JP2012533571A5

JP2012533571A5 - インビトロ及び生体内での軟骨形成のための方法及び組成物

Info

Publication number: JP2012533571A5
Application number: JP2012520830A
Authority: JP
Filing date: 2010-07-16
Publication date: 2015-03-12
Anticipated expiration: 2030-07-16

Description

相互参照
本出願は、米国特許法第１１９（ｅ）条のもとで、以下の仮特許出願：２００９年７月１６日に出願された「胚性前駆細胞株を用いたインビトロ及び生体内での軟骨形成に有用な方法及び組成物」と題する出願番号第６１／２２６，２３７号、２００９年９月１８日に出願された「胚性前駆細胞株をスクリーニングする改善された方法」と題する出願番号第６１／２４３，９３９号、２０１０年５月２７日に出願された「胚性前駆細胞株をスクリーニングする改善された方法」と題する出願番号第６１／３４９，０８８号、及び２０１０年７月１６日に出願された「インビトロ及び生体内での軟骨形成のための方法及び組成物」題する出願番号第６１／３６５，３０８号の利益を主張する。これら出願のそれぞれの全体は参照によって本明細書に組み入れられる。

自家軟骨細胞療法（ＡＣＴ）として知られる細胞に基づいた軟骨治療計画には、軟骨からの軟骨細胞の取り出し、インビトロでの細胞の増殖、及び支持マトリクス（又はそのほかのタンパク質若しくはプロテオグリカン）の存在下又は非存在下でのこれら増殖させた細胞の患者への投与が含まれる。ＡＣＴ療法は、インビトロで培養される場合のヒト関節軟骨細胞の脱分化、並びにそれらが移植部位で豊富な軟骨マトリクスを産生するように細胞を再分化させることの困難さによって複雑なものとなっている。さらに、ヒトからはほんのわずかな数の軟骨細胞しか回収できないので、培養の開始にほんのわずかな数の軟骨細胞しか使用できない。従って、実際上、単離されたヒト軟骨細胞を移植療法に適用する困難さは継続する。

用語「割球／桑実胚の細胞」は、哺乳類の胚における割球若しくは桑実胚の細胞、又はこれらの細胞の分化誘導体を含む追加の細胞の存在下又は非存在下でインビトロにて培養された割球若しくは桑実胚の細胞を指す。

用語「細胞株」は、インビトロで増える及び増殖することが可能である細胞の死すべき集団又は不死の集団を指す。

用語「ＩＣＭ細胞」は、哺乳類胚の内部細胞塊の細胞、又は周辺の栄養外胚葉細胞の存在下若しくは非存在下にてインビトロで培養した内部細胞塊の細胞を指す。

用語「原始幹細胞」は、１を超える分化した細胞種に分化することが可能である動物細胞を指す。そのような細胞には、ｈＥＳ細胞、割球／桑実胚の細胞及びそれらに由来するｈＥＤ細胞、ｈｉＰＳ細胞、ｈＥＧ細胞、ｈＥＣ細胞、並びに間葉幹細胞、神経幹細胞及び骨髄由来幹細胞を含む成人由来細胞が挙げられる。原始幹細胞は非ヒト動物に由来してもよい。原始幹細胞は遺伝子操作されてもよいし、遺伝子操作されなくてもよい。遺伝子操作された細胞は、たとえば、蛍光タンパク質のようなマーカーを含んでインビトロ又は生体内での特定を円滑にしてもよい。

上記で言及したように、本発明の胚性の軟骨形成性前駆細胞は、インビトロ又は生体内で軟骨を生成する方法での使用を見い出す（本明細書では軟骨細胞誘導法と呼ぶことがある）。治療上の使用に好適なものを含む好都合な軟骨細胞誘導法を使用してもよい（多数の例となる軟骨細胞誘導／軟骨生成の方法が以下及び実施例の項で記載される）。

