CN108315303B - 一种制备人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法 - Google Patents

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Abstract

一种制备人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法，取对数生长期的人胆囊癌细胞接种在含新生胎牛血清的DMEM培养液中，置于饱和湿度培养箱中培养，在培养液中加入吉西他滨进行诱导，待细胞恢复正常生长时，浓度递增，当细胞能在0.5μmol/L浓度下正常生长、传代时，用1.0μmol/L吉西他滨冲击培养，立即更换吉西他滨浓度为0.5μmol/L的培养基培养5～10天，待细胞稳定生长、传代时，再次冲击，直至细胞能在10.0μmol/L的吉西他滨中生长，获得能够在含有10μmol/L吉西他滨的培养体系中稳定生长、传代的人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系。本发明的方法简便易行、建立时间短；且耐药指数均达10以上。

Description

一种制备人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种细胞系，具体来说是一种制备人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法。
背景技术
胆囊癌是胆管系统最为常见的恶性肿瘤，近年来其发病率呈上升趋势，致死率一直居高不下，主要原因是胆囊癌患者在早期无特异性症状，因此大部分患者就诊时已属晚期，此外，虽然手术切除是目前的主要治疗手段，但80％的患者在确诊时就已发生转移，手术切除率不到30％，术后复发率很高，预后极差，因此药物化疗对于晚期胆囊癌患者尤为重要。
吉西他滨(Gemcitabine，GEM)是一种核苷类抗代谢药物，可以竞争性抑制DNA的合成，导致肿瘤细胞的死亡，广泛用于多种肿瘤的治疗。以吉西他滨为基础联合铂类化疗药已成为晚期胆囊癌的首选治疗方案，但无法避免的是胆囊癌患者会对吉西他滨产生耐药性。
目前关于胆囊癌吉西他滨耐药机制的研究主要集中在耐药相关蛋白以及耐药基因的表达，尚缺乏系统性的研究，尤其是其关键基因及中心环节的信号通路的研究，此外，关于逆转胆囊癌耐药的研究也很少，其主要原因是胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的缺乏。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法，所述的这种制备人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法要解决现有技术中没有合适的细胞系用于研究胆囊癌吉西他滨耐药机制的技术问题。
本发明提供了一种制备人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法，包括如下步骤：
取对数生长期的人胆囊癌细胞接种在含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中，置于37℃、含有CO2体积百分比浓度为5％的饱和湿度培养箱中培养，在上述含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中加入吉西他滨进行诱导，吉西他滨的初始浓度为0.2μmol/L，待细胞恢复正常生长时，以0.1μmol/L浓度递增，当细胞能在含吉西他滨浓度为0.5μmol/L、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液下正常生长、传代时，用含吉西他滨浓度为1.0μmol/L、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击培养12h，然后更换含吉西他滨浓度为0.5μmol/L、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液培养5～10天，待细胞稳定生长、传代时，再次用含1.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击培养12h，直至细胞能在含有1.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中生长，然后以1.0μmol/L的浓度递增，当细胞能在含有4.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中正常生长、传代时，用含有10.0μmol/L的吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击诱导12h，再更换含有吉西他滨浓度为4.0μmol/L、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液培养5～10天，待细胞稳定生长、传代时，再次用含1.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击培养12h，直至细胞能在含有10.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中生长，获得了能够在含有10μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中稳定生长、传代的人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系。
进一步的，所述的人胆囊癌细胞为GBC-SD或者SGC-996细胞。
本发明以人胆囊癌细胞系GBC-SD、SGC-996为亲本细胞，采用吉西他滨(Gemcitabine，GEM)模拟化疗过程，采用大剂量冲击结合逐步增加剂量法，分别建立获得性胆囊癌耐药细胞系GBC-SD/GEM、SGC-996/GEM，并测定其生物学特性以评价耐药细胞系。
