KR101704666B1 - 시험관내 및 생체내 연골형성을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 양상은 연골형성을 수행할 수 있는 배아 전구세포주의 생산, 확인 및 사용에 관한 방법 및 조성물을 포함한다. 원시 줄기세포로부터 유도된 다수의 예시적인 연골형성 세포주가 기술된다. 본 발명에 기술된 연골형성 세포주는 강건하며, >40 계대 동안 팽창할 수 있고, 부위 특이적 순도를 가지며, 따라서 연구 및 치료에 사용하기 위한 독특한 분자 조성을 갖는 다양한 연골 타입을 생산하는 조성물 및 방법을 제공할 수 있다.

Description

시험관내 및 생체내 연골형성을 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR IN VITRO AND IN VIVO CHONDROGENESIS}
교차 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)에 따라 이하의 임시 특허출원의 혜택을 청구한다: 2009년 7월 16일에 출원된 특허출원 제61/226,237호 (발명의 명칭: "Methods and Compositions Useful for In Vitro and In Vivo Chondrogenesis Using Embryonic Progenitor Cell Lines"); 2009년 9월 18일에 출원된 특허출원 제61/243,939호 (발명의 명칭: "Improved Methods of Screening Embryonic Progenitor Cell Lines"); 2010년 5월 27일에 출원된 특허출원 제61/349,088호 (발명의 명칭: "Improved Methods of Screening Embryonic Progenitor Cell Lines"); 및 2010년 7월 16일에 출원된 특허출원 제61/365,308호 (발명의 명칭: "Methods and Compositions for In Vitro and In Vivo Chondrogenesis"). 이들 출원은 각각 참조함으로써 그 전문이 본원에 통합된다.
연골의 제한된 증식능은 외상 또는 변성 질환으로 인한 손상을 수복하는 신체의 자연적 능력을 제한한다. 예를 들어, 골관절염 (OA)은 65 세 이상의 개체 (2100만 미국인)의 70% 까지가 앓고 있다. 반월판 또는 전방십자인대에 대한 상해는 종종 환자를 관절염의 위험이 증가한 상태로 만든다. 골관절염은 연골하골의 통증성 노출을 초래하는 관절 표면상에서의 연골의 진행성 상실을 특징으로 한다. 관절 연골에 대한 이러한 상해에 의해 인간 조직은 수복능을 거의 나타내지 않는다. 선천적인 수복반응의 결과로 나타나는 신생 연골은 일반적으로 자연적으로는 섬유상이며, 따라서 수복에 부적합하다.
다양한 치료학적 레지멘이 연골 손상을 갖는 대상체를 치료하기 위해서 개발되었다. 이들 치료의 예로는 기계적 수단을 사용하여 대상체에서 연골 생산을 유발시키고자 하는 방법 (예를 들어, 드릴링 (drilling), 미세골절술, 연골성형술 및 해면화 (spongialization)와 같은 박리 및 미세골절술; 질병에 걸린 연골의 제거와 연골 재성형을 조합한 레이저-보조 치료방법) 및 손상된 부위에 대한 조직의 이식 (또는 그래프트 (grafting))에 의존하는 치료법 (예를 들어, 골막 그래프트, 골연골 그래프트 (모자익성형술 (mosaicplasty)), 및 관절연골 페이스트 (paste) 그래프트)이 포함된다. 이들 치료법의 성공률은 다양하며, 일부는 조직 괴사, 반응성 활막염, 연골용해증 및 관절연골 변성의 가속화를 포함하는 잠재적인 유해 부작용을 갖는다.
자가 연골세포 치료법 (ACT)으로 알려진 세포-기본 연골 치료 레지멘은 연골로부터 연골세포의 분리, 시험관내에서 세포의 팽창, 및 지지 매트릭스 (또는 다른 단백질 또는 프로테오글리칸)가 있거나 없이 환자에 대한 이들 팽창된 세포의 투여를 포함한다. ACT 치료법은 시험관내에서 배양하는 경우의 인간 관절 연골세포의 분화뿐만 아니라 그래프트 부위에서 풍부한 연골 매트릭스를 생산하도록 세포를 재-분화시키는데 있어서의 상대적인 어려움에 의해서 복잡하게 된다. 더구나, 단지 소량의 연골을 인간으로부터 수집할 수 있으며, 따라서 단지 소수의 연골세포가 배양의 개시를 위해서 사용될 수 있다. 따라서, 분리된 인간 연골세포를 실제로 이식 치료에 적용하는 데는 어려움이 계속된다.
또 다른 치료학적 전략은 골수 유래 간엽 줄기세포 (hbmMSCs)의 이용이다. 단일 용량의 hbmMSCs (Chondrogen)를 이용하는 임상적 연구는 히알우론산 (HA) 대조군에 비해서 통증의 감소를 나타낸다. 그러나, 간엽 줄기세포 (MSCs)는 연골을 재생시키는데 있어서의 그들의 사용에 관해서 2 가지 장애를 갖는다. 첫째로, 동종 그래프트 (allogeneic graft)로서 세포의 사용은 성숙 MSCs의 제한된 증식능으로 인하여 문제가 있으며, 비록 세포가 일정량의 팽창이 가능하더라도 이들은 종종 비교적 빠르게 연골을 형성하는 그들의 능력을 상실한다. 두 번째 장애는 골수 유래 MSCs와 같은 MSCs가 높은 레벨의 COL10A1 및 IHH 팽창을 특징으로 하는 비대성 연골세포를 형성하는 것이다. 발육시의 이들 연골세포의 역할은 혈관 및 골아세포를 동원한 다음에 사멸시키는 것이다. 비대성 연골세포는 예를 들어, 장골의 성장판 구역에서 관찰된다. 이들은 또한, 이들이 유사하게 골형성에 중요한 역할을 하는 골절의 부위에서도 관찰된다. 따라서, 연골의 외상, 또는 골관절염과 같은 변성 질환의 치료시에 MSCs의 사용은 혼합된 결과를 수득하였다. 또한, 신체에는 다수의 타입의 연골의 있다. 귀의 탄성 연골은 코, 흉골, 기관 및 체중-지탱 관절 (weight-bearing joints)과는 상이한 분자 조성을 갖는다.
따라서, 특히 연골 재생 및 수복의 분야에서의 재생의학의 분야는 비대성인 연골세포와는 대조적인 다양한 타입의 영구적 연골세포의 상업적 양을 생성시키는 신규한 세포성 제제를 필요로 한다.
요약
본 발명의 양상은 연골형성을 수행할 수 있는 배아 전구세포주의 생산, 확인 및 사용과 관련된 방법 및 조성물을 포함한다. 원시 줄기세포로부터 유도된 다수의 예시적인 연골형성 세포주가 기술된다. 본 발명에 기술된 연골형성 세포주는 강건하며, >40 계대 동안 팽창할 수 있고, 부위 특이적 순도를 가지며, 따라서 연구 및 치료에 사용하기 위한 독특한 분자 조성을 갖는 다양한 연골 타입을 생산하는 조성물 및 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 연골형성 마이크로매스 (micromass) 조건의 14일 전 및 후에 qPCR에 의해서 시험한 세포주에서 COL2A1의 유도 레벨을 나타낸다.
도 2는 미분화 및 분화 조건에서 본 발명의 세포주와 함께 MSC 대조군에서 나타나는 연골-관련된 유전자 COL2A1, CRTAC1, CD74, (2A) LECT1, IHH, 및 LHX8 (2B)의 상대적 발현을 나타낸다.
도 3은 모두 펠릿으로의 분화의 제21일에 지방조직 줄기세포와 14 계대시의 세포주 4D20.8과 6 계대시의 MSCs를 비교한 사프라닌 (Safranin) O 염색 및 세포주 4D20.8 및 MSCs의 제14일 펠릿에서 이소타입 대조군에 의한 면역염색을 나타낸다.
도 4는 4D20.8 RGD-알기네이트 (도 4a), E15 RGD-알기네이트 및 SM30 RGD-알기네이트 (도 4b)의 생체내 이식의 결과를 나타낸다.
도 5는 세포주 4D20.8 및 E15의 경우에 초자 연골에서와 유사한 연골세포-양 외관을 나타내는 예시적인 조직학적 영상을 나타낸다.
약어
AFP - 알파 페토프로테인
BMP - 골형성 단백질
BRL - 버팔로 랫트 (buffalo rat) 간
BSA - 소 혈청 알부민
CD - 클러스터 지정 (cluster designation)
cGMP - 현행 우수제조공정 (Current Good Manufacturing Processes)
CNS - 중추신경계
DMEM - 둘베코 (Dulbecco)의 변형된 이글 배지
DMSO - 디메틸 설폭사이드
DPBS - 둘베코의 포스페이트 완충 식염수
EC - 배아암
EC 세포 - 배아암 세포; hEC 세포는 인간 배아암 세포이다.
ECM - 세포외 매트릭스
ED 세포 - 배아 유래 세포; hED 세포는 인간 ED 세포이다.
EDTA - 에틸렌디아민 테트라아세트산
EG 세포 - 배아 생식세포; hEG 세포는 인간 EG 세포이다.
EP 세포 - 배아 전구세포는 원시 줄기세포보다 더 분화된 원시 줄기세포로부터 유도된 세포이며, 즉 이들은 인간 종의 경우에 SSEA4, TRA1-60 또는 TRA-1-81 혈청반응 양성과 같은 마커를 더 이상 나타내지 않지만 완전히 분화되지는 않았다. 배아 전구세포는 발육의 생후 단계와는 대조적으로 배아 단계에 상응한다.
ES 세포 - 배아 줄기세포; hES 세포는 인간 ES 세포이다.
FACS - 형성 활성화 세포 분류
FBS - 태자 소 혈청
GMP - 우수제조실무 (Good Manufacturing Practices)
hED 세포 - 인간 배아 유래 세포
hEG 세포 - 인간 배아 생식세포는 태아 조직의 원시 생식세포로부터 유도된 줄기세포이다.
hEP 세포 - 인간 배아 전구세포는 인간 종으로부터 배아 전구세포이다.
hiPS 세포 - 인간 유도된 다능성 줄기세포는 SOX2, KLF4, OCT4, MYC, 또는 NANOG, LIN28, OCT4, 및 SOX2와 같은 hES 특이적 전사인자에 노출시킨 후에 체세포로부터 수득된 hES 세포와 유사한 특성을 갖는 세포이다.
HSE - 인간 피부 등가물은 시험 목적으로, 또는 창상 수복을 촉진시키는 치료학적 적용을 위해서 제조된 생물학적 또는 합성적 매트릭스와 세포의 혼합물이다.
ICM - 포유동물 배반포-단계 배아의 내부세포 매스 (inner cell mass)
iPS 세포 - 유도된 다능성 줄기세포는 SOX2, KLF4, OCT4, MYC, 또는 NANOG, LIN28, OCT4, 및 SOX2와 같은 ES 특이적 전사인자에 노출시킨 후에 체세포로부터 수득된 hES 세포와 유사한 특성을 갖는 세포이다.
LOH - 이형접합성 (heterozygosity)의 상실
MEM - 최소 필수배지
NT - 핵전이
PBS - 포스페이트 완충 식염수
PS 섬유아세포 - 전-반흔성 (pre-scarring) 섬유아세포는 초기 임신성 피부의 피부로부터 유도되거나, 이들이 반흔 형성이 없이 피부 창상의 빠른 치유를 촉진시킨다는 점에서 유전자 발현의 출생전 패턴을 나타내는 ED 세포로부터 유도된 섬유아세포이다.
RA - 레티노산
RFU - 상대적 형광 유니트
SCNT - 체세포 핵전이
SFM - 무-혈청 배지
SPF - 특이적 병원체-부재
SV40 - 시미안 바이러스 (Simian Virus) 40
Tag - 큰 T-항원
T-EDTA - 트립신 EDTA
정의
용어 "분석적 재프로그래밍 (reprogramming) 기술"은 체세포의 유전자 발현의 패턴을 iPS, ES, ED, EC 또는 EG 세포의 경우와 같은 더 다능성인 상태의 세포의 패턴으로 재프로그래밍하는 다양한 방법을 나타내며, 여기에서 재프로그래밍은 다수의 별개의 단계에서 나타나며, 단순히 체세포의 난모세포로의 전이 및 그 난모세포의 활성화에 의존하지 않는다 [참조: 2001년 11월 26일에 출원된 미국 특허출원 제60/332,510호; 2002년 11월 26일에 출원된 제10/304,020호; 2003년 11월 26일에 출원된 PCT 출원 제PCT/US02/37899호; 2005년 8월 3일에 출원된 미국 특허출원 제60/705625호; 2005년 8월 20일에 출원된 미국 특허출원 제60/729173호; 2006년 7월 5일에 출원된 미국 특허출원 제60/818813호; 2006년 8월 3일에 출원된 PCT/US06/30632, 이들 각각의 기술내용은 참조함으로써 본원에 통합된다].
용어 "할구/상실배 세포"는 포유동물 배아 내의 할구 또는 상실배 세포 또는 이들 세포의 분화된 유도체를 포함하는 추가의 세포가 있거나 없이 시험관내에서 배양된 할구 또는 상실배 세포를 나타낸다.
용어 "세포 발현 유전자 X", "유전자 X는 세포 내에서 발현된다" (또는 세포 집단) 또는 이들의 동의어는 특정의 시험 플랫폼을 사용한 세포의 분석이 양성 결과를 제공하였음을 의미한다. 그 반대도 또한 사실이다 (즉, 유전자 X를 발현하지 않는 세포 또는 그의 동의어는 특정의 시험 플랫폼을 사용한 세포의 분석이 음성 결과를 제공하였음을 의미한다). 따라서, 본 발명에 기술된 모든 유전자 발현 결과는 표시된 유전자에 대한 시험 플랫폼 (또는 플랫폼들)에서 사용된 특정의 프로브 또는 프로브들과 관련이 있다.
용어 "세포주"는 시험관내에서 증식 및 팽창할 수 있는 세포의 사멸성 또는 불멸성 집단을 나타낸다.
용어 "세포성 재구성"은 기능성 세포를 수득하도록 크로마틴의 핵이 세포성 세포질로 전이하는 것을 나타낸다.
용어 "클로날"은 단일 세포를 모두 원래의 단일 세포로부터 유도되고 다른 세포를 함유하지 않는 세포의 집단으로 팽창시킴으로써 수득된 세포의 집단을 나타낸다.
용어 "콜로니 동소 (in situ) 분화"는 콜로니가 미분화된 줄기세포주로 증식된 배양 용기로부터 콜로니를 분리하거나 분해함이 없이 동소에서의 세포 (예를 들어, hES, hEG, hiPS, hEC 또는 hED)의 분화를 나타낸다. 콜로니 동소 분화는 배아체를 형성하는 중간 단계를 이용하지 않지만, 그럼에도 불구하고 배아체 형성, 또는 스피너 배양 (spinner culture)과 같은 그 밖의 다른 응집기술이 콜로니 동소 분화의 기간 다음에 뒤따를 수 있다.
용어 "세포질성 수포 (cytoplasmic bleb)"는 온전하거나, 투과화되었지만 다른 식으로는 온전한 원형질막에 의해서 한정되지만 핵은 없는 세포의 세포질을 나타낸다.
다능성 줄기세포로부터 본 발명의 방법에 의해서 만들어진 세포에 관해서 사용되는 경우에 용어 "분화된 세포"는 모 다능성 줄기세포와 비교한 경우에 분화하는 가능성이 감소된 세포를 나타낸다. 본 발명의 분화된 세포는 더 분화할 수 있는 세포를 포함한다 (즉, 이들은 최종까지 분화되지 않을 수 있다).
용어 "직접 분화"는 미분화된 세포주로서 hES 세포와 같은 분리된 미분화된 줄기세포를 증식시키는 중간단계가 없이 직접, 미분화된 상태 (예를 들어, iPS 세포를 제조하는 방법에서와 같은 상태이지만, 이러한 세포를 미분화된 상태로 정제하기 이전임)로 재프로그래밍된 할구 세포, 상실배 세포, ICM 세포, ED 세포 또는 체세포를 분화시키는 방법을 나타낸다. 직접 분화의 비-제한적 예는 문헌 [Bongso et al, 1994. Human Reproduction 9:2110]에 기술된 바와 같은 온전한 인간 배반포의 배양물로의 배양, 및 인간 ES 세포의 생성이 없는 ED 세포의 유도체화일 수 있다.
용어 "배아 줄기세포" (ES 세포)는 세포주로서 연속적으로 계대되었지만 미분화된 상태를 유지하는 (예를 들어, 종의 ES 세포에 대해서 특이적인 TERT, OCT4, 및 SSEA 및 TRA 항원을 발현하는) 배반포, 할구 또는 상실배의 내부세포 매스로부터 유도된 세포를 나타낸다. ES 세포는 정자 또는 DNA에 의한 난자의 수정, 핵 전이, 단성생식으로부터, 또는 NHC 구역에서의 반접합성 또는 동형접합성으로 hES 세포를 생성시키는 수단에 의해서 유도될 수 있다. ES 세포는 역사적으로 모든 체세포 타입뿐만 아니라 착상전 배아에 이식시킨 경우의 생식세포로 분화할 수 있는 세포로 정의되었지만, 인간을 포함한 모든 종으로부터의 후보 ES 배양물은 배양물에서 더 편평화된 외관을 가지며, 전형적으로 생식세포주 분화에 기여하지 않고, 따라서 "ES-유사 세포"라 칭한다. 인간 ES 세포는 실제로 "ES-유사"한 것으로 통상적으로 믿어지지만, 본 출원에서 본 발명자들은 ES 및 ES-유사 세포주 둘 다를 나타내기 위해서 용어 ES 세포를 사용할 것이다.
용어 "히스토타입 (histotypic) 배양"은 한천의 층 상에서 일부의 세포를 배양할 때 나타나거나, 세포를 콜라겐 겔, 스펀지, 또는 조직 공학에서 통상적으로 사용되는 것과 같은 그 밖의 다른 폴리머 중에서 삼차원으로 배양하는 경우에 나타나는 것과 같은 조직-유사 세포 밀도를 갖는 삼차원 구조를 생성시키도록 응집된 배양된 세포를 나타낸다.
용어 "인간 배아 유래" ("hED") 세포는 할구 유래 세포, 상실배 유래 세포, 내부 세포 매스, 배아 쉴드 (shield) 또는 외배엽의 세포를 포함하는 배반포 유래 세포, 또는 원시 내배엽, 외배엽, 중배엽, 및 신경릉 및 정상적인 인간 발육의 처음 8 주일의 등가물과 상관관계가 있지만 세포주로서 계대된 hES 세포로부터 유도된 세포는 제외한 분화의 상태까지의 이들의 유도체를 포함하는 초기 배아의 그 밖의 다른 전능성 또는 다능성 줄기세포를 나타낸다 [참조: 예를 들어, 미국 특허 제7,582,479; 7,217,569; 6,887,706; 6,602,711; 6,280,718; 및 5,843,780호 (Thomson)]. hED 세포는 정자 또는 DNA에 의한 난자의 수정, 핵 전이, 또는 크로마틴 전이, 단성생식을 통해서 반수성 개체를 형성하도록 유도된 난세포, 분석적 재프로그래밍 기술, 또는 HLA 구역에서의 반접합성 또는 동형접합성으로 hES 세포를 생성시키는 수단에 의해서 생산된 착상전 배아로부터 유도될 수 있다. 용어 "인간 배아 생식세포" (hEG 세포)는 태아 조직의 원시 생식세포, 또는 신체에서 다양한 조직으로 분화할 수 있는 난모세포 및 정조세포와 같은 성숙 중이거나 성숙한 생식세포로부터 유도된 다능성 줄기세포를 나타낸다. hEG 세포는 또한, 자성생식 또는 남성생식 수단, 즉 다능성 세포가 남성 또는 여성 기원의 DNA 만을 함유하는 난모세포로부터 유도되며, 따라서 모든 여성 유래 또는 남성 유래 DNA를 포함할 수 있는 방법에 의해서 생산된 다능성 줄기세포로부터 유도될 수도 있다 [참조: 1999년 10월 28일에 출원된 미국 특허출원 제60/161,987호; 2000년 10월 27일에 출원된 제09/697,297호; 2001년 11월 29일에 출원된 제09/995,659호; 2003년 2월 27일에 출원된 제10/374,512호; 2000년 10월 27일에 출원된 PCT 출원 제PCT/US/00/29551호; 이들의 기술내용은 참조함으로써 그 전문이 본원에 통합된다].
용어 "인간 배아 줄기세포" (hES 세포)는 인간 ES 세포라 칭한다.
용어 "인간 iPS 세포"는 면역손상된 마우스 내로 이식되는 경우에 모두 3 개의 배엽을 형성하는 능력을 포함하는 hES 세포와 유사한 특성을 갖는 세포를 나타내며, 여기에서 상기 iPS 세포는 탈-분화 인자, 예를 들어, KLF4, SOX2, MYC, 및 OCT4 또는 SOX2, OCT4, NANOG, 및 LIN28과 같은 hES 세포 특이적 전사인자 조합에 노출시킨 후의 다양한 체세포 계통의 세포로부터 유도된다. 탈-분화 인자의 어떤 편리한 조합이라도 iPS 세포를 생산하기 위해서 사용될 수 있다. 상기 iPS 세포는 본 기술분야에서 공지된 것으로서 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 아데노바이러스 벡터와 같은 벡터를 통한, 또는 예를 들어, 투과화 또는 그 밖의 다른 기술에 의한 인자의 단백질로서의 도입을 통한 이들 유전자의 발현에 의해서 생산될 수 있다. 이러한 예시적 방법의 설명은 참조함으로써 그 전문이 본원에 통합된 다음의 문헌을 참고로 한다: 2006년 8월 3일에 출원된 PCT 출원 제PCT/US2006/030632호; 미국 특허출원 제11/989,988호; 2000년 6월 30일에 출원된 PCT 특허출원 제PCT/US2000/018063호; 2000년 12월 15일에 출원된 미국 특허출원 제09,736,268호; 2004년 4워 23일에 출원된 미국 특허출원 제10/831,599호; 및 미국 특허공개 제20020142397호 (특허출원 제10/015,824호, 발명의 명칭: "Methods for Altering Cell Fate"); 미국 특허공개 제20050014258호 (특허출원 제10/910,156호, 발명의 명칭: "Methods for Altering Cell Fate"); 미국 특허공개 제20030046722호 (특허출원 제10/032,191호, 발명의 명칭: "Methods for cloning mammals using reprogrammed donor chromatin or donor cells"); 및 미국 특허공개 제20060212952호 (특허출원 제11/439,788호, 발명의 명칭: "Methods for cloning mammals using reprogrammed donor chromatin or donor cells").
용어 "ICM 세포"는 포유동물 배아의 내부세포 매스의 세포, 또는 주변의 영양세포 (trophectodermal cell)가 있거나 없이 시험관내에서 배양된 내부세포 매스의 세포를 나타낸다.
용어 "올리고클로날 (oligoclonal)"은 동일한 배양물 내의 다른 세포들과는 상이한 형태학 또는 분화의 마커의 존재 또는 부재와 같은 유사한 특징을 공유하는 것으로 나타나는 작은 세포의 집단, 전형적으로 2-1000 세포로부터 기원하는 세포의 집단을 나타낸다. 올리고클로날 세포는 이들 공통적인 특징을 공유하지 않는 세포로부터 분리되며, 증식하여 본질적으로 유사한 세포의 원래의 집단으로부터 온전히 유도된 세포의 집단을 생성하도록 허용된다.
