CN106317018B - 一种肿瘤靶向性亲脂性阳离子-苯丁酸氮芥化合物及制备方法和在白蛋白纳米药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域,公开了一种肿瘤靶向性亲脂性阳离子‑苯丁酸氮芥化合物及制备方法和在白蛋白纳米药物中的应用。该化合物具有如式(Ⅰ)所示的结构,其中,Y为F、Cl、Br或I;n为0或1~10之间的自然数。该化合物及其白蛋白纳米药物系统以癌细胞线粒体为靶点,靶向癌症治疗,克服抗癌药物选择性低和耐药多药性的问题,通过诱导细胞凋亡或死亡的途径达到清除癌细胞的效果。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,特别涉及一种肿瘤靶向性亲脂性阳离子(F)-苯丁酸氮芥化合物及制备方法和在白蛋白纳米药物中的应用。
背景技术
癌症是严重危害人类健康的一大顽症,现已成为仅次于心血管病的第二大杀手,所以寻找抗肿瘤药物和研究其作用机理,具有重要意义。
线粒体是细胞内重要的细胞器,在细胞代谢过程中扮演了重要角色,是生命体的“能量工厂”,参与了能量产生细胞凋亡、细胞癌变等多种代谢过程。线粒体结构和功能的改变,不仅会干扰细胞的生长、代谢和增殖过程,还会引起细胞凋亡。因此,以线粒体为靶点的新型抗肿瘤药物的研发,已成为一大研究热点。
亲脂性阳离子化合物(F)是近年来发现的一种高度疏水的、DLC(delocalizelipid cationic)药物,F系列化合物的核心结构是由乙烯基将一个吡啶环酮和一个吲哚环连接而成,如代表化合物F16的结构如下所示:
DLC能有效延长线粒体恢复周期,降低线粒体最大产热量和线粒体活性恢复期速率常数,DLC对于线粒体的作用机制是通过打开舌头转换孔道,破坏线粒体质子动力势,从而干扰线粒体代谢产热。
但是目前一些以线粒体为靶点治疗癌症的药物化合物,普遍存在选择性低和多耐药性及钝活等问题,如氮芥类药物,为此,开发一种基于DLC的F衍生型抗肿瘤药物成为十分必要。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足之处,本发明的首要目的在于提供一种肿瘤靶向性亲脂性阳离子-苯丁酸氮芥化合物。
本发明的再一目的在于提供一种上述肿瘤靶向性亲脂性阳离子-苯丁酸氮芥化合物的制备方法。
本发明的又一目的在于提供上述肿瘤靶向性亲脂性阳离子-苯丁酸氮芥化合物在白蛋白纳米药物系统中的应用;该化合物以线粒体为靶点治疗癌症,克服抗癌药物选择性低和多耐药性及钝活等问题,达到通过细胞凋亡的途径清除癌细胞的效果。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种肿瘤靶向性亲脂性阳离子-苯丁酸氮芥化合物,该化合物具有如式(Ⅰ)所示的结构:
其中,Y为F、Cl、Br或I;n为0或1~10之间的自然数。
上述的一种肿瘤靶向性亲脂性阳离子-苯丁酸氮芥化合物的制备方法,包括以下操作步骤:
(1)取芦竹碱与吡啶甲醛反应得到化合物c;
(2)将化合物c与化合物d反应,获得化合物e;
(3)将化合物e在二碳酸二叔丁酯保护下反应得到化合物g;
(4)将化合物g在卤代甲烷作用下反应得到化合物h;
(5)化合物h经盐酸脱保护反应得到化合物i;
(6)化合物i经与化合物j缩合反应即制得具有如式(Ⅰ)所示的结构的肿瘤靶向性亲脂性阳离子-苯丁酸氮芥化合物;
所述化合物c的结构为:
所述化合物d的结构为:其中X为卤基;
所述化合物e的结构为:
所述化合物g的结构为:
其中n为0或1~10之间的自然数;
所述化合物h的结构为:
其中Y为F、Cl、Br或I;n为0或1~10之间的自然数;
所述化合物i的结构为:
