CN108822120A - Fl118氨基酸盐酸盐及其制备方法与应用 - Google Patents
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
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Abstract
一种式(I)所示的FL118氨基酸盐酸盐，由氨基酸配体基团与FL118进行偶联得到的新衍生物，再经进一步反应形成盐酸盐而得，本发明FL118氨基酸盐酸盐的制备方法反应条件温和、经济高效、收率好且产品质量佳，同时反应三废污染少，适合工业化生产；本发明FL118氨基酸盐酸盐具有更良好的水溶性，更高的活性，稳定性和生物利用度等，有利于确定药物的给药方式，减少给药次数，可制备用于治疗哺乳动物受试者体内与拓扑异构酶I相关的疾病的药物，并且可制备用于针对哺乳动物受试者体内实体肿瘤的药物；
Description
(一)技术领域
本发明涉及一系列抗肿瘤化合物FL118的氨基酸盐酸盐及其制备方法与应用。
(二)背景技术
罗斯威尔·帕克癌症研究所(RPCI)的科学家在2012年发现FL118(10,11-亚甲二氧基-20(S)-喜树碱)能抑制几个与癌细胞生存和繁殖能力密切相关的基因。其分子结构类似于喜树碱，研究报道了FL118制剂内酯环中羟基基团的构效关系，他们分析了FL118其它几种由FL118衍生的化合物，FL118不管是在体内还是在体外都可以高效地抑制癌症生存蛋白，且FL118的存在促使癌症细胞死亡独立于肿瘤抑制基因p53，对肿瘤细胞的体内外抑制活性均极好，可能会成为早期和晚期癌、转移性或非转移性癌症的有效控制药物。
氨基酸是生命活动中最基本的物质，是生命代谢的物质基础，肿瘤细胞对氨基酸的需求远大于正常组织。氨基酸具有多个活性官能团，可以用来固定具有生物活性的分子，如蛋白质、糖类、多肽等，其支链可以与小肽、药物或交联剂等连接，促进细胞的黏附和生长。实验表明将氨基酸引入抗肿瘤药物分子中，可以提高其对肿瘤细胞的选择性，缓解药物对细胞的毒性等。基于FL118水溶性前药的设计需求，氨基酸盐酸盐作为水溶性配基是体内内源性物质，无毒副作用，已经广泛应用于其他药物的水溶性前药设计，结合抗肿瘤化合物FL118的结构特点和构效关系，用氨基酸对FL118的20位进行结构修饰形成水溶性前药得到更有利于癌症患者的高效、低毒的抗肿瘤前药。
(三)发明内容
在深入研究FL118及其衍生物后，发明人发现用氨基酸配体基团与FL118进行偶联得到的新衍生物，再经进一步反应形成盐酸盐形式，所得到的FL118氨基酸盐酸盐具有更良好的水溶性，更高的活性，稳定性和生物利用度等，有利于确定药物的给药方式，减少给药次数，有望开发成新一代抗肿瘤药物。
本发明的技术方案如下：
一种式(I)所示的FL118氨基酸盐酸盐：
式(I)中，R选自如下之一天然氨基酸取代基：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸或赖氨酸取代基；结构式为(波浪线处表示与FL118的连接位点)：
本发明还提供了所述式(I)所示的FL118氨基酸盐酸盐的制备方法，所述制备方法为：
(1)将式(II)所示FL118、BOC(叔丁氧羰基)保护的氨基酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)与反应溶剂混合，在15～50℃下搅拌反应，TLC监测至反应结束，反应液经后处理，得到偶联产物；
(2)将步骤(1)所得偶联产物溶于甲醇中，通入HCl气体，TLC监测至反应结束，反应液经后处理，得到式(I)所示的FL118氨基酸盐酸盐。
本发明所述步骤(1)中，
所述反应溶剂为氯仿或二氯甲烷，优选氯仿；
所述反应溶剂的体积用量以FL118的物质的量计为1～10mL/mmol，优选3～5mL/mmol；
所述FL118与BOC保护的氨基酸的物质的量之比为1：1～10，优选1：3；
所述FL118与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的物质的量之比为1：1～5，优选1：3；
所述4-二甲氨基吡啶的质量用量以FL118的物质的量计为1～20mg/mmol，优选5～10mg/mmol；