용어 "기관형 배양물 (organotypic culture)"은 한천의 층 상의 일부의 세포의 배양물에서 나타나는 것과 같은 조직-유사 세포 밀도를 갖는 삼차원 구조를 생성하도록 응집되거나, 동물에서 기형종으로 배양되거나 다른 식으로는 삼차원 배양 시스템에서 성장한 배양된 세포를 나타내지만, 여기에서 상기 응집된 세포는 비제한적인 예로서 표피 각질세포 및 피부 섬유아세포의 조합 또는 실질세포와 그의 상응하는 조직 기질 또는 상피세포와 간엽 세포의 조합물과 같은 상이한 세포 계통의 세포를 함유한다.
용어 "다능성 줄기세포"는 이하에서 정의하는 바와 같은 용어 "원시 줄기세포"와 동의어로 사용된다.
용어 "풀링된 클로날 (pooled clonal)"은 2 개 또는 그 이상의 클로날 집단을 조합하여 클로날 집단과 유사한 유전자 발현의 마커와 같은 마커의 균일성을 갖는 세포의 집단을 생성시킴으로써 수득된 세포의 집단을 나타내지만, 모든 세포가 동일한 기원의 클론으로부터 유도된 집단은 아니다. 상기 풀링된 클로날 세포주는 단일 또는 혼합된 유전자형의 세포를 포함한다. 풀링된 클로날 세포주는 클로날 세포주가 비교적 조기에 분화하거나 그들의 증식 수명에서 조기에 바람직하지 않은 방식으로 변화한 경우에 특히 유용하다.
용어 "원시 줄기세포"는 하나 이상의 분화된 세포 타입으로 분화할 수 있는 동물 세포를 나타낸다. 이러한 세포에는 hES 세포, 할구/상실배 세포 및 이들의 유도된 hED 세포, hiPS 세포, hEG 세포, hEC 세포, 및 간엽 줄기세포, 뉴론성 줄기세포 및 골수 유래 줄기세포를 포함하는 성인 유래 세포가 포함된다. 원시 줄기세포는 비-인간 동물로부터 유래할 수 있다. 원시 줄기세포는 유전적으로 변형되거나 유전적으로 변형되지 않을 수 있다. 유전적으로 변형된 세포는 시험관내 또는 생체내에서 그들의 식별을 용이하게 하는 형광 단백질과 같은 마커를 포함할 수 있다.
상세한 설명
상기에서 요약한 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 양상은 연골형성을 수행할 수 있는 배아 전구세포주의 생산, 확인 및 사용과 관련된 방법 및 조성물을 포함한다.
본 발명을 더 상세하게 기술하기 전에, 본 발명은 그 자체로 물론 변화될 수 있는, 여기에 기술된 특별한 구체예로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한될 수 있기 때문에, 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특별한 구체예를 설명할 목적으로 사용된 것이며, 제한하고자 함이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우에, 문맥이 다른 식으로 명백하게 지시하지 않는 한 그 범위의 상한과 하한 사이에서 하한의 유니트의 소수 첫 자리까지의 각각의 개입값 및 언급된 범위 내의 모든 언급되거나 개입된 값은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 더 작은 범위 내에 독립적으로 포함될 수 있으며, 또한 언급된 범위 내의 구체적으로 제외된 모든 한계를 조건으로 하여 본 발명에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중의 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우에, 이들 포함된 한계 중의 하나 또는 둘 다를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
본 명세서에서 특정의 범위는 용어 "약"이 선행하는 숫자 값으로 제시된다. 용어 "약"은 본 명세서에서 그것이 선행하는 정확한 숫자뿐만 아니라 상기 용어가 선행하는 숫자에 근접하거나 대략 그 숫자인 수에 대한 문자적인 뒷받침을 제공하기 위해서 사용된다. 숫자가 구체적으로 기술된 숫자에 근접하거나 대략 그 숫자인지 여부를 결정하는 경우에, 근접하거나 대략적인 기술되지 않는 숫자는 이것이 제시된 문맥에서 구체적으로 기술된 숫자의 실질적인 등가물을 제공하는 숫자일 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술된 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 이들 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 등가인 어떤 방법 및 물질이라도 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 이제는 대표적인 방법 및 물질을 기술한다.
본 명세서에서 인용된 모든 문헌 및 특허는 마치 각각의 개별적인 문헌 또는 특허가 참고로 포함되도록 구체적이며 개별적으로 제시된 것처럼 본 발명에 참고로 포함되며, 그와 관련하여 상기 문헌이 인용된 방법 및/또는 물질을 개시하고 기술하기 위해서 참고로 본 명세서에 포함된다. 모든 문헌의 인용은 출원일 이전의 그의 공개내용에 대한 것이며, 본 발명이 선행 발명으로서 이러한 문헌보다 앞서는 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 이해되지는 않아야 한다. 또한, 제시된 공개의 일자는 독립적으로 확인되는 것이 필요할 수 있는 실제 공개일과는 상이할 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 것으로서 단수 형태는 문맥이 다른 식으로 명백하게 기술되지 않는 한, 복수의 대상을 포함하는 것으로 알아야 한다. 또한, 특허청구범위는 어떤 임의의 요소라도 배제하도록 작성될 수 있는 것으로 알아야 한다. 그 자체로서, 이러한 설명은 특허청구범위 요소의 설명 또는 "부정적 (negative)" 제한의 사용과 관련하여 "단독으로 (solely)", "단지 (only)" 등과 같은 배타적 용어의 사용에 대한 선행사로 작용하도록 하기 위한 것이다.
본 명세서를 읽음으로써 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 명백한 바와 같이, 본 명세서에 기술되고 설명된 개별적인 구체예 각각은 본 발명의 범위 또는 정신을 벗어남이 없이 다른 몇 가지 구체예 중의 어떤 것의 특징으로부터 쉽게 구별될 수 있거나 그와 조합될 수 있는 별개의 성분 및 특징을 갖는다. 기술된 모든 방법은 기술된 사건의 순서대로, 또는 논리적으로 가능한 어떤 다른 순서로나 수행될 수 있다.
배아 연골형성 전구세포 및 사용방법
본 발명의 양상에는 연골형성을 수행할 수 있는 배아 전구세포의 생산, 확인 및 사용과 관련된 방법 및 조성물이 포함된다. 높은 레벨의 관절 특이적 마커 GDF5를 발현하는 세포주의 서브세트를 갖는 MSX1, MSX2, 및 SOX9-발현 세포주와 같이 사지 및 관절의 경우와 연관된 간엽의 중추 조절인자를 발현하는 클로날 세포주의 다양한 세트가 기술되었다 [참조: West et al., 2008, Regenerative Medicine vol. 3(3) pp. 287-308 (추가의 정보를 포함해서 본 발명에 참고로 포함된다); 및 2009년 7월 16일에 출원된 미국 특허출원 제12/504,630호 (발명의 명칭: "Methods to Accelerate the Isolation of Novel Cell Strains from Pluripotent Stem Cells and Cells Obtained Thereby"; 이것은 온전히 본 발명에 참고로 포함된다)]. 이들 클론적으로 정제된 세포주는 강건하며, 그들의 유전자 발현 패턴을 유지하면서 >40 계대 동안 팽창할 수 있고, 종양형성성을 나타내지 않으며, 유전자 발현의 배아 패턴을 갖는다. 따라서, 이들 세포주는 연구 및 치료에 사용하기 위한 독특한 분자 조성을 갖는 다양한 연골 타입을 생산하는 조성물 및 방법을 위해서 제공된다.
특정의 구체예에서, 본 발명의 미분화된 배아 연골세포 전구세포 또는 세포주의 유전자 발현 패턴은 이들이 적절한 배양조건 하에서 연골세포가 될 잠재력을 갖는다는 징후를 제공하지 않는다. 즉, 상기 세포는 연골세포 발생 가능성을 시사하는 유전자 발현 패턴을 갖지 않는다.
본 발명의 특정한 연골형성 배아 전구세포주는 연골형성 조건 하에서 유도되는 경우에, 둘 다 이러한 조건 하의 MSCs 내에서 발현되며 비대성 연골세포의 마커인 COL10A1 또는 IHH 유전자를 발현하지 않고 연골을 생성시킬 수 있다. 비대성 연골세포는 후에 골아세포에 의해서 침습되어 뼈를 형성하는 일시적인 매트릭스를 제공하며, 따라서 특정의 치료학적 목적 (예를 들어, 관절 연골 외상, 관절염의 치료 또는 관련된 용도를 위해서 그 조직을 재생시키기 위한 노력으로 관절 내에 주사하거나 다른 식으로는 관절 연골 내로 이식하는 경우에)에는 적합하지 않다. 따라서, 본 발명의 세포주는 비대성 연골세포 (예를 들어, 골수 유래 MSC)로 발육하는 다른 연골세포 전구세포와는 다른 중요한 치료학적 차이점을 갖는다.
본 발명에 따르는 예시적인 배아 연골세포 전구세포는 다음의 유전자 중의 어느 하나, 둘, 셋, 넷 또는 모두의 발현에 대해서 음성 (negative)이다: CD74, CD90, CD166, ITGA2, 및 KCNK2. 이들 유전자의 각각은 현재 연골 대체요법 (이하에 더 기술됨)에서 사용되고 있는 간엽 줄기세포 (MSCs)에 존재하는 마커이다. 따라서, 본 발명의 연골형성 배아 전구세포주는 다른 공지의 연골형성 전구세포와는 상이한 유전자 발현 패턴을 갖는다. 특정의 구체예에서, 연골형성 배아 전구세포는 또한 HOX 유전자 및 PITX1의 발현에 대해서도 음성이다.
이하의 것은 본 발명의 양상에 따르는 예시적인 인간 배아 연골세포 전구세포주 및 관심이 있는 특정의 유전자 발현 마커 (양성 및 음성 마커)의 리스트이다. 이들 인간 배아 연골세포 전구세포주는 연골아세포로, 및 그 다음에는 이들이 인간 ES 또는 유사한 인간 원시 줄기세포 유래 세포로부터 분리된 후에 클론 팽창의 18-21 배가 (doublings)를 겪는 경우에 정상적인 초기 계대 배양된 인간 관절 연골세포 (NHACs)보다 더 높은 레벨의 COL2A1을 발현하는 연골세포로 분화할 수 있다.
P22-28의 범위에서 세포주 MEL2의 유전자 발현 마커는 표 1에 나타낸 바와 같이 미분화된 (대조군 또는 Ctrl) 상태에서의 세포의 유전자 발현 패턴을 비교함으로써 결정될 수 있다. 상기 세포주에 의해서 발현된 특이적 유전자 발현 마커에는 다음의 유전자가 포함된다: PIP, ENPP2, DLX5, CXADR, NPTX2, CLDN23, SFRP2, HSPB3, HAND2, HSD17B2, RCAN2, EBF3, GPM6B, RNF175, PPARGC1A, RGS16, GPM6B, SOX17, EPHB6, 및 BAPX1. P22-28의 범위에서 세포주 MEL2에서 발현되는 이들 마커 중에서 가장 특이적인 것은 다음과 같다: PIP (Illumina 프로브 ID 4010519), SOX17 (Illumina 프로브 ID 3610193), DLX5 (Illumina 프로브 ID 3370767), GPM6B (Illumina 프로브 ID 2630279), RGS16 (Illumina 프로브 ID 1030102), EPHB6 (Illumina 프로브 ID 7400017), 및 HAND2 (Illumina 프로브 ID 4640563); 다음은 음성 발현된다: TBX15 (Illumina 프로브 ID 6060113), HOXA2 (Illumina 프로브 ID 2060471), AJAP1 (Illumina 프로브 ID 1300647), 및 HOXB2 (Illumina 프로브 ID 3460097).
P13-15의 범위에서 세포주 SM30의 유전자 발현 마커는 표 1에 나타낸 바와 같이 미분화된 (대조군 또는 Ctrl) 상태에서의 세포의 유전자 발현 패턴을 비교함으로써 결정될 수 있다. 상기 세포주에 의해서 발현된 특이적 유전자 발현 마커에는 다음의 유전자가 포함된다: COL15A1, DYSF, FST, ITGB4, TMEM119, MSX1, NDST3, NTRK1, 및 ZIC2. P13-15의 범위에서 세포주 SM30에서 발현되는 이들 유전자 발현 마커 중에서 가장 특이적인 것은 다음과 같다: NTRK1 (Illumina 프로브 ID 7050113), NDST3 (Illumina 프로브 ID 670537), ZIC2 (Illumina 프로브 ID 510368), ITGB4 (Illumina 프로브 ID 3940132), 및 PIP (Illumina 프로브 ID 4010519), NNAT (Illumina 프로브 ID 4010709), HOXA2 (Illumina 프로브 ID 2060471), TBX15 (Illumina 프로브 ID 6060113), 및 HAND2 (Illumina 프로브 ID 4640563)의 음성 발현.
P11-18의 범위에서 세포주 7SMOO32의 유전자 발현 마커는 표 1에 나타낸 바와 같이 미분화된 (대조군 또는 Ctrl) 상태에서의 세포의 유전자 발현 패턴을 비교함으로써 결정될 수 있다. 상기 세포주에 의해서 발현된 특이적 유전자 발현 마커에는 다음의 유전자가 포함된다: EGFL6, FGF13, BEX2, CHRNA3, NCAM2, BBOX1, 및 DLK1. 7SMOO32에서 발현되는 이들 유전자 발현 마커 중에서 가장 특이적인 것은 다음과 같다: EGFL6 (Illumina 프로브 ID 6330079), FGF13 (Illumina 프로브 ID 7380239), CHRNA3 (Illumina 프로브 ID 4280180), BBOX1 (Illumina 프로브 ID 3400386), 및 다음의 유전자의 발현에 대해서 음성: TBX15 (Illumina 프로브 ID 6060113), NNAT (Illumina 프로브 ID 4010709), NTRK1 (Illumina 프로브 ID 7050113), HAND2 (Illumina 프로브 ID 4640563), 및 HOXA2 (Illumina 프로브 ID 2060471).
P12-17의 범위에서 세포주 SK11의 유전자 발현 마커는 표 1에 나타낸 바와 같이 미분화된 (대조군 또는 Ctrl) 상태에서의 세포의 유전자 발현 패턴을 비교함으로써 결정될 수 있다. 상기 세포주에 의해서 발현된 특이적 유전자 발현 마커에는 다음의 유전자가 포함된다: PITX1, TBX15, NCAM1, COL21A1, CYYR1, LAMP3, MEGF10, RNF165 및 GDF10. SK11에서 발현되는 이들 유전자 발현 마커 중에서 가장 특이적인 것은 다음과 같다: TBX15 (Illumina 프로브 ID 6060113), COL21A1 (Illumina 프로브 ID 3440747), GDF10 (Illumina 프로브 ID 5690095), PITX1 (Illumina 프로브 ID 2000373), 및 다음의 유전자의 발현에 대해서 음성: NNAT (Illumina 프로브 ID 4010709), HAND2 (Illumina 프로브 ID 4640563), FOXF2 (Illumina 프로브 ID 1660470), FOXG1 (Illumina 프로브 ID 4200458), HOXA2 (Illumina 프로브 ID 2060471) HOXB2 (Illumina 프로브 ID 3460097), 및 AJAP1 (Illumina 프로브 ID 1300647).
P15-26의 범위에서 세포주 7PEND24의 유전자 발현 마커는 표 1에 나타낸 바와 같이 미분화된 (대조군 또는 Ctrl) 상태에서의 세포의 유전자 발현 패턴을 비교함으로써 결정될 수 있다. 상기 세포주에 의해서 발현된 특이적 유전자 발현 마커에는 다음의 유전자가 포함된다: TBX15, CA9, SPAG16, SUSD2, TBXAS1, AIF1, SLITRK5, FOXF2, AADAC, 및 FOXG1. 7PEND24에서 발현되는 이들 유전자 발현 마커 중에서 가장 특이적인 것은 다음과 같다: AADAC (Illumina 프로브 ID 6200619), TBX15 (Illumina 프로브 ID 6060113), SPAG16 (Illumina 프로브 ID 4390537), AIF1 (Illumina 프로브 ID 3800047), 및 다음의 유전자의 발현에 대해서 음성: NNAT (Illumina 프로브 ID 4010709), PITX1 (Illumina 프로브 ID 2000373), SOX17 (Illumina 프로브 ID 3610193), 및 AJAP1 (Illumina 프로브 ID 1300647).
P14-15의 범위에서 세포주 E15의 유전자 발현 마커는 표 1에 나타낸 바와 같이 미분화된 (대조군 또는 Ctrl) 상태에서의 세포의 유전자 발현 패턴을 비교함으로써 결정될 수 있다. 상기 세포주에 의해서 발현된 특이적 유전자 발현 마커에는 다음의 유전자가 포함된다: ENPP2, ABCA6, TBX15, BAI3, CNTN3, TSPYL5, GAP43, AJAP1, CYFIP2, HOXA2 (Illumina 프로브 ID 2060471) HOXB2 (Illumina 프로브 ID 3460097), 및 NNAT. E15에서 발현되는 이들 유전자 발현 마커 중에서 가장 특이적인 것은 AJAP1 (Illumina 프로브 ID 1300647), BAI3 (Illumina 프로브 ID 5690301), NNAT (Illumina 프로브 ID 4010709), ABCA6 (Illumina 프로브 ID 5810209)이며, 유전자 PITX1 (Illumina 프로브 ID 2000373)의 발현에 대해서 음성이고, 다음의 유전자 발현 마커에 대해서 음성이다: HAND2 (Illumina 프로브 ID 4640563) 및 SOX17 (Illumina 프로브 ID 3610193).
P12-17의 범위에서 세포주 4D20.8의 유전자 발현 마커는 표 1에 나타낸 바와 같이 미분화된 (대조군 또는 Ctrl) 상태에서의 세포의 유전자 발현 패턴을 비교함으로써 결정될 수 있다. 상기 세포주에 의해서 발현된 특이적 유전자 발현 마커에는 유전자 LHX8, HAPLN1, LINGO2, FGF18, GPR126, BBOX1, ITGA4, SHISA3, 및 BARX1이 포함되며, 다음의 유전자 발현 마커에 대해서는 음성이다: NNAT 및 HAND2. 4D20.8에서 발현되는 이들 유전자 발현 마커 중에서 가장 특이적인 것은 다음과 같다: SHISA3 (Illumina 프로브 ID 5670286), LHX8 (Illumina 프로브 ID 2900343), BARX1 (Illumina 프로브 ID 6450040), LINGO2 (Illumina 프로브 ID 1110291), 및 다음의 유전자의 발현에 대해서 음성: PITX1 (Illumina 프로브 ID 2000373), SOX17 (Illumina 프로브 ID 3610193), 및 AJAP1 (Illumina 프로브 ID 1300647).
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 배아 연골세포 전구세포는 시험관내 또는 생체내에서 연골을 생성시키는 방법 (때때로 본 명세서에서는 연골세포 유도방법이라 칭함)에서 용도를 갖는다. 치료학적 용도에 적합한 것을 포함한 어떤 편리한 연골세포 유도방법이라도 사용될 수 있다 (다수의 예시적인 연골세포 유도/연골 생성 방법은 이하 및 실시예 항목에 기술된다).
따라서, 본 발명의 배아 연골세포 전구세포는 연골조직의 수복을 위한 치료학적 적용에 사용될 수 있으며, 예를 들어, 치료학적으로 허용되는 담체 중에서 대상체에게 투여된다. 전구세포가 투여되는 대상체는 연골 대체/재생이 치료학적 효과를 제공할 수 있는 모든 상태, 상해 또는 질병을 가질 수 있다. 예를 들어, 대상체가 특정 부위에서의 연골 손상, 예를 들어, 관절 연골 손상을 갖는다면, 배아 전구세포주가 연골 손상의 부위에 투여될 수 있다. 이러한 치료를 위한 약제학적으로 허용되는 담체에는 세포 이식을 위한 치료학적 담체로서의 용도를 갖는 모든 광범한 종류의 스캐폴드, 매트릭스 등이 포함된다. 비-제한적인 예로는 다음의 성분들 중의 어느 하나 또는 조합을 함유하는 담체가 포함된다: 헥스텐드 (Hextend); 히알우로난 및 그의 폴리머; 콘드로이틴 설페이트; 타입 I 콜라겐; 타입 II 콜라겐; 타입 III 콜라겐, 폴리안하이드라이드, 폴리오르토에스테르, 폴리글리콜산 및 그의 코폴리머; 알기네이트; 아가로즈; 폴록사머; 피브린; 키틴; 및 키토산. 예시적인 스캐폴드/매트릭스 및 연골세포 분화 및 치료법에서의 그들의 용도는 이하에서 더 상세하게 기술된다.
특정의 치료학적 적용에서, 사용된 연골세포 배아 전구세포주는 예를 들어, 이식 전에 연골 생산을 유도하기 위해서, 대상체에게 투여하기 전에 연골세포 유도 조건 하에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 세포주로부터 생성된 연골을 함유하는 형태 또는 다른 구조 (예를 들어, 성형된 구조)는 대상체에게 예를 들어, 연골 손실, 상해 또는 변성의 부위에서 이식될 수 있다. 다음의 조건 중의 어느 하나 또는 조합을 포함하는 어떤 통상적인 연골 생산 조건이라도 이러한 구체예에서 사용될 수 있다: 연골세포 배양 조건; 합성 매트릭스 또는 생물학적 재흡수성 고정화 비히클 내로의 배아 전구세포주의 함침; 및 성형된 구조 내로 배아 전구세포주의 배치.
본 발명에 따르는 치료의 방법은 또한, 이식 후의 하나 또는 그 초과의 시점에서 원하는 부위에서의 연골의 생성율을 측정하는 (예를 들어, 손상된 연골의 수복 또는 대체를 측정하는) 것뿐만 아니라 대상체에서 새롭게 형성된 연골의 성능에 대한 정보를 수득하는 것을 포함할 수 있다. 측정된 파라메터에는 환자에게서 이식 부위에 존재하는 투여된 세포의 생존, 국재화 및 수가 포함될 수 있다. 세포 생착 또는 재구성 정도는 다양한 스캐닝 기술 중의 어떤 것, 예를 들어, 컴퓨터 단층 촬영 (CAT 또는 CT) 스캔, 자기공명 영상화 (MRI) 또는 양전자 방출 단층촬영 (PET) 스캔을 사용하여 결정될 수 있다. 대상체에서 본 발명에 따르는 이식 세포의 기능적 통합은 손상되거나 질병에 걸렸던 기능의 회복, 예를 들어, 관절의 회복 또는 기능의 증강을 검사함으로써 평가될 수 있다. 세포 이식 생착, 국재화 및 생존은 또한 표적 조직을 분리하고, 이것을 시각적으로, 또는 현미경을 통해서 검사함으로써 (예를 들어, 사후 분석에서) 결정될 수 있다.