特定の実施形態では、本発明の軟骨産生細胞が治療応用に採用されて、対象者（たとえば、哺乳類、たとえば、ヒト対象者）において軟骨組織（たとえば、損傷された軟骨）を修復し、置き換え、又は整備する。インビトロで軟骨が生成され、その後冒された部位に移植されてもよく、特定の実施形態では、軟骨細胞が（たとえば、マトリクス又は足場の中に）移植されて対象者における所望の部位で軟骨を生成してもよい。軟骨産生細胞（又は軟骨細胞）を用いる多数の治療法が記載されており、その２，３を以下で要約する。

特定の実施形態では、本発明の軟骨産生細胞は、インビトロで培養されて合成軟骨（又は軟骨様の）材料を形成してもよい。得られた軟骨を続いて軟骨欠損の部位で対象者に埋め込んでもよい。この種のアプローチは、埋め込みの前に合成軟骨材料の成長がモニターされ得るという利点を有する。加えて、得られた軟骨は埋め込みに先立って生化学的に及び形態学的に性状分析され得る。インビトロで合成軟骨を増殖させるために２つの一般的な手順が開発されている。これらには、足場依存性の方法又は足場非依存性の方法のいずれかで軟骨産生細胞を増殖することが含まれる。

特定の実施形態では、本発明の軟骨療法は、米国特許第５，７２３，３３１号及び同第５，７８６，２１７号（双方共その全体が参照によって本明細書に組み入れられる「哺乳類における関節軟骨欠陥の修復のための方法及び組成物」と題する）に記載されたものを含む。これらの特許は、軟骨の欠陥の修復のために合成軟骨パッチをインビトロで調製する方法を記載している。本発明の軟骨産生細胞を採用する場合、方法は、（１）細胞の接触を有する事前に成形されたウェル、細胞付着性の表面に本発明の軟骨産生細胞を播く工程と、（２）細胞が細胞外マトリクスを分泌できるのに十分な時間、ウェルにて本発明の軟骨産生細胞を培養し、それによって合成軟骨の三次元の多層細胞パッチを形成する工程を含む。得られた合成軟骨（たとえば、合成関節軟骨）は、内因的に産生され、分泌された細胞外マトリクスの中に分散された本発明の軟骨産生細胞を含有する。続いて、得られた合成軟骨パッチを対象者（たとえば、哺乳類）における軟骨の欠陥の修復（置き換え）に使用してもよい。

ヒドロゲルに被包された軟骨細胞前駆細胞をインビトロで培養し、又は生体内で軟骨産生が望まれる部位に移植し、たとえば、損傷した又は失った軟骨を置き換えることができる。

ＧｌｙｃｏｓａｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓもまた、培養、組織工学の足場及び細胞療法で使用を見い出す三次元細胞培養用のヒドロゲルを提供している。この会社はたとえば、インビトロ及び生体内での細胞増殖及び分化で使用するためのヒアルロナン系、ＰＥＧ系及びコラーゲン系のヒドロゲルを提供している。

胚性前駆細胞株の産生方法
以下に記載する方法に加えて、本明細書で記載される細胞株の産生及び使用において使用を見い出す方法は、以下において見つけることができる：「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する米国特許公開第２００８００７０３０３号；「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００９年７月１６日に出願された米国特許出願、出願番号１２／５０４，６３０；「胚性前駆細胞株を用いたインビトロ及び生体内での軟骨形成に有用な方法及び組成物」と題する２００９年７月１６日に出願された米国特許仮出願、出願番号６１／２２６，２３７；「遺伝子発現の出生前パターンを持つ細胞の新規使用」と題する２００６年４月１１日に出願されたＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１３５１９、そのそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。

