenta- tionsbrühe nach mehreren Methoden gewonnen werden.. Eine dieser Methoden besteht darin, dass man die Brühe filtriert und das Filtrat eintrocknet, um einen festen Körper herzu- stellen, der das Antibiotikum enthält. Ein ähnlicher fester Körper von erhöhter Reinheit und grösserer Aktivität kann erhalten werd@eri, indem man die filtrierte Brühe zuerst mit Holzkohle behandelt, die Mischung nochmals filtriert, das Filtrat unter vermindertem Druck einengt.
und die konzentrierte Lösung unter vermindertem Druck durch Versprähen trocknet. Auf diese Weise wird ein fester Stoff, der Cycloserin enthält, erhalten, der eine Aktivität von ungefähr 4--l.2 Strepto- mycin-Einheiten pro Milligramm aufweist, wie durch die Schalen-Platten-Diffusionsmethode unter Verwendung von Mierococcus pyomenes var. aureus und eines Streptomycin-Standards ermittelt wurde.
<I>Beispiel 1</I> 50 ml eines Mediums, welches 3% Soja- bohnenmehl, 21/a Dextrose, 0,751/o Schlempe und 0,251/o Natriumehlorid in destilliertem Wasser enthielt, wurden in Erlenmeyer-Kolben von 250 ml Inhalt eingebracht.
Die Kolben wurden mit 2 ml eines vegetativen Gewebes von S. garypha.lus beimpft und bei 28 C auf einer rotierenden Schüttelmaschine von 5 cm Ausschlag bei 220 Umdrehungen pro Minute vier Tage lang inkubiert. Das Mycel wurde durch Filtration entfernt und die verblei bende Brühe auf ihre antibakterielle Wirksam keit nach der Schalenmethode geprüft.
Der Durchmesser der Inhibitionszone rund um den Versuchszylinder bei den verschiedenen Test kulturen ist in der nachstehenden Tabelle 3 festgehalten
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<I>Tabelle <SEP> 3</I>
<tb> Testkultur <SEP> Inhibitionszone
<tb> in <SEP> mm
<tb> K. <SEP> pneumonia <SEP> 17
<tb> S. <SEP> d'ysenteriae <SEP> shiga <SEP> 22
<tb> Salmonella <SEP> shottmulleri <SEP> 22
<tb> Salmonefla <SEP> typhosa <SEP> 21
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> W <SEP> 24
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 14
<tb> AI. <SEP> p@#ogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> Smith <SEP> <SEP> 2.6
<tb> Diplocoeeus <SEP> pneumoniae <SEP> 26
<tb> Dillon=Stamm, <SEP> widerstandsfähig
<tb> gegen <SEP> Streptomycin <SEP> 19
<tb> 117. <SEP> pyogenes <SEP> var.
<SEP> aureus, <SEP> wider standsfähig <SEP> gegen <SEP> Strepto thricin <SEP> aktiv. <I>Beispiel 2</I> 3,2 eines wässrigen Mediums, welches 3% Sojabohnenmehl, 2% Dextrose, 0,750/n Schlempe -und 0,25% Natriumchlorid enthielt, wurden in einen Fermentationsbehälter von 5 1 Inhalt eingebracht.
Das Medium wurde durch Erhitzen auf 120 C während 11/2 Stun den sterilisiert und nach Abkühlung mit 00 ml eines vegetativen Gewebes von S. gary- phalus beimpft. Das Medium wurde während 96 Stunden bei 28,5 C unter Belüftung und Rührung fermentiert. Die Aktivität der ab filtrierten Brühe (2,57 1) wurde auf der Grundlage eines Schalenversuches unter Ver wendung von M. pyogenes var. aureu s und eines Streptomycin-Standards ermittelt.
Diese Brühe hatte eine Aktivität von 100 Strepto- mycin-Einheiten pro Milliliter (ungefähr 5 Einheiten/mg). Beispiel <I>3</I> Ein wässriges Fermentationsmedium wurde hergestellt, welches nachstehende Zusammen:
set7-un & aufwies: -
EMI0006.0007
Saceharose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>2,51/a</B>
<tb> Erdnussölmehl <SEP> oder
<tb> E.rdnussmehl <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>1,51/e.</B>
<tb> CaC03 <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,41/o
<tb> Maisabsud <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,2 <SEP> %
<tb> (NH4) <SEP> 2S04 <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,2%
<tb> NaCl <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,2 <SEP> % 50 ml Anteile dieses Mediums wurden in 250 ml fassende Erlenmeyer-Kolben einge bracht, sterilisiert und mit 2 ml eines vege tativen Gewebes von S. garyphalus beimpft.
Die Kolben wurden dann bei 28 C auf einer rotierenden Schüttelmaschine vier Tage lang inkubiert. Die Aktivität der filtrierten Brühe wurde nach der Schalen-Platten-Diffusions- methode unter Verwendung von M. pyogenes v ar. aureus und einem Präparat von Cyclo- serin von 65 Einheiten pro mg als Standard ermittelt. Diese Brühe hatte eine Aktivität von 120 Streptomvein-Einheiten pro ml.
<I>Beispiel 4</I> Ein wässriges Fermentationsmedium fol gender Zusammensetzung wurde hergestellt:
EMI0006.0028
Mit <SEP> Papain <SEP> verdautes <SEP> Sojabohnenmehl <SEP> 1%
<tb> Dextrose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 10/0 Dieses Medium wurde beimpft und ebenso inkubiert, wie es im Beispiel 3 beschrieben ist.
Die Brühe hatte eine Aktivität von 100 Streptomycin-Einheiten pro ml. Cycloserin-Konzentrate von grösserer Akti vität können erhalten werden, wenn man die filtrierte Fermentatiombrühe auf einen pH- Wert von ungefähr 2 ansäuert und darauf das Antibiotikum an ein starksaures Kationen austauschharz in Salzform adsorbiert. Das Harzadsorbat wird dann mit Wasser ge waschen,
um die schwach oder nicht adsorbier- ten Bestandteile zu entfernen. Das aktive Pro dukt wird durch Eluierung des Harzadsorbats mit einer wässrigen Lösung einer organischen oder anorganischen Base und Troeknung des Fluates in der Kälte gewonnen.