조직 공학적 연골
3가지 타입의 연골이 포유동물에 존재하며, 다음이 포함된다: 초자 연골; 섬유 연골 및 탄력 연골. 초자 연골은 견고한 탄성 점조도를 갖는 연골질 매스로 구성되며, 반투명하고, 진주빛의 청색 색상을 나타낸다. 초자 연골은 주로 관절성 관절의 관절성 표면에서 발견된다. 이것은 또한 골단판, 늑연골, 기관연골, 기관지 연골 및 비연골에서도 발견된다. 섬유 연골은 이것이 연골에 인장강도를 부가한 타입 I 콜라겐의 원섬유를 함유하는 것을 제외하고는 본질적으로 초자 연골과 동일하다. 콜라겐성 섬유는 번들로 배열되며, 여기에서 연골 세포는 벌들 사이에 위치한다. 섬유 연골은 통상적으로 추간판의 섬유륜, 건 및 인대 삽입부, 반월판, 치골결합부, 및 관절낭의 삽입부에서 발견된다. 탄력 연골은 또한, 이것이 엘라스틴의 섬유를 함유하는 것을 제외하고는 초자 연골과 유사하다. 이것은 또한 초자 연골보다 더 불투명하고, 더 유연하며 휘기 쉽다. 이들 특징은 연골 매트릭스 내에 매립된 탄성 섬유에 의해서 부분적으로 규정된다. 전형적으로, 탄력 연골은 귀의 이개, 후두개 및 후두에 존재한다.
특정의 구체예에서, 본 발명의 연골-생산 세포는 대상체 (예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간 환자)에서 연골 조직 (예를 들어, 손상된 연골)을 수복, 대체 또는 강화시키는 치료학적 분야에서 사용된다. 연골은 시험관내에서 생성된 후에 병에 걸린 부위에 이식할 수 있거나, 특정의 구체예에서는 연골세포를 이식하여 (예를 들어, 매트릭스 또는 스캐폴드 내에) 대상체의 원하는 부위에서 연골을 생산할 수 있다. 연골-생산 세포 (또는 연골세포)를 이용하는 다수의 치료법이 기술되었으며, 이 중의 몇 가지는 이하에 요약하였다.
특정의 구체예에서, 합성 매트릭스 또는 생물학적 재흡수성 고정화 비히클 (때때로 "스캐폴드" 또는 "매트릭스"로 칭함)은 본 발명의 연골-생산 세포로 함침될 수 있다. 현재까지 다양한 합성 담체 매트릭스가 사용되어 왔으며 다음이 포함된다: 삼차원적 콜라겐 겔 [미국 특허 제4,846,835호; Nishimoto (1990) Med. J. Kinki University 15; 75-86; Nixon et al. (1993) Am. J. Vet. Res. 54:349-356; Wakitani et al. (1989) J. Bone Joint Surg. 71B:74-80; Yasui (1989) J. Jpn. Ortho. Assoc. 63:529-538]; 재구성된 피브린-트롬빈 겔 [미국 특허 제4,642,120; 5,053,050 및 4,904,259호]; 폴리안하이드라이드, 폴리오르토에스테르, 폴리글리콜산 및 그의 코폴리머를 함유하는 합성 폴리머 매트릭스 [미국 특허 제5,041,138호]; 및 히알우론산-기본 폴리머 [Robinson et al. (1990) Calcif. Tissue Int. 46:246-253]. 콜라겐 타입 1 매트릭스 (예를 들어, 아텔로콜라겐 (Atelocollagen); Koken Co Ltd., Tokyo Japan으로부터); 콜라겐 타입 I 및 III 이중층 (bilayer) 스캐폴드 (예를 들어, Verigen, Leverkusen, Germany로부터); 콜라겐 스캐폴드 (예를 들어, 커버된 (covered) 자가유래 연골세포 이식 (CACI) 및 매트릭스-유도된 자가유래 연골세포 이식 (MACI) 시스템 (ACI-Maix™); Matricel, Hezoenrath, Germany로부터); 돼지 타입 I/타입 III 콜라겐 이중층 (예를 들어, ChondroGide® (Geistlich Biomaterials, Wolhusen, Switzerland)); 3D-콜라겐-겔-매트릭스 (예를 들어, CaReS®에서 사용됨; BioRegioSTERN, Friedrichstrasse, Stuttgart and Arthro Kinetics Inc, Boston, MA로부터); 히알우란난 스캐폴드, 예를 들어, 히알우란난 기본 생물분해성 폴리머의 에스테르화된 (벤질 에스테르) 유도체 (예를 들어, Hyaff®-11; Fida Advanced Biopolymers Laboratories, Abano Terme, Italy로부터); PGA/PLA 코폴리머 및 폴리디옥사논 스캐폴드, 예를 들어, 겔-부하된 다공성 생물분해성 플리스 (fleece) (예를 들어, Bio-Seed-C에서 사용됨; Biotissue Technologies, Freiburg, Germany로부터); 아가로즈-알기네이트 매트릭스를 갖는 고체 스캐폴드 (예를 들어, Cartipatch®; TBF Tissue Engineering, MIONS, FRANCE로부터); 이상 삼차원적 콜라겐-콘드로이틴 설페이트 스캐폴드 (예를 들어, NOVOCART™ 3D; TETEC, Reutlingen, Germany로부터)를 포함하는 이들 스캐폴드 및 매트릭스 중의 특정한 것은 현재 치료학적 연골 수복에 사용되고 (또는 시험되고) 있다.
본 발명의 연골-생산 세포는 그의 연골 재구성의 설명 (참조: 예를 들어, 1027 면 내지 1039 면)에 관하여 본 명세서에 참고로 포함된 문헌 [Methods of Tissue Engineering (2002); Anthony Atala and Robert P. Lanza에 의해서 편집되고, Academic Press (London)에 의해서 출판됨]에 기술된 바와 같이 연골 재구성에 사용될 수 있다. 문헌에 기술된 바와 같이, 연골-생산 세포를 성형된 구조 내에 배치시키고 (예를 들어, 사출성형에 의해서), 동물에게 이식할 수 있다. 시간의 경과에 따라, 연골-생산 세포에 의해서 생산된 연골이 성형된 구조를 대체함으로써 형성된 연골 구조 (즉, 초기 성형된 구조의 형상으로)를 생산할 수 있다. 성형된 구조를 위한 예시적인 성형 물질에는 하이드로겔 (예를 들어, 알기네이트, 아가로즈, 폴록사머 (Pluronics)) 및 천연 물질 (예를 들어, 타입 I 콜라겐, 타입 II 콜라겐 및 피브린)이 포함된다.
특정의 구체예에서, 본 발명의 연골-생산 세포를 시험관내에서 배양하여 합성 연골 (또는 연골-유사) 물질을 형성시킬 수 있다. 생성된 연골을 이어서 대상체에게 연골 결함이 있는 부위에서 이식시킬 수 있다. 이러한 타입의 접근방법은 합성 연골물질의 발육을 이식 전에 모니터링할 수 있다는 이점을 갖는다. 또한, 생성된 연골은 이식 전에 생화학적으로 및 형태학적으로 특정화될 수 있다. 2 가지 일반적 절차가 시험관내에서 합성 연골을 성장시키기 위해서 개발되었다. 이들에는 부착 의존적 (anchorage-dependent) 또는 부착 독립적 방식으로 연골 생산 세포를 성장시키는 것이 포함된다.
부착 독립적 방식에서, 연골-생산 세포는 아가로즈 겔 내에서 콜로니로서 배양될 수 있다 [참조: 예를 들어, Benya et al. (1982) Cell 30:215-224; Aydlotte et al. (1990) in Methods and Cartilage Research Chapter 23:pp. 90-92; Aulthouse et al. (1989) In Vitro Cellular and Developmental Biology 25:659-668; Delbruck et al. (1986) Connective Tissue Res. 15:1550-172; and Bohme et al. (1992) J. Cell Biol. 116:1035-1042]. 대신으로, 또 다른 부착 독립적 방식에서 연골-생산 세포는 현탁 배양 중에서 콜로니로서 배양될 수 있다 [참조: 예를 들어, Franchimont et al. (1989) J. Rheumatol. 16:5-9; and Bassleer et al. (1990) in "Methods and Cartilage Research", Academic Press Ltd., Chapter 24].
부착 의존적 방법에서, 연골-생산 세포의 일차 배양물은 세포 배양 플라스크의 표면에 부착된 단일층으로 성장시킬 수 있다 [참조: 예를 들어, Yoshihashi (1983) J. Jpn. Ortho. Assoc. 58:629-641; 및 미국 특허 제4,356,261호; 온전히 본 발명에 참고로 포함된다].
특정의 구체예에서, 본 발명의 연골 치료법은 미국 특허 제5,723,331 및 5,786,217호 [발명의 명칭: "Methods and compositions for the repair of articular cartilage defects in mammals"; 이들은 둘 다 온전히 본 발명에 참고로 포함된다]에 기술된 방법을 포함한다. 이들 특허는 시험관내에서 연골 결함의 수복을 위한 합성 연골 패치를 제조하는 방법을 기술한다. 본 발명의 연골-생산 세포가 사용되는 경우에, 상기 방법은 (1) 본 발명의 연골-생산 세포를 세포 접촉성 세포 접착 표면을 갖는 전-성형된 웰에 접종하고; (2) 본 발명의 연골-생산 세포를 웰 내에서 세포외 매트릭스를 분비하도록 허용하기에 충분한 시간 동안 배양함으로써 합성 연골의 삼차원적 다중 세포-층 패치를 형성시키는 단계를 포함한다. 생성된 합성 연골 (예를 들어, 합성 관절 연골)은 내인성으로 생산 및 분비된 세포외 매트릭스 내에 분산된 본 발명의 연골-생산 세포를 함유한다. 생성된 합성 연골 패치는 이어서 대상체 (예를 들어, 포유동물)에서 연골 결함의 수복 (또는 대체)을 위해서 사용될 수 있다.
또 다른 예로서, 본 발명의 연골형성 세포는 삼차원적 매트릭스, 예를 들어, 하이드로겔 내에 캅셀화될 수 있다. 예시적인 하이드로겔 캅셀화 방법은 본 발명에 참고로 포함된 문헌 ["Directed Differentiation of Embryonic Stem Cells in Three-Dimensional Hydrogel Culture", Nathaniel S. Hwang, Shyni Varghese, and Jennifer Elisseeff, Methods in Molecular Biology, vol. 407: p 351 Stem Cell Assays]에서 찾을 수 있다. 여기에 기술된 예시적인 방법은 이하에 요약한다.
A. PEGDA 또는 RGD-변형된 PEGDA 하이드로겔 내에서 연골세포 전구세포의 광-캅셀화 (photo-encapsulation)
1. 마크로머를 멸균 PBS 중에 10% (w/v)로 혼합시킴으로써 PEGDA 폴리머 폴리(에틸렌 글리콜)-디아크릴레이트 (PEGDA; cat. no. 01010F12, Nektar, Huntsville, AL, USA) 용액 또는 RGD-변형된 PEGDA 폴리머 용액을 제조한다. 상기 폴리머 용액은 광선으로부터 보호하고 -20℃에서 3 개월 동안 저장할 수 있다.
2. 100 ㎎의 광-개시제인 이그라큐어 (Igracure) 2959 (제품 번호 1706673, Ciba Specialty Chemicals, Tarrytown, NY, USA)를 1 ㎖의 70% 필터-멸균된 에탄올에 용해시킨다.
3. PEGDA 용액 및 광-개시제 용액 둘 다는 그들을 사용할 때까지 파쇄된 얼음 상에 배치한다.
5. PEGDA 용액에 광-개시제 용액을 첨가하고 철저하게 혼합시켜 0.05% (w/v)의 최종 농도를 만든다. 개시제는 반드시 마크로머 용액과 매우 잘 혼합되도록 한다 (5 ㎕의 광-개시제 용액/폴리머 용액의 ㎖).
6. 광-개시제를 함유하는 PEGDA 용액을 세포 펠릿에 첨가함으로써 전구체 (광-개시제를 갖는 폴리머) 내에 세포 (2-3천만/㎖)를 현탁시키고, 거품을 생성시키지 않으면서 피펫으로 철저하게 혼합시킨다.
7. 100 ㎖의 전구세포-폴리머 용액을 실린더형 주형에 옮기고, 장파의 365 ㎚ 광선에 4.4 mW/㎠ (Glowmark System, Upper Saddle River, NJ, USA)에 5 분 동안 노출시켜 겔 형성을 완결시킨다.
8. "고화된" 연골세포 전구세포-적재된 하이드로겔을 그들의 주형으로부터 분리하고, 이들을 10 ng/㎖ TGF-β1을 함유하는 연골형성 배지가 있는 12-웰 플레이트에 옮기고, 37℃에서 5% CO2 하에 배양한다. 배지는 매 2-3일 마다 교환한다.
B. 알기네이트 하이드로겔 내에서 연골세포 전구세포의 캅셀화
1. 연골형성 세포를 50-㎖ 원뿔형 튜브 내에 수집하고, 145 g에서 5 분 동안 원심분리시킨다. 상등액을 제거하고, 알기네이트 폴리머 또는 RGD-변형된 알기네이트 폴리머 용액을 첨가하고, (P-1000) 피펫맨 (Pipetteman)을 사용하여 세포를 온화하게 현탁시킨다. 액체 내에서 거품이 만들어지는 것을 피한다.
2. 트랜스웰 (Transwell) 조직 배양 삽입 트레이 중의 하나를 취하고, 웰을 1 ㎖의 염화칼슘 용액을 충진시킨다.
3. 피펫맨을 사용하여 100 ㎕의 세포 현탁액을 조직 배양 삽입물에 첨가한다. 모든 삽입물이 충진된 후에, 멸균 겸자 (forceps)를 사용하여 삽입물을 염화칼슘 용액을 함유하는 웰 내로 전이시킨다. 이들을 5% CO2 하에 37℃에서 20 분 동안 배양한다.
4. 얇고 만곡된 스파툴라에 의한 온화한 지레작용을 사용하여 삽입물로부터 구조물을 분리시킨다. 각각의 웰에 하나의 구조물을 배치하고 5% CO2 하에 37℃에서 배양한다.
하이드로겔 캅셀화된 연골세포 전구세포는 시험관내에서 배양되거나, 생체내에서 연골 생산이 바람직한 부위에, 예를 들어, 손상되거나 결실된 연골을 대체시키기 위해서 이식될 수 있다.
Glycosan Biosystems이 또한 배양, 조직 공학적 스캐폴드 및 세포 치료법에서 용도를 갖는 삼차원적 세포 배양을 위한 하이드로겔을 제공한다. 이 회사는 예를 들어, 시험관내에서 및 생체내 세포 성장 및 분화에 사용하기 위한 히알우로난-기본, PEG-기본, 및 콜라겐-기본 하이드로겔을 제공한다.
Glycosan Biosystems로부터 제공되는 한가지 예시적인 하이드로겔 시스템은 3-D 배양에서 캅셀화된 세포의 온화하고 빠른 회수를 가능하게 하는 하이스템-CSS (HyStem-CSS™)이다. 하이스템-CSS는 단지 소량의 환원제를 사용한 하이스템-C 하이드로겔의 액화를 허용하는 새로운 교차결합제 PEGSSDA를 사용한다. 재구성된 하이스템-CSS 성분은 15 내지 37℃에서 액체로 유지된다. 상기 하이드로겔은 교차결합제 PEGSSDA를 글리코실 (Glycosil™) (티올-변형된 히알우로난) 및 겔린-S (Gelin-S™) (티올-변형된 젤라틴)의 혼합물에 첨가하는 경우에 형성된다. 겔화는 3 가지 성분 모두를 혼합시킨 후 약 20 분 이내에 일어난다. 저온 또는 낮은 pH에 의존적인 단계는 없다. 성분들을 포스페이트-완충된 식염수 (PBS) 또는 세포-배양 배지로 희석하여 겔화 시간을 증가시킬 수 있다. 생성된 하이드로겔은 37℃에서 2 시간 미만 안에 40 ㎖의 아세틸-L-시스테인 (환원제)에 용해시킬 수 있다.
제조자의 프로토콜에 따라 하이스템-CSS 하이드로겔 (3 x 2.5 ㎖ = 7.5 ㎖)을 다음과 같이 제조한다:
하이스템, 겔린-S, PEGSSDA, 및 DG 물 바이알이 실온에 도달하도록 한다.
무균 조건 하에서 주사기 및 바늘을 사용하여 1.0 ㎖의 DG 물을 하이스템 바이알에 첨가한다. 겔린-S 바이알에 대해서도 반복한다.
두 개의 바이알을 모두 로커 (rocker) 또는 진탕기 상에 수평으로 배치한다. 고체를 완전히 용해시키는데 <30 분이 소요될 수 있다. 37℃ 이하로 가온하고/하거나 온화하게 소용돌이를 일으켜서 용해를 촉진시킬 수 있다. 용액은 투명하며 약하게 점성이 있을 것이다.
무균 조건 하에서 주사기 및 바늘을 사용하여 0.5 ㎖의 DG 물을 PEGSSDA 바이알에 첨가한다. 수회 뒤집어서 용해시킨다.
가능한 한 빨리, 그러나 용액을 제조한 지 2 시간 이내에 동등한 용적의 하이스템 및 겔린-S와 무균적으로 혼합시킨다. 피펫으로 앞뒤로 서서히 혼합시켜 공기 방울이 트랩핑 (trapping)하는 것을 피한다.
세포 펠릿을 2.0 ㎖의 하이스템 + 겔린-S에 재현탁시킨다. 피펫을 앞뒤로 하여 혼합시킨다.
하이드로겔을 형성시키기 위해서, PEGSSDA를 하이스템 + 겔린-S 혼합물에 1:4 용적비 (0.5 ㎖ PEGSSDA™ 대 2.0 ㎖ 하이스템 + 겔린-S)로 첨가하고, 피펫으로 혼합시킨다.
용액이 10 분 동안 반응하도록 한 후에 다시 피펫으로 혼합시켜 세포의 균등한 분포를 보장한다. 겔화는 ~10 내지 20 분 이내에 일어날 수 있다.
연골형성 분야에서 용도를 갖는 또 다른 예시적인 스캐폴드는 예를 들어, 사체 공급원, 예를 들어, 인간 사체 조직으로부터 유래하는 탈세포화된 조직이다 [참조: 예를 들어, Minehara et al., "A new technique for seeding chondrocytes onto solvent-preserved human meniscus using the chemokinetic effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2", Cell Tissue Bank. 2010 Jun 17. [Epub ahead of print]; Yang et al. "A cartilage ECM-derived 3-D porous acellular matrix scaffold for in vivo cartilage tissue engineering with PKH26-labeled chondrogenic bone marrow-derived mesenchymal stem cells", Biomaterials. 2008 May;29(15):2378-87; 및 Stapleton et al., "Development and characterization of an acellular porcine medial meniscus for use in tissue engineering", Tissue Eng Part A. 2008 Apr;14(4):505-18; 이들은 각각 참조함으로써 본원에 통합된다].
예를 들어, 미네하라 (Minehara) 등은 사체로부터 유래하는 용매-보존된 인간 반월판 및 연골세포 화학주성제를 사용하는 화학주성 세포 접종기술을 기술하였다. 미네하라는 rhBMP-2 (10 ng/㎖로)가 연골세포가 탈세포화된 인간 반월판 내로 이동하도록 유도할 수 있다. 미네하라 등은 3-주일 배양 후에 새롭게 형성된 연골성 세포외 매트릭스가 3 ㎜의 깊이까지 아래로 반월판을 통해서 이동된 연골세포에 의해서 합성되었음을 나타내었다.
동소 연골형성을 제공하기 위한 세포의 직접 주사
본 발명의 세포주 4D20.8, MEL2, 7SMOO32, SM30, SK11, 7PEND24, 또는 E15와 같은 세포, 또는 동일하거나 유사한 마커를 갖는 인간 또는 동물 세포 또는 그 밖의 다른 세포의 직접 주사는 또한 성숙 골수 유래 MSCs (Chondrogen)에 의해서 이전에 보고된 것과 유사한 치료학적 유용성이 있다. 환자들은 반월판연골절제술을 수행한 후에 히알우론산 (HA) 또는 저용량 (5000만 세포) 또는 고용량 (15000만 세포)의 MSCs의 단일 주사를 시행한다. 환자들은 2 년 동안 안전성, 및 통증, 연골 손상 및 조직 수복과 같은 추가의 예비적 효능에 대해서 모니터링한다. 비-침습성 MRI는 반월판 및 연골 상태를 검사하기 위해서 사용된다. 수술 시점에 골관절염 (OA)이 있는 환자에게서는, 시각통증등급 (visual analog scale (VAS))에 의해서 측정되는 바와 같이 통계학적으로 유의적인 통증의 20 ㎜ 감소가 1 년째에 대조군 HA를 주사한 환자에 비해 MSCs를 단일 주사한 환자에게서 관찰되었다 (MSCs 48 ㎜ 대 대조군 28 ㎜, p=0.05). 통증의 감소는 환자의 관절에 더 심각한 골관절염성 변화가 있는 경우에 37 ㎜까지 훨씬 더 증가하였다 (p=0.004, MSCs 56 ㎜ 대 대조군 19 ㎜). 비교를 위해서, HA와 같은 OA에 대해 현재 이용되는 치료법은 위약에 비해서 9-23 ㎜의 개선을 근거로 하여 FDA (Food and Drug Administration)에 의해서 승인되었다. MRI 용적분석방법은 판독 사이에 나타나는 큰 레벨의 가변성으로 인하여 컴퓨터 분석에 부적합한 것으로 생각되었다. 결과적으로, 반월판 재생의 의미 있는 평가는 이루어질 수 없다. 성숙 MSCs의 유익한 효과는 또한 관절 상태의 물리적 측정시에 나타났다. 연골하 경화증 및 뼈돌기체 형성과 같은 골관절염과 연관된 골질 변화가 대조물질을 투여하는 환자의 21%에서 보고되었지만 MSC-치료된 환자에게서는 단지 6%에서만 보고되었다. 여기에서는 또한 양성 용량-반응 효과가 있었다. 1 년째에 손상된 반월판을 제거하는 수술 이전의 기준선에 비한 통증의 개선은 고용량 MSCs의 경우에는 56 ㎜, 저용량의 경우는 26 ㎜, 및 대조군의 경우는 19 ㎜였다. 관절에 대한 세포-기본 치료법은 관절 특이적 및 환자 특이적 줄기세포, 관절 조직을 재생시키는 개선된 능력을 갖는 세포, 스케일 증대 및 동결보존을 위한 개선된 능력을 갖는 세포를 생성시키는 기술로부터 효과를 볼 수 있다. 본 발명은 산업적 스케일 증대에 적합한 SOX9, MSX1, 및 MSX2를 발현시키는 세포주를 제공한다.
배아 전구세포주의 생산을 위한 방법
이하에 기술된 방법 이외에도, 본 발명에 기술된 세포주를 생산 및 사용하는데 용도가 있는 방법은 다음의 문헌에서 볼 수 있다: 미국 특허 제20080070303호 (발명의 명칭: "Methods to accelerate the isolation of novel cell strains from pluripotent stem cells and cells obtained thereby"); 2009년 7월 16일에 출원된 미국 특허출원 제12/504,630호 (발명의 명칭: "Methods to Accelerate the Isolation of Novel Cell Strains from Pluripotent Stem Cells and Cells Obtained Thereby"); 2009년 7월 16일에 출원된 미국 임시출원 제61/226,237호 (발명의 명칭: "Methods and Compositions Useful for In Vitro and In Vivo Chondrogenesis Using Embryonic Progenitor Cell Lines"); 및 2006년 4월 11일에 출원된 PCT 출원 PCT/US2006/013519 (발명의 명칭: "NOVEL USES OF CELLS WITH PRENATAL PATTERNS OF GENE EXPRESSION") (이들은 각각 참조함으로써 그 전문이 본원에 통합된다).
