CN112048563B - 一种利用软骨特异性基因表达程度控制软骨质量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用软骨特异性基因表达程度控制软骨质量的方法，利用CRTL1基因表达程度控制培养软骨细胞质量，确保体外扩增培养的软骨细胞移植后在体内可以形成健康的软骨。利用本发明方法筛选得到的软骨在体内具有良好的软骨组织形成能力、修复能力。本发明方法方便快捷，为提高软骨培养质量奠定基础。

Description

一种利用软骨特异性基因表达程度控制软骨质量的方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种利用软骨特异性基因表达程度控制软骨质量的方法。
背景技术
培养软骨是世界上公认的治疗软骨损伤的有效方法。培养软骨是从患者的膝盖非加重区域去少量的软骨组织，用酶消化提取软骨细胞，并对软骨细胞进行扩增后，把培养软骨移植到膝盖软骨的缺口上。那么，在体外扩增的培养软骨细胞被移植后在体内到底能否形成正常的软骨，这是保证培养软骨质量保证的重要课题。
软骨细胞在体内时，软骨细胞的特异性基因的表达较高。但在体外的培养软骨细胞，软骨特异性基因AGG，COL-2，SOX-9, CRTL1的表达会随着培养软骨扩增次数的增加而降低，与此同时非特异性基因的表达会随之增加。治疗膝盖软骨损伤的培养软骨通常是把软骨细胞在体外扩增后注入膝盖关节。现有的细胞质量指标主要是细胞数量，生存率（% ofliving cells），细胞的无菌性，含杂质的量，内毒素，支原体等。目前还没有合适的指标可直接细胞在体内软骨的形成能力。如何保证培养软骨细胞质量，以确保被移植细胞能够在体内形成新的弹性软骨是培养软骨是培养软骨产品开发的痛点。
我们认为虽然软骨细胞的特异性基因的表达会随着传代的增加而逐步下降，但这些基因表达只有能保持在一定水平以上就可以确保被移植的培养软骨细胞能够在体内形成新的弹性软骨。然而如何筛选出与软骨质量密切相关的特异性基因，以及如何利用特异性基因的表达程度来管控软骨细胞的质量，是本领域的一大技术难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用软骨特异性基因表达程度控制软骨质量的方法。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
以GAPDH作为内参通过测量培养软骨细胞中软骨特异性基因的表达程度，来控制培养软骨细胞质量，确保培养软骨细胞移植后在体内可以形成健康的软骨。
所述软骨特异性基因为CRTL1基因。
培养软骨细胞的CRTL1基因表达程度大于0.060时，判定为质量良好；所述CRTL1基因表达程度= CRTL1拷贝数/GAPDH拷贝数。
本发明的优点在于：
（1）本发明筛选得到的软骨细胞特异性基因CRTL1与软骨质量能呈现良好的关联关系，CRTL1基因表达程度（CRTL1拷贝数/GAPDH拷贝数）大于0.032时，在3D培养条件下软骨细胞能够生成正常软骨的基质，形成软骨状组织。
（2）本发明判定方法方便快捷，利用本发明方法筛选得到的软骨在体内具有良好的软骨组织形成能力、修复能力。本发明方法方便快捷，为提高软骨培养质量奠定基础。
附图说明
图1为CH6培养软骨细胞经过3D培养28日后形成的软骨状组织；A：培养28日后的3D培养软骨，B:培养28日后的软骨状组织的番红O法(Safranin O)染色结果。
图2为培养软骨细胞传代次数对培养软骨细胞在体内形成软骨能力的影响；A为第3代染色结果；B为第5代染色结果；C为第9代染色结果。
具体实施方式
实施例1 培养软骨细胞，滑膜细胞的CRTL1基因表达水平
将人工关节手术的废弃软骨组织或滑膜组织切成 5mm×5mm 小块，用PBS 液（Gibco）清洗3次后加入浓度为0.25%的胰酶/EDTA和0.2%Ⅱ型胶原酶，500mg软骨加入10mL0.25%的胰酶/EDTA ，10mL 0.2%Ⅱ型胶原酶，37 ℃消化10-20 h后，通过孔径为 50 目筛网滤去杂质，并以350g离心5 min，去上清，加含10％胎牛血清的高糖DMEM （Gibco）培养基制成细胞悬液。以5000个/cm2的细胞密度接种于75cm2摇瓶内，置于饱和湿度、37℃、8%CO2培养箱培养，每2-3天交换培养液1次。待细胞长到80-90%时，0.25%胰蛋白酶/EDTA消化，按1∶5的比例传代，回收第3代细胞用于提取total RNA供real-time PCR分析用。