クローン性、プールしたクローン性、オリゴクローン性及びプールしたオリゴクローン性の細胞株の増殖
本発明の態様は、単一細胞（クローン性）、又はクローニングした細胞株が遺伝子発現マーカーのような見分けがつかないマーカーを有し、培養での細胞数を増やす目的でそれらを組み合わせて単一の細胞培養にすることを意味する「プールされたクローン性」である、又は株が、少数の通常２〜１，０００個の類似細胞から生成され、細胞株として増殖させるオリゴクローン性、又は遺伝子発現のパターンのような見分けがつかないマーカーを有する２以上のオリゴクローン性細胞株を組み合わせることによって生成される株である「プールされたオリゴクローン性」株である、細胞株に由来する胚性前駆細胞株を特定し、分化させる方法を提供する。それらが付着する基材からの細胞の取り外しを介して、前記クローン性、プールしたクローン性、オリゴクローン性及びプールしたオリゴクローン性の細胞株を次いでインビトロで増殖させ、通常、元々の細胞数の１／３〜１／４に減らした密度で細胞を再びプレート培養してさらなる増殖を円滑にする。前記細胞株及び関連する細胞培養培地の例は、補完情報も含めて、双方共参照によって本明細書に組み入れられる、「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を促進する方法及びそれによって得られる細胞」と題する２００９年７月１６日に出願された米国特許出願第１２／５０４，６３０号及びＷｅｓｔら、２００８，ＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅＭｅｄｉｃｉｎｅｖｏｌ．３（３）ｐｐ．２８７−３０８に開示されている。本発明の組成物及び方法は、クローン性増殖の２１を超える倍増を別にして、記載されたように培養された前記細胞株に関する。

軟骨細胞の分化を誘導する例となる条件
本明細書で記載される前駆細胞株を用いて軟骨形成（又は軟骨産生）を誘導する好都合な方法を研究又は治療のいずれかの目的に（生体内又はインビトロのいずれかで）採用してもよいので、この点での限定は意図されないことが言及される。従って、以下に記載されるアッセイは、軟骨形成のための条件の例となる非限定例を表す。

本発明の特定の実施形態では、単一細胞由来の及びオリゴクローン性細胞由来の細胞は、それらが治療上の有用性を示すために通常存在している組織に導入される。本発明の特定の実施形態では、本発明の方法によって導かれる単一細胞由来の及びオリゴクローン性細胞由来の細胞が、ほかの多能性幹細胞の分化の誘導に利用される。インビトロで増殖することが可能である一方で遺伝子発現の胚性パターンを維持している細胞の単一細胞由来の集団は、ほかの多能性幹細胞の分化を誘導することにおいて有用である。細胞と細胞の相互作用は、早期胚において分化を指向する一般的な手段である。脊髄ニューロン、心臓細胞、膵臓β細胞及び限定的な造血細胞を含む多数の医学的に有用である可能性がある細胞種は、正常な胚発生の間での誘導シグナルに影響される。インビトロで増殖することが可能である一方で遺伝子発現の胚性パターンを維持している細胞の単一細胞由来の集団を種々のインビトロ、胚内、又は生体内での条件で培養してそのほかの多能性幹細胞が所望の細胞種又は組織種になる分化を誘導することができる。誘導細胞を標的細胞と並置する種々の方法にて誘導を行ってもよい。非限定の例証として、誘導細胞を組織培養にてプレート培養し、マイトマイシンＣ又は放射線で処理して細胞のさらなる複製を妨げる。次いで細胞分裂上不活化された誘導細胞の上で標的細胞をプレート培養する。或いは、細胞のさらに大きな培養又は元々の単一細胞由来のコロニーから取り外し可能な膜の上で単一細胞由来の誘導細胞を培養してもよく、標的細胞を誘導細胞の上でプレート培養してもよく、又は標的細胞で覆った別の膜を、直接接触にて２つの細胞層を挟むように並置してもよい。細胞の得られる二重層をインビトロで培養し、ＳＰＦの鳥類の卵に移し、血管支援を受けながら三次元への増殖を可能にする条件で培養してもよい（たとえば、その開示が参照によって本明細書に組み入れられる２００５年７月２８日に公開された国際特許公開番号ＷＯ２００５０６８６１０を参照）。誘導細胞はまた、誘導細胞を任意で取り除くことができるように自殺構築物が導入されている、ｈＥＳ及びｈＥＤ細胞を含む多能性幹細胞の起源に由来してもよい。単一細胞由来の及びオリゴクローン性細胞由来の誘導に有用な細胞種には、正常な胚発生で天然に生じることが当該技術で周知である誘導の場合が挙げられてもよい。本発明の特定の実施形態では、本発明の方法によって導かれる単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞は、多能性幹細胞を含むそのほかの細胞種の増殖を支援する「フィーダー細胞」として使用される。本発明の単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞のフィーダー細胞としての使用は、そのほかの哺乳類起源のフィーダー細胞からの病原体の標的細胞への伝染のリスクの可能性を緩和する。フィーダー細胞は、たとえば、γ線照射によって又はマイトマイシンＣ処理によって不活化されて複製を限定され、多能性幹細胞と共培養されてもよい。