更为具体的，推荐步骤(1)按如下方法进行：
室温下，先将BOC保护的氨基酸溶于氯仿中，溶解完全后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，搅拌30min，再加入4-二甲氨基吡啶，继续搅拌30min，最后加入FL118，于25℃下搅拌反应3h，之后反应液经后处理，得到偶联产物；
所述反应液后处理的方法为：反应结束后，向反应液中加入反应液体积1～5倍(优选3倍)的氯仿或二氯甲烷(优选氯仿)，抽滤，滤液依次用饱和氯化钠水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，再用无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液减压浓缩至干，所得浓缩物进行硅胶柱层析，洗脱剂为二氯甲烷与甲醇体积比100：1的混合液，收集含目标化合物的洗脱液，蒸除溶剂并干燥，得到深黄色偶联产物。
本发明所述步骤(2)中，
所述甲醇的体积用量以偶联产物的质量计为30～100mL/g，优选50mL/g；
所述HCl气体由浓硫酸(98wt％)与氯化钠反应所得，并可通过控制浓硫酸滴入氯化钠的速度来调节氯化氢气体的流速；
所述反应液后处理的方法为：反应结束后，反应液减压蒸干，剩余物质用无水甲醇和乙醚重结晶，得到式(I)所示的FL118氨基酸盐酸盐。
所述FL118的结构式如式(II)所示：
所述BOC保护的氨基酸的结构式为如下之一所示：
所述偶联产物的结构式如下之一所示：
本发明制得的FL118氨基酸盐酸盐及其与人体可接受的药用载体制成的药物组合物可应用于制备治疗哺乳动物受试者体内与拓扑异构酶I相关的疾病的药物，或者应用于制备针对哺乳动物受试者体内实体肿瘤的药物。
本发明的有益效果在于：本发明FL118氨基酸盐酸盐的制备方法反应条件温和、经济高效、收率好且产品质量佳，同时反应三废污染少，适合工业化生产。本发明FL118氨基酸盐酸盐可制备用于治疗哺乳动物受试者体内与拓扑异构酶I相关的疾病的药物。本发明FL118氨基酸盐酸盐可制备用于针对哺乳动物受试者体内实体肿瘤的药物。
(四)具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：FL118甘氨酸盐酸盐衍生物的制备(1)
在25mL圆底烧瓶中加入BOC保护甘氨酸(10mmol)和氯仿(20mL)，25℃搅拌溶解，再加入EDCI(10mmol)，25℃搅拌0.5h，接着加入DMAP(50mg)，25℃搅拌0.5h，最后加入FL118(3mmol)，25℃搅拌反应3h，得到淡黄色悬浊液，反应结束后，向反应液中加入氯仿(40mL)，抽滤，滤液依次用饱和氯化钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，再用无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液减压浓缩至干，所得浓缩物进行硅胶柱层析，洗脱剂为体积比100:1的二氯甲烷与甲醇混合液，收集含目标组分的洗脱液，浓缩干燥后将反应液产物溶于25ml有机溶剂甲醇中，在氯化氢气体的作用下，反应液颜色发生变化，TLC跟踪监测40分钟至反应不再进行，甲醇反应液后处理，反应液真空干燥后加入无水甲醇和乙醚重结晶。即得FL118甘氨酸盐酸盐衍生物，产率70％。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:8.58(s,3H),8.47(s,1H),7.50(s,1H),7.43(s,1H),7.20(s,1H),6.29(d,J＝1.6Hz,2H),5.53(s,2H),5.19(m,2H),3.66(m,2H),2.18(m,2H),0.96(t,J＝7.4Hz,3H).
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ:167.30,167.28,156.92,152.00,150.02,149.23,146.84,146.80,145.14,130.87,128.85,126.17,118.45,104.77,103.64,103.18,95.23,77.93,66.80,50.61,40.40,30.66,8.02.
