JPH0147153B2 - - Google Patents

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JPH0147153B2
JPH0147153B2 JP57009237A JP923782A JPH0147153B2 JP H0147153 B2 JPH0147153 B2 JP H0147153B2 JP 57009237 A JP57009237 A JP 57009237A JP 923782 A JP923782 A JP 923782A JP H0147153 B2 JPH0147153 B2 JP H0147153B2
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endopeptidase
streptomyces
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Chikae Yokogawa
Shozo Kotani
Shigeo Kawada
Yoshuki Takase
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Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
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Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
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Publication of JPH0147153B2 publication Critical patent/JPH0147153B2/ja
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    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K9/001—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure
    • C07K9/005—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure containing within the molecule the substructure with m, n > 0 and m+n > 0, A, B, D, E being heteroatoms; X being a bond or a chain, e.g. muramylpeptides
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は、免疫増強作用、非特異的感染防御作
用等を有する有用なジサツカライドトリペプチド
及びジサツカライドテトラペプチドの製法に関す
るものである。 細菌細胞壁の構築単位であるペプチドグリカン
が免疫増強作用を有することはよく知られている
〔生化学48，1081〜1107（1976）〕。従来、細菌細胞
壁に溶菌酵素を作用させて免疫増強作用を有する
水溶性成分を取得しようとする試みは数多くなさ
れている。しかし多くの場合、得られた水溶性ペ
プチドグリカンは、種々の分子量のペプチドグリ
カンの混合物であつて、製造ごとにその組成が異
なり、従つてその作用の強さも製造ごとに変動す
る。 米国特許第4186194号には、他の低分子ペプチ
ドグリカンとともに、一般式（）又は（） （式中、Ｎ−AcGlcはＮ−アセチルグルコサミ
ニル基を、Ｎ−Acyl−MurはＮ−アシルムラミ
ル基を、Ｌ−AlaはＬ−アラニル基を、Ｄ−Glu
はＤ−グルタミル基を、neso−DAPはメソ−２，
６−ジアミノピメリル基又はメソ−２，６−ジア
ミノピメリン酸を、Ｄ−AlaはＤ−アラニンを意
味する。但し、Ｄ−グルタミン酸及び／又はメソ
−２，６−ジアミノピメリン酸残基におけるカル
ボキシ基は遊離の形であつてもアミド化されてい
てもよい。） で表わされる化合物が単一物質として開示され、
それらが免疫増強作用を有すると述べられてい
る。その製法として、ミコバクテリア、ノカルジ
ア又は大腸菌の細胞壁に溶菌酵素を作用させる方
法が開示されている。しかし具体的には、ミコバ
クテリウム・スメグマチスの脱脂細胞壁にリゾー
ム及びムラミル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（ミキ
ソバクターAL1由来）を作用させて得られる、ペ
プチドグリカン３画分のうちの最も低分子の画分