実施例６．
ｑＰＣＲによる軟骨形成性前駆細胞のスコア化のための低処理能力選抜
１０ＲＰＥ８、４Ｄ２０．８、４Ｄ２０．９、４ＳＫＥＬ２０、７ＰＥＮＤ１２、７ＰＥＮＤ２４、７ＰＥＮＤ３０、７ＰＥＮＤ９、７ＳＫＥＬ４、７ＳＫＥＬ７、７ＳＭＯＯ２５、７ＳＭＯＯ３２、７ＳＭＯＯ７、７ＳＭＯＯ９、Ｂ１６、Ｃ４．４、Ｃ４ＥＬＳ５．１、Ｃ４ＥＬＳ５．６、Ｃ４ＥＬＳＲ１０、Ｃ４ＥＬＳＲ２、ＣＭＯ２、Ｅ１０９、Ｅ１１１、Ｅ１２０、Ｅ１５、Ｅ１６４、Ｅ３３、Ｅ４４、Ｅ６８、Ｅ６９、Ｅ８５、ＥＮ１、ＥＮ１３、ＥＮ１６、ＥＮ１８、ＥＮ２、ＥＮ２２、ＥＮ２３、ＥＮ２６、ＥＮ２７、ＥＮ３１、ＥＮ４、ＥＮ４２、ＥＮ４７、ＥＮ５、ＥＮ５１、ＥＮ５５、ＥＮ７、ＥＮ８、Ｆ１５、Ｊ１６、ＭＥＬ２、ＭＥＬ２、ＭＷ１、ＲＡＤ２０．１６、ＲＡＤ２０．１９、ＲＡＤ２０．４、ＲＡＤ２０．５、ＲＡＤ２０．６、ＲＡＰＥＮＤ１０、ＲＡＰＥＮＤ１５、ＲＡＰＥＮＤ１８、ＲＡＳＫＥＬ８、ＲＡＳＭＯ１２、ＲＡＳＭＯ１９、ＳＫ１１、ＳＫ１７、ＳＫ１８、ＳＫ２５、ＳＫ３１、ＳＫ３５、ＳＫ４３、ＳＫ４４、ＳＫ４６、ＳＫ４７、ＳＫ４９、ＳＫ５０、ＳＫ５２、ＳＭ１７、ＳＭ２、ＳＭ２２、ＳＭ２８、ＳＭ２８、ＳＭ３０、ＳＭ３３、ＳＭ８、Ｔ１４、Ｔ２０、Ｔ３６、Ｔ４２、Ｔ４３、Ｔ４４、Ｔ７、Ｕ３１、Ｗ１０、Ｗ１１、Ｗ８、Ｚ１、Ｚ１１、Ｚ２及びＺ３と名付けられた本発明の細胞株は、ｈＥＳ由来の細胞から単離し、集密まで増殖させ、本明細書で記載されるような血清又はそのほかのマイトジェンを１０倍減らして補完した培地で培地を置き換えることによって静止期に同期化させたので、それらをインビトロで＞２１の倍増でクローン増殖させた。インビトロで軟骨形成が可能である細胞についての低処理能力選抜では、細胞を微細塊条件で培養し、本明細書で記載されるように１４日間、軟骨形成を誘導した。これら２つの条件のそれぞれからのＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、次いで軟骨形成に一般に関連する遺伝子（すなわち、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＭＰ、ＣＩＬＰ、ＳＣＸ、ＣＲＴＬ１、ＳＯＸ９、ＢＡＲＸ２）の発現について調べた。遺伝子特異的なプライマー対プローブはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。ｃＤＮＡのＲＮＡ同等物３０ｎｇ，プライマー当たり０．４μＭ、超純度蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から成り、全反応容量２５μｌでＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄＤＮＡポリメラーゼを組み入れる１２．５μｌのＰｏｗｅｒＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲＭａｓｔｅｒミックス（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３６７６５９）で１：１に希釈した試験用試料を標準の光学９６穴反応プレート（ＣＡ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＮ４３０６７３７）にて調製した。ＳＤＳｖ１．２ソフトウエアを採用するＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００リアルタイムＰＣＲ方式を用いてリアルタイムｑＰＣＲを実行した。増幅条件は、５０℃にて２分間（段階１）、９５℃で１０分間（段階２）、９５℃で１５秒間、次いで６０℃で１分間を４０サイクル（段階３）、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間、９５℃で１５秒間の解離段階（段階４）にて設定した。当該遺伝子の増幅産物のＣｔ値を３つのハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤ、ＲＰＳ１０及びＧＵＳＢ）のＣｔ値の平均に対して標準化し、早期継代の正常ヒト膝関節軟骨細胞（Ｌｏｎｚａ）及び培養されたヒト骨髄間葉幹細胞に対して遺伝子発現を解析した。