其中Y为F、Cl、Br或I;n为0或1~10之间的自然数;
所述化合物j的结构为:
步骤(1)所述反应具体按照以下步骤:将芦竹碱与吡啶甲醛溶于有机溶剂中,在三丁基膦(Bu3P)催化作用下,60℃加热回流反应过夜,反应完全后,冷却反应体系至室温,减压除去有机溶剂,浓缩得油状物,经硅胶色谱柱纯化即得产物c;所述芦竹碱、吡啶甲醛和三丁基膦的摩尔比为1:(2~6):(2~6);所述有机溶剂为无水甲醇、无水乙醇或无水乙腈;所述硅胶色谱柱纯化是采用体积比为(1~4):1的己烷/乙酸乙酯为洗脱液。
步骤(2)所述反应具体按照以下步骤:将化合物c和化合物d溶于溶剂中,加热回流反应,反应完全后,冷却反应体系至室温,过滤,再用上述溶剂洗涤;所述化合物d和化合物c的摩尔比为(1~3):1;所述溶剂是无水甲醇、无水乙醇或无水乙醚。
步骤(3)所述反应具体按照以下步骤:将化合物e、四氢呋喃、无水碳酸钠溶于水,室温搅拌后滴加二碳酸二叔丁酯,在25~30℃下反应4小时;过滤,将滤液旋干,然后加入二氯甲烷与无水溶剂进行搅拌,再过滤,将滤液旋干得到化合物g;所述化合物e、无水碳酸钠和二碳酸二叔丁酯的摩尔比为1:(2~5):(1~3);所述无水溶剂是无水甲醇、无水乙醇或无水乙醚;所述二氯甲烷与无水溶剂的体积比为25:1~35:1。
步骤(4)所述反应具体按照以下步骤:将N,N-二甲基甲酰胺和无水溶剂中的一种,与化合物g和卤代甲烷在室温下反应过夜,反应完全后,将反应体系旋干,于CHCl3和正己烷中重结晶,得到化合物h;所述化合物g和卤代甲烷的摩尔比为1:(1~2);所述无水溶剂是无水甲醇、无水乙醇或无水乙醚,所述N,N-二甲基甲酰胺为无水。
步骤(5)所述反应具体按照以下步骤:将化合物h溶解于甲醇中,室温滴加浓盐酸,室温反应2~7小时,将反应体系旋干得到化合物i。
步骤(6)所述反应具体按照以下步骤:将化合物i、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺在室温下搅拌,然后加入化合物j、以及2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯,在20~25℃反应,向反应体系中加入水,用二氯甲烷萃取,有机相再用水洗涤,干燥,浓缩过柱,制得具有如式(Ⅰ)所示的结构的肿瘤靶向性亲脂性阳离子-苯丁酸氮芥化合物;所述化合物i、N,N-二异丙基乙胺、化合物j和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的摩尔比为1:(3~5):(1.5~3):(1.5~3)。
上述具有如式(Ⅰ)所示的结构的肿瘤靶向性亲脂性阳离子-苯丁酸氮芥化合物的合成路径图如图1所示。
上述的肿瘤靶向性亲脂性阳离子-苯丁酸氮芥化合物在制备白蛋白纳米药物中的应用,其特征在于:所述白蛋白纳米药物按照以下方法制备得到:将肿瘤靶向性亲脂性阳离子-苯丁酸氮芥化合物溶解于DMSO中,滴加入含人血清白蛋白的磷酸缓冲液中,4~10℃下搅拌10~120min,磷酸缓冲溶液中透析24~48小时,得到肿瘤靶向性亲脂性阳离子-苯丁酸氮芥化合物的白蛋白纳米药物;所述含人血清白蛋白的磷酸缓冲液的pH为7.4,蛋白浓度为0.5~20mg/ml。
优选的,所述搅拌的时间为60min;所述透析的时间为30小时。
与现有技术药物苯丁酸氮芥相比,本发明具有以下优点及有益效果:(1)本发明化合物具有很强的癌细胞选择性和绿色荧光,可用于癌症的靶向治疗及其治疗的有效监控;(2)本发明化合物是两亲性化合物,自身可以组装成纳米胶束(micelle);(3)本发明化合物可以与人血清白蛋白、转铁蛋白等蛋白进行亲和结合而组装成纳米粒,且荧光显著增强,有利于药物的传递、体内成像和延长体内半衰期;(4)本发明化合物及其白蛋白纳米药物系统以癌细胞线粒体为靶点,可克服抗癌药物选择性低和耐药多药性的问题,通过诱导细胞凋亡或死亡的途径达到清除癌细胞的效果。