を更に調整用電気泳動に付して、式（）におい
てAcylがグリコリル基で、グルタミル基及びメ
ソ−２，６−ジアミノピメリル基のカルボキシ基
がアミド化された物質を得たと述べているにすぎ
ない。大腸菌の細胞壁から調製した不溶性ペプチ
ドグリカンにリゾチームを作用させた例でも、得
られるペプチドグリカン３画分のうちの最も低分
子の画分が、ジサツカライドテトラペプチド及び
ジサツカライドトリペプチドの混合物であると述
べているだけである。従つて、単一物質を単離・
精製したというにはほど遠い。 従来、細菌細胞壁のペプチドサブユニツト間の
Ｄ−アラニル−メソ−２，６−ジアミノピメリン
酸結合を特異的に開裂するＤ−アラニル−メソ−
２，６−ジアミノピメリン酸エンドペプチダーゼ
（以下エンドペプチダーゼと記す）として、スト
レプトミセスsp.L−３ 産生酵素が知られている
〔Biken Journal19，75〜91（1976）〕。しかし後記
参考例から明らかなように、この菌株のエンドペ
プチダーゼ産性能は極めて低く、実用に供し得る
量のエンドペプチダーゼを得るのは困難であつ
た。 本発明者らは、溶菌酵素として実用に供するに
充分な量のエンドペプチダーゼを得るべく鋭意研
究を重らた結果、上記ストレプトミセスsp.L−３
をエンドペプチダーゼ産性能の優れた菌株ストレ
プトミセス・ニレロスポレウスSKに変異させる
こと、及びストレプトミセス・グロビスポラスの
培養液から高活性の新規なエンドペプチダーゼを
好収率で得ることに成功し、これらに基づいて本
発明を完成した。 本発明は、細胞壁構築成分として、アミノ基が
アセチル化されたムラミン酸部分、イソグルタミ
ン及びアミド化されたカルボキシ基を有するメソ
−２，６−ジアミノピメリン酸を含む細菌の細胞
壁に、ストレプトミセス・グロビスポラス由来の
Ｎ−アセチルムラミダーゼ及びストレプトミセ
ス・ニトロスポレウスSK又はストレプトミセ
ス・グロビスポラス由来のエンドペプチダーゼを
作用させ、更に必要に応じて加水分解をすること
も特徴とする一般式（） （式中、R1は水素原子又はアセチル基を意味
し、R2はヒドロキシ基又は１−カルボキシエチ
ルアミノ基を意味する。） で表わされるジサツカライドトリペプチド及びジ
サツカライドテトラペプチド並びにその塩の製法
に関するものである。 本発明の方法によれば、水溶性で、強い生理活
性を有し、毒性が弱く、かつ構造決定された単一
成分のペプチドグリカンである式（）の化合物
を大量に得ることができる。 式（）で表わされる化合物には、Ｎ−アセチ
ルグルコサミニル−β―１，４―Ｎ―アセチルム
ラミル―Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−
メソ−アミド化−２，６−ジアミノピメリン酸
（以下GMP3−Ａと記す），Ｎ−アセチルグルコサ
ミニル−β−１，４−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ
−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−メソ−アミ
ド化−２，６−ジアミノピメリル−Ｄ−アラニン
（以下GMP4−Ａと記す），Ｎ−アセチルグルコサ
ミニル−β−１，４−Ｎ，６−Ｏ−ジアセチルム
ラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−
メソ−アミド化−２，６−ジアミノピメリン酸
（以下GMP3−Ｂと記す）及びＮ−アセチルグル
コサミニル−β−１，４−Ｎ，６−Ｏ−ジアセチ
ルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニ
ル−メソ−アミド化−２，６−ジアミノピメリル
−Ｄ−アラニン（以下GMP4Bと記す）が含まれ
る。 本発明の方法に用いられる細菌の具体例として
は、ラクトバシラス・プランタラム
（Lactobacillus plantarum）、コリネバクテリウ
ム・ジフテリアエ（Corynebacterium
diphtheriae）等が挙げられるが、前者が好まし
い。細胞壁のペプチドグリカン含有量を高めるた
めに、これらの細菌に薬剤耐性を持たせたり、あ
るいは人工的に細胞壁の特殊外層を欠損させて変
異させてもよい。これらの細菌を常法により培養
し、培養液から菌体を分離し、これを物理的に破
壊し、次いで高濃度の食塩水で菌体内蛋白質を流
出・除去し、更にトリプシン処理して不要の蛋白
質を除去することにより、原料の細胞壁が得られ
る。また、このようにして得られた細胞壁を0.05
〜0.5N、好ましくは0.1〜0.2Nのアルカリで処理
したもの、あるいは全菌を0.05〜0.5N、好ましく
は0.1〜0.2Nのアルカリで処理したのち上記と同