驚くべきことに、ＣＯＬ２Ａ１の誘導とＳＯＸ９のような関節形成間充組織の一般に使用されるマーカーとの相関はほとんどないか、少なかった。同様に、軟骨形成性間葉細胞のマーカーであると推測されているＡＱＰ１のようなマーカーは、微細塊軟骨形成条件でＣＯＬ２Ａ１を誘導しない包皮皮膚線維芽細胞のＲＦＵ値にて存在したが、分化前及び分化後の本発明の細胞株には存在しなかった。たとえば、分化に先立って、ＡＱＰ１の発現は、クローン増殖の１８〜２１の倍増にて、細胞株ＳＭ３０には存在せず（バックグランドであるＲＦＵ１３５）、ＳＫ１１には存在せず（１２６のＲＦＵ）、細胞株Ｅ１５には存在しなかった（ＲＦＵ１３９）（Ｗｅｓｔら、２００８，ＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅＭｅｄｉｃｉｎｅ、ｖｏｌ．３（３）ｐｐ．２８７−３０８からの補完表ＩＩを参照）。どちらも、本発明の細胞株は軟骨形成が可能であるかどうかを予測することにおいて予測値の本発明の未分化細胞株におけるＳＯＸ９の発現レベルではなかった。実際、軟骨細胞になってそのような予後を予測するこれら細胞株の可能性と十分に相関する、分化に先立つ未分化の細胞株では遺伝子を見つけることができなかった。部位特異的なホメオボックス遺伝子発現を含むＳＫ１１、７ＳＭＯＯ３２、４Ｄ２０．８、ＭＥＬ２、ＳＭ３０及びＥ１５の群の範囲内での遺伝子発現マーカーの多様性は、各細胞株が独特で且つ識別可能な軟骨形成性前駆細胞を代表することを示唆している。同様に驚くべきことは、たとえば、ＣＯＭＰ及びＣＩＬＰのようなインビトロでの軟骨形成のマーカーとして一般に使用される遺伝子の多くが、ＣＯＬ２Ａ１の発現によって及び軟骨形成の組織学的証拠を示すことによって証拠付けられるのと同一の条件下で皮膚線維芽細胞が、たとえば、本当の軟骨形成を経験することが可能であるかどうかにかかわりなく、培養された皮膚線維芽細胞を含む事実上任意の細胞種にて非特異的な方法での培養条件で誘導されることであった。加えて、細胞株ＳＫ１１、７ＳＭＯＯ３２、４Ｄ２０．８、ＭＥＬ２、ＳＭ３０及びＥ１５は、分化の前と後の双方での遺伝子発現マーカーに関して培養された骨髄ＭＳＣとは明瞭に識別可能だった。骨髄のＭＳＣは一般にＡＬＣＡＭ（ＣＤ１６６）陽性として記載されるが、たとえば、ＳＫ１１、７ＳＭＯＯ３２、４Ｄ２０．８、ＭＥＬ２、ＳＭ３０及びＥ１５のような未分化状態での本発明の細胞株は、ＣＤ１６６の発現は細胞株ＳＭ３０では存在せず（バックグランドであるＲＦＵ１２５）、ＳＫ１１では存在しなかった（１６４のＲＦＵ）（Ｗｅｓｔら、２００８，ＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅＭｅｄｉｃｉｎｅ、ｖｏｌ．３（３）ｐｐ．２８７−３０８からの補完表ＩＩを参照）。非限定の例証としてＭＳＣと比較した場合の本発明の細胞株の追加の差異は、実際には特異的ではない一般的に使用されるマーカーの多くよりもさらに正確なＭＳＣのマーカーであることが明らかにされているＣＤ７４の発現である（Ishii et al, 2005 BBRC 332:297-303）。