CN111088279A - 富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质材料、其制备方法及应用 - Google Patents

富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质材料、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质材料、其制备方法及应用。所述制备方法包括：构建包含有CBD‑VEGFa融合基因的重组载体，再利用所述重组载体将所述CBD‑VEGFa融合基因导入宿主细胞，进而构建能够表达所述血管内皮生长因子a的重组细胞；将所述重组细胞接种到培养皿上进行培养；将附着在培养皿上的重组细胞冻干，获得富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质。本发明构建了携带有胶原结合区域的VEGFa，进而使VEGFa蛋白结合到ECM的胶原I上，达到在ECM上富集的目的，本发明制备的富含VEGFa的片状细胞外基质材料可以诱导间充质干细胞分化成内皮细胞。

Description

富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质材料、其制备方法 及应用
技术领域
本发明涉及一种细胞外基质的制备方法，具体涉及一种含有CBD(CollagenBinding Domain，胶原结合域的简称，可以和胶原结合的一段肽段)的VEGFa融合基因、重组表达载体、富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质材料、其制备方法及其应用，属于生物材料与组织工程技术领域。
背景技术
血管性疾病是威胁人类健康的主要疾病种类之一。而其中的缺血性疾病又占近25.6％，尤其以心肌梗死、大脑缺血和肢体缺血为主。组织在缺血条件下，不能有效进行气体、营养物质和代谢废物的交换，最终导致功能性障碍直至坏死。近年来，越来越多的实验证明间充质干细胞可以有效的促进缺血组织的血管再生。通过研究结果基本证实，间充质干细胞可能通过分化成血管内皮细胞和分泌血管再生相关细胞因子两种途径来影响和促进血管的再生(Aref,Z.,M.R.de Vries,and P.H.A.Quax,Variations in SurgicalProcedures for Inducing Hind Limb Ischemia in Mice and the Impact of TheseVariations on Neovascularization Assessment.Int J Mol Sci,2019.20(15).；Wang,Z.,et al.,Human Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells Relieve HindLimb Ischemia by Promoting Angiogenesis in Mice.Stem Cells Dev,2019.28(20):1384-1397.)。内皮细胞(Endothelial cell，ECs)作为形成血管内膜的单细胞，通过响应血管生成刺激，调节血管通透性，触发血栓形成过程，并与血液中的多种成分相互作用，在维持血管稳态中发挥重要作用(Xu,Y.,et al.,Umbilical cord-derived mesenchymal stemcells isolated by a novel explantation technique can differentiate intofunctional endothelial cells and promote revascularization.Stem Cells Dev,2010.19(10):1511-22.)。将内皮细胞导入缺血组织是一种通过促进血管生成来恢复器官功能的新方法。目前内皮细胞的获取方法主要有三种：①自体内皮细胞；②内皮细胞分化培养基诱导间充质干细胞分化为内皮细胞；③生物材料诱导间充质干细胞分化为内皮细胞。
细胞外基质为细胞提供赖以生存的外部环境，在细胞间起支撑和连接作用，调节组织的发生和细胞的正常生理活动。ECM作为理想的生物学材料来源，广泛应用于组织工程和再生医学领域。ECM材料主要有两大来源：①特定组织器官直接脱细胞制备而成；②细胞衍生制备ECM(Theocharis,A.D.,et al.,Extracellular matrix structure.Adv DrugDeliv Rev,2016.97:4-27.)。ECM材料普遍制备过程是首先体外培养的细胞或组织器官产生ECM，其次脱细胞制备ECM，最后冻干保存ECM。
2017年BinataJoddar已经发明了内皮细胞来源的固态ECM诱导间充质干细胞分化成内皮细胞(Joddar,B.,S.A.Kumar,and A.Kumar,A Contact-Based Method forDifferentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into an Endothelial Cell-Phenotype.Cell Biochem Biophys,2018.76(1-2):187-195.)，其主要操作过程是：(1)人真皮微血管内皮接种在一个24孔板上，每个孔大约有30000-60000个细胞。在细胞密度大于或等于70％时，用2.5％的甲醛4℃固定12小时；(2)固定的细胞用PBS洗涤三次，10％(w/v)NP-40脱细胞；(3)PBS洗涤三次，置于旋转振动筛上，EZBlue染色试剂孵育10分钟，去除染色液，双蒸馏水中清洗三次；(4)再用2.5％甲醛固定脱细胞的ECM，4℃12小时，PBS洗涤三次，用于进一步实验或4℃保存。
