CN115927617A - LncRNA LINC01748在胶质瘤诊断、治疗和提高药物敏感性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及LncRNA LINC01748在胶质瘤诊断、治疗和提高药物敏感性中的应用。本发明首次发现LncRNA LINC01748在胶质瘤中的表达情况显著高于正常脑组织，敲减LncRNA LINC01748后，胶质瘤细胞的增殖能力、迁移能力、侵袭能力均产生了显著下降；同时能够提高胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性。上述发现能够用于胶质瘤的诊断、治疗、提高靶向药物敏感性等产品的制备中，具有较大的应用前景。

Description

LncRNA LINC01748在胶质瘤诊断、治疗和提高药物敏感性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及LncRNA LINC01748在胶质瘤诊断、治疗和提高药 物敏感性中的应用。

背景技术

胶质瘤(Glioma)是最常见的颅内原发恶性肿瘤，约占脑部肿瘤的70％以上，因其具有 侵袭生长特征及解剖位置的特殊性，手术无法将其完全切除，患者常表现为高复发率、高致 残率及低治愈率，预后较差。近年来，虽然胶质瘤治疗在免疫治疗、基因治疗及溶瘤病毒疗 法等方面取得了一定进展，但大都局限于临床试验中。

替莫唑胺(temozolomide，TMZ)因其良好的血脑屏障通透性以及突出的治疗效果，为 恶性脑胶质瘤外科手术切除后治疗的必要首选化疗药物，但仍有相当一部分胶质瘤患者对替 莫唑胺表现为原发性或继发性耐药，而导致化疗失败。更重要的是，越来越多的研究表明： 替莫唑胺耐药机制涉及DNA损伤修复、细胞信号通路异常、肿瘤微环境等，其耐药机制复杂。因此，深入探究胶质瘤替莫唑胺耐药的分子机制，在分子水平上为胶质瘤患者实行个体 化精准治疗提供理论依据，已成为亟待解决的热点与难点。

长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA。越来越多的研究结果发现，多种长链非编码RNA的异常表达与人类重大疾病密切相关。近期发表的大量研究结果显示，lncRNA在肿瘤细胞中有着举足轻重的调控作用，特定的lncRNA的异常表达直接影响到肿瘤的发生发展、转移、耐药等过程。同时，已有一些研究表明单个lncRNA的 表达情况能够为肿瘤诊断和预后提供帮助。在实际临床工作中，一些癌症的诊断已经开始使用分子标志物。

目前，有关lncRNA在胶质瘤的发病机制、疾病诊断及治疗方面的研究依然非常欠缺。 因此，胶质瘤中长链非编码RNA的研究具有很重要的价值和意义，特别是寻找胶质瘤发生、 发展相关的lncRNA对肿瘤的诊断和评估预后、指导个体化精准治疗具有重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供或其抑制剂在制备治疗胶质瘤药物中的应用。

LncRNA LINC01748的序列如下所记载：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NR_14650 8.1，具体为：

申请人发现敲减/沉默LncRNA LINC01748后，胶质瘤细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭 能力均产生了显著下降。本申请由中国国家自然科学基金(No.81860664，82060680)以及江 西省自然科学基金(NO.20202BABL216080，20192BAB215063)资助。

上述发现表明LncRNA LINC01748在胶质瘤发病过程及化学治疗中发挥了重要作用，可 以作为诊疗胶质瘤的新的分子标记和药物靶点，从而指导临床医生进行干预和治疗，提高患 者的生存率和生存质量，具有较大的应用前景。

其中，优选所述抑制剂为siRNA-LINC01748；所述siRNA-LINC01748的靶序列为GACCTTCGGAGCTGAATAA。

本发明的第二个目的在于提供检测LncRNA LINC01748的试剂在制备胶质瘤诊断试剂或 胶质瘤诊断试剂盒中的应用。

其中，优选所述检测LncRNA LINC01748的试剂包括引物对，所述引物对的正向引物的 序列为：F:5′-TCATCCCACATTTGGAGCAC-3′；反向引物的序列为： R:5′-CCCATGTAGCAGACTCCTACTCA-3′。