Auf diese Weise werden Konzentrate von Cyeloserin erhalten, welche eine Aktivität von etwa 50 bis 200 Einheiten<I>pro</I> mg aufwiesen.
Die stark sauren Kationenaustauschharze, welche im Kern. sulfonsaure Gruppen oder Methylensulfon Gruppen enthalten, sind be sonders wertvoll als Adsorptionssmittel bei diesem Verfahren. Gut geeignete Harze dieser Art sind die folgenden Markenprodukte: Amberlit IR 120 (Röhm & Haas Co.), Dowex 50 (Dow Cheinieal Co.) und Duolit C-10 (Cheinical Pro@cess Co.).
Diese Harze lassen sich leicht in Salzform überführen; indem man sie mit einem Alkalimetall- oder Erdalkalimeta.ll-hyd:roxy d behandelt und dann auswäscht, um den Lberschuss an Alkali n1 entfernen. Die stark sauren Kationenaus- tauschharze in Form der Natriumsalze. sind als besonders nützlich für den vorliegenden. Zweck festgestellt worden.
Die Isolierung des Cy eloserins aus einer Fermentationsbrühe und die Reinigung lässt sich mit solchen Harzen zweckmässig folgen dermassen ausführen: Der pH-Wert von 100 ml der filtrierten Brühe, welche nach Beispiel 2 hergestellt wurde, wurde durch Zusatz von 4 ml 2,5n-HCl auf 1,5 eingestellt. Die Brühe wurde dann durch eine Säule geschickt, welche ungefähr 6 g Amberl'it IR 120 in Form dies Natrium salzes enthielt, und zwar mit einer Geschwin digkeit von 25 ml pro Stunde.
Das Antibioti kum verblieb in der Säule und wurde mit 50 ml Wasser naehgewaschen. Die Eluierung der aktiven Substanz wurde mit 0,1n-NH.i013 ausgeführt. Sobald 45 ml der Flüssigkeit durch die Kolonne hindurchgegangen waren,
stieg der pli-W ert von 5 auf 6 und die aktive Substanz befand sich im Eluat. Fast die ganze Mene der aktiven Substanz liess sieh zwischen einem pH-Wert von 6 und 10 in etwa. 20 ml der ablaufenden Flüssigkeit sammeln. Lyophi- lisierte feste Stoffe aus den einzelnen Aus schnitten in dieser pu-Region wiesen Aktivi täten von 50-122 Einheiten pro mg auf.
Die Aktivitäten wurden nach der Schalen Platten-Diffusionsmethode unter Verwendung ton i11. pyogenes var. aureus und einem Streptomycin-Standa.rd bestimmt.
Die Konzentrate von Cycloserin, welche eine Wirksamkeit von ungefähr 50-200 Ein- liciten pro mg aufweisen und nach der vor stehenden Methode gewonnen wurden, können noch weiter gereinigt werden, um das Anti biotikum in reiner Form zu gewinnen.
Ein salch.es Verfahren besteht darin, das Antibiotikum aus den in der oben beschrie benen Weise erhaltenen E1'ua,ten an einem mit GH-Ionen beladenen, stark basischen Anionaustauschharz zu adsorbieren, die Ver- unrei-nigu.ngen aus dem entstandenen Harz- adsorbat mit Wasser auszuwaschen und das gewünschte Produkt mit einem Elüierungs- mittel, welches ein. Anion enthält, zu gewin nen.
Die Harze, welche für dieses Verfahren zweckmässig benutzt. werden, sind solche mit quaternären Ammoniumgruppen. Geeignete Harze dieser Art sind die folgenden iHarken- produkte:
Amberlit. IRA 400 , Amberlit IRA 410 , Amberlit XE-98 , Amberli,t XE-75 , Amberl'it XE-58 (Röhm & Haas Co.), Iona,c A-293 (American Cyanamid Corp.) und Dowex 2 (Dow Chemieal Co.).
Diese Harze lassen sieh leicht in die Hydroxyl- form überführen., indem man sie mit alka lischen Lösungen, wie Natriumhydroxyd, zu sammenbringt und dass behandelte Harz mit Wasser auswäscht, um den 1lberschuss an Alkali zu entfernen.
Nach der Adso;rption des Antibiotikums am Anionaustauschharz wird. das entstandene Adsorbat beispielsweise mit einer wässrigen Lösung einer starken Base, wie Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd oder dergleichen, oder einer wässrigen Lösung einer Säure, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Essig- säuer und dergleichen, oder einer wässrigen Lösung eines Salzes,
wie Natriumchlorid, Kaliumehlorid, Natriumsulfat und. derglei eben, eluiert. Wenn die Eluierung mit einer sauren Lösung durchgeführt. wird, enthalten diejenigen Fraktionen des Eluates, welche einen pH-Wert im Bereich von etwa 7-4,5 aufweisen, das gewünschte Antibiotikum.
So fern basische Eluierungsmittel benützt werden, lässt sieh feststellen, dass die Fraktionen des Elua,tes, welche einen p11-Wert von etwa 7-14 aufweisen, Cyclosemin enthalten. Nach der Trocknung in der Kälte zeigen die erhaltenen Eluate eine Aktivität von ungefähr 250-300 Einheiten pro mg.
Diese Reinigung wird im einzelnen zweckmässig wie folgt durchgeführt; 3000 ml eines Cyeloserin enthaltenden Eluates, welches einen pH-Wert von 8,5 und eine Wirksamkeit von 1400 Einheiten pro ml aufwies und durch E-lui,erung eines Kationen- austauschadsorbates ( Amberlit IR 120 ) mit Ammonfrmhydroxyd, wie oben beschrieben, erhalten worden war,
wurde durch eine Ko lonne von 250 ml eines Anionaustauschharzes ( Amberlit IRA 400 ) in Hydroxylform ge schickt, und zwar mit einer Geschwindigkeit von über 25 ml pro Minute. Die ablaufende Flüssigkeit enthielt kein aktives Material.