实施例2：FL118丙氨酸盐酸盐衍生物的制备(2)
在25mL圆底烧瓶中加入BOC保护丙氨酸(10mmol)和氯仿(20mL)，25℃搅拌溶解，再加入EDCI(10mmol)，25℃搅拌0.5h，接着加入DMAP(50mg)，25℃搅拌0.5h，最后加入FL118(3mmol)，25℃搅拌反应3h，得到淡黄色悬浊液，反应结束后，向反应液中加入氯仿(40mL)，抽滤，滤液依次用饱和氯化钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，再用无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液减压浓缩至干，所得浓缩物进行硅胶柱层析，洗脱剂为体积比100:1的二氯甲烷与甲醇混合液，收集含目标组分的洗脱液，浓缩干燥后将反应液产物溶于25ml有机溶剂甲醇中，在氯化氢气体的作用下，反应液颜色发生变化，TLC跟踪监测40分钟至反应不再进行，甲醇反应液后处理，反应液真空干燥后加入无水甲醇和乙醚重结晶。即得FL118丙氨酸盐酸盐衍生物，产率75％。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:8.92(s,2H),8.79(s,1H),8.48(d,J＝3.5Hz,1H),7.52(d,J＝4.0Hz,1H),7.44(d,J＝6.4Hz,1H),7.17(d,J＝12.1Hz,1H),6.29(d,J＝4.2Hz,2H),5.53(m,2H),5.21(d,J＝5.1Hz,2H),3.90(m,1H),2.25(m,2H),1.59(m,3H),0.96(td,J＝7.4,5.5Hz,3H).
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ:169.06,167.17,156.92,151.98,150.03,149.23,146.96,146.89,144.87,130.87,128.88,126.22,118.57,104.94,103.65,103.17,94.79,77.92,66.86,50.66,48.25,31.19,16.29,8.04.
实施例3：FL118缬氨酸盐酸盐衍生物的制备(3)
在25mL圆底烧瓶中加入BOC保护缬氨酸(10mmol)和氯仿(20mL)，25℃搅拌溶解，再加入EDCI(10mmol)，25℃搅拌0.5h，接着加入DMAP(50mg)，25℃搅拌0.5h，最后加入FL118(3mmol)，25℃搅拌反应3h，得到淡黄色悬浊液，反应结束后，向反应液中加入氯仿(40mL)，抽滤，滤液依次用饱和氯化钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，再用无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液减压浓缩至干，所得浓缩物进行硅胶柱层析，洗脱剂为体积比100:1的二氯甲烷与甲醇混合液，收集含目标组分的洗脱液，浓缩干燥后将反应液产物溶于25ml有机溶剂甲醇中，在氯化氢气体的作用下，反应液颜色发生变化，TLC跟踪监测40分钟至反应不再进行，甲醇反应液后处理，反应液真空干燥后加入无水甲醇和乙醚重结晶。即得FL118缬氨酸盐酸盐衍生物，产率72％。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:8.96(s,3H),8.50(d,J＝5.8Hz,1H),7.55(s,1H),7.43(s,1H),7.32(s,1H),6.30(s,2H),5.50(m,2H),5.26(m,2H),4.10(s,1H),2.22(m,2H),1.17(d,J＝7.0Hz,1H),1.10(dd,J＝14.9,7.0Hz,3H),1.05(d,J＝7.0Hz,3H),0.95(t,J＝7.3Hz,3H).
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ:167.54,167.13,156.93,151.88,150.21,149.15,147.00,146.89,144.84,131.22,128.85,126.16,118.51,104.97,103.68,103.12,95.58,78.14,66.84,57.46,54.32,31.21,30.34,18.42,8.10.