様に処理して調製した細胞壁を原料として用いて
もよい。 上記のようにして得られた細胞壁に２種の酵
素、すなわちＮ−アセチルムラミダーゼ及びエン
ドペプチダーゼを作用させて細胞壁を溶解させ
る。この場合、先にＮ−アセチルムラミダーゼを
作用させるか、あるいは２種の酵素を同時に作用
させるのが好ましい。この反応では、不要な開裂
を避けるために、できるだけ精製した酵素を使用
すべきである。 Ｎ−アセチルムラミダーゼとしては、例えばス
トレプトミセス・グロビスポラスＢ−1829が産生
する酵素（以下M1−アセチルムラミダーゼと記
す）が好ましく用いられる。このＢ−1829株は工
業技術院微生物工業技術研究所及びアメリカンタ
イプカルチヤーコレクシヨン（ATCC）にそれぞ
れ微工研菌寄第596号及びATCC 21553号として
寄託されており、その菌学的性質、培養方法及び
その培養液から酵素採取法は特公昭49−16956号、
特開昭49−118821号及び米国特許第3929579号に
詳細に記載されている。 エンドペプチダーゼとしては、例えばストレプ
トミセス・ニトロスポレウスSK又はストレプト
ミセス・グロビスポラスＢ−1829が産生する酵素
が好ましく用いられる。SK株は、Biken
Journal19，75〜91（1976）に記載されているスト
レプトミセスsp.L−３を、エンドペプチダーゼ産
生能の優れたものに本発明者らが変異させて創製
したものである。このSK株（微工研条寄第216
号）の創製（変異）法、培養方法、菌学的性質及
びその培養液からのエンドペプチダーゼ（以下
SK−エンドペプチダーゼと記す）の採取法につ
いては後記参考例で詳述する。ストレプトミセ
ス・グロビスポラスＢ−1829が産生するエンドペ
プチダーゼ（以下AM3−エンドペプチダーゼと
記す）の単離・精製は、Ｂ−1829株を特公昭49−
16956号に記載の方法で培養し、培養液から粗酵
素を採取し、後記参考例に示す方法で精製するこ
とにより行われる。AM3−エンドペプチダーゼ
は、後記のように物理化学的性質においてSK−
エンドペプチダーゼとは明らかに異なり、更にス
トレプトミセス・アルブスＧ（Streptomyces
albusG）が産生するDDカルボキシペプチダーゼ
〔Biochemistry９，2955，2961（1970）〕とは基質
特異性が異なるので、新規なエンドペプチダーゼ
である。 原料の細胞壁の２種の酵素による溶解は、一般
にPH7.0〜8.5の緩衝液中、防腐剤（例えばクロロ
ホルム、窒化ナトリウム等）の存在下、約37℃で
行われる。反応終了点は、Ｎ−アセチルムラミダ
ーゼを作用させる場合には遊離する還元糖が一定
に達した時であり、エンドペプチダーゼを作用さ
せる場合には遊離アミノ基の生成が一定に達した
時である。反応時間は、酵素量並びに細胞壁の量
及び性質によつて異なるが、通常８〜60時間、好
ましくは24〜48時間である。エンドペプチダーゼ
は、常法に従つて固定化し、連続使用してもよ
い。例えば、該酵素をCM−セフアデツクスＣ−
25（Na+タイプ、フアルマシア社）にイオン結合
により、あるいはジアゾ化されたｐ−アミノベン
ジル−セルロースにジアゾカツプリングにより固
定化して用いられる。反応混液からの目的物の単
離は、イオン交換クロマトグラフイー、シリカゲ
ル等のカラムクロマトグラフイー、ゲル過等の
手段を組み合わせて行うことができる。ラクトバ
シラス・プランタラムのアルカリで処理していな
い細胞壁を原料に用いた場合には、GMP3−Ａ，
GMP4−Ａ，GMP3−Ｂ及びGMP4−Ｂが得られ、
アルカリで処理した細胞壁を用いた場合には、
GMP3−Ａ及びGMP4−Ａが得られる。GMP3−
Ｂ及びGMP4−Ｂはそれぞれ、酸性下に加水分解
することにより、定量的にGMP3−Ａ及びGMP4
−Ａに変換することができる。本加水分解反応
は、0.05〜0.5N、好ましくは0.1〜0.2Nの鉱酸水
溶液中で行われる。反応温度は通常40〜80℃、好
ましくは60℃前後であり、反応時間は通常２〜９
時間、好ましくは５〜７時間である。 式（）の化合物は、各種の無機塩基もしくは
有機塩基又は無機酸もしくは有機酸と常法に従つ
て処理することにより、塩類に導くことができ
る。 式（）の化合物及びその塩は、免疫増強作
用、非特異的感染防御作用等の生理活性を有し、
医薬として有用である。 以下に、GMP3−Ａ，GMP4−Ａ，GMP3−Ｂ
及びGMP4−Ｂについての生理活性試験の結果を
示す。 試験例１ 免疫増強作用（アジユバンド活性） (1) 感作動物の調製 〔ドラケオール6VR（ペンシルバニア リフイ
ニング社）〕、〔アラセルＡ（アストラケミカルイン
ダストリーズ社）〕、〔１／75Mリン酸緩衝生理食