Die Kolonne wurde dann mit 250 ml Wasser ge waschen und das Antibiotikum wurde- durch Eluierung des Harzadsorbates mit 2500 ml einer 2 o/oigen wässrigen Lösung von Essig säure behandelt.
Die Fraktion des El\uates, welche einen PH-Wert von 7-4,5 aufwies, be trug etwa 1065 ml und zeigte eine Wirksam keit von 3211 Einheiten pro ml.
Cyeloserin, das eine Aktivität von etwa 250-300 Einheiten pro mg aufweist, kann durch blosses Eintrocknen des Eluates an der Kälte erhalten werden. Wenn gewünscht, kön nen diese Eluate weiter behandelt werden, um daraus das Cycloserin in kristalliner Form zu gewinnen.
Zu diesem Zweck kann man zum Beispiel den pH-Wert des erhaltenen E'luates auf etwa 8,5 einstellen, .das, alkalische Eluat auf ein kleines Volumen eindampfen, eine Mischung von niedrigen aliphatischen Alkoholen zu dem erhaltenen Konzentrat zusetzen, den pH-Wert der alkoholischen Lösung auf.
etwa 6 einstel len und d\ie Lösung abkühlen, worauf Cyelo- serin in kristalliner Form ausfällt.
Im einzel nen geht man dabei zweckmässig wie folgt vor 1065 ml eines Elüates, welches eitre Wirk samkeit von 3211 Einheiten pro ml aufwies und durch Eluierung des Anionaustauseh- adsorbates ( Amberlit IR 120 ) mit einer 2 o/oigen Lösung von Essigsäure, wie oben be- schrieben, erhalten worden war,
wurde durch Zusatz von Natriumhyd'ro-xy d auf einen pH-Wert von etwa- 8,5 eingestellt. Das resul tierende alkalische Eluat wurde auf etwa L00 ml :eingeengt und das Konzentrat mit 500 ml Isopropanol und 500 ml Äthanol ver dünnt. Diese alkoholische Lösung wurde dann filtriert, um das urilösliche Material' zti besei tigen.
Nach Einstellung des PH-Wertes im Filtrat auf etwa 5,8 mit Essigsäure und Ab kühlung kristallisierte die antibiotische Base aus. Das kristalline Produkt, welches durch Filtration abgeschieden wurde, erwies eine Wirksamkeit von 305 Einheiten pro m:g.
Die kristalline antibiotische Base stellt einen praktisch farblosen Stoff dar, welcher in Wasser leicht löslich ist, dagegen praktisch unlöslich in wasserfreien Alkoholen, Azeton, Chloroform, Äthylaeetat und Pyridin. In Eis essig tritt Zersetzung ein.
Der natürliche pH-Wert der kristallinen antibiot.isehen Base in Wasser beträgt. etwa 6. Die Lösung in Wasser weist eine optische Ro tation, von ungefähr [a]' = -I- 116 in Wasser auf. Das Cyeloserin ist seiner Natur nach amphoter; wenn es mit Säume titriert wird, ergibt sieh ein pK-Wert von ungefähr 4,5 und ein Äquivalentgewicht von etwa 101.
Wenn man es mit Alkali titriert, ergibt sieh einen pK-@'i ert von 7,4 und ein Äquivalentgewicht von ungefähr 103. Das Molekulargewicht des Cycloserins beträgt etwa 100, wie aus Grefrier- punktserniedrigiuigen abgeleitet werden kann.
Zusammensetzung eines gereinigten Mu sters des kristallinen Cy eloserins, ermittelt durch chemische Analyse:
35,85 % Kohlen- stoff, 5,67 1/o, Wasserstoff und 27,9 % Stick- stoff, Rest Sauerstoff. Der antibiotischen Base kommt somit die empirische Formel CsfI6O2N-- zu., und es konnte gezeigt werden, dass es sich .dabei um das D-4-Amino-3-iso:
Kazo- lid'on der Formel
EMI0008.0071
Irin wichtiges Charakteristikum dieser Substanz stellt die ultraviolette Absorptions kurve dar, welche ein Maximum bei 2260 A (E /o = 403) in Wasser beim PH-Wert von 6 aufweist.
Wenn Cyeloserin aus wässrigen Lösungen kristallisiert, wird es in Form eines kristalli nen Monohydrats erhalten. Das wasserfreie Antibiotikum lässt :sieh leicht durch Erhitzen des Monohydrates unter reduziertem Druck gewinnen, bis d-as Wasser entfernt ist, oder durch Kristallisation des Antibiotikums aus einem wasserfreien Lösungsmittel.
Die röntgenographische Untersuchung von kristallisiertem Monohydrat und kristallisier- tem wasserfreiem Cy eloserin zeigt, dass diese beiden Substanzen in verschiedenen Kristall formen vorliegen, wie aus den ungleichen In- tensitäten der Reflexionen gefolgert, werden kann, die in der Tabelle 4 festgehalten sind.
EMI0008.0093
<I>Tabelle</I>
<tb> Wasserfreies <SEP> Cyeloserin
<tb> Relative
<tb> Linie <SEP> Netzebenen- <SEP> Reflexionsintensität
<tb> abstand <SEP> in <SEP> Ä <SEP> in
<tb> 1 <SEP> 9,11 <SEP> 15
<tb> 2 <SEP> 4,73 <SEP> (100<B>)</B>
<tb> 3 <SEP> 4,56 <SEP> 55
<tb> 4 <SEP> 4,27 <SEP> 85
<tb> 5 <SEP> 4,02 <SEP> 40
<tb> 6 <SEP> 3,79 <SEP> 25
<tb> 7 <SEP> 3,46 <SEP> 20
<tb> 8 <SEP> 3,04 <SEP> 35
<tb> 9 <SEP> 2,83 <SEP> 40
<tb> 10 <SEP> <B>2,71-</B> <SEP> 45
<tb> Cy <SEP> el'oserin-Monohydrat
<tb> Relative
<tb> Linie <SEP> Netzebenen- <SEP> Reflexionsintensität
<tb> abstand <SEP> in <SEP> Ä <SEP> in <SEP> <B>0/0</B>
<tb> 1 <SEP> 5,21 <SEP> 30
<tb> 2 <SEP> 4,00 <SEP> 15
<tb> 3 <SEP> 3,9l.