表３に示されるように、未分化のＭＳＣは実際非常に高いレベルのＣＤ７４転写物を発現し、脂肪細胞幹細胞は低レベルで同様にＣＤ７４を発現し、歯髄幹細胞は検出の限界でＣＤ７４を発現したが、その転写物は、ＳＫ１１、７ＳＭＯＯ３２、４Ｄ２０．８、ＭＥＬ２、ＳＭ３０及びＥ１５を含むＣＯＬ２Ａ１を誘導可能な本発明の未分化細胞でも、培養された皮膚線維芽細胞でも非軟骨形成性の胚性前駆細胞株７ＳＭＯＯ７でも全く検出されなかった。細胞株の多様性及び本明細書で検討される成人幹細胞種での際立った差異を示す追加の非限定例は、細胞株Ｅ１５にて高レベルで発現されるが、たとえば、ＭＳＣ、脂肪細胞幹細胞、歯髄幹細胞又は皮膚線維芽細胞では発現されない発生遺伝子ＮＮＡＴ（ＮＭ＿１８１６８９．１）の発現である。当該技術における幹細胞種からＣＯＬ２Ａ１の発現を誘導することが可能である本発明の細胞株の顕著な差異の別の非限定例は、ＭＳＣのマーカーとして知られる遺伝子ＫＣＮＫ２（ＮＭ＿００１０１７４２５．２）の発現を測定することによって理解することができる。表３に示されるように、ＫＣＮＫ２は、ＭＳＣ、脂肪細胞幹細胞及び歯髄肝細胞にて高レベルで発現されるが、ＳＭ３０、Ｅ１５、４Ｄ２０．８、ＭＥＬ２及びＳＫ１１のようなＣＯＬ２Ａ１の発現を誘導することが可能である本発明の幾つかの細胞株では検出可能ではなかった。本発明の細胞株と骨髄由来のＭＳＣの際立った差異は、細胞種における重要な治療上の差異を示す遺伝子においても見られる。ＭＳＣはインビトロで分化すると肥大軟骨細胞への形質転換を受けることに悩まされる。肥大軟骨細胞は、血管形成を誘導するのに有用な遺伝子を発現し、後に骨芽細胞によって侵襲されて骨を作る一時的なマトリクスを提供する。従って、関節に注入する場合、又はさもなければ関節軟骨に移植する場合、関節軟骨の外傷、関節炎の治療、又は関連する用途で組織を再生する尽力においてＭＳＣは上手く機能しない。ＭＳＣが肥大軟骨細胞のマーカーであるＩＨＨを非常に高いレベルで発現する一方で、本発明の細胞株は本明細書の軟骨形成条件で誘導される場合、ほとんどＩＨＨを発現しないか、発現してもわずかである。同様に、細胞株４Ｄ２０．８は肥大軟骨細胞の別のマーカーであるＣＯＬ１０Ａ１を検出可能なレベルで発現しなかったが、ＭＳＣはその転写物を非常に高いレベルで発現した。従って、７ＳＭＯＯ３２、４Ｄ２０．８、ＳＭ３０及びＥ１５のような本発明の細胞株は、関節軟骨の病理の修復のための永続軟骨に分化するその能力でＭＳＣより優れているマーカーを示す。培養されたヒト骨髄ＭＳＣ、脂肪細胞幹細胞、及び成人歯髄幹細胞と比べた細胞株ＳＫ１１、７ＳＭＯＯ３２、４Ｄ２０．８、ＭＥＬ２、ＳＭ３０及びＥ１５における差異のさらなる非限定例は、表３に示される、又は表３におけるような本明細書で記載されるものと細胞の遺伝子発現マーカーを比較することによって理解することができる。従って、これらの結果は、この選抜で特定された細胞株は新規であり、ＭＳＣを特定するのに一般に使用されるマーカーはヒトの胚性前駆細胞株において軟骨形成能を予測せず、前記細胞株が、軟骨形成の真のマーカーを発現する軟骨形成刺激に応答する株の小さなサブセットであることを予測するマーカーは現在存在しないことを示唆している。証拠は、軟骨形成の組織学的証拠の実施例７で提供される。