이하의 방법은 hES 세포로부터 배아 전구세포주의 생산을 기술하고 있지만, 다른 원시 줄기세포, 예를 들어, 인간 또는 비-인간 동물로부터 유래하는 원시 줄기세포가 사용될 수 있다.
hES 세포 배양 및 후보 배양물의 생성
사용된 hES 세포주는 이전에 기술된 H9 (National Institutes of Health-WA09로 등록됨) 및 Advanced Cell Technology로부터 유래하는 세포주 (MA03) [West et al., 2008, Regenerative Medicine vol. 3(3) pp. 287-308]였다. hES 세포는 일상적으로 hES 배지 (KO-DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1X 비필수 아미노산 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1X 글루타맥스-1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 55 μM 베타-머캅토에탄올 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 8% 녹-아웃 (Knock-Out) 혈청 대체물 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 8% 플라즈마네이트 (Plasmanate), 10 ng/㎖ LIF (Millipore, Billerica, MA), 4 ng/㎖ bFGF (Millipore, Billerica, MA), 50 유니트/㎖ 페니실린 - 50 유니트/㎖ 스트렙토마이신 (Invitrogen, Carlsbad, CA))에서 배양하였다. hES 세포주는 미토마이신-C 처리된 마우스 배아 섬유아세포 (MEFs) 상에서 10% CO2 및 5% O2의 대기 하에 37℃에서 유지시켰으며, 트립신처리 또는 콜로니의 주기적인 수동식 선택에 의해서 계대되었다. 클로날 배아 전구세포의 생산을 위해서, hES 세포를 15 ㎝ 접시당 500-10,000 세포로 플레이팅한 다음에, 제1 단계가 "후보 배양물"로 불리는 세포의 다양한 불균질 배양물을 수득하는 조건의 어레이 하에서의 hES 세포의 분화인 2-단계 프로토콜 하에서 분화시켰다. 후보 배양물의 생성은 MEFs 상에서 성장한 부착성 hES 세포 (콜로니 동소 분화) 또는 hES 유래 배아체 (EB)를 사용하여 수행되었다. 콜로니 동소 분화실험을 위해서, hES 세포는 합류 (confluence)하도록 성장시키고, 다양한 방법에 의해서 분화시켰다 (온전히 본 발명에 참고로 포함된 문헌 [West et al., 2008, Regenerative Medicine vol. 3(3) pp. 287-308]의 부록 표 1에 기술된 바와 같다). 비-제한적 예로서, 10% FCS를 함유하는 DMEM 중에서의 콜로니 동소 분화의 경우에는 배양 배지를 마우스 피더 (feeders) 상의 hES 세포 콜로니의 배양물로부터 흡인하고, 상기 배지를 다양한 시간 후에 (분화 배지 내에서 1, 2, 3, 4, 5, 7, 및 9일) 분화를 위한 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지로 교체하였다. 그 후, 세포를 0.25% 트립신 (Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 분리시키고, 팽창을 위해서 150 ㎠ 플라스크 내에 플레이팅하였다. 150 ㎠ 플라스크 내의 각각의 시점으로부터의 후보 세포를 이하에 기술되는 바와 같이 클로닝 및 팽창을 위해서 플레이팅하였다. EB 분화실험을 위해서는, 합류성 hES 세포를 37℃에서 15 분 동안 1 ㎎/㎖ 콜라게나제 IV (DMEM 중에서, Invitrogen, Carlsbad, CA)로 처리하여 콜로니들을 유리시켰다. 탈착된 온전한 콜로니들을 긁어내고, 원심분리 (5 분 동안 150xg)에 의해서 수집하고, 부록 표 1 (온전히 본 발명에 참고로 포함된 문헌 [West et al., 2008, Regenerative Medicine vol. 3(3) pp. 287-308]으로부터)에 기술된 분화 배지 내에 재현탁시키고, 동일한 분화 배지를 함유하는 6-웰 초저 결합 플레이트 (Ultra-Low Binding plate) (Corning, distributed by Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)의 단일 웰에 전이시켰다. EBs는 실험에 따라서 4-7일 동안 분화하도록 하고, 분화된 EBs를 0.25% 트립신으로 분리시키고, 다양한 팽창 배지를 함유하는 6-웰 플레이트 내에 플레이팅하였다. 6-웰 플레이트 내의 후보 배양물을 합류하도록 성장시키고, 이하에 기술된 바와 같은 클로닝 및 팽창을 위해서 플레이팅하였다.
클로날 세포주의 분리 및 팽창
상술한 부분적으로 분화된 후보 세포 배양물을 0.25% 트립신에 의해서 단일 세포로 분리시키고, 부록 표 1 (온전히 본 발명에 참고로 포함된 문헌 [West et al., 2008, Regenerative Medicine vol. 3(3) pp. 287-308]으로부터)에 나타낸 다양한 성장 배지 중에서 추가의 분화 및 팽창을 위해 이중 15 ㎝ 젤라틴 코팅된 플레이트 상에 플레이트당 약 500 및/또는 1,000 및/또는 2,000 및/또는 5,000 세포의 클로닝 밀도로 플레이팅하였다. 클로날 밀도 세포는 10-14일 동안 동요가 없이 성장하도록 하고, 발육한 콜로니를 확인하여 표준 기술을 사용하여 클로닝 실린더 및 트립신에 의해서 수집하였다. 클로닝된 콜로니를 팽창을 위해서 젤라틴-코팅된 24 웰 플레이트 상에 전이시켰다. 클론이 24 웰 플레이트 내에서 합류됨에 따라서 (그러나 세포는 2일을 초과하는 동안 합류한 채로 남아있게 하지 않는다), 이들을 연속적으로 12 웰, 6 웰, T-25 플라스크, T-75 플라스크, T-150 또는 T-225 플라스크, 및 마지막으로 롤러병 (roller bottles)으로 팽창시켰다. 롤러병 단계까지 팽창한 클로날 세포주는 독특한 ACTC 식별번호를 지정하고, 사진을 찍고, 추후의 사용을 위해서 분취액으로 동결보존한다. 일단 세포가 합류성 6 웰 접시에 도달하면, 이들을 T-25 플라스크에 계대시키고, 세포의 일부분 (5 x 105)을 유전자 발현 프로파일 분석을 위해 젤라틴화된 6 ㎝ 접시에 플레이팅하기 위해서 분리시켰다. 대신으로, 일부의 세포를 일차로 T-225 플라스크에 계대시킨 다음에, 세포의 일부분 (5 x 105)을 유전자 발현 프로파일 분석을 위해 젤라틴화된 6 ㎝ 접시에 플레이팅하기 위해서 분리시켰다. 따라서, 세포가 겪은 집단 배가는 18-21 PDs인 것으로 결정되었다. 클로닝 플레이트로부터 세포 클론을 분리시킨 후에, 나머지 클론을 제조자의 설명에 따라 100% 에탄올 중에서 크리스탈 바이올렛 (Crystal violet) 염색 (Sigma HT9132-1L)에 의해서 가시화시켰다. 실험에 이용된 세포 배양 배지에는 다음의 배지가 포함된다: 평활근 세포 기초 배지 (Cat# C-22062B) 및 성장 보충제 (Cat# C-39267), 골격근 기초 배지 (Cat# C-22060B) 및 성장 보충제 (Cat# C-39365), 내피세포 기초 배지 (Cat# C-22221) 및 성장 보충제 (Cat# C-39221), 멜라닌세포 세포 기초 배지 (Cat# C-24010B) 및 성장 보충제 (Cat# C-39415)는 PromoCell GmbH (Heidelberg, Germany)로부터 입수하였다. 에피-라이프 (Epi-Life), 무-칼슘/무-페놀 레드 배지 (Cat# M-EPIcf/PRF-500) 및 저혈청 성장 보충물 (Cat# S-003-10)은 Cascade Biologics (Portland, Oregon)로부터 구입하였다. 메센컬트 (Mesencult) 기초 배지 (Cat# 05041) 및 보충물 (Cat# 5402)은 Stem Cell Technologies (Vancouver, BC)로부터 입수하였다. 둘베코의 변형된 이글 배지 (Cat# 11960-069) 및 태자소혈청 (Cat# SH30070-03)은 각각 Invitrogen (Carlsbad, CA) 및 Hyclone (Logan, UT)으로부터 구입하였다. 배지 및 보충물은 제조자의 설명에 따라 조합하였다.
클로날 배아 전구세포주 명명법:
본 발명의 세포주와 함께 이들의 대체 지정은 표 4에, "."에 대한 "-"의 대체 및 그 반대, 아라비아 숫자로 시작하는 세포주 명칭 앞에 "x"의 포함, 및 동일한 세포주의 동결된 앰플을 해동시키고, 증식시키고, 병행분석 (parallel analysis)에서 사용하는 경우의 예인 동일한 세포주의 생물학적 복제물을 나타내는 "bio1" 또는 "bio2" 및 주어진 세포주로부터 분리된 RNA를 해동시키거나 다른 식으로는 새로운 세포 배양물로 시작함이 없이 반복 분석을 위한 두 번째 시기에 이용하는 기술적 복제물을 나타내는 "Rep1" 또는 "Rep2"와 같은 접미사를 포함하는, 생명정보학적 분석으로 인한 명칭의 조작으로부터 유래하는 약간의 변형을 나타내는 동의어와 함께 열거한다. 세포주에 대한 계대 번호 (트립신 처리되고 재플레이팅된 세포의 횟수의 번호이다)는 통상적으로 문자 "P" 다음에 아라비아 숫자로 지정되며, 반대로 집단 배가 번호 (세포주가 하나의 세포로부터 클로날 팽창을 겪은 추정된 배가의 수를 나타낸다)는 문자 "PD" 다음에 아라비아 숫자로 지정된다. 계대에서 PDs의 번호는 실험에 따라 달랐지만, 일반적으로 각각의 트립신 처리 및 재플레이팅은 1:3 내지 1:4의 비 (각각 1.5 및 2의 PDs의 증가에 해당함)로 이루어졌다. 클론의 팽창 시에는, 원래의 콜로니를 클로닝 실린더에 의해서 조직 배양 플레이트로부터 분리시키고, 상술한 바와 같이 24-웰 플레이트, 그 다음에는 12-웰 및 6-웰에 전이시켰다. 일차 합류성 24 웰을 P1으로 지정하며, 일차 합류성 12 웰 배양물은 P2이고, 일차 6-웰 배양물은 P3이며, 그 다음에 6-웰 배양물을 이차 6 웰 플레이트 (P4) 및 T25 (P4)로 분할하였다. P4에서의 이차 6 웰이 RNA 추출을 위해서 이용되며 [참조: 2009년 7월 16일에 출원된 미국 특허출원 제12/504,630호 (발명의 명칭: "Methods to Accelerate the Isolation of Novel Cell Strains from Pluripotent Stem Cells and Cells Obtained Thereby"); 이것은 온전히 본 발명에 참고로 포함된다], 클로날 팽창의 약 18-21 PD를 나타낸다. 대표적인 추정된 후속 계대 및 PDs는 T75 플라스크 (19.5-22.5 PD)로의 후속 분할, 세포의 T225 플라스크 (21-24 PD)로의 P6 계대이고, 다음으로 P7은 롤러병 (850 ㎠, 23-26 PD)으로의 전이이며, P8은 4 개의 롤러 (25-28 PD)로의 분할이다. 상기에서 괄호 안에 나타낸 범위는 세포 크기, 부착 효율 및 계수 오차 (counting error)에 기인한 세포 수에 있어서의 추정된 범위를 나타낸다.
클로날, 풀링된 (pooled) 클로날, 올리고클로날, 및 풀링된 올리고클로날 세포주의 증식
본 발명의 양상은 단일 세포 (클로날), 또는 클로닝된 세포주가 유전자 발현 마커와 같은 식별할 수 없는 마커를 가지며 종종 배양물에서 세포의 수를 증가시킬 목적으로 단일 세포 배양물을 생산하기 위해 조합되는 것을 의미하는 "풀링된 클로날"인 세포주로부터 유도되거나, 세포주가 소수의, 전형적으로 2-1,000 개의 유사한 세포로부터 생산되고 세포주로서 팽창되는 올리고클로날, 또는 유전자 발현의 패턴과 같은 식별할 수 없는 마커를 갖는 2 개 또는 그 이상의 올리고클로날 세포주를 조합함으로써 생산되는 세포주인 "풀링된 올리고클로날" 세포주인 배아 전구세포주를 확인 및 분화시키는 방법을 제공한다. 그 후에, 상기의 클로날, 풀링된 클로날, 올리고클로날 또는 풀링된 올리고클로날 세포주는 추가의 증식을 촉진시키기 위해서 이들이 부착된 기질로부터의 세포의 분리 및 전형적으로 세포의 원래의 수의 1/3 내지 1/4인 감소된 밀도로 세포의 재-플레이팅을 통해 시험관내에서 증식시킨다. 상기 세포주 및 이들의 연관된 세포 배양 배지의 예는 추가의 정보를 포함한 2009년 7월 16일자 출원된 미국 특허출원 제12/504,630호 (발명의 명칭: "Methods to Accelerate the Isolation of Novel Cell Strains from Pluripotent Stem Cells and Cells Obtained Thereby") 및 문헌 [West et al., 2008, Regenerative Medicine vol. 3(3) pp. 287-308] (이들은 둘 다 본 발명에 참고로 포함된다)에 기술된다. 본 발명의 조성물 및 방법은 클로날 팽창의 21 배가 이상 동안 기술된 바와 같이 배양된 상기 세포주에 관한 것이다.
유전자 발현 분석
세포 주기 인위적 결과 (artifacts)에 기인한 유전자 발현에서의 변화를 감소시키고, 6 웰 플레이트로 팽창 시에 세포의 초기 유전자 발현 프로파일을 포착하기 위해서, 세포가 합류에 도달한 날에 세포를 원래의 혈청 농도가 >5%인 경우에는 0.5%로 혈청을 감소시킨 배지 내에 배치시켰다. 다른 모든 경우에는 혈청 및/또는 다른 성장인자를 그들의 원래 값의 10%로 감소시켰다. 이들 정지 조건 (quiescence conditions)을 5일 동안 부과하고, 모든 배양물을 수확하기 2일 전에 재-피딩하여 피딩 차이 인위적 결과를 감소시켰다. 그래서, 예를 들어, 원래의 배지가 10% FCS를 함유하는 DMEM 배지인 경우에, 정지 동조화 배지 (quiescence synchronization media)는 0.5% FCS를 함유하는 DMEM이었다. 총 RNA는 제조자의 설명에 따라 퀴아겐 알엔이지 미니 키트 (Qiagen RNeasy mini kits)를 사용하여 6-웰 또는 6 ㎝ 조직 배양 플레이트에서 성장하는 세포로부터 직접 추출하였다. RNA 농도는 베크만 (Beckman) DU530 또는 나노드롭 (Nanodrop) 분광광도계를 사용하여 측정하였으며, RNA 품질은 변성 아가로즈 겔 전기영동 또는 애질런트 (Agilent) 2100 생물분석기 (bioanalyzer)에 의해서 결정하였다. 전체-게놈 발현 분석은 아피메트릭스 (Affymetrix) 인간 게놈 U133 플러스 2.0 젠칩 (GeneChip®) 시스템, 일루미나 (Illumina) 인간-6 v1 및 인간Ref-8 v1 비드칩 (Beadchips) (Illumina 1), 및 일루미나 인간-6 v2 비드칩 (Illumina 2)를 사용하여 수행되었으며, 특정의 유전자에 대한 RNA 레벨은 정량적 PCR에 의해서 확인되었다. 일루미나 비드어레이 (Illumina BeadArrays)의 경우에, 총 RNA는 선형으로 증폭되었으며, 일루미나 토탈프렙 (Illumina TotalPrep) 키트 (Ambion)를 사용하여 비오틴-표지되었고, cRNA는 애질런트 2100 생물분석기를 사용하여 품질 조절되었다. cRNA를 일루미나 비드칩에 하이브리드화시키고, 처리하고, 제조자의 설명 (Illumina)에 따라 비드스테이션 어레이 판독기 (BeadStation array reader)를 사용하여 판독하였다. 공통적인 프로브 세트를 갖는 모든 세포주에 대한 상대적 형광 유니트 (RFU)는 분위수 (quantile) 정규화하였다.
상기 유전자 발현 분석으로부터의 데이터는 모든 부록 표를 포함하여 온전히 본 발명에 참고로 포함된 문헌 [West et al., 2008, Regenerative Medicine vol. 3(3) pp. 287-308]으로부터의 부록 표에서 볼 수 있다. 부록 표 II-IV에서, 상기 유전자들은 (세포주의 전체 세트 중의 유전자에 대해 관찰된 최고 RFU 값 - 평균 RFU 값)/Ave RFU 값의 비에 대한 순위 등급 (최고-최저)로 표시된다. 부록 표 V에서, 상위 45 개의 차등적으로 발현된 유전자는 모든 세포주에 대한 (개개 세포주에서 유전자에 대해 관찰된 최고 RFU 값)/Ave RFU 값의 비에 대해 순위로 배열한다 (최고-최저). 부록 표 VI에서, 인식된 CD 항원에 상응하는 유전자는 각각 (세포주의 전체 세트 중의 유전자에 대해 관찰된 최고 RFU 값)/Ave RFU 값 및 (세포주의 전체 세트 중의 유전자에 대해 관찰된 최저 RFU 값)/Ave RFU 값의 비에 대한 순위 등급 (최고-최저) 및 또한 (최저-최고)로 나타낸다. 부록 표 VII에서, 분비된 단백질에 상응하는 유전자는 (세포주의 전체 세트 중의 유전자에 대해 관찰된 최고 RFU 값)/Ave RFU 값의 비에 대한 순위 등급 (최고-최저)로 나타낸다.
연골세포 분화를 유도하기 위한 예시적 조건
본 발명에 기술된 전구세포주를 사용하여 연골형성 (또는 연골 생산)을 유도하는 어떤 편리한 방법이라도 연구 또는 치료학적 목적으로 사용될 수 있으며 (생체내 또는 시험관내에서), 그들만으로 이에 관해서 제한하고자 하는 것은 아님을 알아야 한다. 따라서, 이하에 기술된 시험방법은 연골형성을 위한 조건의 예시적인 비-제한적 예를 나타낸다.
마이크로매스 분화 프로토콜 1
이하의 분화 프로토콜은 간단하게 "d14 MM" (예를 들어, 여기에 기술된 마이크로어레이 표에서)으로 칭한다.
1. 세포를 젤라틴 (0.1%) 코팅된 코닝 (Corning) 조직 배양 처리된 컬처웨어 (cultureware) 중에서 배양하고, PBS (Gibco 무-Ca,Mg)로 1:3 희석된 0.25% 트립신/EDTA (Gibco)로 탈착시킨다. 탈착시키고 성장 배지를 첨가한 후에, 세포를 코울터 계수기 (Coulter counter)를 사용하여 계수하고, 실험에 필요한 적절한 수의 세포 (예를 들어, 10 x10e6 세포 또는 그 이상)를 성장 배지 내에 20x10e6 세포/㎖의 세포 밀도로 재현탁시킨다.
2. 10 ㎕ 분취액을 코닝 조직 배양 처리된 폴리스티렌 플레이트 또는 접시 상에 마운드 (mounds) 또는 "마이크로매스 (micromasses)"로 접종한다. 25 또는 그 이상의 마이크로매스 분취액 (200,000 세포/10 ㎕ 분취액)을 접종한다.
3. 접종된 마이크로매스를 부착을 위해서 5% O2 및 10% CO2 하의 37℃의 가습 배양기 내에서 90 분 내지 2 시간 동안 배치한다.
4. 성장 배지를 첨가하고, 다음 아침에 흡인하고, PBS (무-Ca, Mg)로 세척한 후에, 완전 연골형성 배지 (펠릿 마이크로매스에 대해서 이하에 기술된 바와 같이 제조됨)로 대체시킨다. 예를 들어, 10 ㎝ 접시당 6 ㎖ 완전 연골형성 배지를 첨가한다. 세포를 5% O2, 10% CO2 하의 37℃의 가습 배양기 내에 유지시키고, 연골형성 배지는 매 2-3일마다 신선하게 제조된 배지로 대체시킨다.
5. 연골형성 배지 내에서 다양한 시간 후에 RNA를 Qiagen Handbook에 기술된 바와 같이 퀴아겐 알엔이지 키트 (Qiagen RNeasy kits; Qiagen Cat. No. 74104)를 사용하여 추출한다. RNA 수율은 RNA 추출 전에 마이크로매스를 RLT 완충액 (알엔이지 미니 키트와 함께 제공됨)으로 용해시킨 후에 퀴아겐 퀴아슈레더 (Qiagen's QiaShredder; Cat. # 79654)를 사용하여 샘플을 균질화시킴으로써 최대화시킨다.
Lonza 연골형성 배지에 대한 대안은 Media Tech로부터의 셀그로 (CellGro; Cat. No. 15-013-CV)이다. 500 ㎖ 각각에 다음의 보충물을 첨가한다: 5.0 ㎖ Pen/Strep (Gibco Cat. No. 15140), 5.0 ㎖ 글루타맥스 (Gibco Cat. No. 35050), 덱사메타손 (Sigma, St. Louis, MO, Cat. No.D1756-100) - 0.1 μM의 최종 농도의 경우에는 0.1 mM 500 ㎕; L-프롤린 (Sigma Cat. No. D49752) - 0.35 mM의 최종 농도의 경우에 0.35 M 500 ㎕; 아스코르빈산-2-포스페이트 (Sigma, Cat. No. 49792, Fluka) - 0.17 mM의 최종 농도의 경우에 0.17 M 500 ㎕; ITS 프리믹스 (BD, Franklin Lakes, NJ, sterile Cat. No. 47743-628) - 6.25 ㎍/㎖ 인슐린, 6.25 ㎍/㎖ 트랜스페린, 6.25 ng/㎖ 아셀렌산, 혈청 알부민 1.25 ㎎/㎖, 5.35 ㎍/㎖ 리놀렌산의 최종 농도를 위해서 500 ㎕의 1000x 농축물.
상기 구성성분을 첨가한 후에 배지를 500 ㎖ 코닝 0.2 미크론 필터 유니트를 통해서 여과한다.
마이크로매스 분화 프로토콜 2
이하의 분화 프로토콜은 본 발명에 기술된 마이크로어레이 표에서 간단하게 "d14 MM"으로 칭한다.
상기에 기술된 Lonza TGFβ3에 대한 대안으로 본 발명자들은 TGFβ3 (R&D Systems, Minneapolis MN, Cat. No. 243-B3-010)을 사용한다. 이것은 Lonza로부터 구입한 것과 유사하게 제조, 분취 및 저장하고, 사용하였다.
마이크로매스 분화 프로토콜 3
이하의 분화 프로토콜은 본 발명에 기술된 마이크로어레이 표에서 간단하게 "d14 CS"로 칭한다.
마이크로매스 프로토콜 1에 대한 대안으로, 혈청-함유 배지의 존재하에서 마이크로매스가 부착하도록 하는 것이 아니라 세포를 완전 연골형성 배지 내에 직접 플레이팅할 수 있다. 상기 분화된 마이크로매스는 본 발명에서 "Chondro-접종" 또는 "CS"로 지정된다.