<SEP> 20
<tb> 4 <SEP> 3,77 <SEP> (100)
<tb> 5 <SEP> 3,66 <SEP> 20
<tb> 6 <SEP> 3,24 <SEP> 40
<tb> 7 <SEP> 3,13 <SEP> 40
<tb> 8 <SEP> 2,80 <SEP> 15 Die Infrarot-Absorptionsspektren von was serfreiem Cycloserin und dem Monohydrat in kristalliner Form wurden bestimmt, indem man die Kristalle in flüssiges Petrolatum ein bettete und die Lage der Infrarot-Absorptions- banden mit einem Baird'aehen Infrarot-Spek- t.rophotometer bestimmte, das mit Natrium ehlorid-Optik ausgerüstet war.
Die erhaltenen l#',rgebnis.se sind in Tabelle 5 zusammengefasst.
EMI0009.0012
<I>Tabelle <SEP> 5</I>
<tb> Hauptsächliche <SEP> Infrarot-Absorptionsbanden
<tb> Wasserfreies <SEP> Cycloserin <SEP> Monohydrat <SEP> des
<tb> Cycloserins
<tb> 2,8-4,4 <SEP> Mehrfach banden <SEP> 3,0
<tb> .1,65 <SEP> 3,2-3,3
<tb> <B>6,12</B> <SEP> 3,6-4,6 <SEP> Mehrfach banden
<tb> 6,20 <SEP> Schulter <SEP> 5,0 <SEP> Sehulter
<tb> 6,30 <SEP> 5,93
<tb> 6,42 <SEP> 6,1 <SEP> Schulter
<tb> 6,52 <SEP> 6,17 <SEP> Schulter
<tb> 7,10 <SEP> 6,23 <SEP> Schulter
<tb> 7,3 <SEP> 6,37
<tb> 7,5 <SEP> 6,50 <SEP> Schulter
<tb> 7,85 <SEP> 7,04
<tb> 8,15 <SEP> <B>7,30</B>
<tb> 8,55 <SEP> Schulter <SEP> .
<SEP> 7,52
<tb> 8,80 <SEP> 7,72
<tb> 9,40
<tb> 10,68 <SEP> 8,1.5
<tb> 10,9 <SEP> 8,60
<tb> <B>11</B> <SEP> ,2-11,3 <SEP> Schulter <SEP> 8,69
<tb> 1.7.,38 <SEP> 9,19
<tb> 12,08 <SEP> 10,0
<tb> 13,25 <SEP> 10,37 <SEP> Schulter
<tb> 15,0 <SEP> 10,42
<tb> 11,25
<tb> 12,27
<tb> 13,5 <SEP> breites <SEP> Band Für das Cycloserin ist auch der Rf-Wert charakteristisch (Verhältnis der Distanz, welche ein Tropfen der Prüfsubstanz von ihrem Ausgangspunkt auf einem Papie:
r- Chromatogramm zurücklegt, zu der Entfer nung, die gleichzeitig von der Entwickler- Lösung zurückgelegt wird). In Versuchen mit Cycloserin bei Benutzung einer Mischung von äthanol und Wasser im Verhältnis 4:1 und Butanol, Wasser und Essigsäure im Verhält nis 4 : 2: 1 als Entwi!eklerflüssigkeiten wurden Rf-Werte von 0,33-0,37 erhalten.
Bei diesen Versuchen wurde die Wanderung der Tropfen des Antibiotikums leicht sichtbar gemacht, indem man eine Lösung von 0,2 0/9 Ninhyd'rin in 95 /oigem Äthanol zusetzte, die eine charak- teristisehe Gelb-Blau-Färbung bei der Berüh rung mit dem Antibiotikum ergibt.
Da das Cycloserin eine amphotere Substanz isst, bildet es sowohl Metallsalze mit dien Alkalz- metallen oder den Erdalkalimetallen, als auch Salze mit Säuren, z. B. ein Chlorid, ein Sulfat und dergleichen. Diese Salze können nach be kannten Verfahren gewonnen werden.
Die Alkalimeta11- und Erdalkalimetallgalze von Cycloserin werden leicht erhalten., indem man das. Antibiotikum mit einer Lösung einer Alkalimetallbase :
oder einer Erdalkadimetall- base in Wasser zusammenbringt. Zu diesem Zweck haben sich Alkali- und, Erdalkalimetall.- oxyde, -hydroxyde, -karbonate und -bikarbonate als geeignet erwiesen.
Die Isolierung der Erd- all#:alimetallsalze, wie des Kalzium-, Barium- oder Magnesiumsalzes,
in. kristalliner Form erreicht man durch Ausfällung des Salzes aus wässrigen Lösungen mit Äthanol oder Isopro- panol. Die Alkalirnetallsalze von Cycloserin können zweckmässig durch Verdampfung der wässrigen Lösungen der Salze zur- Trockne gewonnen werden.
Die Salze von Cycloserin mit Säuren, wie das Hydrochlorid, das, Sulfat und dergleichen, können durch Zusatz der erforderlichen Säuxe#- menge zu einer wässrigen Lösung dies Anti- biotikiuns hergestellt werden.
Die Salze lassen sich aus der wässrigen Lösung d'arch Zusatz eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels abscheiden, in welchem das betreffende saure Salz unlöslich ist.
Die Titration das Sulfates mi!t Alkali. ergab einen plz-Wert von etwa 4,5 und ein Äquiva- lentgewicht von 175 bzw. einen pK-Wert von 7,4 und ein Äquivalentgewicht von 167.
Der Karl-Fischer-Test. ergab 8;3 % Wasser. Das Produkt hast daher wahrscheinlich die Formel
EMI0010.0008
Cycloserin hat eine ausgesprochene Wirk samkeit gegen eine grosse Zahl von sowohl grampositiven und gramnegativen Bakterien.