实施例4：FL118亮氨酸盐酸盐衍生物的制备(4)
在25mL圆底烧瓶中加入BOC保护亮氨酸(10mmol)和氯仿(20mL)，25℃搅拌溶解，再加入EDCI(10mmol)，25℃搅拌0.5h，接着加入DMAP(50mg)，25℃搅拌0.5h，最后加入FL118(3mmol)，25℃搅拌反应3h，得到淡黄色悬浊液，反应结束后，向反应液中加入氯仿(40mL)，抽滤，滤液依次用饱和氯化钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，再用无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液减压浓缩至干，所得浓缩物进行硅胶柱层析，洗脱剂为体积比100:1的二氯甲烷与甲醇混合液，收集含目标组分的洗脱液，浓缩干燥后将反应液产物溶于25ml有机溶剂甲醇中，在氯化氢气体的作用下，反应液颜色发生变化，TLC跟踪监测40分钟至反应不再进行，甲醇反应液后处理，反应液真空干燥后加入无水甲醇和乙醚重结晶。即得FL118亮氨酸盐酸盐衍生物，产率76％。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:8.82(s,1H),8.65(d,J＝5.4Hz,2H),8.49(s,1H),7.53(d,J＝1.3Hz,1H),7.43(s,1H),7.21(d,J＝7.1Hz,1H),6.30(s,2H),5.52(d,J＝5.1Hz,2H),5.25(m,2H),4.41(m,1H),2.19(m,2H),1.83(m,1H),1.74(m,1H),1.21(m,1H),0.99(m,9H).
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ:169.68,167.22,156.93,151.96,150.13,149.20,146.91,146.91,145.41,130.75,128.79,126.11,118.16,104.83,103.62,103.17,95.23,78.03,66.80,50.58,50.55,40.65,30.70,24.29,22.64,22.58,8.13.
实施例5：FL118异亮氨酸盐酸盐衍生物的制备(5)
在25mL圆底烧瓶中加入BOC保护异亮氨酸(10mmol)和氯仿(20mL)，25℃搅拌溶解，再加入EDCI(10mmol)，25℃搅拌0.5h，接着加入DMAP(50mg)，25℃搅拌0.5h，最后加入FL118(3mmol)，25℃搅拌反应3h，得到淡黄色悬浊液，反应结束后，向反应液中加入氯仿(40mL)，抽滤，滤液依次用饱和氯化钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，再用无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液减压浓缩至干，所得浓缩物进行硅胶柱层析，洗脱剂为体积比100:1的二氯甲烷与甲醇混合液，收集含目标组分的洗脱液，浓缩干燥后将反应液产物溶于25ml有机溶剂甲醇中，在氯化氢气体的作用下，反应液颜色发生变化，TLC跟踪监测40分钟至反应不再进行，甲醇反应液后处理，反应液真空干燥后加入无水甲醇和乙醚重结晶。即得FL118异亮氨酸盐酸盐衍生物，产率70％。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:8.67(s,3H),8.42(m,1H),7.39(m,2H),7.19(m,1H),6.23(s,2H),5.48(d,J＝5.2Hz,2H),5.12(d,J＝6.8Hz,2H),4.35(m,1H),2.18(m,2H),1.33(m,1H),1.04(m,2H),0.93(m,9H).
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ:167.83,167.22,157.07,152.01,149.67,149.24,146.81,146.78,144.72,130.91,128.58,126.17,118.62,104.64,103.56,103.18,95.29,78.22,66.97,56.91,50.64,36.71,30.82,24.90,14.72,12.02,7.92.
实施例6：FL118甲硫氨酸盐酸盐衍生物的制备(6)
在25mL圆底烧瓶中加入BOC保护甲硫氨酸(10mmol)和氯仿(20mL)，25℃搅拌溶解，再加入EDCI(10mmol)，25℃搅拌0.5h，接着加入DMAP(50mg)，25℃搅拌0.5h，最后加入FL118(3mmol)，25℃搅拌反应3h，得到淡黄色悬浊液，反应结束后，向反应液中加入氯仿(40mL)，抽滤，滤液依次用饱和氯化钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，再用无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液减压浓缩至干，所得浓缩物进行硅胶柱层析，洗脱剂为体积比100:1的二氯甲烷与甲醇混合液，收集含目标组分的洗脱液，浓缩干燥后将反应液产物溶于25ml有机溶剂甲醇中，在氯化氢气体的作用下，反应液颜色发生变化，TLC跟踪监测40分钟至反应不再进行，甲醇反应液后处理，反应液真空干燥后加入无水甲醇和乙醚重结晶。即得FL118甲硫氨酸盐酸盐衍生物，产率71％。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:8.96(m,2H),8.75(d,J＝5.7Hz,1H),8.47(s,1H),7.50(m,1H),7.42(m,1H),7.23(m,1H),6.29(dd,J＝6.7Hz,J＝2.0Hz,2H),5.53(m,2H),5.21(m,2H),3.68(m,1H),3.00(m,2H),2.21(m,3H),2.07(m,2H),0.97(m,3H).