塩水溶液〕をそれぞれ４：１：５（Ｖ／Ｖ）の割
合で含むＷ／Ｏ型乳濁液１ml当り、結晶卵白アル
ブミン１mg及び試験化合物（変量、200μｇ以下）
を加えて調製した液の0.2mlずつを、１群５匹の
雌性ハートレイ系モルモツト（体重200〜300ｇ）
の左側後足蹠内に１回注射し、感作動物を調製し
た。 角膜反応 感作２週間後に角膜内に、20mg／ml濃度の結晶
卵白アルブミン生理食塩水溶液を、直径が約５mm
の一過性の白濁が生じるように注射する。48時間
後における角膜の濁りの程度（スコア）から細胞
性抗体生成増強の有無、すなわち遅延性アレルギ
ー成立の有無及びその程度を判定した。 皮膚反応 感作３週間後に脱毛した指部皮内に、１mg／ml
濃度の結晶卵白アルブミン溶液0.1mlを注射し、
48時間後の発赤の長、短径の平均値及び硬結注射
部位と反対側の対照部位の皮膚の厚さの比（ダブ
ルシツクネス法）から、遅延型アレルギーの成立
の有無及びその程度を判定した。 体液性抗体生成量 感作４週間後に心臓穿刺によつて採血し、血清
中の抗卵白アルブミン量を窒素量（μｇ／ml）と
して定量し、体液性抗体生成増加の有無及びその
程度を調べた。 試験結果を第１表に示す。
【表】 ＊ フロインドの不完全アジユバンド
試験例２ 非特異的感染防禦作用 体重約23ｇのStd−ddY系雄性マウスを使用し
た。感染前３，２及び１日目に試験化合物の生理
食塩水溶液を静脈内投与する。投薬24時間後に緑
膿菌No.12（感染菌量２×106／マウス）を腹腔内感
染させ、感染７日後の生存数を観察し第２表の結
果を得た。
【表】 以下に参考例及び実施例を挙げて本発明を更に
具体的に説明する。 参考例１ ストレプトミセス・ニトロスポレウス
SKの調製 小谷らが奈良県橿原市の土壌から分離した親株
ストレプトミセスsp.L−３を可溶性デンプン１
％、酵母エキス0.2％、ラクトバシラス・プラン
タラムATCC 8014の細胞壁0.1％、寒天２％から
なる斜面培地（PH7.4）で15回継代培養をくり返
し、この培地に親株を充分馴化させる。 この親株を上記培地で30℃、７日間培養し、充
分胞子を着生させた後、胞子を無菌生理食塩水
5.0mlで洗い取り、その0.5mlを、シヤーレに流し
込んだ上記培地に塗抹し、30℃で４日間培養す
る。生成した大きな溶菌斑を伴つたコロニーを拾
取し、上記斜面培地に植えつける。この操作を15
回くり返し、特にエンドペプチダーゼ産生能の優
れた１株を選出した。この単胞子分離操作で得ら
れた菌株を上記斜面培地に植え、胞子が充分着生
するまで培養する。胞子を無菌生理食塩水5.0ml
で洗い取り、２回遠心洗浄浮遊後シヤーレに移
し、紫外線殺菌燈（東芝電気、15W）で照射（10
分間、距離約15cm）し、照射液の0.5mlを上記培
地を含むシヤーレに塗抹し、特にコロニーの大き
さに比べて大きな溶菌斑を示す菌株を拾い上げ
る。この操作を５回くり返してSK株を調製した。 このようにして変異させた新規SK株の菌学的
性質は第３〜６表に示すとおりである。
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】 わめて生育弱い
なお、本変異株の細胞壁中にはＬ，Ｌ−２，６
−ジアミノピメリン酸残基を含む。 SK株のこれらの菌学的性質をBergey，ｓ
Manual of Determinative Bacteriology ８版、
ISPの分類法、ヒユツターの検索表と照合し、比
較検討したところ、近緑種としてはアクチノミセ
ス・アトロリバセウス（Actinomyces
atrolivaceus）、ストレプトミセス・ハルステデ
イ（Streptomyces halstedii）及びストレプトミ
セス・ニトロスポレウスが挙げられる。しかし、
アクチノミセス・アトロリバセウスはその胞子表
面構造に疣（warty）がみられる点において、ま
たストレプトミセス・ハルステデイはその胞子の
数が３〜10ケである点において本変異株とは一致
しない。本変異株は、フラクトース及びラムノー
スの利用性のパターンが僅かに異なるもののスト
レプトミセス・ニトロスポレウスと最も類似する
ので、ストレプトミセス・ニトロスポレウスに属
する新菌株と認め、本変異株をSK株と命名した。
なお第７表に示すように、SK株と親株とはその
エンドペプチダーゼ産生能において明確に区別さ
れる。
【表】 本SK株及び親株が産生するエンドペプチダー
ゼの基質に対する作用点は同一であるが、親株の
酵素産生能があまりにも低すぎるため、両酵素が
同一であるかどうかは判らない。そこで本発明者
らはSK株が産生する溶菌酵素をSK−エンドペプ
チダーゼと命名し、親株が産生するエンドペプチ
ダーゼとは区別することにした。 このような菌学的性質を有するSK株は適当な