诱导间充质干细胞分化成内皮细胞的方法目前已经有很多种，但是这些方法或多或少也都有一些不尽如人意的地方。主要问题是：(1)内皮细胞分化培养基是诱导间充质干细胞分化成内皮细胞最常用的方法，虽然其培养基化学成分明确，含有促进间充质干细胞向内皮分化的各种生长因子。但是其成本高，各种生长因子半衰期短，降解快，对细胞的刺激相对较短且不连续。(2)成熟的内皮细胞在新生血管形成中起着重要的作用，但其数量有限，不能充分应用于治疗。(3)化学材料生物相容性差。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质材料、其制备方法及应用，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质材料的制备方法，其包括：
构建包含有CBD-VEGFa融合基因的重组载体，再利用所述重组载体将所述CBD-VEGFa融合基因导入宿主细胞，进而构建能够表达所述血管内皮生长因子a的重组细胞；
将所述重组细胞接种到培养皿上进行培养；
将附着在培养皿上的重组细胞冻干，获得富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质。
本发明实施例还提供了一种由前述方法制备的富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质材料。
本发明实施例还提供了前述富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质材料于制备功能性产品中的用途，所述功能性产品至少具有诱导间充质干细胞向内皮细胞分化的功能。
本发明实施例还提供了一种药物组合物，其包含作为有效成分的前述富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质材料。
与现有技术相比，本发明有益效果至少在于：
1)本发明制备的富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质(ECM)材料可以诱导人脐带间充质干细胞(HUC MSCs)分化成内皮细胞；
2)本发明通过基因工程技术构建了携带有胶原结合区域(CBD)的VEGFa，进而使其所表达的VEGFa蛋白结合到ECM的胶原I上，达到在ECM上富集的目的；
3)本发明制备的ECM无需另加生长因子VEGFa，CBD-VEGFa的瞬时转染细胞本身就可以往外分泌生长因子VEGFa的融合蛋白，并可富集在ECM上。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一典型实施方案中富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质材料的制备流程图。
图2a是本发明一典型实施方案中重组表达载体的构建流程示意图。
图2b是本发明一典型实施方案中脂质体转染流程图。
图3a是本发明一典型实施方案中所需表达生长因子的瞬转细胞的QPCR验证结果示意图。
图3b是本发明一典型实施方案中所需表达生长因子的瞬转细胞的WB验证结果示意图。
图4a-图4b分别是本发明一典型实施方案中过表达因子的IF鉴定结果示意图。
图5a-图5b分别是本发明一典型实施方案中瞬时转染HFF-pLVX-CBD-VEGFa细胞ECM冻干前、后图。
图6a-图6b分别是本发明一典型实施方案中对照组和诱导组Matrigel成管试验结果示意图。
具体实施方式
如前所述，鉴于现有技术的诸多缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是提供一种富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质材料的制备方法，用于诱导间充质干细胞向内皮细胞分化，其原理在于融合了胶原结合区域的VEGFa可以和细胞外基质ECM中胶原I相结合，从而实现在ECM中的富集，所获富含血管内皮生长因子a的片状ECM材料可以诱导人脐带间充质干细胞(HUC MSCs)分化成内皮细胞。
首先需说明的是，本发明说明书中述及的术语的释义均是本领域技术人员所知悉的。例如，其中一些术语的定义如下：
细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)：由细胞分泌到细胞外间质中的胶原蛋白、蛋白聚糖/糖胺聚糖、弹性蛋白、纤维连接蛋白、纤连蛋白和其他几种糖蛋白组成的非细胞三维大分子网络。
血管内皮生成因子a(Vascular endothelial growth factor a,VEGFa)：是半胱氨酸生长因子超家族成员，通常以二聚糖蛋白的形式存在。可促进新生血管形成、增加血管通透性。
人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSCs)：是一种具有良好的增殖能力、多向分化能力和免疫调节能力的多能干细胞。
胶原结和域(Collagenous binding domain,CBD)：可以和胶原结合的一段肽段。
如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
本发明实施例的一个方面提供的一种富含血管内皮生长因子a(以下可简称为“VEGFa”)的片状细胞外基质(以下可简称为“ECM”)材料的制备方法，其包括：
构建包含有CBD-VEGFa融合基因的重组载体，再利用所述重组载体将所述CBD-VEGFa融合基因导入宿主细胞，进而构建能够表达所述血管内皮生长因子a的重组细胞；
将所述重组细胞接种到培养皿上进行培养；