펠릿 분화 프로토콜
이하의 분화 프로토콜은 본 발명에 기술된 마이크로어레이 표에서 간단하게 "d14 Pel"로 칭한다.
1. 세포를 젤라틴 (0.1%) 코팅된 코닝 조직 배양 처리된 컬처웨어 내에서 배양하고, PBS (무-Ca,Mg)로 1:3 희석된 0.25% 트립신/EDTA (Invitrogen, Carlsbad, CA, Gibco)로 탈착시킨다. 탈착시키고 성장 배지를 첨가한 후에, 세포를 코울터 계수기를 사용하여 계수하고, 실험에 필요한 적절한 수의 세포 (예를 들어, 10x10e6 또는 그 이상)를 멸균 폴리프로필렌 튜브에 전이시키고, 실온에서 5 분 동안 150g로 회전시킨다.
2. 상등액을 흡인하여 버린다. 세포를 보충물이 첨가된 hMSC 콘드로 뷸렛키트 (Chondro BulletKit) (PT-3925) (Lonza, Basel, Switzerland, Poietics Single-Quots, Cat. # PT-4121)로 구성된 불완전 연골형성 배지를 첨가하여 세척한다. 불완전 연골형성 배지를 제조하기 위해서 첨가된 보충물은 다음과 같다: 덱사메타손 (PT-4130G), 아스코르베이트 (PT-4131G), ITS + 보충물 (4113G), 피루베이트 (4114G), 프롤린 (4115G), 겐타마이신 (4505G), 글루타민 (PT-4140G).
3. 세포를 실온에서 150g로 회전시키고, 상등액은 흡인하고, 세포 펠릿을 7.5 x 105 세포당 1.0 ㎖ 불완전 연골형성 배지로 재현탁시키고 (한번 더), 5 분 동안 150 x g으로 회전시킨다. 상등액을 흡인하여 버린다. Lonza에 의해서 기술된 바와 같은 연골형성 배양 프로토콜을 약간 변형 (이하에 기술되는 바와 같음)시켜 수행한다.
4. 세포 펠릿을 완전 연골형성 배지 내에 ㎖당 5.0 x 105 세포의 농도로 재현탁시킨다. 완전 연골형성 배지는 Lonza 불완전 배지와 TGFβ3 (Lonza, PT-4124)으로 구성된다. 멸균 동결건조된 TGFβ3은 1 ㎎/㎖ BSA를 함유하는 멸균 4 mM HCl을 20 ㎍/㎖의 농도로 첨가함으로써 재구성하고, 분취한 후에 -80℃에서 저장한다. 완전 연골형성 배지는 2 ㎖의 불완전 연골형성 배지 각각에 1 ㎕의 TGFβ3를 첨가함으로써 (최종 TGFβ3 농도는 10 ng/㎖이다) 사용하기 직전에 제조한다.
5. 세포 현탁액의 0.5 ㎖ (2.5 x 105 세포)의 분취액을 멸균 15 ㎖ 폴리프로필렌 배양 튜브 내에 배치한다. 세포를 실온에서 150 x g으로 5 분 동안 회전시킨다.
6. 원심분리한 후에, 튜브의 캡을 절반 돌려서 느슨하게 하여 가스 교환이 일어나도록 한다. 튜브를 10% CO2 및 5% O2의 가습 대기 하에 37℃의 배양기 내에 배치한다. 펠릿은 24 시간 동안 동요시키지 않는다.
7. 세포 펠릿은 이전의 배지를 멸균 1-200 ㎕ 피펫 팁을 사용하여 흡인하고, 0.5 ㎖의 새롭게 제조된 완전 연골형성 배지를 각각의 튜브에 첨가하여 각각의 튜브 내의 배지를 완전히 대체시킴으로써 매 2-3일마다 피딩한다.
8. 배지를 대체시키고, 펠릿이 자유-부유하도록 보장한 후에, 캡을 느슨하게 하고 튜브를 배양기로 복귀시킨다.
9. 펠릿은 연골형성 배지 내에서 다양한 시간 후에 수확하고, 중성 완충된 포르말린으로 고정시킴으로써 조직학을 위해서 대비하고/하거나, 펠릿을 합하여 알엔이지 미니 키트 (RNeasy mini Kits; Qiagen, Germantown, MD, Cat. No. 74104)를 사용한 RNA 추출에 대비한다.
RNA 추출을 위한 프로토콜은 Qiagen Handbook에 의해서 기술된 바와 같이 수행된다. RNA 수율은 RNA 추출 전에 세포 펠릿을 RLT 완충액 (알엔이지 미니 키트와 함께 제공됨)으로 용해시킨 후에 퀴아겐 퀴아슈레더 (Qiagen's QiaShredder; Cat. # 79654)를 사용하여 샘플을 균질화시킴으로써 최대화시킨다.
알기네이트 비드 분화 프로토콜
이하의 분화 프로토콜은 본 발명에 기술된 마이크로어레이 표에서 간단하게 "d14 alginate"로 칭한다.
본 발명의 세포를 저속으로 원심분리함으로써 펠릿화하고, NaCl (155 mM)로 세척하고, 다시 원심분리시키고, 펠릿을 1.2% 알기네이트 (Lonza) 내에 20x106으로 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 1 ㎖ 주사기 내로 뽑아내고, 22g 바늘을 통해서 CaCl2 배쓰 (102 mM)에 적가하여 분배시켰다. 겔화는 즉각적이다. 비드를 NaCl (155 mM)로 3-5x 세척한 다음에 연골형성 배지 내에 액침시켜 연골형성 배지 (TGF 없음)로 한번 세척하였다. 상기 비드를 6 웰 플레이트의 다중 웰에 배치하고, 14일 동안 1 주일에 3일마다 피딩하였다. 그 후, 비드를 NaCl로 수회 세척한 후에 20 분 동안 나트륨 시트레이트 (55 mM)에 노출시킴으로써 해중합시켰다. 회전시킨 후에, 세포 펠릿을 RLT (Qiagen)로 용해시키고, 총 RNA는 수율을 개선시키기 위한 퀴아슈레더 (QiaShredder)를 사용하는 세편화 단계 (shredding step) 후에 알엔이지 마이크로 키트 (RNeasy micro kits; Qiagen)를 사용하여 추출한다. COL2A1 발현은 상기한 바와 같이 qPCR에 의해서 결정되었다.
연골세포 분화의 유전자 발현 마커
연골세포 유전자 발현은 본 명세서에 기술된 바와 같은 마이크로어레이 분석에 의해서, 또는 qPCR에 의해서 시험할 수 있다. qPCR 프라이머 서열은 본 기술분야에서 공지된 방법에 의해서 선택될 수 있으며, 비-제한적인 예를 들면 다음과 같을 수 있다:
Figure 112012011816846-pct00001
연골형성을 위한 그 밖의 다른 프라이머 세트:
Figure 112012011816846-pct00002
Figure 112012011816846-pct00003
Figure 112012011816846-pct00004
qPCR 프로토콜은 다양할 수 있으며, 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 비-제한적 예를 들어, 프라이머당 0.4 μM의 cDNA에 해당하는 30 ng의 RNA, 초순수 증류수 (Invitrogen)로 구성된 시험을 위한 샘플을 표준 옵티칼 (Optical) 96-웰 반응 플레이트 (Applied Biosystems Carlsbad, CA, PN 4306737) 내에서 제조하고, 25 ㎕의 총 반응 용적으로 앰플리택 골드 (AmpliTaq Gold) DNA 폴리머라제를 혼입시킨 12.5 ㎕의 파워 SYBR 그린 PCR 매스터 믹스 (Power SYBR Green PCR Master Mix; Applied Biosystems Carlsbad, CA, Cat# 4367659)에 의해 1:1 희석한다. 실시간 qPCR은 SDSv1.2 소프트웨어를 이용하는 Applied Biosystems 7500 실시간 PCR 시스템을 사용하여 수행한다. 증폭조건은 2 분 동안 50℃ (단계 1), 10 분 동안 95℃ (단계 2), 15 초 동안 95℃ 및 그 다음에는 1 분 동안 60℃의 40 사이클 (단계 3)과 함께 15 초 동안 95℃, 1 분 동안 60℃, 및 15 초 동안 95℃의 분리단계 (단계 4)로 설정된다. 관심이 있는 유전자의 증폭 생성물에 대한 Ct 값은 3 개의 항존 유전자 (housekeeping genes) (GAPD, RPS10, 및 GUSB)의 평균 Ct 값에 대해 표준화시킨다.
사프라닌 O 염색 검정
사프라닌 O으로 포르말린-고정되고 파라핀-매립된 조직 절편을 염색하는 잘 알려진 기술이 통상적으로 연골-관련된 프로테오글리칸의 검출에 사용되지만, 상기 시험방법은 뮤신, 비만세포 과립, 및 다른 세포 타입 내의 유사한 다은 물질을 또한 염색하기 때문에 이것은 연골에 대해 절대적으로 특이적인 것은 아니다. 연골 및 뮤신이 오렌지색 내지 적색으로 염색되고, 핵이 흑색으로 염색되며, 배경은 녹색으로 염색되는 프로토콜의 비-제한적인 예는 세포의 포르말린-고정된 마이크로매스, 펠릿 또는 유사한 응집체를 사용한다. 사용된 시약에는 바이거트 (Weigert) 철 헤마톡실린 용액 (여기에서, 저장 용액 A는 100 ㎖의 95% 알콜 중의 1 그램의 헤마톡실린으로 구성되며; 저장 용액 B는 95 ㎖의 증류수와 1.0 ㎖의 진한 염산 중에 희석된 물 중의 4 ㎖의 29% 염화제2철로 구성된다); 동등한 부의 저장 용액 A 및 B로 구성되고 4 주일 이내에 사용되는 바이거트 철 헤마톡실린 작업 용액; 1000 ㎖ 증류수 중의 0.01 그램의 패스트 그린 (Fast green), FCF, C.I. 42053으로 구성된 0.001% 패스트 그린 (FCF) 용액; 99 ㎖ 증류수 중의 1.0 ㎖ 빙초산으로 구성된 1% 아세트산 용액; 및 100 ㎖ 증류수 중의 0.1 그램의 사프라닌 O, C.I. 50240으로 구성된 0.1% 사프라닌 O 용액이 포함된다. 샘플을 탈파라핀화시키고, 증류수로 수화시킨다. 이들을 바이거트 철 헤마톡실린 작업 용액으로 10 분 동안 염색한 다음에, 10 분 동안 흐르는 수돗물 중에서 세척하고, 패스트 그린 (FCF) 용액으로 5 분 동안 염색하고, 1% 아세트산 용액으로 단지 10-15 초 동안만 씻어내고, 0.1% 사프라닌 O 용액으로 5 분 동안 염색하고, 탈수시키고, 95% 에틸 알콜, 무수 에틸 알콜, 및 크실렌으로 각각 2 번씩 교대하여 각각 2 분씩 세정하고, 수지상 배지를 사용하여 마운트 (mount)하고, 영상화하여 상술한 바와 같이 염색에 대해서 분석한다. 연골-관련된 프로테오글리칸은 암적색-오렌지색으로 염색된다.
저처리율 (low throughput) 스크리닝 및 qPCR
클로날 또는 올리고클로날 팽창의 <21 또는 바람직하게는 >21 배가, 가장 바람직하게는 클로날 팽창의 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 또는 70 배가 상태 (세포 팽창의 29 배가 이전에는 세포를 단지 제한된 양으로 이용할 수 있고, 70 배가를 넘어서면 세포가 통상적으로 노화에 가까워지기 때문이다)인 본 발명의 클로날, 올리고클로날, 또는 풀링된 클로날 또는 풀링된 올리고클로날 배아 전구세포주를 1, 2, 3, 4, 5, 또는 바람직하게는 10 또는 그 이상의 다양한 분화조건에서 동시에 스크리닝한다. 분화조건은 상기에 "마이크로매스 분화", "펠릿 분화" 및 "알기네이트 비드 분화"로 기술된 것을 포함할 수 있다.
시험의 정보 판독은 "연골세포 분화의 유전자 발현 마커"로 상술된 것으로 마이크로어레이를 포함하는 (이들로 제한되지 않는다) 어레이된 표적 서열에 대한 하이브리드화에 의해서, 또는 qPCR에 의해서 측정될 수 있는 것을 포함하는 (이들로 제한되지 않는다) 연골세포 분화의 mRNA 마커일 수 있다. 검출은 또한 효소 시험방법, 질량분석법 또는 본 기술분야에서 잘 알려진 그 밖의 다른 유사한 방법을 사용함으로써 특이적 항체의 사용을 통해서 검출될 수 있는 펩타이드 또는 단백질의 레벨에서 이루어질 수도 있다.
클로날 또는 올리고클로날 배아 전구세포의 운명 공간 (Fate Space)의 중간 처리율 스크린
클로날 또는 올리고클로날 팽창의 <21 또는 바람직하게는 >21 배가, 가장 바람직하게는 클로날 팽창의 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 또는 70 배가 상태 (세포 팽창의 29 배가 이전에는 세포를 단지 제한된 양으로 이용할 수 있고, 70 배가를 넘어서면 세포가 통상적으로 노화에 가까워지기 때문이다)인 본 발명의 클로날, 올리고클로날, 또는 풀링된 클로날 또는 풀링된 올리고클로날 배아 전구세포주를 10, 20, 30, 40, 50, 또는 바람직하게는 100 또는 그 이상의 다양한 분화조건 [참조: 예를 들어, 각각 본 발명에 참고로 포함된 2006년 11월 21일에 출원된 미국 특허출원 제11/604,047호 (발명의 명칭: "Methods to Accelerate the Isolation of Novel Cell Strains from Pluripotent Stem Cells and Cells Obtained Thereby"); 및 2009년 7월 16일에 출원된 미국 특허출원 제12/504,630호 (발명의 명칭: "Methods to Accelerate the Isolation of Novel Cell Strains from Pluripotent Stem Cells and Cells Obtained Thereby")에 기술된 분화조건]에서 동시에 스크리닝한다. 상기 세포는 1-6 주일 동안, 가장 바람직하게는 4 주일 동안 상기의 분화조건에서 배양한다.
시험의 정보 판독은 "연골세포 분화의 유전자 발현 마커"로 상술된 것으로 마이크로어레이를 포함하는 (이들로 제한되지 않는다) 어레이된 표적 서열에 대한 하이브리드화, 또는 qPCR에 의해서 측정될 수 있는 것과 같은 분화의 mRNA 마커일 수 있다. 검출은 또한 효소 시험방법, 질량분석법 또는 본 기술분야에서 잘 알려진 그 밖의 다른 유사한 방법을 사용함으로써 특이적 항체의 사용을 통해서 검출될 수 있는 펩타이드 또는 단백질의 레벨에서 이루어질 수도 있다.
hEP 세포 분화의 중간 처리율 qPCR 스크린
클로날 또는 올리고클로날 팽창의 <21 또는 바람직하게는 >21 배가, 가장 바람직하게는 클로날 팽창의 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 또는 70 배가 상태의 상술한 것으로 포함하는 (이들로 제한되지 않는다) 본 발명의 클로날, 올리고클로날, 또는 풀링된 클로날 또는 풀링된 올리고클로날 배아 전구세포주를 12 웰 배양 플레이트에 플레이팅하며, 여기에서 각각의 웰은 250,000 세포의 10 마이크로매스를 갖는다 (즉, 웰당 250만 세포). 대신으로, 세포를 다른 배양조건 [예를 들어, 각각 본 발명에 참고로 포함된 2006년 11월 21일에 출원된 미국 특허출원 제11/604,047호 (발명의 명칭: "Methods to Accelerate the Isolation of Novel Cell Strains from Pluripotent Stem Cells and Cells Obtained Thereby"); 및 2009년 7월 16일에 출원된 미국 특허출원 제12/504,630호 (발명의 명칭: "Methods to Accelerate the Isolation of Novel Cell Strains from Pluripotent Stem Cells and Cells Obtained Thereby")에 기술된 바와 같음; 참조: 이들 출원의 표 IV에 열거된 인자를 보충한 표 III에 열거된 배양 배지의 모든 조합에 노출된 동일한 수의 세포를 사용한 표 II]으로 처리한다. 상기 세포는 1-6 주일 동안, 가장 바람직하게는 4 주일 동안 상기의 분화조건에서 배양한다.
RNA는 제조자의 설명에 따라 알엔이지 미니 키트 (RNeasy mini kits; Qiagen)를 사용하여 세포 용해물로부터 제조한다. 간략해서, 세포 배양물 (마이크로매스)을 PBS로 씻은 다음에 최소 용적의 RLN 용해 완충액 중에서 용해시킨다. 얼음 상에서 배양한 후에, 세포 파편을 원심분리에 의해서 제거하고, 용해물을 RLT 완충액과 혼합시키고, 그 후에 에탄올을 혼합물에 첨가한다. 그 후, 조합된 혼합물을 알엔이지 스핀 칼럼 (RNeasy spin column) 상에 부하시키고, 원심분리한다. 그 후, 부하된 칼럼을 세척하고, 정제된 RNA를 최소 용적의 DEPC-처리된 물 (전형적으로 30 ㎕ 또는 그 미만)을 사용하여 칼럼으로부터 유리시킨다. 최종 용출액 중의 RNA의 농도는 260 ㎚에서의 흡광도에 의해 결정된다.
cDNA 합성은 슈퍼스크립트 제1 스트랜드 cDNA 키트 (SuperScript First Strand cDNA kit) (InVitrogen; Carlsbad, CA)를 사용하여 수행된다. 간략하면, 2.5 ㎍의 정제된 RNA를 랜덤 헥사머의 존재 하에서 열변성시킨다. 냉각시킨 후에, 제1 스트랜드 반응을 슈퍼스크립트 역전사효소 및 키트로부터의 관련된 시약을 사용하여 완결시킨다. 수득된 생성물을 제조자의 설명에 따라 퀴아퀵 (QIAquick) PCR 정제 키트 (Qiagen)를 사용하여 더 정제한다. 간략하면, PB 완충액을 제1 스트랜드 cDNA 반응 생성물에 첨가한 다음에, 상기 혼합물을 퀴아퀵 스핀 칼럼 상에 부하시키고 원심분리한다. 상기 칼럼을 PE 완충액으로 세척하고, 정제된 cDNA를 최소 용적의 물 (20 ㎕)을 사용하여 칼럼으로부터 용출시킨다.
각각의 표적 유전자에 대한 qPCR 프라이머 쌍을 합성한다. 간략하면, 표적 유전자에 대한 프라이머 쌍은 단지 표적 mRNA 서열만을 증폭시키고, 최적으로 그들의 표적 서열에 대한 65-80℃의 범위에 있는 어니일링 온도 및 100-500 bp의 크기 범위인 독특한 증폭 생성물을 갖도록 디자인된다. 프라이머 쌍은 주문용 qPCR 오픈 어레이 플레이트 (Open Array plate)의 생산을 위해서 BioTrove, Inc. (Woburn, MA)에 작업 농도 (10 μM)로 공급된다. 오픈 어레이 플레이트는 56-336 프라이머 쌍을 수용하도록 디자인되며, 건조된 다운 (down) 프라이머 쌍을 갖는 최종 제작된 플레이트가 서비스 제공자에게 제공된다. 정제된 cDNA 반응 생성물 (2.) 및 사이버 (Syber) 그린 매스터 믹스를 오픈어레이 오토레이더 (OpenArray autolader) 장치 (BioTrove)를 사용하여 오픈어레이 플레이트의 각각의 웰에 부하시킨다. 상기 플레이트를 밀봉하고, qPCR을 수행하고, 증폭을 위해서 NT 이미저 (imager)/사이클러 (Cycler) 장치 (BioTrove)에 부하시킨다. 각각의 샘플에 대한 Ct 값은 오픈어레이 적용 소프트웨어를 사용하여 계산한다.
적용
동물 세포 및 조직의 배양을 위한 기술된 방법은 골관절염과 같은 관절염을 포함하는 (이들로 제한되지 않는다) 정형외과적 상태, 추간 조직의 변성, 일시적인 하악골 질환, 외상, 또는 코, 외이, 하악골, 기관, 윤상연골, 흉골, 또는 어깨, 팔꿈치, 손목, 손가락 및 둔부, 무릎, 발목 및 발가락과 같은 체중-지지 관절의 관절과 같은 그 밖의 다른 활막성 관절의 연골성 조직의 수술적 수복을 치료하는데 유용한 인간 세포 및 세포 유래 제제를 생성시키는 것과 같은 (이들로 제한되지 않는다) 포유동물 및 인간 세포 치료법에서 세포 또는 그의 자손을 생성시키는데 유용하다.
본 발명의 특정한 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해서 유도된 단일 세포 유래 및 올리고클로날 세포 유래 세포는 세포 생물학에 관한 장애의 연구 및 치료, 세포-기본 약물 발견 및 세포 치료법에 이용된다. 본 발명의 방법을 사용하여 유도된 단일 세포 유래 세포 집단은 이미 분화경로를 하류로 유도하는 필요한 시그날을 수용하였다.
본 발명의 특정한 구체예에서는, 단일 세포 유래 및 올리고클로날 세포 유래 세포를 치료학적 유용성을 나타내도록 하기 위해서 이들이 정상적으로 존재하는 조직 내로 도입시킨다. 본 발명의 특정한 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해서 유도된 단일 세포 유래 및 올리고클로날 세포 유래 세포는 다른 다능성 줄기세포의 분화를 유도하는데 이용된다. 유전자 발현의 배아 패턴을 유지하면서 시험관내에서 증식될 수 있는 세포의 단일 세포 유래 집단의 생성은 다른 다능성 줄기세포의 분화를 유도하는데 유용하다. 세포-세포 유도는 초기 배아에서 분화를 지시하는 통상적인 수단이다. 척수 뉴론, 심장 세포, 췌장 베타 세포, 및 한정적인 조혈성 세포를 포함하는 다수의 잠재적으로 의학적으로 유용한 세포 타입은 정상적인 배아 발육 중에 유도성 시그날에 의해서 영향을 받는다. 유전자 발현의 배아 패턴을 유지하면서 시험관내에서 증식될 수 있는 세포의 단일 세포 유래 집단은 다양한 시험관내, 난내, 또는 생체내 배양 조건에서 배양하여 바람직한 세포 또는 조직 타입이 되도록 다른 다능성 줄기세포의 분화를 유도할 수 있다. 유도는 유도제 (inducer) 세포를 표적 세포와 나란히 배치하는 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 비-제한적인 예를 들어, 유도체 세포를 조직 배양으로 플레이팅하고, 미토마이신 C 또는 방사선으로 처리하여 세포가 더 복제하는 것을 방지시킬 수 있다. 그 후, 표적 세포를 유사분열적으로-불활성화된 유도제 세포의 상부에 플레이팅한다. 대신으로, 단일 세포 유래 유도제 세포를 세포의 더 큰 배양물로부터, 또는 원래의 단일 세포 유래 콜로니로부터 제거가능한 막 상에서 배양할 수 있으며, 표적 세포는 유도제 세포의 상부에 플레이팅할 수 있거나, 표적 세포로 덮인 별도의 막을 두 개의 세포층이 간접적으로 접촉하게 샌드위치되도록 나란히 배치할 수 있다. 생성된 세포의 이중층은 시험관내에서 배양하고, SPF 조류 난에 이식하거나, 혈관 지지체를 제공하면서 삼차원적으로 성장하도록 하는 조건에서 배양할 수 있다 [참조: 예를 들어, 그의 기술내용이 이에 의해서 참고로 포함되는, 2005년 7월 28일에 공개된 국제특허출원 제WO2005068610호]. 유도제 세포는 또한, 유도제 세포가 마음대로 제거될 수 있도록 자살 구조물이 도입된, hES 또는 hED 세포를 포함한 다능성 줄기세포의 공급원으로부터 유래할 수도 있다. 단일 세포-유도 및 올리고클로날 세포-유도된 도입에 유용한 세포 타입은 정상적인 배아 발육 시에 자연적으로 일어나는 것으로 본 기술분야에서 잘 알려진 유도의 경우를 포함할 수 있다. 본 발명의 특정한 구체예에서, 본 발명의 방법에서 유도된 단일 세포 유래 세포 및 올리고클로날 세포 유래 세포는 다능성 줄기세포를 포함한 다른 세포 타입의 성장을 뒷받침하는 "피더 세포 (feeder cells)"로 사용된다. 본 발명의 단일 세포 유래 세포 및 올리고클로날 세포 유래 세포의 피더 세포로의 사용은 다른 포유동물 공급원으로부터 유도된 피더 세포로부터 병원체가 표적 세포로 전달되는 잠재적인 위험을 경감시킨다. 피더 세포는 예를 들어, 감마선 조사에 의해서, 또는 미토마이신 C로 처리함으로써 불활성화시켜 복제를 제한한 다음에, 다능성 줄기세포와 공동-배양할 수 있다.