培地中で培養される。培養は振盪培養あるいは静
置培養のいずれでもよいが、20〜40℃、好ましく
は30℃前後において、１〜４日間、なかんずく２
〜３日間振盪培養するのが好ましい。培地は、ス
トレプトミセス属に属する微生物の培養に通常用
いられるものであればいずれも使用できる。例え
ば、グルコース、デキストリン、マルトース、可
溶性デンプンのような糖類、脱脂大豆、酵母エキ
ス、ポリペプトン、肉エキス、コーンスチープリ
カー、味液のような窒素源、食塩、硫安、塩化ア
ンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸第二鉄、硫
酸亜鉛、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、リン
酸塩のような無機塩あるいはビタミン類等を含む
PH６〜９、なかんずくPH７〜８の培地が用いられ
る。ラクトバシラス・プランタラムやコリネバク
テリウム・ジフテリアエのような微生物の全菌又
はその細胞壁をSK−エンドペプチダーゼ誘発剤
（inducer）として培地に加えてもよい。 培養液からのSK−エンドペプチダーゼの採取
は、培養液から菌体を除いた溶液について、陽イ
オン交換樹脂処理、硫安塩析あるいはCM−セフ
アデツクスＣ−25（Na+タイプ）処理等を合理的
に組し合わせることにより行うことができる。 参考例２ SK株の培養とSK−エンドペプチダー
ゼの製造 デキストリン２％、脱脂大豆２％、酵母エキス
0.5％、食塩0.2％、ラクトバシラス・プランタラ
ムATCC 8014の細胞壁0.2％を含有する培地（PH
7.4）50にSK株を２％の接種量で接種した後、
通気量50／分、撹拌速度180回転／分条件下、
30℃で３日間培養し、過助剤２Kgを加えてフイ
ルタープレスで過する。液50にアンバーラ
イトCG−50（H+タイプ、ロームアンドハース社）
2.5Kg（湿潤重量）を加え、PH5.0に調整し１時間
撹拌する。樹脂を分別水洗後、0.2M食塩水10
で溶出し、その溶出液をPH7.5に調整した後、80
％飽和になるように硫安を加える。得られた沈殿
を最少量の水に溶解し、４℃で２日間水に対して
透析した後、CM−セフアデツクススＣ−25
（Na+タイプ，フアルマシア社）のカラム（5.6×
40cm）に付し、次いで０〜0.5M NaClの直線濃
度勾配法で溶出する。0.05〜0.1Mで溶出する画
分を濃縮し、脱塩し、凍結乾燥してSK−エンド
ペプチダーゼ300mgを得た。 参考例３ AM3―エンドペプチダーゼの製造 デキストリン２％、脱脂大豆0.5％、ポリペプ
トン0.2％、食塩0.2％、MgSO4 0.1％、
Ma2HPO4 0.5％、CaCl2 0.02％からなる培地
（PH7.5）70にストレプトミセス・グロビスポラ
スＢ−1829株を１％の接種量で接種した後、通気
量70／分、撹拌速度250回転／分の条件下、30
℃で３日間培養する。培養液を過し、液70
にアンバーライトCG−50（H+タイプ）6.5Kgを加
えて１時間撹拌後、過する。分別した樹脂を充
分に水洗した後、0.2M Na2HPO4（PH7.5）で溶
出し、溶出液に硫安を60％飽和になるように加え
る。得られた沈殿物を取し、少量の脱イオン水
に溶解し、電気透析器（セレミオン透析槽DU−
Ob型、日本練水）で２〜５時間脱塩を行う。そ
の溶液をCM−セフアデツクスＣ−25（Na+タイ
プ）のカラム（5.0×20cm）に付し、次いで０〜
0.06M NaClの直線濃度勾配法で溶出する。活性
画分を集めて濃縮し、セフアデツクスＧ−25（フ
アルマシア社）でゲル過後、凍結乾燥して
AM3−エンドペプチダーゼ800mgを得た。 このようにして得られたSK−及びAM3−エン
ドペプチダーゼの酵素学的性質の比較結果を第８
表に示す。
【表】 参考例４ M1−アセチルムラミダーゼの製造 デキストリン２％、脱脂大豆0.5％、ポリペプ
トン0.25％、食塩0.17％、MgSO4 0.1％、
Na2HPO4 0.5％、CaCl2 0.02％からなる培地
（PH7.5）70中で、通気量70／分、撹拌速度
250回転／分の条件下、ストレプトミセス・グロ
ビスポラスＢ−1829株を30℃で３日間培養する。
培養液を過し、液70にアンバーライトCG
−50（H+タイプ）6.5Kgを加えて１時間撹拌した
後過する。樹脂を．0.2M Na2HPO4（PH7.5）
で溶出し、溶出液に硫安を60％飽和になるように
加える。得られた沈殿物を取し、少量の脱イオ
ン水に溶解し、0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）で
平衡化したCM−セルロース（Na+タイプ、バイ
オーラツド社のカラム（3.0×70cm）に付す。