将附着在培养皿上的重组细胞冻干，获得富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质。
在一些优选实施例中，所述制备方法具体包括：将所述CBD-VEGFa融合基因连接到pLVX-IRES-Puro载体的多克隆位点上，从而构建形成所述重组载体。
在一些优选实施例中，所述制备方法具体包括：通过脂质体转染体系将所述重组载体导入宿主细胞中，从而构建形成所述重组细胞。
进一步地，本发明构建的载体可以是慢病毒载体pLVX-IRES-Puro载体，也可以是非病毒的载体。
进一步地，本发明还提供了CBD-VEGFa重组载体的构建方法，并构建了可以瞬时表达且能够分泌生长因子VEGFa并结合在ECM上的重组细胞。
进一步地，本发明利用分子生物学技术构建了所述CBD-VEGFa融合基因，其序列如SEQID NO:1所示，具体序列内容如下：
ATGACCAAGAAGACCCTGAGACTGGGAGGAGGTGGCAGCGGAGGTGGCGGATCTGGTGGAGGCGGATCACTGACGGACAGACAGACAGACACCGCCCCCAGCCCCAGCTACCACCTCCTCCCCGGCCGGCGGCGGACAGTGGACGCGGCGGCGAGCCGCGGGCAGGGGCCGGAGCCCGCGCCCGGAGGCGGGGTGGAGGGGGTCGGGGCTCGCGGCGTCGCACTGAAACTTTTCGTCCAACTTCTGGGCTGTTCTCGCTTCGGAGGAGCCGTGGTCCGCGCGGGGGAAGCCGAGCCGAGCGGAGCCGCGAGAAGTGCTAGCTCGGGCCGGGAGGAGCCGCAGCCGGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAGGAGAGGGGGCCGCAGTGGCGACTCGGCGCTCGGAAGCCGGGCTCATGGACGGGTGAGGCGGCGGTGTGCGCAGACAGTGCTCCAGCCGCGCGCGCTCCCCAGGCCCTGGCCCGGGCCTCGGGCCGGGGAGGAAGAGTAGCTCGCCGAGGCGCCGAGGAGAGCGGGCCGCCCCACAGCCCGAGCCGGAGAGGGAGCGCGAGCCGCGCCGGCCCCGGTCGGGCCTCCGAAACCATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGCATTGGAGCCTTGCCTTGCTGCTCTACCTCCACCATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGCACCCATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCACGAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATCACCATGCAGATTATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAAGACAAGAAAAATGTGACAAGCCGAGGCGGTGA。
进一步地，所述宿主细胞包括人体细胞，例如可选用人包皮成纤维细胞，还可以选用其他来源的细胞，但不限于此。
进一步地，所述富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质为片状。
本发明实施例的另一个方面提供了由前述任意一种制备方法制备的富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质材料于制备功能性产品中的用途，所述功能性产品至少具有诱导间充质干细胞向内皮细胞分化的功能。
进一步地，所述间充质干细胞可选用人脐带间充质干细胞(HUC MSCs)，如骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞等，但不限于此。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种药物组合物，其包含作为有效成分的前述富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质材料。
进一步地，所述药物组合物还可包含药学可接受的载体。
本说明书中所述的“载体”具有本领域人员熟知的含义，其可包括任何及所有的溶剂、分散介质、涂层、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘结剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、类似物质及它们的组合。
藉由上述技术方案，本发明通过基因工程技术构建了携带有胶原结合区域(CBD)的VEGFa，进而使其所表达的VEGFa蛋白结合到ECM的胶原I上，达到在ECM上富集的目的；本发明制备的富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质(ECM)材料可以诱导人脐带间充质干细胞(HUC MSCs)分化成内皮细胞。
以下结合附图及若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例提供的一种富含血管内皮生长因子a的细胞外基质的制备方法，主要技术流程可分为四个步骤(可参见图1所示)：1、载体构建；2、细胞构建；3、制备ECM；4、ECM性能检测。
下面将对每个步骤进行详细描述：
1、载体构建
(1)选择合适的载体骨架。本发明选取的是慢病毒载体pLVX-IRES-Puro(以下表示为PLVX)作为所构重组载体的基本骨架。