본 발명의 특정한 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해서 유도된 단일 세포 유래 및 올리고클로날 세포 유래 세포의 세포외 매트릭스 (ECM)는 덜 분화된 세포를 지지하기 위해서 사용될 수 있다 [참조: Stojkovic et al., Stem Cells (2005) 23(3):306-14]. 통상적으로 피더 층을 필요로 하는 특정의 세포 타입은 매트릭스 상에서의 무-피더 배양으로 지지될 수 있다 [Rosler et al., Dev Dyn. (2004) 229(2):259-74]. 매트릭스는 STO 마우스 섬유아세포주 (ATCC 수탁번호 CRL-1503), 또는 인간 태반 섬유아세포와 같은 매트릭스-형성 세포주 [참조: WO 99/20741]를 전배양하고 용해시킴으로써 침착될 수 있다.
본 발명의 특정한 구체예에서, 단일 세포 유래 및 올리고클로날 세포 유래 세포 배양물의 조건화 배지를 수집하고, 풀링하여 여과하고, 조건화 배지로 저장할 수 있다. 이 조건화 배지를 제제화하고, 연구 및 치료를 위해서 사용할 수 있다. 이러한 조건화 배지는 덜 분화된 상태를 유지하는데 기여할 수 있으며, 다능성 줄기세포와 같은 세포의 증식을 허용할 수 있다. 본 발명의 특정한 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해서 유도된 단일 세포 유래 및 올리고클로날 세포 유래 세포 배양물의 조건화 배지를 사용하여 다능성 줄기세포를 포함한 다른 세포 타입의 분화를 유도할 수 있다. 단일 세포 유래 및 올리고클로날 세포 유래 세포 배양물의 조건화 배지의 사용은 배양된 세포가 다른 포유동물 공급원 (즉, 무-이종발생성)으로부터 유도된 비-인간 동물 병원체에 노출될 잠재적인 위험을 감소시키는데 유리할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서는, 어떤 공지된 세포 배양 조건 하에서 잘 증식하지 않는 세포 타입은 이들이 SV40 바이러스 거대 T-항원 (Tag), 또는 조절된 E1a 및/또는 E1b, 또는 파필로마바이러스 E6 및/또는 E7, 또는 CDK4의 조절된 발현과 같은 세포 주기의 억제를 극복하는 인자의 조절된 발현을 통해서 본 발명의 방법에 따라 클론적으로 또는 올리고클론적으로 분리될 수 있도록 증식하게 유도될 수 있다 [참조: 예를 들어, 참조함으로써 본원에 통합된, 2006년 11월 21일에 출원된 미국 특허출원 제11/604,047호 (발명의 명칭: "Methods to Accelerate the Isolation of Novel Cell Strains from Pluripotent Stem Cells and Cells Obtained Thereby")].
본 발명의 또 다른 구체예에서는, 세포 주기 정지를 무효화하는 인자를 추가의 단백질 또는 단백질 영역과 융합시켜 세포에 송달할 수 있다. 예를 들어, 세포 주기 정지를 무효화하는 인자는 단백질 형질도입 영역 (PTD)에 접합될 수 있다. 세포 주기 정지를 무효화하는 인자에 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합된 단백질 형질도입 영역은 상기 인자가 세포막을 가로질러서 전위하도록 함으로써 궁극적으로 단백질이 세포의 핵 구획에 도달할 수 있다. 세포 주기 정지를 무효화하는 인자와 융합될 수 있는 PTDs에는 HIV 전이활성화 (transactivating) 단백질 (TAT)의 PTD (Tat 47-57)가 포함된다 [Schwarze and Dowdy 2000 Trends Pharmacol. Sci. 21: 45-48; Krosl et al. 2003 Nature Medicine (9): 1428-1432]. HIV TAT 단백질의 경우에, 막 전위 활성을 부여하는 아미노산 서열은 잔기 47-57에 상응한다 [Ho et al., 2001, Cancer Research 61: 473-477; Vives et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 16010-16017]. 이들 잔기는 단독으로 단백질 전위 활성을 부여할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, PTD 및 세포 주기 정지 인자는 링커를 통해서 컨주게이트될 수 있다. 링커의 정확한 길이 및 서열 및 결합된 서열에 대한 그의 배향은 다양할 수 있다. 상기 링커는 예를 들어, 2, 10, 20, 30, 또는 그 이상의 아미노산을 포함할 수 있으며, 용해도, 길이, 입체적 분리 등가 같은 바람직한 특성을 기초로 선택될 수 있다. 특별한 구체예에서, 상기 링커는 예를 들어, 융합 단백질의 정제, 검출 또는 변형에 유용한 기능적 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 단일 세포 유래 또는 올리고클로날 세포 유래 세포는 2005년 8월 3일에 출원된 미국 특허출원 제60/705,625호, 2005년 10월 20일에 출원된 미국 특허출원 제60/729,173호, 및 2006년 7월 5일에 출원된 미국 특허출원 제60/818,813호 (이들의 기술내용은 본 발명에 참고로 포함된다)에 기술된 바와 같이 신규의 재프로그래밍 (reprogramming) 기술에 의해서 미분화된 상태로 재프로그래밍될 수 있다. 간략하면, 상기 세포는 제1 핵 리모델링 단계, 제2 세포 재구성 단계, 및 마지막으로 제2 단계로부터 발생하는 세포의 생성된 콜로니를 재프로그래밍의 정도 및 핵형 및 품질의 정규성에 대해서 특정화하는 제3 단계를 포함하는 적어도 2, 바람직하게는 3-단계 방법을 사용하여 미분화된 상태로 재프로그래밍될 수 있다. 특정의 구체예에서, 본 발명의 단일 세포 유래 또는 올리고클로날 세포 유래 세포는 분화된 세포의 핵막 및 크로마틴을 미분화된 세포 또는 배선 세포의 분자 조성과 더 근접하게 유사하도록 리모델링함으로써 재프로그래밍 방법의 제1 핵 리모델링 단계에서 재프로그래밍될 수 있다. 그 후, 재프로그래밍 방법의 제2 세포 재구성 단계에서는 리모델링된 핵막을 함유하는 제1 단계의 핵을, 전이된 핵과 함께 증식이 가능한 ES 또는 ED-유사 세포와 같은 미분화된 줄기세포의 집단을 생산할 수 있는 필수적인 유사분열 기구를 함유하는 세포질성 수포와 융합시킨다. 재프로그래밍 방법의 제3 단계에서는 제2 단계로부터 유래하는 하나 또는 다수의 세포로부터 발생한 세포의 콜로니를 재프로그래밍의 정도 및 핵형의 정규성에 대해서 특정화하고, 고품질의 콜로니를 선택한다. 이 제3 단계는 세포를 성공적으로 재프로그래밍하는데 필요하지 않고, 일부의 적용분야에서는 필수적이지 않지만, 재프로그래밍된 세포를 인간 이식과 같은 특정의 적용분야에서 사용하는 경우에는 제3 품질 조절단계를 포함시키는 것이 바람직하다. 마지막으로, 표준 핵형을 갖지만 충분한 정도의 프로그래밍이 되지 않은 재프로그래밍된 세포의 콜로니는 제1 및 2 단계 또는 제1 내지 3 단계를 반복함으로써 재순환될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 단일 세포 유래 및 올리고클로날 세포 유래 세포는 파지 디스플레이 (phage display) 기술을 사용하여 리간드를 생성시키기 위해서 사용될 수 있다 [참조: 2005년 5월 27일에 출원된 미국 특허출원 제60/685,758호 및 2006년 5월 26일에 출원된 PCT US2006/020552; 이들의 기술내용은 참조함으로써 본원에 통합된다].
유전자 발현 레벨의 측정은 마이크로어레이 유전자 발현 분석, 비드 어레이 유전자 발현 분석 및 노던 (Northern) 분석을 포함한 (이들로 제한되지 않는다) 본 기술분야에서 공지된 어떤 방법에 의해서라도 수행될 수 있다. 유전자 발현 레벨은 ADPRT (수탁번호 NM_001618.2), GAPD (수탁번호 NM_002046.2), 또는 본 기술분야에서 공지된 그 밖의 다른 항존 유전자에 대해서 표준화된 상대적 발현으로 표시될 수 있다. 유전자 발현 데이터는 또한, 중앙값 중의 중앙값 방법 (median of medians method)에 의해서 표준화될 수도 있다. 이 방법에서, 각각의 어레이는 상이한 총 강도를 제공한다. 중앙값을 사용하는 것은 실험에서 세포주 (어레이)를 비교하는 확실한 방법이다. 예를 들어, 중앙값을 각각의 세포주에 대해서 찾은 다음에 이들 중앙값의 중앙값이 표준화를 위한 값이 된다. 각각의 세포주로부터의 시그날이 다른 세포주 각각에 비례하여 만들어졌다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 단일 세포 유래 또는 올리고클로날 세포 유래 세포는 세포 표면 항원인 CD 항원 유전자 발현의 독특한 패턴을 발현할 수 있다. 세포 표면상에서 CD 항원의 차등 발현은 예를 들어, 어떤 CD 항원이 세포에 의해서 발현되는지를 기초로, 상업적으로 이용할 수 있는 항체를 사용하여 세포를 분류하기 위한 도구로서 유용할 수 있다. 본 발명의 일부 세포의 CD 항원의 발현 프로파일은 추가의 정보를 포함한 문헌 [West et al., 2008, Regenerative Medicine vol. 3(3) pp. 287-308; 이것은 본 발명에 참고로 포함된다]에 제시되었다. 예를 들어, ES 세포에서는 발현되지만 비교적 더 분화된 본 발명의 세포주에서는 발현되지 않는 (또는 일부의 경우에 감소된 레벨로 발현되는) CD 항원이 잇다. 이것은 ES 세포를 선택, 분류, 정제 및/또는 특정화하기 위한 매우 유용한 도구일 수 있다. CD 항원은 세포 표면상에서 발현되며, 그들에 대한 항체는 일반적으로 말해서 상업적으로 이용할 수 있기 때문에, 항체 (또는 그들의 특정한 조합)를 사용하여 ES 세포 또는 본 발명의 세포의 순수한 집단을 세포의 불균질 혼합물로부터 정제할 수 있다. 이것은 ES 세포 또는 본 발명의 세포를 성장시키거나, 다양한 상업적 목적으로 이들 세포를 제조하기 위한 다양한 전략에서 유용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서는, 본 발명의 방법에 의해서 유도된 단일 세포 유래 및 올리고클로날 세포 유래 세포를 마우스에게 주사하여 분화 항원에 대한 항체를 야기시킬 수 있다. 분화 항원에 대한 항체는 세포 치료 및 세포 분화의 연구를 위한 집단의 순도를 문서에 기록하기 위한 것뿐만 아니라 이식 후에 세포의 존재 및 운명을 문서에 기록하기 위해서 모두 세포를 확인하는데 유용할 수 있다. 일반적으로, 항체를 야기하는 기술은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다.
본 발명의 방법에 의해서 생산된 세포는 대량의 BMP3b 또는 BMP 패밀리의 다른 구성원을 생산하도록 유전적으로 변형될 수 있으며, 따라서 이 세포는 골-소모성 질환 (bone-wasting disease)에서 뼈를 유도하는데 유용할 수 있다. 하악골 간엽의 마커를 갖는 4D20.8로 지정된 본 발명의 세포주의 경우에, BMP3b 또는 BMP 패밀리의 다른 구성원과 같은 인자의 과발현은 턱의 골괴사 또는 골절과 같은 골괴사 또는 골절의 치료에 유용하다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 연골형성을 수행할 수 있는 단일 세포 유래 및 올리고클로날 세포 유래 세포는 비인간 동물 종으로부터 생성될 수 있으며, 수의학적 질환의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 연골형성을 수행할 수 있는 단일 세포 유래 및 올리고클로날 세포 유래 세포는 인간 또는 비인간 신체에서 다양한 연골 타입을 유도하는 전사 조절 네트워크를 포함하는 연골세포 분화에 대한 연구를 수행하기 위해서 실험적으로 사용될 수 있다.
조합
명확히 하기 위해서 별개의 구체예와 관련하여 기술된 본 발명의 특정한 특징들은 단일 구체예로 조합하여 제공될 수도 있는 것으로 이해된다. 역으로, 간결하게 하기 위해서 단일 구체예와 관련하여 기술된 본 발명의 다양한 특징들은 또한 별도로 또는 어떤 적합한 하위-조합으로 제공될 수도 있다. 본 발명의 배아 연골세포 전구세포의 유전자 발현 패턴에 관련된 구체예의 모든 조합은 구체적으로 본 발명에 의해서 포함되며, 어떤 조합이라도 모두 마치 개별적으로 및 명확하게 기술된 것처럼 본 발명에 기술된다. 따라서, 기술된 상기 마커를 디스플레이하는 배아 연골세포 전구세포가 본 발명에서 제공된다.
시스템 및 키트
본 발명에 의해서는 또한, 본 발명에 기술된 바와 같은 다양한 적용분야에서 사용하도록 디자인된 시스템 및 키트가 제공된다.
예를 들어, 본 발명의 양상에 따르는 시스템 및 키트 (이하에서는 일반적으로 "키트"라 칭함)는 하나 또는 그 초과의 본 발명의 배아 연골세포 전구세포주를 포함한다. 상기 키트는 추가로 연구 및/또는 치료학적 적용을 위한 세포의 증식 및 사용을 위한 시약 및 물질뿐만 아니라 사용 설명서를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한, 마이크로매스 분화 프로토콜 1, 마이크로매스 분화 프로토콜 2, 마이크로매스 분화 프로토콜 3, 펠릿 분화 프로토콜, 및 알기네이트 비드 분화 프로토콜로 상기에서 지정된 프로토콜에 기술된 물질과 같이 세포의 연골세포로의 분화를 유도하기 위해서 본 발명에서 사용된 시약을 함유할 수 있다.
일부의 구체예에서, 상기 키트는 연골 생산을 위해서 디자인되며, 하나 또는 그 초과의 본 발명에 기술된 배아 연골세포 전구세포주, 및 세포의 증식을 위해서 및/또는 연골형성을 유도하기 위해서 사용된 하나 또는 그 초과의 추가의 성분을 포함한다. 이러한 키트에서 제공된 배아 연골세포 전구세포주는 세포주 SM30, E15, 4D20.8, 7SMOO32, MEL2, SK11, 및 7PEND24의 마커와 같은 본 발명의 배아 전구세포주의 유전자 발현 마커를 디스플레이한다. 증식 및/또는 연골세포 분화를 위한 성분은 매트릭스 또는 스캐폴드 (또는 매트릭스/스캐폴드를 생성시키기 위한, 예를 들어, 하이드로겔을 생성시키기 위한 시약), 수화제 (예를 들어, 생리학적으로-허용되는 식염수 용액, 제조된 세포 배양 배지), 세포 배양 기질 (예를 들어, 배양 접시, 플레이트, 바이알 등), 세포 배양 배지 (액체 형태이거나 분말화된 형태), 항생제 화합물, 호르몬, 첨가제 등을 포함한, 이러한 목적을 위해 본 발명에 기술된 모든 성분을 포함할 수 있다.
특정의 구체예에서, 상기 키트는 예를 들어, 실험 동물 또는 필요한 환자, 예를 들어, 연골 수복/대체 요법이 필요한 환자에 대한 세포 집단의 송달을 촉진하도록 디자인된 성분을 더 포함할 수 있다. 이들 후자의 구체예에서, 키트의 성분은 치료학적 용도에 적합한 형태로 제공될 수 있다 (예를 들어, 멸균/의학적 등급의 성분으로 제공될 수 있다). 송달 성분은 세포 집단을 캅셀화 또는 고정화하도록 디자인된 것 (예를 들어, 스캐폴드 또는 매트릭스)뿐만 아니라 세포를 직접, 또는 분리된 세포를 결합 부위에 주사하고, 배아 전구세포를 적합한 스캐폴드 또는 매트릭스와 배양하고, 이식하며, 생물-재흡수성 스캐폴드와 함께 배양하는 등을 포함하여 다른 성분 (예를 들어, 스캐폴드 또는 매트릭스)과 함께 송달하도록 디자인된 것을 포함할 수 있다. 상기에서 상세히 기술된 바와 같은 생물-재흡수성 생체적합성 스캐폴드와 같은 모든 스캐폴드 또는 매트릭스가 이용될 수 있으며, 여기에서는 다수가 치료학적 연골 수복/대체를 위해서 사용되고 있거나, 이러한 연골 수복/대체에서의 사용에 관해 시험 중에 있다.
일부의 구체예에서, 상기 키트는 송달/이식된 세포 집단이 적어도 하나의 원하는 부위에, 예를 들어, 연골 손상의 부위에 위치하는 지를 결정하는데 사용하기 위한 성분을 포함한다. 이러한 성분은 대상체에게 송달된 세포의 국재화를 결정하고, 정량화까지도 가능하게 할 수 있다.
특정의 구체예에서, 키트 내의 배아 연골세포 전구세포주 또는 세포주들은 유전적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 배아 연골세포 전구세포주는 외인성 유전자, 예를 들어, 세포주로부터 송달된 세포의 추후 확인을 위해서 사용될 수 있는 마커 유전자 (예를 들어, 본 기술분야에서 잘 알려진 바와 같은 리포터 유전자)를 발현하도록 처리될 수 있다. 리포터 유전자는 직접 또는 간접적으로 검출할 수 있는 것, 예를 들어, 형광 단백질, 발광 단백질, 효소, 세포 표면 마커 등을 포함한다. 특정의 구체예에서, 상이한 세포주는 서로 식별가능한 외인성 리포터 유전자, 예를 들어, 상이한 여기 및/또는 방출 특징을 갖는 형광 단백질을 발현하도록 처리된다.
특정의 구체예에서, 상기 키트는 그의 의도하는 용도에 필요한 모든 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따르는 키트는 인공 관절, 튜브, 봉합사, 메스, 바늘, 주사기, 수술 부위의 준비를 위한 방부제, 정형외과적 장치 등과 같은 다수의 다른 적합한 제품 또는 성분을 포함할 수 있다.
키트의 추가의 타입이 또한 본 발명의 양상에서 제공된다.
예를 들어, 키트는 본 발명에 따르는 연골세포 전구세포의 확인 및/또는 분리를 위해서 제공된다. 이러한 키트는 본 발명에 기술된 유전자 발현 마커 중의 어떤 것을 포함한 세포 마커의 발현을 검출하도록 디자인된 시약을 포함할 수 있다. 이러한 검출 시약은 단백질 또는 핵산 (예를 들어, mRNA) 레벨에서 이들 유전자의 발현 생성물을 검출하도록 제제화될 수 있다. 그러한 것으로서 시약은 항체 또는 그의 특이적 결합 부분 (에 검출가능하게 표지된 항체), 그 밖의 다른 특이적 단백질 결합제 (예를 들어, 리간드 또는 가용성 수용체), 하이브리드화 분석, 예를 들어, 노던 블럿 분석, 마이크로어레이 분석 등에서 사용하기 위한 핵산 프로브; PCR 시험, 예를 들어, 상기에 상술한 것과 같은 정량적 PCR 시험에서 사용하기 위한 프라이머 쌍 등을 포함할 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 키트는 전형적으로, 본 발명의 방법을 실시하기 위해서, 예를 들어, 본 발명의 방법의 양상에 따른 돌연변이 방법을 수행하기 위한 핵산 샘플을 제조하기 위해서 키트의 성분을 사용하는데 관한 설명서를 포함한다. 본 발명의 방법을 실시하는데 관한 설명서는 일반적으로 적합한 기록매체 상에 기록된다. 예를 들어, 상기 설명서는 종이 또는 플라스틱 등과 같은 기질 상에 인쇄될 수 있다. 이러한 설명서는 키트 내에 포장 삽입물 (package insert)로서, 키트 또는 그의 성분의 용기의 라벨 (즉, 포장 또는 속포장과 함께) 등으로 존재할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 설명서는 적합한 컴퓨터 판독용 저장 매체, 예를 들어, CD-ROM, 디스켓 등에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로 존재한다. 또 다른 구체예에서, 실제 설명서는 키트 내에 존재하지 않지만 원격 공급원으로부터, 예를 들어, 인터넷을 통해서 설명서를 얻기 위한 수단이 제공된다. 이 구체예의 예는 설명서를 볼 수 있고/있거나 설명서를 다운로드할 수 있는 웹 주소를 포함하는 키트이다. 상기 설명서와 마찬가지로, 설명서를 얻기 위한 이 수단은 적합한 기질 상에 기록된다.
상기 언급한 성분들 이외에도, 키트는 또한 하나 또는 그 초과의 대조 샘플 및 시약, 예를 들어, 2 개 또는 그 이상의 대조 샘플을 포함할 수 있다. 이러한 대조 샘플은 어떤 형태의 것이라도 될 수 있으며, 예를 들어, 공지의 마커 프로파일을 갖는 추가의 세포주, 유전자 발현 데이터를 분석하는데 사용하기 위한 음성 및 양성 대조 샘플 등일 수 있다. 본 발명의 키트에서는 어떤 편리한 대조 샘플이라도 사용될 수 있다.