0.05M及び0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で段階的
に溶出する。0.1Mリン酸緩衝液溶出画分を透析
した後、0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）で平衡化
したCM−セフアデツクスＣ−25（Na+タイプ）
のカラム（3.0×60cmに付す。次いで0.05M及び
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で段階的に溶出し、
0.1M溶出画分を0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）に
対して透析する。透析液をセフアデツクスＧ−75
（フアルマシア社）でゲル過を行い、活性画分
を脱塩し、濃縮したのち凍結乾燥してM1−アセ
チルムラミダーゼ1100mgを得た。 参考例５ 細胞壁の調製 ラクトバシラス・プランタラムATCC 8014の
湿潤菌体520ｇを生理食塩水４に浮遊させ、こ
れをダイノーラボラトリーミル（シンマルエンタ
ープライゼス社）を用いて破壊する。未破壊細胞
を遠心分離（800×ｇ，10分）し、上清懸濁液に
食塩を1Mになるように加える。次いで細胞壁を
遠心分離（9000×ｇ，30分）し、大量の脱イオン
水で４回遠心洗浄する。洗浄細胞壁を0.05Mリン
酸緩衝液（PH7.0）に懸濁し、トリプシン4.2ｇを
加え、37℃で６時間温置する。反応混液を冷却遠
心（800×ｇ，15分）して粗大物を除き、その上
清を更に遠心（9000×ｇ，30分）して細胞壁を集
める。細胞壁を0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）で
３回遠心洗浄して精製細胞壁86ｇを得た。 参考例６ アルカリ処理細胞壁の調製 参考例５で得られた細胞壁80ｇを0.1N
NaOH4.4に懸濁し、室温で30分〜２時間撹拌
した後、濃塩酸で中和し、次いで遠心（9000×
ｇ，30分）して細胞壁を集める。細胞壁を1M食
塩及び水で洗浄し、凍結乾燥してアルカリ処理細
胞壁40ｇを得た。 参考例７ アルカリ処理細胞壁の調製 ラクトバシラス・プランタラムATCC 8014の
湿潤全菌体121ｇを常水１に懸濁し、よく分散
させた後、固型のNaOH4ｇを加え、NaOHが完
全に溶解したのち室温で30分間撹拌する。濃塩酸
でPH値を7.0付近に戻した後、遠心分離（800×
ｇ，10分）し、沈殿物を１回水洗する。得られた
アルカリ処理全菌を参考例５と同様に処理して、
アルカリ処理細胞壁18ｇを得た。 参考例８ AM3−エンドペプチダーゼの固定化 参考例３で得られたAM3−エンドペプチダー
ゼ500mgを0.05Mリン酸緩衝液（PH8.0）20mlに溶
解した溶液を、常法に従つてジアゾ化したｐ−ア
ミノベンジル−セルロース1000mgに加え、４℃で
20時間撹拌して反応させた後、37℃で１時間加温
する。反応終了後、固定化された酵素を取し、
0.25Mリン酸緩衝液（PH8.0）、次いで水の遊離の
酵素を洗い出した後、低温保存する。 参考例９ AM3−エンドペプチダーゼの固定化 参考例３で得られたAM3−エンドペプチダー
ゼ200mgをセフアデツクスＧ−100のカラム（2.0
×100cm）でのゲル過分画により更に精製する。
ここに得られた精製酵素を、0.001Mリン酸緩衝
液（PH6.5）50mlに懸濁したCM−セフアデツクス
Ｃ−25（Na+タイプ、5.0ｇ湿潤重量）に加え、４
℃で24時間撹拌する。CM−セフアデツクスＣ−
25を取し、上記緩衝液500mlで充分洗浄して
AM3−エンドペプチダーゼ結合CM−セフアデツ
クスＣ−25を得た。 実施例１ GMP3−Ａ，GMP4−Ａ，GMP3−Ｂ
及びGMP4−Ｂの製造 参考例５で得られた精製細胞壁43ｇをトリス−
塩酸緩衝液（PH8.5、最終濃度0.02M）に懸濁し、
超音波処理により充分に分散させ、120℃で10分
間加熱処理をする。冷後、参考例４で得られた
M1−アセチルムラミダーゼ43mgおよび窒化ナト
リウム280mgを加え、脱イオン水を加えて総量を
4.3となし、37℃で24時間温置する。次いで参
考例２で得られたSK−エンドペプチダーゼ105mg
を加え同温度で24時間撹拌した後、100℃、２分
間の加熱により反応を停止させる。反応混液を冷
却遠心（9000×ｇ、30分）して不溶物を除き、そ
の上清をECTEOLA−セルロース（ブラウン社）
のカラム（5.6×50cm）に通し、非吸着部分を50
℃以下で減圧濃縮する。濃縮液をセフアデツクス
Ｇ−50（5.6×83cm）とセフアデツクスＧ−25（5.6
×77cm）の連結カラムに通し、中分子量画分を集