実施例１０
インビトロの連続継代に対する細胞株の安定性を判定するために、未分化状態及び１４の微細塊及び上述のような（実施例９）アルギン酸ビーズにて、定期的にＲＮＡを単離しながら、細胞株４Ｄ２０．８、Ｅ１５、ＳＭ３０及びｈｂｍＭＳＣを連続継代した。アルギン酸ビーズにてＰ１２と比較した継代３３の細胞株４Ｄ２０．８はほぼ同一レベルのＣＯＬ２Ａ１を示したが、ｈｂｍＭＳＣは、老化のために匹敵する継代で比較することはできなかった。

Claims

軟骨を生成する医薬の製造における、
（ａ）軟骨を生成することができるクローン性に精製した胚性前駆細胞株であって、ＣＤ７４、ＣＤ９０、ＣＤ１６６、ＩＴＧＡ２、ＫＣＮＫ２及びそれらの組み合わせから成る群から選択される１以上の遺伝子の発現について陰性である胚性前駆細胞株と、
（ｂ）薬学上許容可能なキャリア
を含む胚性前駆細胞株組成物の使用。
胚性前駆細胞株がＣＤ７４の発現について陰性である請求項１の使用。
胚性前駆細胞株がさらに、ＨＯＸ遺伝子及びＰＩＴＸ１から成る群から選択される１以上の遺伝子の発現について陰性である請求項２の使用。
胚性前駆細胞株が、ＣＯＬ１０Ａ１マーカーの発現の非存在下で軟骨を生成する請求項１の使用。
胚性前駆細胞株が、ＳＭ３０、Ｅ１５、４Ｄ２０．８、７ＳＭＯＯ３２、ＭＥＬ２、ＳＫ１１及び７ＰＥＮＤ２４及びそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項１の使用。
胚性前駆細胞株組成物が軟骨の損傷を有する対象者に投与される請求項１の使用。
軟骨の損傷が関節軟骨の損傷である請求項６の使用。
薬学上許容可能なキャリアが、ヘタスターチ；ヒアルロナン及びそのポリマー；コンドロイチン硫酸；Ｉ型コラーゲン；ＩＩ型コラーゲン；ＩＩＩ型コラーゲン；ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸及びそれらのコポリマー；アルギン酸；アガロース；ポロキサマー；フィブリン；キチン；及びキトサン及びこれらの組み合わせから成る群から選択される組成物を含む請求項１の使用。
胚性前駆細胞株が、対象者への投与に先立って軟骨細胞を誘導する条件下で培養される請求項６の使用。
損傷された軟骨を時間とともに修復する速度を測定する、請求項６の使用。