附图说明
图1为本发明所提供的具有如式(Ⅰ)所示的结构的肿瘤靶向性亲脂性阳离子-苯丁酸氮芥化合物的合成路径图。
图2为本发明实施例中制得F3CBL和F6CBL白蛋白纳米药物的水合粒径DLS图。
图3为本发明实施例1所制得F3CBL白蛋白纳米药物的透射扫描电镜TEM图。
图4为本发明实施例1所制得化合物F3CBL白蛋白纳米药物定位肿瘤细胞线粒体的激光共聚焦显微镜图。
图5为本发明实施例1所制得F3CBL白蛋白纳米药物在癌细胞HeLa和健康肝脏细胞L-O2的内吞情况流式细胞分析荧光比较图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1:
首先,取化合物1芦竹碱与化合物2吡啶甲醛反应得到化合物3,结构如下所示:
具体实施时,在反应瓶中分别加入芦竹碱(约1.8g,10.0mmol)、吡啶甲醛(2.0eq)、三丁基膦(2.0eq)和无水乙腈50ml,然后60℃加热回流反应过夜。反应完全后,冷却反应体系至室温,减压除有机溶剂,浓缩得油状物,经硅胶色谱柱(正己烷/乙酸乙酯,体积比为(1~4):1,优选为1:1)纯化即得1.9g化合物3。
紧接着,在反应瓶中加入化合物3(1.0g,4.5mmol)、3-溴丙胺氢溴酸盐(1.0eq)、无水甲醇(或无水乙醇、无水乙醚)10ml,然后加热回流反应过夜;反应完全,冷却反应体系至室温,过滤,用少量甲醇洗涤,干燥得到浅红色半固状物即化合物4(1.25g);本实施例中,化合物4的结构如下所示:
接着,在反应瓶中加入化合物4(1.0g,2.8mmol)、四氢呋喃20ml、无水碳酸钠(2.0eq)溶于水20ml,室温搅拌30min,然后滴加二碳酸二叔丁酯(1.1eq)溶于四氢呋喃10ml,在25~30℃反应6小时;过滤,将滤液旋干,然后加入20ml的二氯甲烷与甲醇(体积比25:1~35:1,优选30:1)搅拌一段时间,过滤,滤液旋干,得到深红色半固状物即化合物5(0.79g),化合物5的结构如下所示:
随后,将化合物5与碘甲烷于DMF中反应制备得化合物6,其具体步骤为:在反应瓶中分别加入化合物5(0.73g,2.0mmol)和CH3I(1.1eq)室温反应过夜,反应完全后,将反应体系旋干,于CHCl3和正己烷中重结晶,得到化合物6(0.93g),结构如下所示:
再接着,在反应瓶中加入化合物6(0.32g,0.6mmol)、甲醇10ml,室温滴加浓盐酸5ml,室温反应6小时,将反应体系旋干得到深红色半固状物即化合物7(0.25g),化合物7的结构如下所示:
再后,将化合物7与化合物8(苯丁酸氮芥)反应,
其具体步骤为:在反应瓶中加入化合物7(230mg,0.55mmol)、N,N-二甲基甲酰胺10ml、N,N-二异丙基乙胺(3.0eq),室温搅拌20min,然后加入苯丁酸氮芥(1.3eq)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.2eq),在20~25℃反应过夜;向反应体系中加入水15ml,用二氯甲烷15ml×3萃取,有机相再用水15ml×2洗涤,干燥,浓缩过柱得到约350mg红黄色泡沫状固体即一种肿瘤靶向性亲脂性阳离子-苯丁酸氮芥化合物9(F3CBL),其结构式如下:
实施例2:
制备化合物3的方式与实施例1中相同,在此不再赘述。
取化合物3与化合物10反应,
在反应瓶中加入化合物3(1.0g,4.5mmol)、化合物10(1.0eq)、无水甲醇(或无水乙醇、无水乙醚)10ml,然后加热回流反应过夜;反应完全,冷却反应体系至室温,过滤,用少量甲醇洗涤,干燥得到浅红色半固状物即化合物11(1.37g);本实施例中,化合物11的结构如下所示:
接着,在反应瓶中加入化合物11(1.0g,2.5mmol)、四氢呋喃20ml、无水碳酸钠(2.0eq)溶于水20ml,室温搅拌30min,然后滴加二碳酸二叔丁酯(1.1eq)溶于四氢呋喃10ml,在25~30℃反应6小时;过滤,将滤液旋干,然后加入30ml的二氯甲烷与甲醇(体积比25:1~35:1,优选30:1)搅拌,过滤,滤液旋干,得到深红色半固状物即化合物12(0.90g),化合物12的结构如下所示:
随后,将化合物12与碘甲烷于DMF中反应制备得化合物13,其具体步骤为:在反应瓶中分别加入化合物12(0.76g,2.0mmol)和CH3I(1.1eq)室温反应过夜,反应完全后,将反应体系旋干,于CHCl3和正己烷中重结晶,得到化合物13(0.99g),结构如下所示:
再接着,在反应瓶中加入化合物13(0.33g,0.6mmol)、甲醇10ml,室温滴加浓盐酸5ml,室温反应6小时,将反应体系旋干得到深红色半固状物即化合物14(0.26g),化合物14的结构如下所示:
再后,将化合物14与化合物8(苯丁酸氮芥)反应,其具体步骤为:在反应瓶中加入化合物14(230mg,0.50mmol)、N,N-二甲基甲酰胺10ml、N,N-二异丙基乙胺(3.0eq),室温搅拌20min,然后加入苯丁酸氮芥(1.3eq)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.2eq),在20~25℃反应过夜。向反应体系中加入水15ml,用二氯甲烷15ml×3萃取,有机相再用水15ml×2洗涤,干燥,浓缩过柱,得到约360mg红黄色泡沫状固体即一种肿瘤靶向性亲脂性阳离子-苯丁酸氮芥化合物的化合物15(F6CBL),其结构式如下:
实施例3:偶联化合物白蛋白纳米药物的制备及鉴定
针对前述实施例1和实施例2所制得的偶联化合物9(F3CBL)和15(F6CBL),将其溶解于微量DMSO中,然后滴入搅拌中的人血清白蛋白磷酸缓冲液(pH为7.4,蛋白浓度为0.5~20mg/ml),4~10℃下低温搅拌10~120min,透析袋(分子量>8000)PBS中透析过夜,即可获得偶联化合物9或15的白蛋白纳米药物。
对制备获得的化合物9和15的白蛋白纳米药物和人血清白蛋白(HSA)分别进行动态光散射(Dynamic Light Scattering)DLS测定白蛋白颗粒纳米尺寸的水合粒径,从DLS分析结果来看,化合物8和14的水合粒径大约为105nm和120nm左右,且分散性良好,PDI值均<0.3,具体如图2。
同时,对化合物9的白蛋白纳米颗粒进行了透射电子显微镜(TransmissionElectron Microscope)TEM确证,扫描结果表明其干燥后的纳米尺寸约为37nm,具体如图3。
实施例4:偶联化合物9白蛋白纳米药物的线粒体定位和癌细胞选择性内吞
选取化合物9(F3CBL)的线粒体进行定位确证。将Hela接板光学培养皿后,将线粒体定位试剂Mitotracker和化合物9一块与细胞进行孵育1小时,激光共聚焦显微镜(600X)观察拍照,红色和绿色荧光进行共定位观察;同时将对比化合物也进行相应的定位,然后同等条件下观察拍照,得到的结果如图4所示。
鉴于化合物9具有绿色荧光,将其分别与癌细胞HeLa和健康肝脏细胞LO2进行平行孵育0~4小时,流式细胞仪进行检测分析,结果表明化合物9对癌细胞具有快速靶向介导内吞作用,正常细胞对其内吞非常缓慢,结果如图5所示。
实施例5:体外抗肿瘤效应评价