本发明的第三个目的在于提供一种胶质瘤诊断评估试剂盒，所述试剂盒包括上述检测 LncRNA LINC01748的试剂。

优选地，上述试剂盒还包括TB green、ddH₂O和cDNA模板。其中，反应体系为20μL，正向引物和反向引物的浓度均为10μM。其中，20μL的反应体系具体为：TB green 10μL， 正向引物和反向引物各0.8μL，ddH₂O 6.4μL，cDNA模板2μL。

本发明的第四个目的在于提供LncRNA LINC01748或其抑制剂在制备提高胶质瘤细胞对 伊立替康的敏感性的产品中的应用。优选所述抑制剂为siRNA-LINC01748；所述siRNA-LINC01748的靶序列为GACCTTCGGAGCTGAATAA。发明人发现敲减/沉默LncRNALINC01748后，能够增加替莫唑胺的药物敏感性。

本发明的有益效果为：本发明首次发现敲减LncRNA LINC01748后，胶质瘤细胞的增殖 能力、迁移能力、侵袭能力均产生了显著下降；同时能够提高胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感 性。上述发现能够用于胶质瘤的诊断、治疗、提高靶向药物敏感性等产品的制备中，具有较 大的应用前景。

附图说明

图1所示为lncRNA LNC01748在胶质瘤组织与正常脑组织中表达情况的结果图；

图2所示为lncRNA LINC01748在不同胶质瘤细胞HS683、U87、T98G、U251中的表达情况的结果图。

图3所示为shRNA-LINC01748对LINC01748的RNA表达情况的作用结果图；

图4所示为敲减LINC01748对胶质瘤细胞增殖能力影响的结果图；

图5所示为干扰LINC01748对胶质瘤细胞增殖能力影响的结果图；

图6所示为敲减LINC01748对胶质瘤细胞迁移能力影响的结果图；

图7所示为干扰LINC01748对胶质瘤U251、T98G细胞侵袭能力影响的结果图；

图8所示为干扰LINC01748对胶质瘤细胞U251、T98G替莫唑胺药物敏感性影响的结果 图；

图9所示为干扰LINC01748对胶质瘤细胞U251、T98G替莫唑胺药物敏感性影响的结果 图。

图10所示为干扰LINC01748对胶质瘤细胞U251、T98G替莫唑胺药物敏感性影响的结 果图。

具体实施方式

以下将结合实施例和附图对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以 充分地理解本发明的目的、方案和效果。

实施例1：

一、胶质瘤中差异表达的lncRNA筛选

1、TCGA数据库分析筛选IncRNA

方法：申请人前期通过胶质瘤及正常脑组织(3vs3)进行lncRNA测序的方式，发现LINC0 1748为新近发现的lncRNA，但其在胶质瘤中的作用及机制尚未阐明。为探究LINC01748在 胶质瘤中的表达情况及临床意义，通过生物信息学分析TCGA-GTEx数据库中胶质瘤及正常 脑组织中(Tumor，n＝689；Normal，n＝1157)lncRNA的表达谱数据，绘制散点图。

结果：如图1A 所示，LINC01748在胶质瘤中的表达显著高表达于正常脑组织(p＜0.00 1)。Normal组的中位数为0.411(0.214-0.66)，Tumor组的中位数为0.566(0.299-0.956)。

2、临床样本验证

方法：采用RT-qPCR方法对本院收集的胶质瘤及正常脑组织样本(Tumor，n＝68；Nor mal，n＝20)中检测LINC01748的表达情况。

本实施例公开的一种LINC01748诊断检测方法，收集胶质瘤及正常脑组织样本，利用Q IAGEN的组织RNA提取试剂盒提取RNA样品，具体操作详见说明书。

(1)逆转录反应：

采用TAKARA公司的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(PerfectReal Tim e)(货号：RR047B)进行lncRNA反转录，去除基因组DNA反应，在EP管中加入gDNAEraser 1μL、5×gDNA Era Bμffer 2μL，Total RNA 1μg，加Rnase Free ddH₂O使总体积 至10μL，置于PCR仪中反应条件为42℃加热2min，4℃，+∞。

逆转录反应：将5×primescript Buffer 24μL，RT primer Mix 1μL，PrimescriptRT En zyme Mix 1μL，RNase Free ddH₂O 5.0μL，混合后加入上述EP管中一起混合共20μL，置于PCR仪中反应条件为37℃，15min；85℃，5s；4℃，+∞。