めて50℃以下で減圧濃縮する。この濃縮液をダウ
エツクス50W×２（Na+タイプ、ダウケミカル社）
にかけ、非吸着部分を同様に濃縮する。濃縮液を
シリカドライカラム（７×70cm）に通し、70％プ
ロパノール700mlで展開し、GMP3−Ａ，GMP4
−Ａ，GMP3−Ｂ及びGMP4−Ｂ混在画分を集め
濃縮する。この濃縮液を更にシリカドライカラム
（ナイロン製）に付し、イソ酪酸−0.5M
NH4OH（５：3V／Ｖ）で展開した後、ドライカ
ラムを適当な長さに輪切りする。次いで各輪切画
分の一部を取り、薄層クロマトグラフイーに付
し、上記イソ酪酸−NH4OHで展開し、いずれの
輪切画分にペプチドグリカンが存在するかを確認
する。薄層クロマト的に単一のペプチドグリカン
が含まれる２群の輪切画分を集め、エーテル処理
をしてイソ酪酸を除去した後、水で抽出する。抽
出液を濃縮し、ゲル過により脱塩する。得られ
たGMP3−，GMP4−Ａ混在画分及びGMP3−，
GMP4−Ｂ混在画分をそれぞれCM−セフアデツ
クスＣ−25（H+タイプ）のカラム（4.5×30cm）
に付し、次いで0.5×10-3N塩酸2.0で溶出して、
GMP3−Ａ，GMP4−Ａ及びGMP3−Ｂ，GMP4
−Ｂを分画する。各化合物を主として含有する画
分を集め、0.01N NaOHで注意深く中和した後、
50℃以下で減圧濃縮する。次いで、セフアデツク
スＧ−25のカラム（5.0×80cm）でのゲル過に
より脱塩し、50℃以下で減圧濃縮した後、凍結乾
燥してGMP3−Ａ，GMP4−Ａ，GMP3−Ｂ，
GMP4−Ｂをそれぞれ0.7ｇ，0.7ｇ，1.6ｇ，1.4ｇ
得た。 これら４化合物の理化学的性質及び化学分析の
結果を第９表に示す。
【表】
【表】 また、４化合物にＮ−アセチルムラミル−Ｌ−
アラニンアミダーゼを作用させて得られた分解産
物及びそれらについての分析結果を第10表に示
す。なお、分析は公知の方法に従つて行い、構造
の決定は機器分析（MS，GCMS，NMR，IR，
UV）及び酵素的分析により行つた。
【表】
【表】 実施例２ GMP3−Ａ，GMP4−Ａ，GMP3−Ｂ
及びGMP4−Ｂの製造 参考例５に記載の方法で得られたラクトバシラ
ス・プランタラムATCC 8014の精製細胞壁1200
ｇをリン酸緩衝液（PH8.0、最終濃度0.04M）30
に懸濁し、M1−アセチルムラミダーゼ2.4ｇ、
クロロホルム50ml，CoCl2・6H2O 14.3ｇ，AM3
−エンドペプチダーゼ0.58ｇを加え、更に常水を
加えて60とし、37℃で24時間撹拌する。反応液
に濃塩酸を加えてPH2.5〜3.0に調整し、不溶物を
遠心除去する。上清液を希NaOHで注意深く中
和した後、ダイアイオン PA 316（Cl-タイプ、
三菱化成）のカラム（10×140cm）に通し、夾雑
物を吸着除去する。非吸着画分をダイアイオン
K212（H+タイプ、三菱化成）のカラム（14×190
cm）に付し、次いで0.3M食塩水で溶出する。得
られた画分を希NaOHで注意深く中和した後、
シリカゲル（キーゼルゲル60，メルク社）のカラ
ム（5.0×50cm）に付す。カラムをクロロホルム
−メタノール−水（15：10：２）10で洗浄し、
次いでクロロホルム−メタノール−水（10：10：
２）15でGMP3−，GMP4−Ｂ混在画分を溶出
させ、次いでメタノール10でGMP3−，GMP4
−Ａ混在画分を溶出させる。両画分を50℃以下で
減圧濃縮後、それぞれをダイアイオンHP−20
（三菱化成）のカラム（20×135cm）に付す。常水
10、次いで５％メタノール10で溶出すると、
水溶出画分からはGMP3−Ａ及びGMP3−Ｂが、
５％メタノール溶出画分からはGMP4−Ａ及び
GMP4−Ｂが得られる。このようにして得られた
GMP3−Ａ，GMP4−Ａ，GMP3−Ｂ，GMP4−
Ｂ画分をそれぞれ50℃以下で減圧濃縮後、CM−
セフアデツクス（H+タイプ）のカラム（15×135
cm）に付し、次いで0.5×10-3N塩酸10で溶出
する。得られた画分を希NaOHで中和した後、
50℃以下で減圧濃縮し、次いでセフアデツクスＧ
−25のカラム（6.0×160cm）でのゲル過により
脱塩する。溶出液を50℃以下で減圧濃縮し、凍結
乾燥してGMP3−Ａ，GMP4−Ａ，GMP3−Ｂ，
GMP4−Ｂをそれぞれ38ｇ，38ｇ，67.8ｇ，56.2
ｇ得た。 実施例３ GMP3−Ａ及びGMP4−Ａの製造 参考例６に記載の方法で得られたラクトバシラ
ス・プランタラムATCC 8014のアルカリ処理細
胞壁1200ｇをリン酸緩衝液（PH8.5，最終濃度
0.02M）30に懸濁し、よく分散させた後、M1
−アセチルムラミダーゼ2.4ｇ，クロロホルム50
ml，CoCl2・6H2O 14.3ｇ，参考例８に記載の方
法で得られた固定化AM3−エンドペプチダーゼ