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ:168.17,167.22,156.93,151.97,150.10,149.23,147.00,146.95,145.27,130.78,128.89,126.20,118.46,104.88,103.66,103.15,95.08,78.37,66.90,51.43,50.68,30.32,28.71,14.75,8.07.
实施例7：FL118谷氨酸盐酸盐衍生物的制备(7)
在25mL圆底烧瓶中加入BOC保护谷氨酸(10mmol)和氯仿(20mL)，25℃搅拌溶解，再加入EDCI(10mmol)，25℃搅拌0.5h，接着加入DMAP(50mg)，25℃搅拌0.5h，最后加入FL118(3mmol)，25℃搅拌反应3h，得到淡黄色悬浊液，反应结束后，向反应液中加入氯仿(40mL)，抽滤，滤液依次用饱和氯化钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，再用无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液减压浓缩至干，所得浓缩物进行硅胶柱层析，洗脱剂为体积比100:1的二氯甲烷与甲醇混合液，收集含目标组分的洗脱液，浓缩干燥后将反应液产物溶于25ml有机溶剂甲醇中，在氯化氢气体的作用下，反应液颜色发生变化，TLC跟踪监测40分钟至反应不再进行，甲醇反应液后处理，反应液真空干燥后加入无水甲醇和乙醚重结晶。即得FL118谷氨酸盐酸盐衍生物，产率76％。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:8.84(s,3H),8.45(s,1H),7.47(m,2H),7.14(s,1H),6.29(s,2H),5.53(s,2H),5.17(d,J＝11.6Hz,2H),4.56(s,1H),3.63(s,2H),2.76(m,1H),2.20(m,3H),0.95(m,3H).
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ:172.73,169.02,167.41,156.93,151.94,150.10,149.18,146.98,146.94,145.19,130.75,128.78,126.11,118.14,104.91,103.62,103.20,95.07,78.14,66.89,52.11,51.22,30.69,29.16,25.85,8.10.
实施例8：FL118苯丙氨酸盐酸盐衍生物的制备(8)
在25mL圆底烧瓶中加入BOC保护苯丙氨酸(10mmol)和氯仿(20mL)，25℃搅拌溶解，再加入EDCI(10mmol)，25℃搅拌0.5h，接着加入DMAP(50mg)，25℃搅拌0.5h，最后加入FL118(3mmol)，25℃搅拌反应3h，得到淡黄色悬浊液，反应结束后，向反应液中加入氯仿(40mL)，抽滤，滤液依次用饱和氯化钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，再用无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液减压浓缩至干，所得浓缩物进行硅胶柱层析，洗脱剂为体积比100:1的二氯甲烷与甲醇混合液，收集含目标组分的洗脱液，浓缩干燥后将反应液产物溶于25ml有机溶剂甲醇中，在氯化氢气体的作用下，反应液颜色发生变化，TLC跟踪监测40分钟至反应不再进行，甲醇反应液后处理，反应液真空干燥后加入无水甲醇和乙醚重结晶。即得FL118苯丙氨酸盐酸盐衍生物，产率77％。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:8.92(m,2H),8.76(m,1H),8.50(m,2H),8.01(t,J＝6.8Hz,1H),7.43(m,7H),6.30(d,J＝2.2Hz,1H),5.51(m,2H),5.21(m,2H),4.61(s,1H),3.30(m,2H),2.04(m,2H),0.76(m,3H).
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ:168.04,167.22,156.94,151.98,150.20,149.25,147.04,146.93,144.66,135.39,130.78,129.99,129.08,128.85,127.36,126.21,118.46,105.00,103.68,103.16,95.27,78.32,66.84,53.23,50.69,36.39,30.42,7.80.