(2)引物设计

根据GCBI中LINC01748及GAPDH基因的序列，设计RT-qPCR扩增引物，各由广州锐博生物技术公司及上海生工公司合成。具体引物序列如下：

LINC01748基因：

正向引物为：F:5′-TCATCCCACATTTGGAGCAC-3′；

反向引物为：R:5′-CCCATGTAGCAGACTCCTACTCA-3′；

GAPDH基因：

正向引物为：F:5′-CCCATCACCATCTTCCAGGAG-3′；

反向引物为：R:5′-GTTGTCATGGATGACCTTGGC-3′；

(3)RT-qPCR扩增检验

采用TAKARA公司的TB green premix Ex Taq II(货号：RR820B(A×2))试剂盒，进行扩 增，实验操作按产品说明书进行。

采用20μL反应体系：TB green 10μL，正反向引物(10μM)各0.8μL，ddH₂O 6.4μL，cDNA 模板2μL。

置于荧光定量PCR仪中扩增程序为：第一步变性95℃30s；第二步PCR反应95℃5 s，60℃30s；40个循环，第三步溶解曲线95℃10s，65℃5s。每个样本设置3个平行 管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性，并按照2^-ΔCt法计算相对表达量。

(4)结果

结果如图1B所示，发现LINC01748其在胶质瘤组织中表达显著增高(图1B,Tumor，n＝68； Normal，n＝20，p＜0.01)，与前期的生信分析结果一致，因此，推断：在胶质瘤中LINC01748 表达情况显著高于正常脑组织。

二、LINC01748在胶质瘤细胞系中的表达情况

1、细胞培养

将胶质瘤HS683、U87、T98G、U251细胞，培养于含有10％FBS的DMEM培养基中，于5％CO₂，37℃的恒温培养箱中进行培养。

2、转染

本申请所构建的LINC01748 shRNA由汉恒生物以LINC01748的siRNA靶序列相关信息 进行合成，siRNA靶序列信息如下siRNA-LINC01748，GACCTTCGGAGCTGAATAA。

转染：以6孔板为例，转染前一天采用胶质瘤细胞U251、T98G细胞铺板，用含有10％FBS的DMEM完全培养基培养。待细胞生至长融合度达60％时，对细胞进行转染。转染前 先除去旧的细胞培养液，PBS清洗两遍后，每孔加入1.5mL完全培养基。随后配制转染体系： 在3个1.5mL EP管中各加入250μL Opti-MEM，再分别加入5μL HNRNPC siRNA、NC片 段，另一组不加干扰片段设置为Control组，轻轻混匀后静置5min；另取3个1.5mL EP管 中各加入250μL Opti-MEM，再分别加入5μL lipo3000，轻轻混匀后静置5min。最后将两个 体系轻轻混匀，静置20min后分别加入各孔中。

3、RT-qPCR检测LINC01748的表达水平

(1)细胞转染48h后，使用Trizol法提取细胞总RNA；

(2)RT-qPCR检测LINC01748的表达水平，操作步骤如下：

采用TAKARA公司的TB green premix Ex Taq II(货号：RR820B(A×2))试剂盒，进行扩 增，实验操作按产品说明书进行。

采用20μL反应体系：TB green 10μL，正反向引物(10μM)各0.8μL，ddH₂O 6.4μL，cDNA 模板2μL。

置于荧光定量PCR仪中扩增程序为：第一步变性95℃30s；第二步PCR反应95℃5 s，60℃30s；40个循环，第三步溶解曲线95℃10s，65℃5s。每个样本设置3个平行 管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性，并按照2^-ΔCt法计算相对表达量。

4、实验结果

结果：如图2所示，在高级别胶质瘤细胞U87、T98G、U251中LINC01748的表达显著高于低级别胶质瘤HS683细胞中的表达情况，且T98G、U251表达LINC01748最高。因此 选择这两个细胞系进行后续实验。

如图3所示，在胶质瘤U251、T98G细胞系中，shRNA-LINC01748可显著下调LINC01748 的RNA表达(p＜0.01,p＜0.05)。

三、沉默LINC01748可抑制胶质瘤细胞的增值能力

1、MTS实验

实验方法：取采用DMEM培养的对数生长期胶质瘤U251、T98G细胞，种于96孔板中，每孔3000个细胞，转染NC及shRNA-LINC01748，继续培养24h、48h、72h、96h，采用 MTS分别检测各时间点细胞增殖情况。取至时间点的细胞，除去原培基，根据MTS： DMEM＝1:9比例配制工作液，混匀后各取100μL工作液加至每孔中。置于细胞培养箱37℃ 孵育30min，酶标仪于490nm波长处检测吸光度。