Beispiele von einigen grampositiven Bakterien, gegen welche es wirksam ist, sind: Strepto- coc-cus pyogenes, M. pyogenes var. aureus, Streptococeus faecalis, Diplococeus pneumo- niae, Erysipelothrix rhuspiopathiae, Coryne- bacterium d'iphtheriae, C.
ovis, C. renalis, C. diphtheriae und C. xerosis. Beispiele einiger gramnegativer Bakterien, gegen welche es gleichfalls wirksam ist, sind Eseheriehia coli, Klebsiena pneumoniae, Salmonell:
a sehott- mulleri, Shigella dysenteriae, Sa.lmonella typhosa und Pseudomonas aeruginosa.
Tabelle 6 zeigt einen Vergleich zwischen dem Inhibiti.onseffekt von Cycloserin, Strepto- mycin und! Terramycin auf verschiedene gram positive und gramnegative Organismen und lässt die breite antibakterielle Wirksamkeit des neuen Antibiotikums sowie die Tatsache er kennen, dass dieses Antibiotikum sich sowohl vom Terramycin als auch vom Streptomycin unterscheidet.
EMI0010.0062
<I>Tabelle <SEP> 6</I>
<tb> Antibakterielles <SEP> Spektrum <SEP> von <SEP> Cycloserin, <SEP> Streptomycin <SEP> und <SEP> Terramycin <SEP> in <SEP> vitro <SEP> nach
<tb> der <SEP> Schalen-Dif<U>f</U>usionsmet<U>h</U>od'e
<tb> Durchmesser <SEP> der <SEP> Inhibitionszone <SEP> in <SEP> mm
<tb> Organismus <SEP> Cycloserini <SEP> Sm* <SEP> TM*
<tb> mg/ml
<tb> 5 <SEP> 0.5 <SEP> 0,05 <SEP> o,i <SEP> o,i
<tb> K7ebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 25 <SEP> +** <SEP> ** <SEP> 15 <SEP> 20
<tb> Shigellla <SEP> dysenteriae <SEP> (Shiga) <SEP> 34 <SEP> 21 <SEP> - <SEP> 13 <SEP> 25
<tb> Safmonella <SEP> schottmul'leri <SEP> 33 <SEP> 20 <SEP> - <SEP> 15 <SEP> 23
<tb> Salmonella <SEP> typhosa <SEP> 29 <SEP> 17 <SEP> - <SEP> <B>.17</B> <SEP> 23
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 36 <SEP> 24 <SEP> 11 <SEP> 16 <SEP> 21
<tb> .
<SEP> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 25 <SEP> - <SEP> - <SEP> 10 <SEP> 14
<tb> E. <SEP> coli <SEP> (Dillon-Stamm) <SEP> 30 <SEP> 16 <SEP> - <SEP> - <SEP> 22
<tb> M. <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 38 <SEP> 24 <SEP> -i- <SEP> 19 <SEP> 27
<tb> M. <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus
<tb> (widerstandsfähig <SEP> gegen
<tb> Streptothricin)
<SEP> 40 <SEP> 40 <SEP> 36 <SEP> - <SEP> 31
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> 32 <SEP> 16 <SEP> - <SEP> -f- <SEP> 27
<tb> Streptococeus <SEP> pyogenes <SEP> 32 <SEP> 18 <SEP> - <SEP> -f- <SEP> 30
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> 352 <SEP> 143 <SEP> -4 <SEP> -f- <SEP> 38
<tb> SM* <SEP> - <SEP> kristallines <SEP> Streptomycin-Kalziumchlorid.
<tb> TM <SEP> * <SEP> - <SEP> kristallines <SEP> Terramycin-hydrochlorid.
<tb> -f- <SEP> ** <SEP> - <SEP> Inhibierung <SEP> bloss <SEP> unter <SEP> der <SEP> Schale <SEP> (8 <SEP> mm).
<tb> -** <SEP> - <SEP> keine <SEP> Inhibierung.
<tb> i <SEP> - <SEP> Cycloserin <SEP> mit <SEP> einer <SEP> Aktivität <SEP> von <SEP> i5o <SEP> Einheiten <SEP> pro <SEP> mg.
<tb> 2, <SEP> 3,
<SEP> 4 <SEP> - <SEP> Cycloserin <SEP> mit <SEP> einer <SEP> Aktivität <SEP> von <SEP> 6o <SEP> Einheiten <SEP> pro <SEP> mg.
<tb> 2 <SEP> ^ <SEP> Cycloserin <SEP> mit <SEP> einer <SEP> Konzentration <SEP> von <SEP> :2 <SEP> mg/ml.
<tb> 3 <SEP> - <SEP> Cycloserin <SEP> mit <SEP> einer <SEP> Konzentration <SEP> von <SEP> o,-- <SEP> mg/ml.
<tb> 4 <SEP> - <SEP> Cycloserin <SEP> mit <SEP> einer <SEP> Konzentration <SEP> von <SEP> o,oa <SEP> mg/ml.
Aus den in der Tabelle 6 zusammengefass ten Ergebnissen ist ersichtlich, d:ass sich Cyclo- serin von Streptoinycin unterscheidet, welches in erster Linie gegen gramnegative Bakterien wirksam ist.
Das neue Antibiotikum ähnelt dem Terramycin insofern, als es einen Inhi- bitionseffekt sowohl bei gramnegativen ahs auch bei grampositiven Bakterien zeigt. Cyclo- serin ist jedoch erheblich wirksamer als Terra- inyein gegenüber einen gegen Streptothricin widerstandsfähigen Stamm von 14I. pyogenes var. aureus.
Die Tabellen 7 und 8 zeigen die Ergeb- nisse von verschiedenen Proben betreffend die -#ATiderstandsfähigkeit mit einem normal emp findlichen Stamm von M. py ogenes var. aureus und abgeleiteten Kulturen dieses Stammes, welche gegenüber Terramycin, Aureomyein, Chloromycetin,
Streptothricin und Strepto- mycin widerstandsfähig geworden sind. .