实施例9：FL118脯氨酸盐酸盐衍生物的制备(9)
在25mL圆底烧瓶中加入BOC保护脯氨酸(10mmol)和氯仿(20mL)，25℃搅拌溶解，再加入EDCI(10mmol)，25℃搅拌0.5h，接着加入DMAP(50mg)，25℃搅拌0.5h，最后加入FL118(3mmol)，25℃搅拌反应3h，得到淡黄色悬浊液，反应结束后，向反应液中加入氯仿(40mL)，抽滤，滤液依次用饱和氯化钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，再用无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液减压浓缩至干，所得浓缩物进行硅胶柱层析，洗脱剂为体积比100:1的二氯甲烷与甲醇混合液，收集含目标组分的洗脱液，浓缩干燥后将反应液产物溶于25ml有机溶剂甲醇中，在氯化氢气体的作用下，反应液颜色发生变化，TLC跟踪监测40分钟至反应不再进行，甲醇反应液后处理，反应液真空干燥后加入无水甲醇和乙醚重结晶。即得FL118苯丙氨酸盐酸盐衍生物，产率77％。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:10.10(d,J＝6.4Hz,1H),9.00(d,J＝6.2Hz,1H),8.49(s,1H),7.54(s,1H),7.45(s,1H),7.22(s,1H),6.30(s,2H),5.54(d,J＝2.3Hz,2H),5.24(d,J＝3.8Hz,2H),4.91(m,1H),3.22(d,J＝8.4Hz,2H),2.41(m,1H),2.20(m,3H),2.02(m,1H),1.91(m,1H),0.97(t,J＝7.4Hz,3H).
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ:168.99,167.36,156.95,151.97,150.11,149.23,146.96,146.89,145.51,130.80,128.92,126.19,117.97,104.88,103.65,103.15,95.14,78.44,66.79,58.83,50.67,45.63,30.43,28.66,23.07,8.12.
实施例10：FL118赖氨酸盐酸盐衍生物的制备(10)
在25mL圆底烧瓶中加入(S)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸(15mmol)和二氯甲烷(10mL)，30℃搅拌溶解，再加入EDCI(15mmol)，30℃搅拌0.5h，接着加入DMAP(50mg)，30℃搅拌0.5h，最后加入FL118(5mmol)，30℃搅拌反应3h，得到淡黄色悬浊液，反应结束后，向反应液中加入二氯甲烷(20mL)，抽滤，滤液依次用饱和氯化钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，再用无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液减压浓缩至干，所得浓缩物进行硅胶柱层析，洗脱剂为体积比100:1的二氯甲烷与甲醇混合液，收集含目标组分的洗脱液，浓缩干燥后将反应液产物溶于20ml有机溶剂甲醇中，在氯化氢气体的作用下，反应液颜色发生变化，TLC跟踪监测60分钟至反应不再进行，甲醇反应液后处理，反应液真空干燥后加入无水甲醇和乙醚重结晶。即得FL118赖氨酸盐酸盐衍生物，产率70％。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:8.93(d,J＝5.6Hz,1H),8.73(d,J＝5.6Hz,2H),8.48(s,1H),8.10(s,2H),7.53(d,J＝2.5Hz,1H),7.45(d,J＝13.9Hz,1H),7.21(m,1H),6.30(s,2H),5.54(m,2H),5.23(m,2H),4.49(m,1H),2.79(m,2H),2.24(m,2H),2.00(m,2H),1.67(m,4H),0.96(t,J＝7.4Hz,3H).
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ:169.34,167.31,156.92,152.02,150.10,149.25,146.93,145.21,144.82,130.84,128.89,126.19,118.26,104.86,103.66,103.16,95.14,78.02,66.88,51.67,50.64,38.65,30.75,29.83,26.68,21.50,8.14.