实验结果：如图4所示，与NC组对比，敲减LINC01748后胶质瘤U251、T98G细胞增 殖能力显著下降(96h，U251 p＜0.001；T98G p＜0.001)。

2、EDU实验

取对数生长期U251和T98G细胞，细胞接种于96孔板中。采用NC及shRNA-LINC01748转染48h后，每孔加入100μL 50μM EdU培养基(1000：1的比例稀释EdU试剂A)孵育2 小时。PBS洗涤2次，每孔加入1mL 4％多聚甲醛固定30min；PBS洗涤1次，每孔加入100 μL通透液(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10min；PBS清洗1次，每孔加入100μL 的1×Apollo染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30min；PBS清洗1次，每孔加入100 μL 1×DAPI染色液30min。PBS清洗1-3次，在荧光显微镜拍照统计数据。

其结果如图5所示，与NC组对比，敲减LINC01748可明显抑制胶质瘤细胞的增值，增殖能力降低。

四、沉默LINC01748可抑制胶质瘤细胞的迁移、侵袭能力

1、划痕实验

实验方法：取采用DMEM培养的对数生长期胶质瘤U251、T98G细胞，种于6孔板中，细胞生长融合度达60％时，转染NC及shRNA-LINC01748；待细胞长至90％时划痕，首先 用黑色细记号笔在6孔板背面孔中间画一条直线，并用1mL进口Tip在孔内垂直之前划过的 黑线划3条平行直线，PBS轻轻将刮掉的游离细胞清洗两遍，并将培养液更换为含有2％FBS 的DMEM，在倒置显微镜下每组随机选取3个固定位置记录划痕宽度，分别于0小时，24 小时进行拍照，进而比较不同组细胞的迁移速度。

实验结果：如图6所示，与NC组对比，敲减LINC01748后胶质瘤U251、T98G细胞迁 移能力显著下降(U251 p＜0.001；T98G p＜0.001)。

2、Transwell实验

实验方法：

(1)将基质胶与预冷的无血清DMEM以1:8比例进行稀释，并迅速用预冷的200μLTip 吹打混匀，每个traswell小室中各均匀加入60μL混合液，轻轻敲打24孔板的四个边缘，使 基质胶混悬液均匀铺于小室底内，24孔板置于恒温细胞培养箱；

(2)将胶质瘤U251、T98G细胞预先转染NC及shRNA LINC01748，24小时后分别进 行消化、重悬、并用无血清培基进行稀释，弃去小室中的液体，各向小室内加入体积约为200 μL含有3000个细胞的不同处理组的胶质瘤细胞悬液；并向transwell小室底部与24孔板底部之间的间隙中加入600μL含10％FBS的DMEM培养基；置于恒温培养箱培养24小时后， 将小室内与外的培养基用Tip吸取丢弃，并用PBS预先湿润的棉棒将上室内的细胞轻轻擦去；

(3)将transwell小室用PBS轻轻清洗两遍，吹干小室，4％多聚甲醛固定小室10分钟； 去除多聚甲醛，PBS轻轻清洗两遍，加入0.1％的结晶紫染色液，染色两个小时，PBS清洗两 遍，并在显微镜下随机选取五个视野，计算穿过基底膜的平均细胞数。

实验结果：如图7所示，与NC组对比，敲减LINC01748后胶质瘤U251、T98G细胞侵 袭能力显著下降(U251 p＜0.001；T98G p＜0.001)。

五、沉默LINC01748对胶质瘤替莫唑胺药物敏感性的影响

1、MTS实验

实验方法：通过MTS实验(操作步骤同三)，检测LINC01748对交胶质瘤细胞替莫唑胺药物敏感性的影响。将LINC01748干扰24h后，分别加入含有替莫唑胺(TMZ)浓度为0、100、200、400、800μm的培养基，继续培养72小时并检测每组细胞生存率。

实验结果：如图8所示，当干扰LINC01748后，胶质瘤U251、T98G细胞的生存率明 显下降(图4)，即胶质瘤细胞对一线化疗药物替莫唑胺的药物敏感性显著增加。