EMI0011.0039
<I>Tabelle <SEP> 7</I>
<tb> Wirksamkeit <SEP> von <SEP> Cyeloserin, <SEP> Terramycin <SEP> und <SEP> Streptomycin <SEP> auf <SEP> normal <SEP> empfindliche <SEP> und
<tb> widerstandsfähige <SEP> Stämme <SEP> von <SEP> iM. <SEP> pyogenes <SEP> vor.
<SEP> aureus
<tb> Cvcloserin- <SEP> Durchmesser <SEP> der <SEP> Inhibitionszone <SEP> in <SEP> mm
<tb> Antibiotikum <SEP> Konzentration <SEP> 1 <SEP> Normaler <SEP> gegen <SEP> Streptomycin <SEP> gegen <SEP> Terramycin
<tb> mg/ml <SEP> widerstandsfähiger <SEP> widerstandsfähiger
<tb> Stamm <SEP> Stamm <SEP> Stamm
<tb> Cycloserin <SEP> 3,1 <SEP> 33 <SEP> 31 <SEP> 36
<tb> <SEP> 0,31 <SEP> 19 <SEP> 15 <SEP> 22
<tb> <SEP> 0,031 <SEP> - <SEP> - <SEP> -f Terramyein <SEP> 1,0 <SEP> NT <SEP> NT <SEP> -I <SEP> 0,1 <SEP> 27 <SEP> NT <SEP> Streptomycin <SEP> 2,0 <SEP> NT <SEP> - <SEP> NT
<tb> <SEP> 0,1 <SEP> 19 <SEP> - <SEP> NT
<tb> + <SEP> - <SEP> Inhibierung <SEP> unter <SEP> der <SEP> Schale <SEP> (8 <SEP> mm)
.
<tb> - <SEP> - <SEP> keine <SEP> Inhibierung.
<tb> NT <SEP> - <SEP> nicht <SEP> geprüft.
<tb> 1 <SEP> = <SEP> Cycloserin <SEP> mit <SEP> einer <SEP> Aktivität <SEP> von <SEP> 92 <SEP> Einheiten <SEP> pro <SEP> mg.
EMI0012.0001
<I>Tabelle <SEP> 8</I>
<tb> Wirksamkeit <SEP> von <SEP> Cycloserin, <SEP> Streptomycin, <SEP> Aureomycin, <SEP> Terramycin, <SEP> Chloromyeetin <SEP> und
<tb> Streptothricin <SEP> auf <SEP> normal <SEP> empfindliehe <SEP> und <SEP> widerstandsfähige <SEP> Stämme <SEP> von
<tb> M. <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus
<tb> M. <SEP> M. <SEP> M.
<SEP> M.
<tb> pyogenes <SEP> pyogenes
<tb> Antibiotikum <SEP> M <SEP> pyogenes <SEP> Dillon <SEP> M' <SEP> pyogenes <SEP> M
<tb> pyogenes <SEP> CMR <SEP> pyogenes <SEP> SMR <SEP> -f- <SEP> STR <SEP> pyogenes <SEP> TMR <SEP> AMR
<tb> Cycloserin <SEP> Muster <SEP> 2930 <SEP> 18,0 <SEP> > <SEP> 35
<tb> Cyeloserin <SEP> Muster <SEP> 3969 <SEP> 20,0 <SEP> > <SEP> 35
<tb> Cycloserin <SEP> Muster <SEP> 3971 <SEP> 21.,0 <SEP> > <SEP> 35
<tb> Chloromycetin <SEP> 0,25 <SEP> mgiml <SEP> 17,0 <SEP> 0
<tb> Chloromycetin <SEP> 0,10 <SEP> mglml <SEP> 20,
0 <SEP> 0
<tb> Cycloserin <SEP> Muster <SEP> 4179 <SEP> 19 <SEP> 28 <SEP> > <SEP> 35
<tb> Cycloserin <SEP> Muster <SEP> 3969 <SEP> 15 <SEP> 25 <SEP> > <SEP> 35
<tb> Cyeloserin <SEP> Muster <SEP> 3971 <SEP> 20 <SEP> 28 <SEP> 31
<tb> Streptomycin-Kal-zium ehlorid <SEP> 100 <SEP> Einh./ml <SEP> - <SEP> 22 <SEP> Streptothricin-hyd'ro ehlorid <SEP> 1000 <SEP> Einh./ml <SEP> Streptothricin-hydTo chl,orid-Aureomycin hydrochlhrid
<tb> 5 <SEP> Einh./ml <SEP> 14 <SEP> < <SEP> 10 <SEP> < <SEP> 10
<tb> 10 <SEP> Einh./ml <SEP> 15,5 <SEP> < <SEP> 10 <SEP> < <SEP> 10
<tb> 25 <SEP> Einh./ml <SEP> 23 <SEP> 13 <SEP> 13
<tb> 50 <SEP> Einh./ml <SEP> 21,5 <SEP> 14 <SEP> 1.5
<tb> 75 <SEP> Einh./ml <SEP> 23,
5 <SEP> 17 <SEP> 16
<tb> 100 <SEP> Einh./ml <SEP> 24 <SEP> 18 <SEP> 20
<tb> Terramycin-hydrochlorid
<tb> 5 <SEP> Einh./ml <SEP> 13 <SEP> < <SEP> 1.0 <SEP> < <SEP> 10
<tb> 10 <SEP> Einh./ml <SEP> 16 <SEP> < <SEP> 10 <SEP> < <SEP> 10
<tb> 25 <SEP> Einh./ml <SEP> 20 <SEP> 10 <SEP> 12
<tb> 50 <SEP> Einh./ml <SEP> 2=2 <SEP> 12
<tb> 75 <SEP> Einh./ml <SEP> 23 <SEP> 14
<tb> 100 <SEP> Einh./ml <SEP> 24 <SEP> 16
<tb> Cycloserin <SEP> Muster <SEP> 4179 <SEP> 20 <SEP> 18 <SEP> 18
<tb> SMR <SEP> = <SEP> widerstandsfähig <SEP> gegen <SEP> Streptomycin.