实施例11：式(I)所示化合物对肿瘤细胞增殖抑制活性
(1)实验原理：MTT法是一种从数量上检测细胞相对存活率的方法。只有活细胞的线粒体中才存在琥珀酸脱氢酶，该酶具有将MTT还原为甲臜(Formazan)结晶的能力，而死细胞无此功能。该甲臜晶体呈蓝紫色且不溶于水，用二甲基亚矾或酸性异丙醇将其溶解后，在560nm处测定其光吸收值OD，吸光值的大小能够间接反映活细胞数量，并计算出细胞的存活率。在一定细胞数量范围内，MTT结晶形成的量与活细胞数量成正比，即可预测药物对细胞活性的影响。本实验通过MTT法检测药物细胞毒性试验来确定药物最大毒性剂量。
(2)实验材料：人肺癌细胞(A549)、人结肠癌细胞(HCT116)、人肝癌细胞(HepG-2)，人子宫颈癌细胞(Hela)从中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库购买。
(3)实验步骤及检测方法：
(a)配制PBS缓冲液(pH7.2-7.4)：10ml 10×PBS缓冲液加无菌水至100ml，4℃保存备用。配制MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50mlPBS缓冲液在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃保存备用。
(b)待实验细胞培养至80-90％左右融合时，用胰蛋白酶-EDTA(0.02％)将细胞消化下来，取20μL消化后的细胞悬液(2mL)加入到180μL DMEM培养基中，吹散，取吹打均匀后的细胞悬液10μL加入到血细胞计数板的计数室中，低倍镜下观察，计数。计算单个发亮圆球的数量，抱团细胞计作一个细胞，对于占线细胞，只数左边线和上边线上的。调节细胞密度为2×105cell/mL，将细胞接种于96孔板内，每孔200μL，放入培养箱中培养24h。
(c)将FL118及其衍生物初步溶解于DMSO中，配制成浓度为1mM的母液。给药前用含1％FBS的完全DMEM培养基稀释成0.008,0.04,0.20,1.00,5.00,10.00μM(HCT116细胞系、HepG-2细胞系)/0.032,0.16,0.8,4.00,10.00,20.00μM(A549细胞系、Hela细胞系)浓度梯度的药物溶液。
(d)待细胞达80％融合时，弃上清，实验孔每孔加入200μL不同药物溶液，每个样品浓度设置3个平行孔，空白孔每孔加入200μL含1％FBS的完全DMEM培养基作为空白对照。将加好药的96孔板放入37℃，5％CO2的培养箱中继续培养72h，之后每孔加入20μL 5mg/mL的MTT溶液(PBS溶解)，继续培养4h。取出，小心弃上清，每孔加入150μL DMSO溶液溶解蓝紫色结晶产物。将96孔板放在微量振荡器上震荡溶解20分钟，用酶标仪设定参比波长为630nm，在570nm处检测吸光度OD值。取平均数，按下列公式算细胞存活率：
细胞存活率％＝(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100
Claims (9)
1.一种式(I)所示的FL118氨基酸盐酸盐：
式(I)中，R选自如下之一天然氨基酸取代基：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸或赖氨酸取代基；结构式为：
2.如权利要求1所述式(I)所示的FL118氨基酸盐酸盐的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：
(1)将式(II)所示FL118、BOC保护的氨基酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶与反应溶剂混合，在15～50℃下搅拌反应，TLC监测至反应结束，反应液经后处理，得到偶联产物；
所述反应溶剂为氯仿或二氯甲烷；
(2)将步骤(1)所得偶联产物溶于甲醇中，通入HCl气体，TLC监测至反应结束，反应液经后处理，得到式(I)所示的FL118氨基酸盐酸盐；
所述FL118的结构式如式(II)所示：
所述BOC保护的氨基酸的结构式为如下之一所示：
所述偶联产物的结构式如下之一所示：
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述反应溶剂的体积用量以FL118的物质的量计为1～10mL/mmol。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述FL118与BOC保护的氨基酸的物质的量之比为1：1～10。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述FL118与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的物质的量之比为1：1～5。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述4-二甲氨基吡啶的质量用量以FL118的物质的量计为1～20mg/mmol。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述甲醇的体积用量以偶联产物的质量计为30～100mL/g。
8.如权利要求1所述式(I)所示的FL118氨基酸盐酸盐及其与人体可接受的药用载体制成的药物组合物在制备治疗哺乳动物受试者体内与拓扑异构酶I相关的疾病的药物中的应用。
9.如权利要求1所述式(I)所示的FL118氨基酸盐酸盐及其与人体可接受的药用载体制成的药物组合物在制备针对哺乳动物受试者体内实体肿瘤的药物中的应用。
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