2、流式细胞仪检测细胞凋亡实验

实验方法：将胶质瘤U251、T98G细胞干扰LINC01748 12h后，加入含胶质瘤细胞一线化疗药物替莫唑胺的培养基继续培养72h。收集上清离心，PBS清洗2遍，胰酶消化并收 集细胞转移至已收集的上清细胞的EP管中，3000rpm离心10min，弃去上清；PBS洗涤后，个样本加入195μL结合液重悬细胞，依次加入5μL Annexin V-FITC及10μL碘化丙啶后， 轻轻混匀，室温避光孵育20min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

实验结果：如图9所示，干扰LINC01748后，并通过替莫唑胺处理的胶质瘤细胞凋亡数 目显著增加(图9的A和B)。即研究结果表明，干扰LINC01748后可显著提高胶质瘤细 胞U251、T98G对替莫唑胺的药物敏感性。

3、Hoechst染色检测细胞凋亡实验

实验方法：将胶质瘤U251、T98G细胞干扰LINC01748 12h后，加入含胶质瘤细胞一线化疗药物替莫唑胺的培养基继续培养72h。弃掉旧培基，加入适量的4％多聚甲醛固定细胞 30min。弃掉多聚甲醛后PBS清洗2-3遍，加入适量Hoechst 33342荧光抗猝灭剂染色20min后，立即在荧光显微镜中观察细胞凋亡情况。

实验结果：如图10所示，Hoechest染色结果表明，干扰LINC01748后并通过替莫唑胺 处理的胶质瘤U251、T98G细胞凋亡数目显著增加，增加了胶质瘤细胞对替莫唑胺的药物敏 感性。

以上MTS实验、流逝细胞仪检测细胞凋亡实验以及Hoechst染色检测细胞凋亡实验结果 均表明，干扰LINC01748可提高胶质瘤细胞对替莫唑胺的药物敏感性。即lncRNALINC01748 在胶质瘤一线化疗药物替莫唑胺化学治疗中发挥重要作用。

总结：本发明前期通过高通量lncRNA测序以及对TCGA胶质瘤相关信息进行生物信息 学分析发现，lncRNA LINC01748在胶质瘤中显著高表达，且通过本院样本库样本验证发现， 结果与生物信息学分析结果一致，即LIN01748在胶质瘤组织中的表达情况显著高于正常脑 组织织样本中的表达情况。且通过MTS实验、EDU实验、划痕实验、Transewell实验，也进一步表明干扰lncRNA LINC01748的表达可显著抑制胶质瘤的增值及侵袭能力。此外，MTS实验、流逝细胞仪检测细胞凋亡实验以及Hoechst染色检测细胞凋亡实验结果均表明，干扰LINC01748可提高胶质瘤细胞对一线化疗药物替莫唑胺的药物敏感性。表 明lncRNALINC01748在胶质瘤诊断、发病过程及化学治疗中发挥重要作用，可以作为诊疗 胶质瘤的新的分子标记和药物靶点，从而指导临床医生进行干预和治疗，提高患者的生存率 和生存质量，具有较大的应用前景。

以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以 相同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范围内其 技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。

Claims (10)

1.LncRNA LINC01748或其抑制剂在制备治疗胶质瘤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为siRNA-LINC01748；所述siRNA-LINC01748的靶序列为GACCTTCGGAGCTGAATAA。

3.检测LncRNA LINC01748的试剂在制备胶质瘤诊断试剂或胶质瘤诊断试剂盒中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，检测LncRNA LINC01748的试剂包括引物对，所述引物对的正向引物的序列为：F:5′-TCATCCCACATTTGGAGCAC-3′；反向引物的序列为：R:5′-CCCATGTAGCAGACTCCTACTCA-3′。

5.一种胶质瘤诊断评估试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求4中所述的试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括TB green、ddH₂O和cDNA模板。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，反应体系为20μL，正向引物和反向引物的浓度均为10μM。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，20μL的反应体系具体为：TB green 10μL，正向引物和反向引物各0.8μL，ddH₂O 6.4μL，cDNA模板2μL。

9.LncRNA LINC01748或其抑制剂在制备提高胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性的产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为siRNA-LINC01748；所述siRNA-LINC01748的靶序列为GACCTTCGGAGCTGAATAA。

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