针对前述实施例1和2所制得的化合物9和15的进行体外抗肿瘤效应评价。鉴于苯丁酸氮芥(CBL)是广谱抗癌烷化剂,本实施例采用慢性骨髓性白血病K562(CBL钝活不敏感),慢性骨髓性白血病耐药K562/MDR(CBL钝活不敏感),骨髓性白血病U937(CBL敏感),急性淋巴白血病CCRF-CEM(CBL敏感),多发性骨髓性细胞MM.1S(CBL敏感),多发性骨髓性细胞耐药MM.1R(CBL钝活不敏感)和人宫颈癌HeLa细胞(CBL钝活不敏感)对其进行药效评价,同时以人健康肝脏细胞LO2对其进行非靶细胞毒性检测。
取对数生长期的细胞,根据细胞的大小接种4~40×103个于96孔板上,待生长24小时后,弃上清,然后按以下分组给药:肿瘤细胞设不加药组和加药组(浓度2.5~320μM对肿瘤细胞,浓度50~900μM对LO2细胞),F3为化合物7,CBL为化合物8(苯丁酸氮芥),F3/CBL混合为F3和CBL等浓度的组合,F3CBL为合成化合物9。F6为化合物14,CBL为化合物8(苯丁酸氮芥),F6/CBL混合为F6和CBL等浓度的组合,F6CBL为合成化合物15。每组设4~6个复孔,培养24小时,弃上清,加入100μl含0.5mg/ml的MTT(四氮唑盐)无血清培养液培养4小时,加入100μl DMSO(二甲亚砜),放置于微型振荡仪上振荡10min,再置于酶标仪上570nm处检测OD值。正常人细胞系LO2做对照。每次实验均重复3次。
结果显示,随着药物浓度增加,与相应不加药对照组比较,细胞增殖活性分别下降,说明化合物呈浓度依赖性抑制肿瘤细胞细胞增殖。同时比较CBL钝活和不敏感癌细胞(K562、HeLa)及多药耐药癌细胞(MM.1R、K562/MDR)的细胞毒性,发现F3CBL和F6CBL能逆转CBL的钝活和多药耐药效应,且显著提高杀伤癌细胞的功能。而对正常肝细胞系L-O2细胞的增殖活性抑制明显低于CBL或F3/CBL或F6/CBL组,显示出F3CBL和F6CBL类化合物对正常细胞具有低毒特性,对癌细胞具有高选择性(如表1)。
表1不同细胞的IC50值(24h)及不同化合物IC50比值
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种肿瘤靶向性亲脂性阳离子-苯丁酸氮芥化合物,其特征在于:该化合物具有如式(Ⅰ)所示的结构:
其中,Y为F、Cl、Br或I;n为0或1~10之间的自然数。
2.根据权利要求 1所述的一种肿瘤靶向性亲脂性阳离子-苯丁酸氮芥化合物的制备方法,其特征在于包括以下操作步骤:
(1)取芦竹碱与吡啶甲醛反应得到化合物c;
(2)将化合物c与化合物d反应,获得化合物e;
(3)将化合物e在二碳酸二叔丁酯保护下反应得到化合物g;
(4)将化合物g在卤代甲烷作用下反应得到化合物h;
(5)化合物h经盐酸脱保护反应得到化合物i;
(6)化合物i经与化合物j缩合反应即制得具有如式(Ⅰ)所示的结构的肿瘤靶向性亲脂性阳离子-苯丁酸氮芥化合物;
所述化合物c的结构为:
所述化合物d的结构为:其中X为卤基;
所述化合物e的结构为:
所述化合物g的结构为:
其中n为0或1~10之间的自然数;
所述化合物h的结构为:
其中Y为F、Cl、Br或I;n为0或1~10之间的自然数;
所述化合物i的结构为:
其中Y为F、Cl、Br或I;n为0或1~10之间的自然数;
所述化合物j的结构为:
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:步骤(1)所述反应具体按照以下步骤:将芦竹碱与吡啶甲醛溶于有机溶剂中,在三丁基膦催化作用下,60℃加热回流反应过夜,反应完全后,冷却反应体系至室温,减压除去有机溶剂,浓缩得油状物,经硅胶色谱柱纯化即得产物c;所述芦竹碱、吡啶甲醛和三丁基膦的摩尔比为1:(2~6):(2~6);所述有机溶剂为无水甲醇、无水乙醇或无水乙腈;所述硅胶色谱柱纯化是采用体积比为(1~4):1的正己烷/乙酸乙酯为洗脱液。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:步骤(2)所述反应具体按照以下步骤:将化合物c和化合物d溶于溶剂中,加热回流反应,反应完全后,冷却反应体系至室温,过滤,再用上述溶剂洗涤;所述化合物d和化合物c的摩尔比为(1~3):1;所述溶剂是无水甲醇、无水乙醇或无水乙醚。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:步骤(3)所述反应具体按照以下步骤:将化合物e、四氢呋喃、无水碳酸钠溶于水,室温搅拌后滴加二碳酸二叔丁酯,在25~30℃下反应4小时;过滤,将滤液旋干,然后加入二氯甲烷与无水溶剂进行搅拌,再过滤,将滤液旋干得到化合物g;所述化合物e、无水碳酸钠和二碳酸二叔丁酯的摩尔比为1:(2~5):(1~3);所述无水溶剂是无水甲醇、无水乙醇或无水乙醚;所述二氯甲烷与无水溶剂的体积比为25:1~35:1。
6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:步骤(4)所述反应具体按照以下步骤:将N,N-二甲基甲酰胺和无水溶剂中的一种,与化合物g和卤代甲烷在室温下反应过夜,反应完全后,将反应体系旋干,于CHCl3和正己烷中重结晶,得到化合物h;所述化合物g和卤代甲烷的摩尔比为1:(1~2);所述无水溶剂是无水甲醇、无水乙醇或无水乙醚,所述N,N-二甲基甲酰胺是无水的。
7.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:步骤(5)所述反应具体按照以下步骤:将化合物h溶解于甲醇中,室温滴加浓盐酸,室温反应2~7小时,将反应体系旋干得到化合物i。
8.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:步骤(6)所述反应具体按照以下步骤:将化合物i、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺在室温下搅拌,然后加入化合物j、以及2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯,在20~25℃反应,向反应体系中加入水,用二氯甲烷萃取,有机相再用水洗涤,干燥,浓缩过柱,制得具有如式(Ⅰ)所示的结构的肿瘤靶向性亲脂性阳离子-苯丁酸氮芥化合物;所述化合物i、N,N-二异丙基乙胺、化合物j和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的摩尔比为1:(3~5):(1.5~3):(1.5~3)。
9.根据权利要求1所述的肿瘤靶向性亲脂性阳离子-苯丁酸氮芥化合物在制备白蛋白纳米药物中的应用,其特征在于:所述白蛋白纳米药物按照以下方法制备得到:将肿瘤靶向性亲脂性阳离子-苯丁酸氮芥化合物溶解于DMSO中,滴加入含人血清白蛋白的磷酸缓冲液中,4~10℃下搅拌10~120 min,磷酸缓冲溶液中透析24~48小时,得到肿瘤靶向性亲脂性阳离子-苯丁酸氮芥化合物的白蛋白纳米药物;所述含人血清白蛋白的磷酸缓冲液的pH为7.4,蛋白浓度为0.5~20mg/ml。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于:所述搅拌的时间为60min;所述透析的时间为30小时。
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