本发明建立胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法简便易行、建立时间短；且耐药指数均达10以上。本发明可用于研究胆囊癌对吉西他滨耐药的分子机制、逆转肿瘤耐药的方法及筛选其他抗肿瘤药物，发现肿瘤耐药标志物以及筛选和评估新型抗肿瘤药物等。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明以人胆囊癌GBC-SD、SGC-996细胞为对象，采用逐步增加药物浓度法建立其吉西他滨耐药细胞株，对胆囊癌耐药机制的研究、指导临床用药以及开发、评价新药等具有重要的应用价值。本发明建立所得的两种胆囊癌耐药细胞株可直接用于抗癌药物的敏感性、耐药性机制的研究、筛选和评估新型抗肿瘤药物等。
附图说明
图1倒置显微镜下GBC-SD(A、C)与GBC-SD/GEM(B、D)的形态。
图2倒置显微镜下SGC-996(A、C)与SGC-996/GEM(B、D)的形态。
图3GBC-SD与GBC-SD/GEM的生长曲线。
图4SGC-996与SGC-996/GEM的生长曲线。
图5GBC-SD与GBC-SD/GEM对吉西他滨的耐受性。
图6SGC-996与SGC-996/GEM对吉西他滨的耐受性。
图7胆囊癌细胞及其耐药细胞的平板克隆图(A)；克隆计数(B)。
图8胆囊癌细胞及其耐药细胞的迁移能力(A)；迁移计数(B)。
具体实施方式
实施例1：耐药细胞系的诱导
采用大剂量冲击结合逐步增加剂量法诱导胆囊癌细胞耐药。取对数生长期的人胆囊癌细胞GBC-SD(BNF-2472)与SGC-996(JN-C0997)，(均购自上海榕柏生物技术有限公司)接种在含20％新生胎牛血清的DMEM培养液中，置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养，在含20％新生胎牛血清的DMEM培养液中加入吉西他滨进行诱导，初始浓度均为0.2μmol/L，待细胞恢复正常生长时，以吉西他滨0.1μmol/L浓度递增，当细胞能在含吉西他滨0.5μmol/L、含20％新生胎牛血清的DMEM培养液中正常生长、传代时，用含1.0μmol/L吉西他滨、含20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击培养12h，立即更换含吉西他滨浓度为0.5μmol/L、含20％新生胎牛血清的DMEM培养液培养5～10天，待细胞稳定生长、传代时，再次冲击，直至细胞能在含1.0μmol/L的吉西他滨、含20％新生胎牛血清的DMEM培养液中生长，然后以1.0μmol/L的浓度递增，当细胞能在含吉西他滨4.0μmol/L浓度、含20％新生胎牛血清的DMEM培养液中正常生长、传代时，用含10.0μmol/L的吉西他滨、含20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击诱导12h，立即更换吉含西他滨浓度为4.0μmol/L、含20％新生胎牛血清的DMEM培养液培养5～10天，待细胞稳定生长、传代时，再次冲击，直至细胞能在含10.0μmol/L的吉西他滨、含20％新生胎牛血清的DMEM培养液中生长，历时四个月，最终获得了能够在含有10μmol/L吉西他滨、含20％新生胎牛血清的DMEM培养液中稳定生长、传代的GBC-SD与SGC-996细胞，依次命名为GBC-SD/GEM与SGC-996/GEM耐药细胞。
实施例2：形态学观察
利用倒置相差显微镜观察GBC-SD与SGC-996细胞在吉西他滨诱导前后的细胞形态，并拍照记录。如图1所示，GBC-SD细胞大小形态较规则，轮廓清晰，细胞间结构紧密，而GBC-SD/GEM细胞形态不规则，轮廓模糊，多具长伪足，高倍镜下的GBC-SD/GEM多呈类圆形，无明显的棱角；如图2所示，SGC-996细胞为规则多边形、排列紧密，而SGC-996/GEM细胞看起来较为杂乱，细胞间隙大，具多个伪足。总的来说，经吉西他滨诱导耐药后，GBC-SD与SGC-996细胞的形态均发生了明显的变化。
实施例3：生长曲线的测定
取对数生长期的GBC-SD、SGC-996与其相应的耐药细胞，胰酶消化、接种于96孔培养板中，调整细胞密度为4×104个/mL，每组设5个复孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h后，每天以CCK-8法测定每组在450nm的吸光值A，连续测定5天，以培养天数为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制生长曲线。
如图3所示，第1-2天时GBC-SD细胞生长较慢，在第3天进入生长对数期，第4天生长减缓，进入平台期，其耐药细胞系GBC-SD/GEM的生长趋势与GBC-SD基本一致，整体生长稍慢；与GBC-SD耐药组相比，SGC-996耐药组整体生长较快(图4)，前者的生长峰值仅为2.0左右，而后者的峰值可达3.0左右，与SGC-996相比，SGC-996/GEM生长较慢。综上，两种耐药细胞系的生长均有所减慢。
实施例4：药物浓度—生存率曲线的绘制与耐药指数的测定
取对数生长期的GBC-SD、SGC-996细胞与其耐药细胞，胰酶消化后用培养液调整细胞密度为105个/mL，接种于96孔培养板中，加入适量吉西他滨，使其终浓度依次为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100umol/L，每个浓度设5个复孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养72h后，采用CCK-8法测定每组在450nm的吸光值A，根据下式计算生存率(％)：
生存率(％)＝样品OD均值/对照OD均值×100
以GEM的浓度为横坐标，每组的生存率为纵坐标，绘制药物浓度—生存率曲线，并利用SPSS计算半数抑制浓度(IC50)，根据下式计算耐药指数(RI)。