생물학적 기탁
본 출원에 기술된 세포주는 부다페스트 조약 하에서 "ATCC" (American Type Culture Collection; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA)에 기탁되었다. 세포주 4D20.8 (또한 ACTC84로 공지됨)은 2009년 7월 23일에 계대 11로 ATCC에 기탁되었으며, ATCC 수탁번호 PTA-10231를 갖는다. 세포주 SM30 (또한 ACTC256으로 공지됨)은 2009년 7월 23일에 계대 12로 ATCC에 기탁되었으며, ATCC 수탁번호 PTA-10232를 갖는다. 세포주 7SMOO32 (또한 ACTC278로 공지됨)은 2009년 7월 23일에 계대 12로 ATCC에 기탁되었으며, ATCC 수탁번호 PTA-10233을 갖는다. 세포주 E15 (또한 ACTC98로 공지됨)은 2009년 9월 15일에 계대 번호 20으로 ATCC에 기탁되었으며, ATCC 수탁번호 PTA-10341을 갖는다. 세포주 MEL2 (또한 ACTC268로 공지됨)은 2010년 7월 1일에 계대 번호 22로 ATCC에 기탁되었으며, ATCC 수탁번호 PTA-11150을 갖는다. 세포주 SK11 (또한 ACTC250으로 공지됨)은 2010년 7월 1일에 계대 번호 13으로 ATCC에 기탁되었으며, ATCC 수탁번호 PTA-11152를 갖는다. 세포주 7PEND24 (또한 ACTC283으로 공지됨)은 2010년 7월 1일에 계대 번호 11로 ATCC에 기탁되었으며, ATCC 수탁번호 PTA-11149를 갖는다.
실시예
이하의 실시예는 본 발명을 어떻게 만들고 사용하는지에 대한 완전한 개시 및 설명을 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에게 제공하기 위하여 제시된 것이며, 본 발명자들이 생각하는 그들의 발명의 범위를 제한하고자 하는 것도 아니고 이들은 이하의 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내고자 하는 것은 아니다. 사용된 수 (예를 들어, 양, 온도 등)에 관해서는 정확성이 보장되도록 노력하였지만, 일부의 실험적 오차 및 편차는 고려되어야 한다. 다른 식으로 나타내지 않는 한, 부는 중량부이며, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압이거나 대기압에 가깝다.
실시예 1. 연골형성 분화 조건의 저처리율 스크린에서 클로날 인간 배아 전구세포주의 마이크로어레이 분석
세포주 10RPE8, 4D20.8, 4D20.9, 4SKEL20, 7PEND12, 7PEND24, 7PEND30 , 7PEND9, 7SKEL4, 7SKEL7, 7SMOO25, 7SMOO32, 7SMOO7, 7SMOO9, B16, C4.4, C4ELS5.1, C4ELS5.6, C4ELSR10, C4ELSR2, CMO2, E109, E111, E120, E15, E164, E33 , E44, E68, E69, E85, EN1, EN13, EN16, EN18, EN2, EN22, EN23, EN26, EN27, EN31, EN4 , EN42 , EN47, EN5, EN51, EN55, EN7, EN8, F15, J16, MEL2, MEL2, MW1, RAD20.16, RAD20.19, RAD20.4, RAD20.5, RAD20.6, RAPEND10, RAPEND15, RAPEND18, RASKEL8, RASMO12, RASMO19, SK11, SK17, SK18, SK25, SK31, SK35, SK43, SK44, SK46, SK47, SK49, SK50, SK52, SM17, SM2 , SM22, SM28, SM28, SM30 , SM33, SM8, T14, T20, T36, T42, T43, T44, T7, U31, W10, W11, W8, Z1, Z11, Z2, 및 Z3을 "마이크로매스 분화 프로토콜 1"로 상기에 기술한 바와 같이 스크리닝하고, 서브세트를 또한 "펠릿 분화" 및 "알기네이트 비드 분화"로 분화시켰다. 간략하면, 다음의 세포를 포함하는 대조 세포 타입을 포함시켰다: 인간 골수 간엽 줄기세포 계대 3 (Lonza), 지방 줄기세포 (ASCs), 치수 줄기세포 (DPSCs), 포피 피부 섬유아세포 (Xgene FB), 및 표준 인간 관절 연골세포 (NHACs). 스크리닝할 상기 세포뿐만 아니라 상술한 대조 세포 타입을 본 발명뿐만 아니라 2006년 11월 21일에 출원된 미국 특허출원 제11/604,047호 (발명의 명칭: "Methods to Accelerate the Isolation of Novel Cell Strains from Pluripotent Stem Cells and Cells Obtained Thereby") 및 2009년 7월 16일에 출원된 미국 특허출원 제12/504,630호 (발명의 명칭: "Methods to Accelerate the Isolation of Novel Cell Strains from Pluripotent Stem Cells and Cells Obtained Thereby") (이들은 각각 본 발명에 참고로 포함된다)에 기술된 바와 같이 5% 주위 산소 하의 배양기 내에서 성장 정지 또는 마이크로매스 및 펠릿 연골형성 조건 하에서 동조화시켰다. 예를 들어, 정지 상태에서 동조화를 유도하기 위한 조건의 경우에는 세포주 7PEND24 (ACTC283)를 제조자에 의해서 통상적으로 추천되고 완전 키트 (Cat# C-22022)로 판매되는 농도로 보충물을 갖는 Promocell 내피 MV2 배지 중에서 세포가 합류에 도달할 때까지 배양하였다. 합류에 도달하면, 배지를 제거하고, 10%의 원래의 보충물 믹스를 갖는 동일한 Promocell 배지로 대체시켰다. 3일 후에, 배지를 흡인하고, 추가로 2일 동안 동일한 배지 (즉, 10% 표준 보충물)로 대체시켰다 (즉, 총 5일의 정지 조건). 세포주 4D20.8 (ACTC84)의 경우에는, 세포를 20% FCS가 보충된 DMEM 배지 내에서 세포가 합류에 도달할 때까지 배양하였다. 합류에 도달하면, 배지를 제거하고, 10%의 원래 농도의 보충물 (즉, 2% FCS)을 갖는 동일한 DMEM 배지로 대체시켰다. 3일 후에, 배지를 흡인하고, 추가로 2일 동안 동일한 배지 (즉, 2% FCS를 갖는 DMEM)로 대체시키거나 (즉, 총 5일의 정지 조건), 1, 2 또는 14일 동안 펠릿 또는 마이크로매스로 연골형성 조건에서 분화시켰다. RNA는 본 발명에 기술된 바와 같이 수확하여 qPCR에 의해서 시험하고, 본 발명에 기술된 바와 같이 유전자 발현 분석하기 위해서 Illumina 마이크로어레이에 하이브리드화시켰다. 골수 간엽 줄기세포는 펠릿 및 마이크로매스 연골형성 조건 둘 다에 대해서 연골세포 유전자 발현의 현저한 상향-조절로 응답하였다. 연골세포 분화 마커의 예는 연골에 대해서 특이적이지는 않지만 그럼에도 불구하고 연골형성 중에 상향조절되는 MGP 및 PENK, 및 연골 발육에 비교적 특이적인 COL2A1, MATN4, EPYC, COL9A2, 및 LECT1을 포함한다. 세포주 4D20.8에서의 미분화 대 마이크로매스 조건 하에서 14일의 유전자 발현의 비교는 MGP 발현의 >479x, MATN4의 >10x, PENK의 >369x, COL2A1의 >60x, EPYC의 >42x, COL9A2의 >25x, LECT1의 >24x의 상향조절을 나타내었으며, 유사하게 MSCs에 의해서 분화는 MGP 발현의 5x (그러나 4D20.8과는 달리 미분화된 MSCs가 비교적 높은 기초 레벨의 발현을 나타내었다), MATN4의 20x, PENK의 6x (역시 미분화된 4D20.8에서 발현이 없는 것에 비해 미분화된 MSCs에서는 비교적 높은 레벨로 발현됨), COL2A1의 613x, EPYC의 48x, COL9A2의 117x, LECT1의 34x의 상향조절을 나타내었다. 대조적으로, 피부 섬유아세포는 MGP 발현의 37x, PENK의 369x의 상향조절을 나타내었지만 실험적 처리 전 또는 후에 COL2A1, EPYC, LECT1, 또는 COL9A2의 발현을 나타내지 않았다. 따라서, 피부 섬유아세포와는 달리 4D20.8은 MSCs와 동일하지는 않지만 유사한 연골 특이적 유전자의 광범한 어레이를 발현하였다. 발현된 24,526 유전자 중에서, 265 유전자는 MSC 분화 중에 증가된 발현을 나타내었으며, 191 개는 D20.8 분화 중에 증가하였고, 단지 47 개의 유전자는 공통적이었다. 따라서, LHX8 발현을 나타내지 않지만 대신에 하지의 HOXA10, HOXB7, HOXC8, 및 HOXD13, 및 PITX1 발현 특징과 같은 꼬리 HOX 유전자 발현을 나타내는 MSCs와는 달리 구개 및 하악골의 부위 특이적 LHX8 호메오박스 (homeobox) 유전자 발현이 있고 HOX 또는 PITX1 발현이 있다는 점에서 세포주 4D20.8은 MSCs와는 상이한 세포주를 나타낸다. 세포주 7PEND24는 또한 더 낮은 레벨로 연골형성 유도를 나타내었다.
MSC 및 표준 인간 관절 연골세포 (NHAC) 대조군과 함께 연골형성 조건 이전 및 14일 후에 세포주에서 마이크로어레이에 의해서 시험한 COL2A1의 유도 레벨은 도 2에 그래프 제목 "COL2A1"로 나타낸다. 또한 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 연골의 공통 성분인 LECT1에 대한 유전자가 상기 세포주들에서 유도되지만 상기 세포주들에서 차등적으로 발현된다. 원래 영구적 연골 (비대성 연골세포와는 대조적임)의 마커로서 특정화된 유전자인 CRTAC1은 실제로 NHACs에서는 발현되지만 MSCs에서는 발현되지 않고, 이것은 본 발명이 세포주들에서 다양한 정도로 발현된다. 비대성 연골세포에서 발현된 마커 IHH는 NHACs에서 발현되지 않고 MSCs에서 발현되지만, 이것은 본 발명의 세포들에서는 발현되지 않으며 이들이 MSCs와 상이하고 잠재적으로 안정한 연골에 대한 전구세포인 것과 일치한다. 섬유아세포가 아닌 MSCs의 마커로서 원래 특정화된 유전자인 CD74인 지방 줄기세포 (ASCs), MSCs에서 발현되지만 NHACs 또는 본 발명의 세포주들에서는 발현되지 않는다. 마지막으로, 하악골 연골세포의 마커인 LHX8은 NHACS, ACSs에서 발현되지 않지만, 하악골 신경릉에서의 그들의 기원과 일치하는 치수 줄기세포 (DPSCs)에서는 발현되며, 세포주 4D20.8에서 발현된다.
마이크로매스의 14일 후 및 상술한 바와 같은 이들 세포주 펠릿 연골형성 조건의 서브세트에서, 세포주 7PEND24, 4D20.8, 7SMOO32, MEL2, SK11, SM30, 및 E15는 분화의 유도시에 현저하게 상승된 COL2A1 발현을 나타내었으며, 4D20.8, 7SMOO32, MEL2, E15, 및 SM30이 표준 인간 관절 연골세포보다 더 큰 상대적 레벨의 전사물을 발현한다. 두드러지게, 세포주 SM30은 >1,000 만큼 COL2A1 전사물을 발현한다. 계대 3에서의 골수 간엽 줄기세포는 있다 하더라도 약간의 전사물을 발현하였지만 이것은 본 기술분야에서 잘 알려진 바와 같이 사용된 세포의 로트 (lot) 및 계대 수에 따라 크게 달라지는 것으로 관찰되었다. COL2A1 발현은 ASCs, DPSCs, 또는 Xgene FBs에서 관찰되지 않았다. 상기 세포주들은 TBX5 및 HAND2, 중배엽의 마커 및 신경릉의 마커와 같은 마커들의 다양한 마커 조합을 발현하며, 따라서 다양한 타입의 연골형성의 모델링, 및 임상적 세포-기본 치료법에 유용하다. 또한, 이들은 신체에서 연골의 부위 특이적인 독특한 기계적 특성을 생성시키는 다양한 부위 특이적 호메오박스 유전자를 디스플레이한다. 비-제한적인 예를 들면, 세포주 4D20.8은 이차 구개를 생성하거나, 구개열의 수복, 치주질환, 치아의 신경릉 성분, 하악골 부분의 피부, 말초신경 또는 하악골 부분의 멜라닌세포를 형성할 수 있는 세포를 제공함으로써 치뢰를 재구성하거나, 치은 위축을 수복시키는 것을 포함하여 (이들로 제한되지 않는다) 하악골 또는 신경릉 하악골 간엽의 다른 유도체를 재구성하는 것과 같은 입주위 간엽의 마커인 마커 유전자 LHX8을 강력하게 발현한다.
실시예 2
hMSCs에 의해서 이전에 입증된 바와 같이, 양에게서 중앙 또는 측면 반월판연골절제술 또는 ACL 절제 후에 외인성 세포의 투여를 사용하여 관절 연골 및 반월판의 상해 및 수복을 결정할 수 있다 [Ghosh, et al., Clin. Orthop., Vol. 252, pgs. 101-113, 1990; Little, et al., J. Rheumatol., Vol. 11, pgs. 2199-2209, 1997; 이들은 둘 다 온전히 본 발명에 참고로 포함된다]. 양에게서 hES 유래 세포에 대한 내성은 hES 유래 세포의 출생전 이식을 통해서 달성된다. 7PEND24, 7SMOO32, SM30, E15, 4D20.8과 같은 hES-iPS 유래 배아 전구세포뿐만 아니라 hMSC 및 HA 대조군의 증량식 용량을 헥스텐드, 히알우로난, 콘드로이틴 설페이트, 키틴, 키토산, 또는 그 밖의 다른 스캐폴드/매트릭스 (예를 들어, 탈세포화된 반월판)와 같은 하나 또는 그 초과의 약제학적 담체와 함께 내성화된 (tolerized) 양의 손상된 관절에 주사한다. 상해의 수복율은 시간의 경과에 따른 증량식 투약량에 대한 응답으로 측정된다. 이식된 세포는 인간 성숙 MSCs 및 비히클 대조군과 비교하여 거부반응, 기형종 형성, 및 효능의 증거에 대해서 조직학적으로 평가한다.
실시예 3. 연장된 계대에 걸친 배아 연골세포 전구세포의 안정성의 시험
본 발명자들은 성숙 골수 MSCs를 >30 배가 동안 계대시킬 수 없었든 반면에, 본 발명자들은 4D20.8로 지정된 본 발명의 세포주를 33 계대 이상 동안 배양하였다. 본 발명자들은 COL2A1 발현에 의해서 측정되며, 계대 12 및 계대 33에서 본 발명에 기술된 바와 같이 qPCR에 의해서 시험한 바와 같은 연골을 유도하는 세포의 능력을 비교하였다. 상기 세포는 병행 실험에서의 MSCs의 경우와는 달리, 연장된 계대에서 동등한 레벨의 COL2A1을 생산하였다. 계대 12에서의 작업 세포 은행으로부터 세포를 추가로 21 계대 또는 그 이상 동안 증대시키는 능력 (여기에서 각각의 계대는 1.5 배가이다)은 작업 세포 은행보다 약 52 배가 또는 2e50 더 큰 세포에 해당한다. 따라서, 상기 세포는 다수의 환자에게서 동종이계 이식을 위해 상업적으로 규모화되는 그들의 잠재력에 있어서 독특하다.
실시예 4. 본 발명의 선택된 연골형성 세포주 상에서 CD 항원을 인식하는 항체에 대한 스크리닝
본 발명의 연골형성 세포주는 CD 항원에 대한 항체의 라이브러리에 대해 중간 처리율 방식으로 시험하였으며, 양성 세포율은 이하 (표 2)에 나타내며, 이것은 각각 본 발명에 참고로 포함된 것으로서 2006년 11월 21일에 출원된 미국 특허출원 제11/604,047호 (발명의 명칭: "Methods to Accelerate the Isolation of Novel Cell Strains from Pluripotent Stem Cells and Cells Obtained Thereby") 및 2009년 7월 16일에 출원된 미국 특허출원 제12/504,630호 (발명의 명칭: "Methods to Accelerate the Isolation of Novel Cell Strains from Pluripotent Stem Cells and Cells Obtained Thereby")에 기술된 예상 항원의 일반적 이용성을 입증한다. 그러나, 예외가 또한 확인될 수 있다. 특히, 항원 CD56에 대한 항체 (NCAM1)는 세포주 4D20.8에서 세포의 80%를 결합시키는 반면에 이것은 소수의 시험한 다른 세포주를 결합시킨다. 이것은 마이크로어레이 데이터에서 NCAM1 (Illumina 프로브 ID 4040725)의 비교적 높은 레벨과 일치한다. 따라서, CD56에 대한 항체는 본 발명에 기술된 세포주 4D20.8의 유전자 발현 마커에 의한 세포의 친화성 정제에 유용하다.
[표 2]
Figure 112012011816846-pct00005
Figure 112012011816846-pct00006
실시예 5. NNAT 양성 연골형성 전구세포주의 발견
계대 17의 세포주 E15 (또한 ACTC98로 공지됨)를 이것이 원래 클론적으로 팽창된 것과 동일한 배지인 20% 혈청이 보충된 DMEM 배지 내에서 연속 계대시킴으로써 팽창시켰다 [참조: 부록 표 I, West et al., 2008, Regenerative Medicine vol. 3(3) pp. 287-308; 이것은 본 발명에 참고로 포함된다]. 계대 14 및 17에서, 상기 세포는 일단 세포가 합류에 도달하면 배지를 제거하고, 배지를 혈청의 10-배 감소량 (2%)이 보충된 신선한 DMEM으로 대체시킴으로써 정지 상태로 동조화시켰다. 3일 후에, 배지를 흡인하고, 추가로 2일 동안 2% FCS가 보충된 신선한 DMEM으로 대체시켰다. 동일한 계대에서 세포를 마이크로매스 및 펠릿 조건 둘 다에 플레이팅하여 본 발명에 기술된 바와 같이 연골형성을 유도하였다. 마이크로매스 배양의 14일 후에, 동일한 조건 하에서 배양된 세포주 E15, 및 표준 인간 관절 연골세포 (NHAC) 대조군을 발현 특이적 마커에 대해 qPCR에 의해서 시험하였다 (참조: 이하의 실시예 6). E15는 NHAC 대조군보다 >10,000 더 많은 COL2A1 mRNA를 발현하는 것으로 관찰되었다. 제14일 마이크로매스를 고정시키고, 이하에 기술된 바와 같이 사프라닌 O로 염색하였다. 상기 샘플은 연골 프로테오글리칸에 대해서 강력하게 염색되었다. 세포를 더 특정화하기 위해서 RNA를 본 발명에 기술된 바와 같이 Illumina 마이크로어레이에 대해 하이브리드화시켰다.
실시예 6. qPCR에 의한 연골형성 전구세포 분류를 위한 저처리율 스크리닝
10RPE8, 4D20.8, 4D20.9, 4SKEL20, 7PEND12, 7PEND24, 7PEND30, 7PEND9, 7SKEL4, 7SKEL7, 7SMOO25, 7SMOO32, 7SMOO7, 7SMOO9, B16, C4.4, C4ELS5.1, C4ELS5.6, C4ELSR10, C4ELSR2, CMO2, E109, E111, E120, E15, E164, E33 , E44, E68, E69, E85, EN1, EN13, EN16, EN18, EN2, EN22, EN23, EN26, EN27, EN31, EN4 , EN42 , EN47, EN5, EN51, EN55, EN7, EN8, F15, J16, MEL2, MEL2, MW1, RAD20.16, RAD20.19, RAD20.4, RAD20.5, RAD20.6, RAPEND10, RAPEND15, RAPEND18, RASKEL8, RASMO12, RASMO19, SK11, SK17, SK18, SK25, SK31, SK35, SK43, SK44, SK46, SK47, SK49, SK50, SK52, SM17, SM2 , SM22, SM28, SM28, SM30 , SM33, SM8, T14, T20, T36, T42, T43, T44, T7, U31, W10, W11, W8, Z1, Z11, Z2, 및 Z3으로 지정된 본 발명의 세포주는, 이들이 hES 유래 세포로부터 분리되고, 합류할 때까지 성장시키고 배지를 본 발명에 기술된 바와 같이 10-배 감소된 혈청 또는 다른 미토겐으로 보충된 배지로 대체시킴으로써 정지 상태로 동조화되었기 때문에, 시험관내에서 >21 배가의 클로날 팽창으로 팽창되었다. RNA는 대조군으로서 이들 세포로부터 추출되었다. 시험관내에서 연골형성할 수 있는 세포에 대한 저처리율 스크리닝에서는, 세포를 14일 동안 본 발명에 기술된 바와 같이 마이크로매스 조건에서 배양하여 연골형성을 유도하였다. 이들 2 개의 조건 각각으로부터의 RNA를 cDNA로 전환시킨 다음에, 연골형성과 통상적으로 연관된 유전자 (즉 COL2A1, COMP, CILP, SCX, CRTL1, SOX9, BARX2)의 발현에 대해서 검사하였다. 유전자 특이적 프라이머 쌍 프로브는 Invitrogen으로부터 수득하였다. 프라이머당 0.4 μM의 cDNA에 해당하는 30 ng의 RNA, 초순수 증류수 (Invitrogen)로 구성된 시험을 위한 샘플을 표준 옵티칼 96-웰 반응 플레이트 (Applied Biosystems Carlsbad, CA, PN 4306737) 내에서 제조하고, 25 ㎕의 총 반응 용적으로 앰플리택 골드 DNA 폴리머라제를 혼입시킨 12.5 ㎕의 파워 SYBR 그린 PCR 매스터 믹스 (Applied Biosystems Carlsbad, CA, Cat# 4367659)에 의해 1:1 희석하였다. 실시간 qPCR은 SDSv1.2 소프트웨어를 이용하는 Applied Biosystems 7500 실시간 PCR 시스템을 사용하여 수행하였다. 증폭조건은 2 분 동안 50℃ (단계 1), 10 분 동안 95℃ (단계 2), 15 초 동안 95℃ 및 그 다음에는 1 분 동안 60℃의 40 사이클 (단계 3)과 함께 15 초 동안 95℃, 1 분 동안 60℃, 및 15 초 동안 95℃의 분리단계 (단계 4)로 설정되었다. 관심이 있는 유전자의 증폭 생성물에 대한 Ct 값은 3 개의 항존 유전자 (GAPD, RPS10, 및 GUSB)의 평균 Ct 값에 대해 표준화시키고, 유전자 발현을 초기 계대 무릎-표준 인간 관절 연골세포 (Lonza) 및 배양된 인간 골수 간엽 줄기세포의 경우와 비교 분석하였다.
연골형성 유전자를 검출하기 위해서 사용된 프라이머 세트는 상술한 것이었다: 스크리닝된 세포주에 대한 배양된 초기 계대 표준 인간 관절 연골세포와 비교하여 배수-발현 (fold-expression)으로 발현된 Col2A1 발현은 도 1에 나타낸다. 초기 계대 표준 인간 관절 연골세포 (NHAC)는 값을 1.0으로 설정한다. NHACs와 비교한 -배 유도로 정량화된 COL2A1의 발현 레벨은 대부분의 세포주에서 현저하게 상승되지 않았지만, 세포주의 작은 서브세트, 즉 7SMOO32 기술적 복제물 2 (154x NHAC 발현), 7SMOO32 생물학적 복제물 2 (137x NHAC 발현), 4D20.8 생물학적 복제물 2 (130x NHAC 발현), SM30 (1287x NHAC 발현), SM30 생물학적 복제물 2 (13,494x NHAC 발현), SM30 기술적 복제물 2 (1168x NHAC 발현), E15 (10,809x NHAC 발현), E15 기술적 복제물 2 (9810x NHAC 발현), MEL2 (22x NHAC 발현), 및 SK11 (4x NHAC 발현)에서는 두드러지게 상승하였다.