<tb> AMR <SEP> - <SEP> widerstandsfähig <SEP> gegen <SEP> Aureomycin.
<tb> TMR <SEP> - <SEP> widerstandsfähig <SEP> gegen <SEP> Terramycin.
<tb> CMR <SEP> - <SEP> widerstandsfähig <SEP> gegen <SEP> Chloromycetin.
<tb> STR <SEP> .- <SEP> widerstandsfähig <SEP> gegen <SEP> Streptothricin,
Die Ergebnisse, welche in den Tabellen 7 und 8 zusammengefasst sind, zeigen, dass das neue Antibiotikum sich vom Streptothricin, Aureomycin, Chloromycetin, Streptomycin und Terramycin klar unterscheidet. Die Versuche beweisen, dass die widerstandsfähigen Stämme von M. pyogenes var. aureus genau so anspre chen wie die gewöhnlichen empfindlichen Stämme, wenn sie dem Cycl'oserin ausgesetzt werden.
Andere bVersuche in vitro haben ergeben, dass das Cyc'loserin einen bemerkenswerten Inhibitionseffekt auf das Wachstum von M.
tuberculosis (virulenter, menschlicher Stamm) ausübt. Das Wachstum dieses Patho- gens wird durch Cycloserin in Konzentratio nen von 0,005 bis, 0,01 mg/ml des Dubos'schen Mediums vollständig aufgehalten.
Versuche mit Mäusen zeigen, d'ass Konzen trate von. Cycl'oserin einen heilenden Effekt bei bakteriellen Infektionen in vivo aufweisen. Die Ergebnisse solcher invivo-Versuche mit 2 grampositiven Bakterien und 2 gramnega, tiven Bakterien sind in der naehstehenden Tabelle 9 enthalten.
EMI0013.0041
<I>Tabelle <SEP> 9</I>
<tb> Wirkung <SEP> von <SEP> Konzentraten <SEP> von <SEP> Cycloserin <SEP> auf <SEP> einige <SEP> gra@mpositive <SEP> und <SEP> gramnegative
<tb> Bakterien-Infektionen <SEP> bei <SEP> Mäusen
<tb> Aktivität <SEP> des <SEP> Wirksame
<tb> Cycloserin-Konzentrates <SEP> Mindestdosis <SEP> Therapeutischer
<tb> Infektionserreger <SEP> Index
<tb> in <SEP> Streptomycin-Einheiten <SEP> in <SEP> mg/2o <SEP> g
<tb> pro <SEP> mg <SEP> ED <SEP> ioo <SEP> ED <SEP> 50 <SEP> @I <SEP> D <SEP> 5 /ED <SEP> 50)
<tb> <I>Subkutane <SEP> Behandlung:
</I>
<tb> M. <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> au <SEP> reus <SEP> 1.50 <SEP> 6,2 <SEP> 1,4 <SEP> 100
<tb> Diplocoq-,c.us <SEP> pneu.monia@e <SEP> 60 <SEP> > <SEP> 50,0 <SEP> 31,0 <SEP> 4,2
<tb> Klebsiena <SEP> pneumoniae <SEP> 60 <SEP> 50,0 <SEP> 15,6 <SEP> 8,3
<tb> Sa.lmonella <SEP> schottmulleri <SEP> 150 <SEP> 12,5 <SEP> 4,1 <SEP> 34,0
<tb> <I>Orale <SEP> Behandlung:
</I>
<tb> M. <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 60 <SEP> - <SEP> 25,0 <SEP> 8,8 <SEP> - <SEP> > <SEP> 34
<tb> M. <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 92 <SEP> 3,1 <SEP> 1.,9 <SEP> > <SEP> 158 Bei andern Experimenten in vivo wurde die antibakterielle Wirksamkeit von Cy clo- serin (300 Einheiten pro mg) mit einigen seiner Salze verglichen.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 10 zusammengefasst, worin die Dosen - angegeben sind, die benötigt werden, um 50% einer Gruppe von 20 g Mäusen vom Tod durch die Krankheit zu bewahren.
EMI0013.0060
<I>Tabelle <SEP> 10</I>
<tb> Form <SEP> des <SEP> Cycloserins <SEP> Infektionserreger <SEP> ED <SEP> <B>50</B> <SEP> in
<tb> mg/2o <SEP> g
<tb> <I>Einzige <SEP> orale <SEP> Dosis:</I>
<tb> Base <SEP> Microcoecus <SEP> aureus <SEP> 0,99
<tb> Kalziumsalz <SEP> <SEP> <SEP> 0,99
<tb> Magnes <SEP> iumsalz <SEP> <SEP> <SEP> 1.,05
<tb> Sulfat <SEP> <SEP> <SEP> 1,80
<tb> Natxiumsalz <SEP> <SEP> <SEP> 1,71
<tb> Base <SEP> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 2,49
<tb> Kalziumsalz <SEP> <SEP> <SEP> 4,55
<tb> Kalziumsalz <SEP> Salmonella <SEP> schottmulleri <SEP> 7,35
EMI0014.0001
<I>Tabelle <SEP> 10</I> <SEP> (Fortsetzung)
<tb> Form <SEP> des <SEP> Cycloserins <SEP> Infektionserreger <SEP> ED <SEP> 5o <SEP> in
<tb> -g/20 <SEP> g
<tb> <I>Einzige <SEP> subkutane <SEP> Dosis</I>
<tb> Base <SEP> M.
<SEP> aureus <SEP> 0,69
<tb> Sulfat <SEP> <B> <SEP> </B> <SEP> 0,6l.
<tb> Natriumsalz <SEP> <SEP> <SEP> 1;32
<tb> Base <SEP> K. <SEP> pneumoniae <SEP> 2,51 Das Cyclo:serin hat eine Antirickettsia- Wirksamkeit in vivo: bei Mäusen und Hühner embryonen, welche mit Riekettsien vom Mu- rientyphus infiziert worden waren.