1.0ｇ（乾燥重量）を加え、更に常水を加えて60
とし、37℃で48時間撹拌する。反応液を脱水機
に付して固定化酵素を除去した後、上清液を濃塩
酸でPH2.5〜3.0に調整し、生じた沈殿を高速遠心
で除去する。上清液を希NaOHで注意深く中和
した後、ダイアイオン PA 316（Cl-タイプ）の
カラム（10×140cm）に通し、夾雑物を吸着除去
する。非吸着画分をダイアイオンPK212（H+タイ
プ）のカラム（14×190cm）に付し、次いで0.3M
食塩水で溶出する。得られた画分を希NaOHで
中和した後、ダイアイオンHP−20のカラム（20
×135cm）に付し、水で溶出されるGMP3−Ａと
５％メタノールで溶出されるGMP4−Ａに分画す
る。このようにして得られたGMP3−Ａ，GMP4
−Ａ画分をそれぞれ逆浸透装置（RO−モジユー
ルRT−１、住友化学）で脱塩濃縮した後、CM
−セフアデツクス（H+タイプ）のカラム（15×
135cm）に付し、次いで0.001N塩酸10で溶出す
る。得られた画分を希NaOHで中和した後、50
℃以下で減圧濃縮し、次いでセフアデツクスＧ−
25のカラム（6.0×160cm）でのゲル過により脱
塩する。溶出液を50℃以下で減圧濃縮し、凍結乾
燥してGMP3−Ａ，GMP4−Ａをそれぞれ110ｇ，
90ｇを得た。 実施例４ GMP3−Ａ及びGMP4−Ａの製造 参考例７に記載の方法で得られたラクトバシラ
ス・プランタラムATCC 8014のアルカリ処理細
胞壁1200ｇをリン酸緩衝液（PH8.5、最終濃度
0.02M）30に懸濁し、よく分散させた後、M1
−アセチルムラミダーゼ2.4ｇ，クロロホルム50
mlを加え、更に常水を加えて60とし、37℃で24
時間撹拌する。反応液を濃塩酸でPH2.5〜3.0に調
整し、生じた沈殿を高速遠心で除去する。上清液
を濃NaOHで中和した後、ダイアイオンPA316
（Cl-タイプ）のカラム（10×140cm）に通し、夾
雑物を吸着除去する。非吸着画分を電気透析器
（セレミオン透析槽DU−Ob型）により脱塩した
後、塩酸でPH6.5に調整する。参考例９に記載の
方法で得られたAM3−エンドペプチダーゼ結合
CM−セフアデツクスＣ−25をカラム（10×100
cm）に充填し、37℃に保温しながら、上記溶液を
流速100ml／分で通す。この操作を２〜３回くり
返す。得られた反応液をダイアイオンPK212（H+
タイプ）のカラム（14×190cm）に付し、次いで
0.3M食塩水20で溶出する。得られた画分を希
NaOHで中和した後、ダイアイオンHP−20のカ
ラム（20×135cm）に付し、以後実施例３と同様
に処理してGMP3−Ａ，GMP4−Ａをそれぞれ
100ｇ，80ｇ得た。 実施例５ GMP3−Ｂ及びGMP4−ＢからGMP3
−Ａ及びGMP4−Ａへの変換 GMP3−B1000mgを0.1N塩酸10mlに溶解し、60
℃で８時間加熱する。冷後、反応液を希NaOH
でPH6.0に調整し、50℃以下で減圧濃縮した後、
セフアデツクスＧ−25のカラムでのゲル過によ
り脱塩する。溶出液を50℃以下で減圧濃縮し、凍
結乾燥してGMP3−A960mgを得た。 GMP4−Ｂ 1000mgを用い、上記と同様に反応
処理してGMP4−Ａ 966mgを得た。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 細胞壁構築成分として、アミノ基がアセチル
    化されたムラミン酸部分、イソグルタミン及びア
    ミド化されたカルボキシ基を有するメソ−２，６
    ジアミノピメリン酸を含む細菌の細胞壁に、スト
    レプトミセス・グロビスポラス（Streptomyces
    globisporus）由来のＮ−アセチルムラミダーゼ
    及びストレプトミセス・ニトロスポレウスSK
    （Streptomyces nitrosporeus SK）又はストレ
    プトミセス・グロビスポラス由来のＤ−アラニル
    −メソ−２，６−ジアミノピメリン酸エンドペプ
    チダーゼを作用させ、更に必要に応じて加水分解
    することを特徴とする一般式 （式中、R1は水素原子又はアセチル基を意味
    し、R2はヒドロキシ基又は１−カルボキシエチ
    ルアミノ基を意味する。） で表わされるジサツカライドトリペプチド及びジ
    サツカライドテトラペプチド並びにその塩の製
    法。
JP57009237A 1982-01-22 1982-01-22 ジサツカライドトリペプチド及びジサツカライドテトラペプチドの製法 Granted JPS58126797A (ja)

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