놀랍게도, COL2A1 유도와 SOX9와 같은 연골형성 간엽에 대한 통상적으로 사용된 마커와의 상관관계는 있다고 하더라도 아주 작다. 마찬가지로, 연골형성 간엽세포의 마커인 것으로 생각되는 AQP1과 같은 마커는 마이크로매스 연골형성 조건에서 COL2A1을 유도하지 않았던 포피 피부 섬유아세포의 RFU 값으로 존재하였으며, 분화 전 및 후의 본 발명의 세포주에는 존재하지 않았다. 예를 들어, 분화 전에 AQP1 발현은 클로날 팽창의 18-21 배가 상태에서 세포주 SM30에서는 부재하였으며 (배경이 RFU 135), SK11에서 부재하였고 (126의 RFU), 세포주 E15에서 부재하였다 (RFU 139) [참조: West et al., 2008, Regenerative Medicine vol. 3(3) pp. 287-308, 부록 표 II]. 어떤 것도 본 발명의 세포주가 연골형성을 할 수 있었는지 여부를 예측하는데 있어서의 예언적 값의 본 발명의 미분화된 세포주에서 SOX9의 발현의 레벨은 아니었다. 실제로, 어떤 유전자도 이러한 결과를 예측하기 위한 연골세포가 되는 이들 세포주의 잠재력과 충분하게 상관관계가 있었던 분화 전의 미분화된 세포주에서 발견될 수 없었다. 부위 특이적 항존 유전자 발현을 포함하는 SK11, 7SMOO32, 4D20.8, MEL2, SM30, 및 E15의 그룹 내에서의 유전자 발현 마커의 다양성은 각각의 세포주가 연골형성 전구세포의 독특하고 식별할 수 있는 타입을 나타낸다는 것을 시사한다. 또한 놀라운 것은 COMP 및 CILP와 같은 시험관내 연골형성의 마커로 통상적으로 사용된 대부분의 유전자는 실질적으로, 배양된 피부 섬유아세포가 예를 들어, COL2A1의 발현에 의해서 입증되는 바와 같이 동일한 조건 하에서 진정한 연골형성을 수행할 수 있고, 연골 형성의 조직학적 증거를 나타낼 수 있는지 여부와는 무관하게, 상기 피부 섬유아세포를 포함하는 어떤 세포 타입에서라도 비특이적 방식으로 배양조건에서 유도되었다. 또한, 세포주 SK11, 7SMOO32, 4D20.8, MEL2, SM30, 및 E15는 분화 전 및 후 모두에서 유전자 발현 마커에 관해서 배양된 골수 MSCs로부터 분명하게 구별할 수 있었다. 골수 MSC는 통상적으로 ALCAM (CD166) 양성으로 기술되는 반면에, SK11, 7SMOO32, 4D20.8, MEL2, SM30, 및 E15와 같은 미분화된 상태의 본 발명의 세포주는 CD166 발현이 SM30에서는 부재하였고 ( 배경이 RFU 125), SK11에서 부재하였음 (164의 RFU) [참조: West et al., 2008, Regenerative Medicine vol. 3(3) pp. 287-308, 부록 표 II]을 나타내었다. 비-제한적 예를 들어, MSCs와 비교하는 경우에 본 발명의 세포주의 추가의 차이는 실질적으로 특이적이지 않은 통상적으로 사용된 대부분의 마커보다 MSCs의 더 정확한 마커인 것으로 입증된 CD74의 발현이다 [Ishii et al, 2005 BBRC 332:297-303]. 표 3에 나타낸 바와 같이, 미분화된 MSCs는 실제로 매우 높은 레벨의 CD74 전사물을 발현하였으며, 지방세포 줄기세포는 더 낮은 레벨로 역시 CD74를 발현하였고, 치수 줄기세포는 검출 한계의 CD74를 발현하였지만, 상기 전사물은 SK11, 7SMOO32, 4D20.8, MEL2, SM30, 및 E15를 포함하는 COL2A1을 유도할 수 있는 본 발명의 미분화된 세포에서도, 배양된 피부 섬유아세포 또는 비연골형성 배아 전구세포주 7SMOO7에서도 전혀 검출되지 않았다. 세포주의 다양성 및 본 발명에서 시험한 성숙 줄기세포 타입과의 두드러진 차이를 입증하는 추가의 비-제한적 예는 MSCs, 지방세포 줄기세포, 치수 줄기세포 또는 피부 섬유아세포와 같은 성숙 줄기세포에서는 발현되지 않지만 세포주 E15에서는 높은 레벨로 발현된 발생 유전자 NNAT (NM_181689.1)의 발현이다. 본 기술분야에서 줄기세포 타입으로부터 COL2A1 발현을 유도할 수 있는 본 발명의 세포주의 두드러진 차이의 또 다른 비-제한적 예는 MSCs의 마커인 것으로 알려진 유전자 KCNK2 (NM_001017425.2)의 발현을 측정함으로써 볼 수 있다. 표 3에 나타낸 바와 같이, KCNK2는 MSCs, 지방세포 줄기세포 및 치수 줄기세포에서 높은 레벨로 발현되지만, SM30, E15, 4D20.8, MEL2, 및 SK11과 같이 COL2A1의 발현을 유도할 수 있는 본 발명의 몇 가지 세포주에서는 검출할 수 없었다. 본 발명의 세포주 및 골수 유래 MSCs의 두드러진 차이는 또한 세포 타입에서의 중요한 치료학적 차이를 나타내는 유전자에서 나타난다. MSCs는 이들을 시험관내에서 분화시키는 경우에 비대성 연골세포로의 변환을 겪는다는 문제가 있다. 비대성 연골세포는 혈관형성을 유도하는데 유용한 유전자를 발현하며, 후에 골아세포에 의해서 침습되어 뼈를 만드는 일시적인 매트릭스를 제공한다. 따라서, MSCs는 관절 연골 외상, 관절염 또는 관련된 용도의 치료를 위해서 해당 조직을 재생시키기 위한 노력으로 관절 내에 주사하거나 다른 식으로 관절 연골 내로 이식하는 경우에 잘 작용하지 않는다. 본 발명에서 연골형성 조건에 의해서 유도되는 경우에 본 발명의 세포주는 비대성 연골세포의 마커인 IHH의 발현을 있다 하더라도 매우 적게 유도한 반면에, MSCs는 매우 높은 레벨의 IHH 전사물을 발현하였다. 마찬가지로, 세포주 4D20.8는 비대성 연골세포의 또 다른 마커인 COL10A1를 검출가능한 레벨로 발현하지 않는 반면에 MSCs는 매우 높은 레벨의 전사물을 발현하였다. 따라서, 7SMOO32, 4D20.8, SM30, 및 E15와 같은 본 발명의 세포주는 이들이 관절 연골 병리학의 수복을 위하여 영구 연골로 분화하는 그들의 능력에 있어서 MSCs보다 탁월함을 마커임을 나타낸다. 배양된 인간 골수 MSCs, 지방세포 줄기세포 및 성숙 치수 줄기세포와 비교한 세포주 SK11, 7SMOO32, 4D20.8, MEL2, SM30, 및 E15에 있어서의 차이의 추가의 비-제한적 예는 표 3에 나타내거나, 상기의 유전자 발현 마커를 표 3에서와 같이 본 발명에 기술된 것과 비교함으로써 나타낼 수 있다. 따라서, 이들 결과는 이 스크리닝에서 확인된 세포주가 신규하며, MSCs를 확인하기 위해서 통상적으로 사용된 마커가 인간 배아 전구세포주에서의 연골형성능을 예견하는 것이 아니며, 상기 세포주가 연골형성의 진정한 마커를 발현하는데 있어서 연골형성 자극에 응답할 수 있는 세포주의 작은 서브세트를 가질 수 있음을 예견할 수 있는 마커는 현재 존재하지 않음을 시사한다. 증거는 연골 형성의 조직학적 증거의 실시예 7에 제시된다.
[표 3]
인간 지방세포 줄기세포 (ACSs), 인간 골수 간엽 줄기세포 (MSCs), 인간 성숙 치수 줄기세포 (DPSCs), 배양된 인간 포피 섬유아세포 (Fibro), COL2A1 유도를 할 수 없는 클로날 hEP 세포주 7SMOO7, 및 각각 COL2A1 발현을 유도할 수 있는 인간 배아 전구세포 SM30, E15, 4D20.8, 7SMOO32, MEL2 및 SK11에서 유전자 발현 마커의 비교. 수는 RFU 값이다. 음성 발현은 음영이 박스로 나타내었다. (ND는 데이터가 없음을 의미한다)
Figure 112012011816846-pct00007
실시예 7. 연골 형성의 조직학적 및 면역화학적 확인
7PEND24, 7SMOO32, MEL2, SM30, E15, SK11, 및 4D20.8과 같이 COL2A1의 중등도 내지 강건한 유도를 나타내는 것으로 상기 실시예 6에서 저처리율 스크리닝에서 발견된 것과 같은 본 발명의 세포주뿐만 아니라 MSCs, 지방세포 줄기세포, 및 포피 피부 섬유아세포, Z11, 치수 줄기세포, 7SMOO7, E44 등과 같은 그 밖의 다른 세포주와 같은 대조군을 1, 8, 14 및 21일을 포함한 다양한 시간 동안 본 발명에 기술된 바와 같은 마이크로매스 및 펠릿 연골형성 조건, 및 연장된 분화를 촉진시키기 위해서 SCID 마우스의 신장 캅셀 내로 전이시키는 경우에는 상기 펠릿의 서브세트에 노출시켰다. 상기 마이크로매스 및 펠릿을 포르말린 내에 고정시키고, H&E 염색, 상술한 바와 같은 프로테오글리칸의 사프라닌 O 염색에 의해서, 및 대조군으로서 특이 항체 및 비특이 항체를 사용하여 면역반응성 COL2A1에 대해서 조직학적으로 분석하였다. 사프라닌 O에 대한 강력한 반응성 및/또는 COL2A1 면역반응성은 세포주 4D20.8의 제14 및 21일 펠릿에서 관찰되었으며, 강력한 사프라닌 O 염색은 세포주 E15의 제14일 마이크로매스에서 관찰되었다. 놀랍게도, 세포주 RAD20.6은 제14일 펠릿에서 COL2A1에 대한 면역반응성 및 사프라닌 O 염색을 나타내었다. 도 2는 모두 펠릿으로서의 분화의 제21일에, 계대 6의 MSCs와 비교한 계대 14의 세포주 4D20.8과 비교한 지방조직 줄기세포의 사프라닌 O 염색의 예, 및 세포주 4D20.8 및 MSCs의 제14일 펠릿에서 이소타입 대조군에 의한 면역염색을 나타낸다.
실시예 8
연골형성을 할 수 있는 본 발명의 세포주는 다음과 같이 관절 연골을 수복하는 능력에 대해서 시험하였다: 기증된 인간 관절 조직을 팽창시켰다. 세포주 SM30, E15, 및 4D20.8의 5 X 105 세포를 14 ㎖ 원뿔형 튜브 내의 10% FBS/DMEM/F12 중에서 400 X g으로 5 분 동안 회전시키고, 밤새 배양하여 세포 응집체를 생성시켰다. 6 ㎜ 직경의 실린더형 플러그를 아트랙스 단일 사용 (Arthrex Single Use) OATS 시스템 (Naples, Fl)에 의해서 관절 팽창물로부터 떼어내었다. 수술용 큐벳을 사용하여 관절 표면에 크기가 약 2 ㎜인 부분적 두께 결함을 만들었다. 상기 결함을 SM30, E15, 및 4D20.8의 세포 응집체 또는 일차 인간 관절 연골세포, hES 유래 연골세포의 매스 배양물 또는 성숙 지방 유래 줄기세포 (hASCs)로 구성된 대조군으로 충진시켰다. 연골 외식편 (explant)을 TGFβ3의 존재 또는 부재 하에 10% FBS/DMEM/F12 중에서 배양하였다. 4 주일 후에, 외식편을 고정시키고, 파라핀-매립시키고, 절편화하고, 스코어링 (scoring)을 위해서 사프라닌 O로 염색하였다. 선택된 클로날 세포주에서 유전자 발현 레벨 및 매트릭스 염색은 불균질한 hESCs 및 ASCs에서보다 클로날 전구세포주 SM30, E15, 및 4D20.8을 사용하는 경우에 더 컸으며, hACs에서 나타난 레벨에 근접하였다. 연골 외식에서, 수복 조직은 관절 연골과 닮아있었으며, 주변 숙주 조직과 잘 통합되었다.
실시예 9
연골형성을 할 수 있는 본 발명의 세포주는 인공 매트릭스에서 연골형성을 수행하는 능력에 대해서 시험하였다. 세포주 4D20.8 및 7PEND24로부터의 세포를 팽창시키고, 저속으로 원심분리함으로써 펠릿화시키고, NaCl (155 mM)로 세척하고, 다시 원심분리시키고, 펠릿을 1.2% 알기네이트 (Lonza)에 20x106으로 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 1 ㎖ 주사기 내로 뽑아내고, 22g 바늘을 통해서 CaCl2 배쓰 (102 mM)에 적가하여 분배시켰다. 겔화는 즉각적이다. 비드를 NaCl (155 mM)로 3-5x 세척한 다음에 연골형성 배지 내에 액침시켜 연골형성 배지 (TGF 없음)로 한번 세척하였다. 상기 비드를 6 웰 플레이트의 다중 웰에 배치하고, 14일 동안 1 주일에 3일마다 피딩하였다. 그 후, 비드를 NaCl로 수회 세척한 후에 20 분 동안 나트륨 시트레이트 (55 mM)에 노출시킴으로써 해중합시켰다. 회전시킨 후에, 세포 펠릿을 RLT (Qiagen)로 용해시키고, 총 RNA는 수율을 개선시키기 위한 퀴아슈레더 (QiaShredder)를 사용하는 세편화 단계 후에 알엔이지 마이크로 키트 (RNeasy micro kits; Qiagen)를 사용하여 추출하였다. COL2A1 발현은 상기한 바와 같이 qPCR에 의해서 결정되었다. 세포주 4D20.8의 경우에는, 표준 마이크로매스 조건에 비해 COL2A1 발현의 51-배 증가가 있었다. 세포주 7SMOO32에서는, 표준 마이크로매스 조건과 비교한 것으로서 RGD-알기네이트를 사용하여 COL2A1 발현의 2.88-배 증가가 있었다. 세포주 SK11의 경우에는, 표준 마이크로매스 조건과 비교한 것으로서 알기네이트를 사용하여 COL2A1 발현의 179-배 증가가 있었다. Lonza 알기네이트 이외에도, RGD-결합된 알기네이트 (NovaMatrix) 비드가 또한 제조되었다. 7PEND24의 경우에, 이것은 마이크로매스 조건에서는 단지 약하게 COL2A1을 유도한 반면에, 알기네이트 비드에서 이것은 마이크로매스 조건에 비해 45-배 증가를 나타내었다. RGD-알기네이트 컴플렉스 내에 캅셀화된 7PEND24는 마이크로매스 조건보다 증진된 COL2A1 발현을 디스플레이하지 않았지만, 표준 인간 관절 연골세포 (NHACs)에 비해서는 COL2A1의 17-배 더 큰 발현을 디스플레이하였다. 마찬가지로, 마이크로매스 조건에서 단지 약하게 연골형성성이었던 7SMOO32는 RGD-알기네이트 비드에서는 강건하게 COL2A1을 발현하였다.
Illumina 플랫폼을 사용하여 RGD 알기네이트는 세포주 4D20.8에서 인상적인 COL2A1의 449-배 상향조절을 나타내었다.
실시예 10
연속 시험관내에서 계대에 대한 세포주의 안정성을 결정하기 위해서, 세포주 4D20.8, E15, SM30, 및 hbmMSCs를 RNA를 미분화된 상태로 주기적으로 분리시키면서 상술한 바와 같이 (실시예 9) 14 마이크로매스 및 알기네이트 비드 중에서 연속 계대시켰다. 알기네이트 비드 중에서 P12에 비해 계대 33의 세포주 4D20.8은 대략 동일한 레벨의 COL2A1을 디스플레이한 반면에 hbmMSCs는 노화로 인하여 동등한 계대에서 비교할 수 없었다.
실시예 11. 알기네이트 중에 캅셀화된 연골형성 hEPs의 생체내 s.c. 이식
hES 세포 전구세포주 4D20.8, E15, SM30, 7PEND24, MEL2 및 대조군 인간 골수 MSCs, 및 x-Gene 피부 섬유아세포를 무게를 달고, 탈착시키고, 펠릿화하고, 알기네이트 제제 (RGD 펩타이드 결합된 알기네이트로 Lonza 1.2% 또는 NovaMa) 중에 20x106 세포/㎖로 재현탁시켰다. 겔화 및 세포 캅셀화를 위해서, 1 ㎖ 멸균 주사기를 사용하여 알기네이트 현탁액을 주사기에 부하시킨 후에 22G 바늘을 통해서 CaCl2 (102 mM) 용액 내에 적가하여 배출시키거나, CaCl2로 미리 습윤된 대퇴부 형상의 실리콘 주형 내에 배치시킨 다음에 완전한 빠른 겔화를 위해서 102 mM CaCl2로 덮었다.
대퇴골 형성의 구조물을 주형으로부터 분리시켜 알기네이트 비드 (약 1-2 ㎜ 직경)의 경우와 마찬가지로 NaCl (155 mM)로 세척하고, 이어서 덱사메타손 0.1 μM, 및 인간 재조합 TGFβ3 (10 ng/㎖)을 함유하는 연골형성 분화배지 내에 액침시켰다. 구조물 및 비드는 월요일, 수요일 및 금요일에 피딩하였다. 12일 후에 구조물을 NOD-SCID 마우스의 어깨에 s.c.로 이식하고, 14일째에 비드를 마찬가지로 이식하였다.
이식한 지 6 주일 후에, 조직을 절제하고, 4% 포름알데히드로 24 시간 동안 고정시킨 다음에 70% 알콜에 액침시켰다.
현미경 관찰은 특정의 hEPC 구조물을 나타내었으며, 비드는 흰색을 띈 외관을 획득하여 표준 근막 원피부로부터 쉽게 식별할 수 있었다. 4D20.8에 대한 예시적인 외식편은 알기네이트 외식편이다 (도 4A).
조직학적 평가를 위해서, 샘플을 파라핀 매립하고, 약 100 ㎛ 간격으로 4 ㎛ 슬라이스로 절편화하여, 슬라이드 상에 배치한 다음에 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다.
도 5는 세포주 4D20.8 및 E15.에 대한, 초자 연골의 경우에서와 유사한 연골세포-양 외관을 보여주는 예시적인 조직학적 영상을 나타낸다.
[표 4]
Figure 112012011816846-pct00008
Figure 112012011816846-pct00009
Figure 112012011816846-pct00010
Figure 112012011816846-pct00011
Figure 112012011816846-pct00012
Figure 112012011816846-pct00013
Figure 112012011816846-pct00014
Figure 112012011816846-pct00015
전술한 발명은 이해를 명쾌하게 할 목적으로 설명 및 예를 들어서 어느 정도 상세하게 기술되었지만, 첨부된 특허청구범위의 의의 또는 범주를 벗어나지 않으면서 이에 대한 특정의 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것은 본 발명의 이러한 교시내용에 비추어 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에게 쉽게 명백한 것이다.
따라서, 전술한 것은 단순히 본 발명의 원리를 설명하는 것이다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 비록 본 명세서에 명확하게 기술되거나 나타내지 않았더라도 본 발명의 원리를 구체화하고, 본 발명의 의의 및 범주 내에 포함되는 다양한 배열을 고안해 낼 수 있을 것임을 이해할 수 있을 것이다. 더구나, 본 명세서에 인용된 모든 예 및 조건적 언어는 주로 독자가 본 발명의 원리, 및 본 기술분야를 더 진전시키기 위해서 본 발명자들에 의해서 제공된 개념을 이해하는데 도움을 주기 위한 것이며, 이러한 구체적으로 인용된 예 및 조건으로 제한되지 않는 것으로 해석되어야 한다. 또한, 본 발명의 원리, 개념 및 구체예뿐만 아니라 이들의 구체적인 예를 언급하는 본 명세서의 설명은 그의 구조적 및 기능적 등가물 둘 다를 포함하고자 하는 것이다. 추가로, 이러한 등가물은 현재 공지된 등가물 및 미래에 개발된 등가물, 즉 구조와는 무관하게 동일한 기능을 수행하는 개발된 모든 요소 둘 다를 포함하고자 하는 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 본 명세서에 나타내고 기술된 예시적인 구체예로 제한하고자 하지 않는다. 오히려, 본 발명의 범위 및 의의는 첨부된 특허청구범위에 의해서 구체화된다.
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cactcaccag 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 7 atccgtagag agcacggaga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 8 ggactctcca tgggacaaga 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 9 ggcaatagca ggttcacgta ca 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 10 cgataacagt cttgccccac tt 22 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 11 tggcctgaga cagcatga 18 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 12 agtgttggga gccagattg 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 13 atccgtagag agcacggaga 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 14 ggactctcca tgggacaaga 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 15 tacgactaca ccgaccacca 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 16 tcaaggtcga gtgagctgtg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 17 tccagctaca tctcgcacct 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 18 cggtccttgc tcaactttct 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 19 ggacttggct cagtctctgg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 20 tggggatgga gttcttcttg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 21 ggcctccaag gagtaagacc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 22 aggggtctac atggcaactg 20 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 23 atttggtcgt ggacgtggt 19 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 24 tttggctgta agtttattca atgc 24 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 25 aaacgattgc agggtttcac 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 26 ctctcgtcgg tgactgttca 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 27 tctaccccaa tccagcaaac 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 28 gttgggagcc agattgtcat 20 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 29 cacactggta agtggggcaa gaccg 25 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 30 acgaggtcct cactggtgaa 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 31 tgagtcctca agcctcctgt 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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<210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 41 cccatcagca tcctcttcat 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 42 tgtagatgct cctgccacag 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 43 accacgcttc ctatgtgacc 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 44 tgttgtaact gggtggcaaa 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 45 tcgagggttt gatggacttc 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 46 catcttctcc cctcattcca 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 47 tggcaacaaa atcagcagag 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 48 gccattgtca acagcagaga 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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  11. 클론적으로 정제된 배아 전구 세포주를 연골 생성 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는, 연골을 생산하는 방법에 있어서,
    상기 배아 전구 세포주는 CD74, CD90, CD166, ITGA2, 및 KCNK2으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현에 대해서 음성이고,
    상기 배아 전구 세포주는 SM30, 4D20.8, 7SMOO32, MEL2, SK11, 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 연골을 생산하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 배아 전구세포주가 CD74의 발현에 대해서 음성인 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 배아 전구세포주가 또한 HOX 유전자 및 PITX1로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 초과의 유전자의 발현에 대해서 음성인 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 배아 전구세포주가 COL10A1 마커 발현의 부재 하에서 연골을 생성시키는 방법.
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  16. 청구항 11에 있어서, 상기 연골 생산 조건이 연골세포 배양 조건; 합성 매트릭스 또는 생물학적 재흡수성 고정화 비히클 내로의 배아 전구세포주의 함침; 및 성형된 구조 내로 배아 전구세포주의 배치로 구성된 그룹 중의 하나 또는 그 초과으로부터 선택되는 방법.
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