CN105296515A - 一种干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种如SEQ？ID？NO：1～3任意一项所示的核苷酸序列，公开了包含该核苷酸序列的重组载体、重组菌、SEQ？ID？NO：1～3任意一项所示的核苷酸序列编码的干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白及其制备方法和用途。本发明干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白(IFNA-CBD)更容易特异结合在肿瘤组织上，不会很快随体液扩散，本发明干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白对肿瘤的治疗效果佳，临床应用前景良好。

Description

一种干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白及其制备方法和用途。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是细胞因子的一类，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生物活性。干扰素有多个亚型，I型干扰素包括IFN-ɑ(IFNA)、IFN-β，II型干扰素包括IFN-γ，III型干扰素包括IFN-λ。在抗肿瘤治疗中，临床常用是IFNA2a和IFNA2b，它们的一级结构仅差异1个氨基酸。在临床上，IFNA用于治疗诸如毛细胞白血病、黑色素瘤、滤泡性淋巴瘤、肾细胞瘤等肿瘤。IFNA发挥抗增殖活性包括直接作用和间接作用，直接作用通过JAK-STAT信号转导通路导致细胞周期停滞、细胞坏死或细胞分化，间接作用则通过活化免疫细胞，如淋巴T细胞、自然杀伤细胞，抑制血管新生和诱导其他细胞因子表达。

目前，IFNA2b通常采用皮下、肌内、静脉给药，但蛋白注射后很快随体液扩散而使得局部浓度很难达到治疗要求，如果大量注射则会对生物体产生负作用，而反复较低剂量给药给患者带来不便和痛苦。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白，其可以特异结合在肿瘤组织上。

本发明提供了一种SEQIDNO：1～3任意一项所示的核苷酸序列。

SEQIDNO：1所示的核苷酸序列含552个核苷酸，其中，第1-498位为IFNA的编码序列，第499-531位为连接肽的编码序列；第532-552位为胶原结合结构域(CBD)的编码序列。

SEQIDNO：2所示的核苷酸序列含558个核苷酸，除了包含SEQIDNO：1所示序列以外，还包含连接肽的编码序列(第553-558位)，该序列编码连接肽，用于连接CBD与组氨酸标签。

SEQIDNO：3所示的核苷酸序列含579个核苷酸，除了包含SEQIDNO：2所示序列以外，还包含编码组氨酸标签的核苷酸序列(第559-576位)以及终止密码子，添加编码组氨酸标签的核苷酸序列是为了方便纯化。

本发明还提供了一种重组载体，它包含SEQIDNO：1～3任意一项所示的核苷酸序列。优选地，所述的重组载体是重组pET28a质粒。

本发明还提供了一种重组菌或转基因细胞系，它包含前述的重组载体。优选地，所述的重组菌为重组大肠杆菌。

本发明干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白，它是由SEQIDNO：1～3任意一项所示的核苷酸序列编码。优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：4～6任意一项所示。

SEQIDNO：4所示的的蛋白包括184个氨基酸，其由SEQIDNO：1编码，其中，第1-166位为IFNA的氨基酸序列，由SEQIDNO：1中第1-498位核苷酸编码；第167-177位连接肽的氨基酸序列，由SEQIDNO：1中第499-531位核苷酸编码；第178-184位为胶原结合结构域(CBD)的氨基酸序列，由SEQIDNO：1中第532-552位核苷酸编码。

SEQIDNO：5所示的的蛋白包括186个氨基酸，除了含有SEQIDNO：4所示的氨基酸以外，还含有两个氨基酸组成的连接肽，其由SEQIDNO：2编码，其中，第1-166位为IFNA的氨基酸序列，由SEQIDNO：2中第1-498位核苷酸编码；第167-177位连接肽的氨基酸序列，由SEQIDNO：2中第499-531位核苷酸编码；第178-184位为胶原结合结构域(CBD)的氨基酸序列，由SEQIDNO：2中第532-552位核苷酸编码；第185-186位为连接肽的氨基酸序列，由SEQIDNO：2中第553-558位核苷酸编码。

SEQIDNO：6所示的的蛋白包括192个氨基酸，除了含有SEQIDNO：5所示的氨基酸以外，还含有组氨酸标签，其由SEQIDNO：3编码，其中，第1-166位为IFNA的氨基酸序列，由SEQIDNO：3中第1-498位核苷酸编码；第167-177位连接肽的氨基酸序列，由SEQIDNO：3中第499-531位核苷酸编码；第178-184位为胶原结合结构域(CBD)的氨基酸序列，由SEQIDNO：3中第532-552位核苷酸编码；第185-186位为连接肽的氨基酸序列，由SEQIDNO：3中第553-558位核苷酸编码；第187-192位为组氨酸标签，由SEQIDNO：3中第559-576位核苷酸编码。