(2)国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找到VEGFa和CBD的编码序列(codingsequence,CDS)序列。
(3)利用Primer5引物设计软件设计VEGFa和CBD所需要的引物，再交由公司合成引物，引物列表如表1所示。
表1：本发明构建载体所需引物列表
Figure BDA0002344909780000061
(4)进行一系列的生物分子实验操作构建重组质粒，原理参见图2a。构建流程主要包括：①用引物通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)将VEGFa和CBD基因的cDNA从正常细胞中扩增出来并纯化回收。②根据引物所选用的酶切位点将扩增出来的基因和原始载体同时进行酶切，之后回收酶切片段。③基因酶切片段与载体酶切片段在DNA连接酶的作用下进行酶连反应。④酶连反应结束后，酶连产物转化进入感受态细胞中并涂板扩增质粒。⑤挑取单菌落进行菌落PCR,检测出成功连接VEGFa和CBD基因的单菌落。⑥挑取含VEGFa和CBD基因的菌落进行菌落扩大培养，之后提取质粒测序，确定VEGFa和CBD基因成功连接到了载体上并且没有突变后，pLVX-CBD-VEGFa载体构建完成。
2、细胞构建(参见图2b所示)
(1)选择合适的细胞。本发明选择的是人包皮成纤维细胞(human foreskinfibroblast,HFF)。
(2)细胞密度70％-80％可以进行转染。
(3)通过脂质体转染体系将重组载体整合到细胞中，本发明选用的脂质体转染体系如表2所示。
表2：本发明选用的脂质体转染体系
Figure BDA0002344909780000071
(4)本发明中所需的瞬时过表达VEGFa基因的细胞经过实时荧光定量核酸扩增反应(Real-time Quantitative PCR,QPCR)检测到其对应的信使RNA均过表达，结果可参见图3a，蛋白印记实验(Western Blot,WB)检测到VEGFa蛋白也都过表达，结果可参见图3b。用免疫荧光(Immunofluorescence，IF)检测瞬时转染的细胞中生长因子的分泌情况，检测到瞬时转染的细胞生长因子均有高表达，结果可参见图4a和图4b。
3、制备ECM
将HFF-pLVX-CBD-VEGFa细胞接种在10cm的培养皿中，在37℃无菌培养箱中培养，待细胞长到70％-80％后加入含有50μM抗坏血酸的完全培养基(DMEM+20％FBS+1％青霉素-链霉素)，每2天换一次培养基。培养两周后，吸去培养基，将10cm培养皿置于-80℃冰箱，24小时，再置于真空冷冻干燥机，24小时，即制成含血管内皮生长因子a的片状ECM材料，图5a和图5b示出了瞬时转染HFF-pLVX-CBD-VEGFa细胞ECM冻干前、后图。
4、ECM性能检测
将人脐带间充质干细胞(HUC MSCs)接种于含血管内皮生长因子a的片状ECM材料上诱导培养，每两天换一次培养基，在倒置相差显微镜下观察，诱导的人脐带间充质干细胞形态由长梭形逐渐缩短，部分呈现短梭形或多角形。请参阅图6a和图6b所示，Matrigel成管实验结果显示对照组部分细胞呈小团状聚拢，未形成典型的线状、管状结构；而诱导14天的细胞能够形成典型的管状结构，这说明含血管内皮生长因子a的片状ECM材料具有诱导脐带间充质干细胞分化成内皮细胞的功能。
藉由上述技术方案，本发明通过基因工程技术构建了携带有胶原结合区域(CBD)的VEGFa，进而使其所表达的VEGFa蛋白结合到ECM的胶原I上，达到在ECM上富集的目的；本发明制备的富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质(ECM)材料可以诱导人脐带间充质干细胞分化成内皮细胞。
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。
在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。
应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。
Figure BDA0002344909780000091
Figure BDA0002344909780000101
序列表
<110> 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
<120> 富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质材料、其制备方法及应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
atgaccaaga agaccctgag actgggagga ggtggcagcg gaggtggcgg atctggtgga 60
ggcggatcac tgacggacag acagacagac accgccccca gccccagcta ccacctcctc 120
cccggccggc ggcggacagt ggacgcggcg gcgagccgcg ggcaggggcc ggagcccgcg 180
cccggaggcg gggtggaggg ggtcggggct cgcggcgtcg cactgaaact tttcgtccaa 240
cttctgggct gttctcgctt cggaggagcc gtggtccgcg cgggggaagc cgagccgagc 300
ggagccgcga gaagtgctag ctcgggccgg gaggagccgc agccggagga gggggaggag 360
gaagaagaga aggaagagga gagggggccg cagtggcgac tcggcgctcg gaagccgggc 420