用NucleoSpin RNA kit（Takara Bio Inc）试剂盒提供的方法从细胞中提取totalRNA，然后用PrimeScriptII 1st strand synthesis kit（Takara Bio Inc）试剂盒提供的方法合成cDNA，按照TaqMan Fast Universal PCR Master Mix（ThermofisherScientific）试剂盒说明进行real-time PCR操作，分析细胞中的CRTL1，GAPDH等基因的拷贝数。
使用的PCR仪器：StepOnePlus（Applied biosystems）
扩增程序为：50℃2min；95℃10min；95℃15sec、60℃10sec，40个循环。
使用PCR引物：
CRTL1上游引物：5’-TGA AGG ATT AGA AGA TGA TAC TGT TGT G-3’；
CRTL1下游引物：5’-GCC CCA GTC GTG GAA AGT AA-3’；
GAPDH上游引物：5’-ATG GGG AAG GTG AAG GTC G-3’；
GAPDH下游引物：5’-TAA AAG CAG CCC TGG TGA CC-3’；
表1是3代培养后的软骨细胞和关节滑膜细胞的CRTL1基因表达程度（CRTL1拷贝数/GAPDH拷贝数）。因个体不同，CRTL1基因表达程度也随之变化。作为参考，我们也分析了滑膜细胞的CRTL1基因表达。表1的滑膜细胞CK3和CK6分别是从与软骨细胞CH3和CH6相同个体的关节滑膜组织分离出来的。与软骨细胞相比，滑膜细胞CRTL1基因表达程度要低2倍左右。
表1各种Lot培养软骨细胞的CRTL1基因表达程度（CRTL1拷贝数/GAPDH拷贝数）
CH1-7：软骨细胞，CK3，CK6:关节滑膜细胞
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例2 3D培养软骨细胞的软骨特异的基质生成能力
为了检查表1中的各种培养软骨细胞有没有软骨损伤修复作用，本发明利用3D培养技术来模仿软骨细胞的体内环境，检验这些培养细胞是否具有软骨组织形成能力。
（1）3D软骨细胞培养是利用海藻酸钠(Alginate)技术，具体方法：
3代培养后的软骨细胞，经过350g×5min离心浓缩后，去掉上清。往细胞沉淀物添加2%海藻酸钠溶液，调制2×106 cells/mL细胞悬浊液。把细胞悬浊液移到10ml注射器吸后，装上22G注射针，把细胞悬浊液往100mM氯化钙溶液滴下，作海藻酸钠水凝胶球，然后用生理食盐水洗3次后，移到6孔细胞培养板6well plate（浮游 细胞培养用），添加5mL含10μg/mL硫酸庆大霉素，FBS（10%）、IGF-I(200ng/mL)、胰岛素10μg/mL)、BMP-7(400ng/mL)、抗坏血酸（25μg/mL）的高糖DMEM （Gibco），置于饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱培养，每2-3天交换培养液1次。
（2）3D培养后的软骨细胞分析：
为了分析软骨细胞的基因表达程度，以及在3D培养环境下，各种培养细胞的软骨组织形成能力，我们把培养开始（0日）及14日后的细胞回收，进行软骨细胞的基因表达以及软骨组织特异的基质生成能力分析。软骨细胞的基因表达是用实例的real-time PCR方法，软骨组织特异的基质糖胺聚糖（Glycolsaminoglycans，GAG)是利用1,-9,-Dimethylmethylene Blue (DMMB)方法检测KIT试剂盒（Proteoglycan Detection Kit、Astarte Biologics）提供的方法来测定。