本发明还提供了一种制备前述干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白的方法，包含如下步骤：

ⅰ、取前述的重组大肠杆菌组菌，接种到LB培养基上，37℃、200r/min培养12h，得菌液；

ⅱ、取步骤ⅰ的菌液按2ml：100ml的接种量转接至LB培养基中，37℃、200r/min培养，至OD600值达到0.8～1时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，诱导表达4h；

ⅲ、离心，得菌体，裂解，取上清，分离纯化，即得。

步骤ⅲ中，所述分离纯化采用His-tag磁珠纯化试剂盒分离纯化。

本发明还提供了前述核苷酸序列重组载体、重组菌、干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。

优选地，所述制剂为缓释制剂。

进一步优选地，所述缓释制剂的辅料为胶原，其中，融合蛋白与胶原的重量比为融合蛋白与胶原的重量比为138:1000。

进一步优选地，所述胶原为I型胶原。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物，它是以前述核苷酸序列、重组载体、重组菌和/或干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂

与天然的干扰素A2b相比，本发明干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白(IFNA-CBD)更容易特异结合在肿瘤组织上，不会很快随体液扩散，相同剂量下，本发明干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白可以更好的抑制肿瘤组织生长，存活时间显著延长，对肿瘤的治疗效果明显更佳，临床应用前景良好。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为IFNA-CBD和IFNA蛋白结构示意图

图2为MCF-7细胞生长曲线

图3为IFNA-CBD和IFNA在体外与胶原的结合能力

图4为CH-IFNA-CBD与CH-IFNA蛋白释放曲线

图5为裸鼠荷瘤体积

图6为裸鼠生存期曲线

具体实施方式

实验材料和仪器：

DNA聚合酶(MaxDNAPolymerase，Takara，日本)

DNA标准品(Takara，日本)

DNA连接试剂盒(Takara，日本)

快速DNA产物纯化试剂盒(康为世纪生物科技有限公司，中国)

高纯度质粒小抽提试剂盒(康为世纪生物科技有限公司，中国)

细菌蛋白抽提试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)

包涵体蛋白溶解液(康为世纪生物科技有限公司)

琼脂糖(Biowest，西班牙)

核酸染料Gelview(百泰克生物技术有限公司，中国)

酶切缓冲液Buffer(NEB，美国)

XbaI限制性内切酶(NEB，美国)

XhoI限制性内切酶(NEB，美国)

大肠杆菌感受态细胞株Trans5ɑ(全式金生物技术有限公司，中国)

大肠杆菌感受态细胞株Transetta(全式金生物技术有限公司，中国)

琼脂(Amresco，美国)

IPTG(Amresco，美国)

咪唑(Amresco，美国)

酵母提取物(OXOID，英国)

胰蛋白胨(OXOID，英国)

氯化钠(分析纯，成都科龙化工试剂厂，中国)

氯化钾(分析纯，成都科龙化工试剂厂，中国)

NaOH(分析纯，成都科龙化工试剂厂，中国)

乙醇(分析纯，成都科龙化工试剂厂，中国)

硫酸卡那霉素(碧云天生物技术，中国)

考马斯特亮蓝染色液(碧云天生物技术，中国)

HRP标记山羊抗小鼠IgG多克隆抗体(碧云天生物技术，中国)

镍组氨酸标签蛋白纯化磁珠(海狸生物科技有限公司，中国)

蛋白质标准品(ThermoScientific，美国)

PBS(中杉金桥生物技术有限公司，中国)

人乳腺癌细胞系MCF-7(中科院上海细胞库，中国)

RPMI1640培养基(Hyclone，美国)

FBS(BI，以色列)

胰蛋白酶(Gibco，美国)

CCK-8试剂(Dojindo，日本)

I型胶原溶液(生友生物技术有限公司，中国)

25cm²细胞培养瓶(Corning，美国)

96孔板(Corning，美国)

酶标板(Corning，美国)

人IFNA2bELISA试剂盒(欣博盛生物科技有限公司，中国)

小鼠抗人IFNA2b单克隆抗体(Abcam，英国)

BALB/c裸鼠(达硕实验动物有限公司，中国)

仪器：

台式离心机(Eppendorf，德国)