耐药指数(RI)＝耐药细胞IC50/亲本细胞IC50
两种胆囊癌细胞系及其耐药细胞系对吉西他滨的耐受性如图5、6所示，GBC-SD与SGC-996在低剂量(0.01～0.05umol/L)时对吉西他滨均不敏感，随着浓度的提升，其生存率开始逐步下降；GBC-SD与SGC-996的IC50依次为2.64、8.452umol/L，GBC-SD对吉西他滨具有较高的敏感性，GBC-SD/GEM与SGC-996/GEM的IC50依次为39.16、96.20umol/L，其耐药指数(RI)依次为14.83、11.38，均在十倍以上，提示两种胆囊癌耐药细胞系均对吉西他滨具有良好的耐受性。
实施例5：平板克隆实验
取对数生长期的GBC-SD、SGC-996细胞与其耐药细胞GBC-SD/GEM、SGC-996/GEM，胰酶消化后用培养液调整细胞密度，按每孔400个细胞的密度接种入6孔板，每种细胞设3个复孔，加入适量吉西他滨，使其终浓度为5umol/L，随后置于37℃，5％CO2培养箱中培养7-10天，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养，弃去上清，用PBS清洗小心浸洗2次，加入90％甲醇固定细胞15分钟，然后弃去固定液，PBS洗1次，加适量0.1％结晶紫染色液染10～15分钟，然后用水洗去染色液，空气干燥后拍照记录，计算六孔板中肉眼可见的克隆数，用SPSS进行统计学分析。
如图7所示，在相同浓度GEM处理下，耐药细胞均可以形成较多的克隆，部分克隆较大，而两种对照细胞的克隆稀疏，克隆形成能力均明显减弱，提示对照细胞的生长受到了抑制，而耐药细胞生长良好，克隆形成能力明显提高。
实施例6：Transwell迁移实验
取对数生长期的GBC-SD、SGC-996细胞与其耐药细胞GBC-SD/GEM、SGC-996/GEM，胰酶消化后加入4℃预冷的无血清培养基，轻轻吹打均匀后，收集至离心管中，离心、弃上清，加入适量无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为1.5×105/ml，每个小室加入100uL细胞液，在小室外加入500μL含10％血清的培养基，加入适量吉西他滨，使小室内、外的终浓度均为5umol/L，每个样品设三个平行，随后置于37℃、5％CO2条件下常规培养24h。
培养结束后，弃区小室内培养基，PBS漂洗3次，用棉签擦拭去小室内部的细胞，随后加入适量90％甲醇固定，待甲醇挥去后，加入适量0.1％结晶紫染色液处理10分钟，然后用水洗去染色液，干燥后拍照记录，并在200×光镜下计数5个视野的迁移细胞数，以迁移细胞的数目表示肿瘤细胞的迁移能力。
如图8所示，GBC-SD与SGC-996迁移能力较弱，而GBC-SD/GEM与SGC-996/GEM的迁移数均约为其亲本细胞的两倍左右，迁移能力显著增强，提示胆囊耐药细胞系具有较强的迁移能力。

Claims (1)

1.一种制备人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法，其特征在于包括如下步骤：
取对数生长期的人胆囊癌细胞接种在含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中，所述的人胆囊癌细胞为GBC-SD或者SGC-996细胞，置于37℃、含有CO2体积百分比浓度为5％的饱和湿度培养箱中培养，在上述含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中加入吉西他滨进行诱导，吉西他滨的初始浓度为0.2μmol/L，待细胞恢复正常生长时，以0.1μmol/L浓度递增，当细胞能在含吉西他滨浓度为0.5μmol/L、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液下正常生长、传代时，用含吉西他滨浓度为1.0μmol/L、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击培养12h，然后更换含吉西他滨浓度为0.5μmol/L、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液培养5～10天，待细胞稳定生长、传代时，再次用含1.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击培养12h，直至细胞能在含有1.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中生长，然后以1.0μmol/L的浓度递增，当细胞能在含有4.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中正常生长、传代时，用含有10.0μmol/L的吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击诱导12h，再更换含有吉西他滨浓度为4.0μmol/L、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液培养5～10天，待细胞稳定生长、传代时，再次用含1.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击培养12h，直至细胞能在含有10.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中生长，获得了能够在含有10μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中稳定生长、传代的人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系。
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