インビトロで軟骨を産生する方法であって、軟骨産生条件下にて、ＳＭ３０、Ｅ１５、４Ｄ２０．８、７ＳＭＯＯ３２、ＭＥＬ２、ＳＫ１１及び７ＰＥＮＤ２４及びそれらの組み合わせから成る群から選択され、かつ、ＣＤ７４、ＣＤ９０、ＣＤ１６６、ＩＴＧＡ２及びＫＣＮＫ２から成る群から選択される１以上の遺伝子の発現について陰性である、クローン性に精製した胚性前駆細胞株を培養することを含む方法。
胚性前駆細胞株が、ＣＤ７４の発現について陰性である請求項１１の方法。
胚性前駆細胞株がさらに、ＨＯＸ遺伝子及びＰＩＴＸ１から成る群から選択される１以上の遺伝子の発現について陰性である請求項１２の方法。
胚性前駆細胞株が、ＣＯＬ１０Ａ１マーカーの発現の非存在下で軟骨を生成する請求項１３の方法。
軟骨産生条件が、軟骨細胞培養条件；胚性前駆細胞株を合成マトリクス又は生体吸収性不動化媒体に含浸させること；及び胚性前駆細胞株を成形構造に入れることから成る群の１以上から選択される請求項１１の方法。
方法がさらに、胚性前駆細胞株によって産生された軟骨をヒトを除く対象に移植することを含む請求項１１の方法。
キットであって、
（ａ）ＣＤ７４、ＣＤ９０、ＣＤ１６６、ＩＴＧＡ２及びＫＣＮＫ２から成る群から選択される１以上の遺伝子の発現について陰性である胚性前駆細胞株と
（ｂ）前記細胞株から軟骨産生を誘導する試薬
を含むキット。
胚性前駆細胞株が、ＳＭ３０、Ｅ１５、４Ｄ２０．８、７ＳＭＯＯ３２、ＭＥＬ２、ＳＫ１１及び７ＰＥＮＤ２４及びそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項１７のキット。
軟骨産生を誘導する試薬が軟骨細胞培養試薬を含む請求項１７のキット。
ＳＭ３０、Ｅ１５、４Ｄ２０．８、７ＳＭＯＯ３２、ＭＥＬ２、ＳＫ１１及び７ＰＥＮＤ２４及びそれらの組み合わせから成る群から選択されるクローン性に精製した軟骨細胞前駆細胞株。
ＣＤ７４、ＣＤ９０、ＣＤ１６６、ＩＴＧＡ２及びＫＣＮＫ２から成る群から選択される１以上の遺伝子の発現について陰性である請求項２０の細胞株。
前記軟骨細胞前駆細胞株が、ＨＯＸ遺伝子及びＰＩＴＸ１から成る群から選択される１以上の遺伝子の発現についてさらに陰性である請求項２０の細胞株。
軟骨細胞前駆細胞株が、ＣＯＬ１０Ａ１マーカーの発現の非存在下で軟骨を生成する請求項２０の細胞株。