桌面型迷你离心机(生工生物工程上海(股份)有限公司，中国)

电泳仪(Bio-rad，美国)

PCR热循环仪(Bio-rad，美国)

凝胶成像系统(Bio-rad，美国)

超纯水仪(四川优普超纯科技有限公司，中国)

低温冰箱(Sanyo，日本)

电子天平(上海医疗器械厂，中国)

数显恒温水浴锅(国华电器有限公司，中国)

恒温水平摇床(Thermo，美国)

分光光度计(Thermo，美国)

超净工作台(Thermo公司，美国)

高压灭菌锅(Sanyo，日本)

CO₂细胞培养箱(Sanyo，日本)

超滤管(10kDa，Millipore，德国)

滤膜(0.22μm，Millipore，德国)

倒置相差显微镜(Zeiss，德国)

分光光度计(Biotek，美国)

1ml注射器(BD，美国)

游标卡尺(三圈牌，中国)

实施例1本发明干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白(IFNA-CBD)的制备

1、重组表达

1.1基因克隆

a、合成重组目的基因：

根据人IFNA2b蛋白的氨基酸序列设计IFNA2b基因的核苷酸序列以及PCR扩增引物，并在下游引物中引入胶原结合结构域(CBD)“TKKTLRT”的编码序列“ACTAAGAAAACCCTGCGTACT”。

引物序列如下：

上游引物：

S1：

5′-TGTGACCTGCCGCAAACCCATAGCTTAGGTAGCCGCCGTACCCTGATG-3′；

S2：

5′-AGCCGCCGTACCCTGATGTTACTGGCCCAGATGCGCCGTATTAGCCTGTTTTCTTGTTTAAAGGACCGCCATGA-3′；

S3：

5′-GTTTAAAGGACCGCCATGATTTCGGCTTTCCGCAGGAAGAGTTTGGTAATCAGTTTCAAAAGGCCGAGACC-3′；

S4：

5′-TTTCAAAAGGCCGAGACCATCCCGGTTTTACACGAAATGATTCAGCAAATCTTTAACCTGTTCAGCACGAA-3′；

S5：

5′-CTTTAACCTGTTCAGCACGAAAGACAGCTCTGCCGCGTGGGACGAAACCTTATTAGACAAGTTCTACACCGAG-3′；

U1：

5′-ATTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATG-3′；

U2：

5′-CTTTAAGAAGGAGATATACCATGTGTGACCTGCCGCAAA-3′；

下游引物：

R1：

5′-ACACCTTGGATAACGCACGCCTCCAGGTCGTTCAGTTGCTGGTATAACTCGGTGTAGAACTTGTCTAATAAGG-3′；

R2：

5′-TTACGAACGGCCAGGATGCTGTCCTCCTTCATCAGTGGCGTCTCCGTCACGCCAACACCTTGGATAACGCACG-3′；

R3：

5′-CACGGGCTGTACTTTTTCTCTTTCAGGTATAAGGTAATACGCTGGAAATACTTACGAACGGCCAGGATG-3′；

R4：

5′-TGGTGCTCAGAGAGAAGCTGCGCATAATCTCGGCGCGAACCACCTCCCAGGCGCACGGGCTGTACTTTTTC-3′；

R5：

5′-GATCTCGAGTTATTCTTTGCTACGCAGAGATTCTTGTAAATTGGTGCTCAGAGAGAAGCTG-3′；

D1：

5′-TACTCGAGAGTACGCAGGGTTTTCTTAGTACCGCCGCTACCCGCAGCGCTGC-3′；

D2：

5′-GCCGCTACCCGCAGCGCTGCCCGCGCTACCTTCTTTGCTACGCAGAGATTCTT-3′；

D3：5′-TACTCGAGTTCTTTGCTACGCAGAGATTCTT-3′。

以引物S5和R1互为模板、引物进行PCR扩增，获得的片段进行回收并纯化后，作为第二次PCR的模板，以S4和R2为引物进行第二次PCR扩增，扩增的片段回收并纯化后，作为第三次PCR的模板，以S3和R3为引物进行第三次PCR扩增，扩增的片段回收并纯化后，作为第四次PCR的模板，以S2和R4为引物进行第四次PCR扩增，扩增的片段回收并纯化后，作为第五次PCR的模板，以S1和R5为引物进行第五次PCR扩增，扩增的片段回收并纯化后，作为第六次PCR的模板，以U2和D2为引物进行第六次PCR扩增，扩增的片段回收并纯化后，作为第七次PCR的模板，以U1和D1为引物进行第七次PCR扩增，扩增的片段回收并纯化。扩增得到的基因片段，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，编码序列表中氨基酸序列如SEQIDNO：6所示的的蛋白。其中，SEQIDNO：3由579个核苷酸组成，第1-498位为IFNA的编码序列，编码SEQIDNO：6所示的第1-166位所示的多肽；第532-552位为胶原结合结构域(CBD)的编码序列，编码SEQIDNO：6所示的第178-184位所示的多肽；第559-576位为编码组氨酸标签的核苷酸序列，编码SEQIDNO：6所示的第187-192位所示的多肽。