Wenn Mäuse, die man mit Rickettsien infiziert hatte, eine einzige subkutane Dosis von 5 mg oder zwei Dosen von je 2,5 mg Cycloserin mit einer Wirksamkeit von 300 Streptomycin-Einheiten pro mg erhielten, waren sie vollständig gegen die tödlichen Infektibnen geschützt. Derselbe Betrag (5 mg) gibt auch bei Hühnerembryo- nen, die mit Rickettsien infiziert wurden, voll ständigen Schutz.
Das Cycloserin zerstört vollständig den Bazillus Borellia novyi, die Spirocheten des Rückfallfiebers, bei Mäusen. Eine einzige sub kutane Dosis, die 24 Stunden nach der Infek tion verabreicht wird, erweist sieh als ebenso wirksam., wie wenn sie unmittelbar nach der Infektion gegeben wird.
Die Ergebnisse von Versuchen in bezug auf die akute Toxizität bei Mäusen, die mit. einer einzigen Dosis von verschiedenen Cyclo- serin-Konzentration behandelt wurden, sind in der Tabelle 11 wiedergegeben.
EMI0014.0034
<I>Tabelle <SEP> 11.</I>
<tb> Akute <SEP> Toxizität <SEP> von <SEP> Cycloserin <SEP> bei <SEP> Mäusen
<tb> Aktivität <SEP> des <SEP> Akute <SEP> CD <SEP> So <SEP> bei <SEP> Mäusen <SEP> in <SEP> mg/2o <SEP> g
<tb> Cycloserin-Konzentrates
<tb> in <SEP> Streptomycin-Einheiten <SEP> Intravenös <SEP> Subkutan <SEP> Oral
<tb> pro <SEP> mg
<tb> 1. <SEP> 60 <SEP> > <SEP> 80 <SEP> <B>1</B>30 <SEP> > <SEP> 300
<tb> 2 <SEP> 150 <SEP> > <SEP> 63 <SEP> etwa <SEP> 150 <SEP> nicht <SEP> geprüft
<tb> 3 <SEP> 92 <SEP> nicht <SEP> geprüft <SEP> <B>162</B> <SEP> > <SEP> 300 Diese Zahlen zeigen, d:ass das Cycloserin verhältnismässig gut vertragen wird'.
Im Ver gleich mit kristallinem Aureomycin und Terra- inyein. (subkutan LD 50 = 60=80 mg/20 g bzw. 12-13 mg/20 g (von Schoenbach, Ann. N. Y. Acad. Sei. 53 [2], 247] ), erweist sich das Cycloserin als etwa nur halb bzw. nur ein Zehntel so toxisch.
Weitere Versuche sind an Ratten und Hunden mit Cycloserin-Konzentraten ausge führt worden, welche eine Wirksamkeit von 300 Einheiten pro mg .aufwiesen. Sie ergaben, dass das Produkt von den Versuchstieren gut vertragen wird.
Nach :der Behandlung von Mäusen mit Cycloserin-Konzentraten in Mengen von 25 und 50 g/20 g subkutan und 50 mg/20 g oral wurden die Blutkonzentrationen untersucht, wobei die Schalen-Platten-Methode und M. pyogenes var. aureus als Testorganismus be nutzt wurden.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 12 zusammengefasst.
EMI0015.0001
<I>Tabelle</I> <SEP> 12
<tb> Menge <SEP> Aktivität <SEP> des <SEP> Antibiotische <SEP> Konzentration <SEP> im <SEP> Serum <SEP> in <SEP> mg
<tb> in <SEP> Cycloserins <SEP> Stunden <SEP> nach <SEP> der <SEP> Anwendung
<tb> mg/20g <SEP> Einheiten/mg <SEP> 1/' <SEP> 1/2 <SEP> 3/,4 <SEP> <B>1</B> <SEP> 11/2 <SEP> 2 <SEP> 21i2 <SEP> 3
<tb> 25 <SEP> 92 <SEP> subkutan <SEP> 1,35 <SEP> 0,65 <SEP> 0,6 <SEP> 0,58 <SEP> 0,17 <SEP> 0,03 <SEP> 0,05 <SEP> 0
<tb> 50 <SEP> 92 <SEP> <SEP> 0,52 <SEP> 0,33 <SEP> 0,28 <SEP> 0,17 <SEP> 0,07 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 50 <SEP> 92 <SEP> oral <SEP> 0,7 <SEP> 0,53 <SEP> 0,34 <SEP> 0,22 <SEP> 0,06 <SEP> 0,
04 <SEP> 0 <SEP> 0 Das Cycloserin wurde auch klinisch ge prüft und hat sich als nützlich erwiesen bei der Vorbeugung und Heilung von natürlichen bakteriellen Infektionen in Zahntaschen nach der Extraktion menschlicher Zähne. Wenn es örtlich benutzt wird, hat das Antibiotikum sich als wirksam für diesen Zweck gezeigt, wobei es ausserdem noch die Wiederherstellung und die Heilung des Gewebes fördert.
Ausser dem ist das Antibiotikum nützlich bei der Be handlung von Pyorrhöe-Taschen.
Das, Cycl'oserin ist wegen seiner Wirksam keit gegenüber verschiedenen Bakterien wert voll bei der Behandlung von Infektionskrank heiten bei Tieren. Beispielsweise können die antibiotische Base öder ihre Salze sowohl in Form der reinen Produkte als auch in Form von Konzentraten für die örtliche Behand lung benutzt werden. Zu diesem Zweck kön nen die antibiotischen Produkte sowohl in Lö sung als auch in Form von Salben und der gleichen in bekannter Weise zubereitet sein.
In der vorstehenden Beschreibung ist die Aktivität des Cycloserins und seiner Salze in Streptomycin-Einheiten ausgedrückt. Die Akti vität wurde nach der StanCliard'-Sehaleri-Diffu- sionsmethode unter Benutzung von M. pyogenes vor. aureus und:
einem Streptomycih-Standard ermittelt. Die Versuchsmethode ist die gleiehe wie diejenige, die man für Streptomycin be nutzt, mit der Ausnahme, dass ein anderer Testorganismus verwendet wird.