为了检查3D培养后，软骨细胞能否形成软骨状组织，3D培养28日后的海藻酸钠水凝胶球回收/洗净，用4%多聚甲醛固定切片后，进行番红O软骨染色（Histochemistryvolume 82, P249–255(1985) I. Kiviranta et al Microspectrophotometricquantitation of glycosaminoglycans in articular cartilage sections stainedwith Safranin O）。
培养软骨细胞经过3D培养后，CRTL1基因的表达明显提高（表2）。3D培养的关节滑膜细胞的CRTL1基因表达程度虽然也提高了，但表达水平只有培养软骨细胞的1/3以下。这个结果说明经3D培养后，软骨细胞逐步获得体内软骨细胞的特征。这一点从3D培养后的培养软骨的软骨组织特异的基质糖胺聚糖的生成量的结果（表3）可以得到进一步证明。图1为CH6培养软骨细胞经过3D培养28日后形成的软骨状组织。因软骨细胞在3D环境下生产软骨组织特异的基质使得整个3D培养软骨具有一定的弹性。
表２３D培养14日后各种Lot培养软骨细胞的CRTL1基因表达程度
（CRTL1拷贝数/GAPDH拷贝数）
CH1-7：软骨细胞，CK3，CK6:关节滑膜细胞
Figure 865795DEST_PATH_IMAGE002
表3 培养软骨细胞在3D培养条件下软骨组织特异基质生成量
CH1-7：软骨细胞，CK3，CK6:关节滑膜细胞
Figure DEST_PATH_IMAGE003
实施例3 体内试验
为了确认培养软骨细胞传代次数对培养软骨细胞在体内形成软骨能力的影响。分别将传代3，5，9的培养软骨细胞CH3移植到20周龄兔子膝盖关节软骨缺损（5mm×2.5mm）处。2个月后，取出移植后的软骨组织，用4%多聚甲醛固定后，进行番红0软骨染色。
表4是不同传代的培养软骨细胞CH3的CRTL1基因表达程度（CRTL1考贝数/GAPDH考贝数）, 番红O软骨染色结果。移植传代3的培养软骨到兔子膝盖关节软骨缺损2个月后，软骨缺损的地方几乎填满软骨组织特异基质，显示了良好的软骨损伤修复能力。传代5的培养软骨对软骨缺损的修复效果虽然没有传达3的培养软骨细胞那么快，但大部分的软骨缺损的地方也乎填上了软骨组织特异基质，只有再经过一段时间，就能达到传代3的培养软骨治疗效果。而传代9培养软骨细胞几乎没有形成软骨组织特异基质，在移植后2个月里看不到软骨损伤的治疗效果。
从表4的结果可以看出，CRTL1基因表达程度与细胞的传代数有关。如果CRTL1基因表达程度太低，比如低于0.023，那么培养软骨细胞就没有什么软骨修复能力，大于0.060则修复能力良好，所以CRTL1基因表达程度可以用来控制培养软骨细胞质量指标。
表4 培养软骨细胞传代次数对培养软骨细胞在体内形成软骨能力的影响
Figure 727745DEST_PATH_IMAGE004
除了CRTL1基因以外，根据同样的原理，软骨细胞特异性基因AGG，COL-2，SOX-9等基因表达程度也可以用来控制培养软骨细胞质量指标。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (1)

1.一种非疾病诊断治疗目的的在体外鉴定高活性软骨细胞的方法，其特征在于，以GAPDH作为内参通过测量培养软骨细胞中软骨特异性基因的表达程度，来控制培养软骨细胞质量；所述软骨特异性基因为CRTL1基因；培养软骨细胞的CRTL1基因表达程度大于0.065时，判定为质量良好，即为高活性软骨细胞；所述CRTL1基因表达程度= CRTL1拷贝数/GAPDH拷贝数。
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"Intact human amniotic membrane differentiated towards the chondrogenic lineage";Lindenmair, A等;《CELL AND TISSUE BANKING》;20140702;第15卷(第2期);全文 *
重组人骨形态发生蛋白-2质粒转染诱导人脐血间充质干细胞软骨分化研究;李大伟等;《中华老年骨科与康复电子杂志》;20190405;第5卷(第2期);参见摘要、第77页左栏第3-4段，第80页左栏第1段，图9 *

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