tcatggacgg gtgaggcggc ggtgtgcgca gacagtgctc cagccgcgcg cgctccccag 480
gccctggccc gggcctcggg ccggggagga agagtagctc gccgaggcgc cgaggagagc 540
gggccgcccc acagcccgag ccggagaggg agcgcgagcc gcgccggccc cggtcgggcc 600
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cacgaagtgg tgaagttcat ggatgtctat cagcgcagct actgccatcc aatcgagacc 780
ctggtggaca tcttccagga gtaccctgat gagatcgagt acatcttcaa gccatcctgt 840
gtgcccctga tgcgatgcgg gggctgctgc aatgacgagg gcctggagtg tgtgcccact 900
gaggagtcca acatcaccat gcagattatg cggatcaaac ctcaccaagg ccagcacata 960
ggagagatga gcttcctaca gcacaacaaa tgtgaatgca gaccaaagaa agatagagca 1020
agacaagaaa aatgtgacaa gccgaggcgg tga 1053
<210> 2
<211> 106
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
cggaattcgc caccatgacc aagaagaccc tgagactggg aggaggtggc agcggaggtg 60
gcggatctgg tggaggcgga tcactgacgg acagacagac agacac 106
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
gctctagatc accgcctcgg cttgt 25
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
cccactgagg agtccaacat c 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 5
ggccttggtg aggtttgatc 20

Claims (10)

1.一种富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质材料的制备方法，其特征在于包括：
构建包含有CBD-VEGFa融合基因的重组载体，再利用所述重组载体将所述CBD-VEGFa融合基因导入宿主细胞，进而构建能够表达所述血管内皮生长因子a的重组细胞；
将所述重组细胞接种到培养皿上进行培养；
将附着在培养皿上的重组细胞冻干，获得富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于具体包括：将所述CBD-VEGFa融合基因连接到pLVX-IRES-Puro载体的多克隆位点上，从而构建形成所述重组载体。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于具体包括：通过脂质体转染体系将所述重组载体导入宿主细胞中，从而构建形成所述重组细胞。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述CBD-VEGFa融合基因的序列如SEQID NO:1所示。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述宿主细胞包括人体细胞；优选的，所述宿主细胞包括人包皮成纤维细胞。
6.由权利要求1-5中任一项所述方法制备的富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质材料。
7.权利要求6所述的富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质材料于制备功能性产品中的用途，所述功能性产品至少具有诱导间充质干细胞向内皮细胞分化的功能。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述间充质干细胞包括人脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。
9.一种药物组合物，其特征在于包含作为有效成分的如权利要求6所述的富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质材料。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于还包含药学可接受的载体。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101671396A (zh) * 2008-09-11 2010-03-17 烟台正海生物技术有限公司 与胶原蛋白特异结合的血管内皮生长因子及其应用
CN110129274A (zh) * 2019-05-17 2019-08-16 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 含梯度细胞因子的细胞基质材料、其制备方法及应用

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