对照组：以引物S5和R1互为模板、引物进行PCR扩增，获得的片段进行回收并纯化后，作为第二次PCR的模板，以S4和R2为引物进行第二次PCR扩增，扩增的片段回收并纯化后，作为第三次PCR的模板，以S3和R3为引物进行第三次PCR扩增，扩增的片段回收并纯化后，作为第四次PCR的模板，以S2和R4为引物进行第四次PCR扩增，扩增的片段回收并纯化后，作为第五次PCR的模板，以S1和R5为引物进行第五次PCR扩增，扩增的片段回收并纯化后，作为第六次PCR的模板，以U2和D3为引物进行第六次PCR扩增，扩增的片段回收并纯化后，作为第七次PCR的模板，以U1和D3为引物进行第七次PCR扩增，扩增的片段回收并纯化。扩增得到的基因片段，其核苷酸序列如SEQIDNO：7所示，编码SEQIDNO：8的蛋白，其中，第1-498位为IFNA2b的编码序列，编码SEQIDNO：,8第1-166位所示的多肽；第505-522位为编码组氨酸标签的核苷酸序列。

b、构建重组表达载体

取步骤a制得的SEQIDNO：3所示的基因片段以及SEQIDNO：7所示的基因片段，分别用限制性内切酶XbaI和XhoI双酶切，连接入同样双酶切的pET28a(Novagen)载体上，构建重组表达载体pET28a-IFNA-CBD-6His和pET28a-IFNA-6His。对该载体进行测序，测序结果表明，构建的表达载体符合设计。

c、转化大肠杆菌，制备重组菌

将重组表达载体pET28a-IFNA-CBD-6His和pET28a-IFNA-6His分别转入大肠杆菌Rossetta中，得到重组菌Rossetta-IFNA-CBD和Rossetta-IFNA。

1.2重组大肠杆菌的诱导表达

重组菌Rossetta-IFNA-CBD和Rossetta-IFNA分别接种于10ml新鲜的LB培养基，在37℃，200rpm培养12小时，然后按2ml/100ml的比例将培养的重组菌Rossetta-IFNA-CBD和rossetta-IFNA分别接种到150ml新鲜LB培养基，在37℃，200rpm培养3小时，当OD600达到0.8-1时，加入诱导物IPTG(终浓度1mM)诱导4小时。8000g离心10min收集菌体。

使用了细菌蛋白抽提试剂盒破碎菌体，离心分离沉淀，沉淀溶解于包涵体蛋白溶解液，使用了镍组氨酸标签蛋白纯化磁珠试剂盒纯化蛋白溶液，用超滤管将溶液更换为磷酸盐缓冲液，获得IFNA-CBD和IFNA的溶液。

IFNA-CBD的结构如图1所示，氨基酸序列如SEQIDNO：6所示，IFNA的结构如图1所示，其氨基酸序列如SEQIDNO：8所示。

以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：

实验例1本发明干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白(IFNA-CBD)的生物活性

1、实验材料

IFNA-CBD(氨基酸序列如SEQIDNO：6所示)、IFNA(氨基酸序列如SEQIDNO：8所示)，实施例1制备。

2、实验方法

人乳腺癌细胞系MCF-7细胞的培养：培养的基础培养基为RPMI1640，完全培养基添加10％的FBS。

传代后的细胞长至约80％融合时，消化、计数后用完全培养基稀释成细胞浓度为2.5×10⁵个/ml的细胞悬液，接种于96孔板。每孔接种100μL细胞悬液，每板共接种36个孔(连续测量6天，每天6个复孔)，接种3个板。另接种6个复孔作为第0天起始数据。接种后1h，显微镜下确认细胞贴壁完成，更换培养基，3个板分别更换为：

空白对照组培养基(完全培养基+0.1％PBS)、

IFNA-CBD组培养基(完全培养基+0.1％IFNA-CBD蛋白溶液)、

IFNA组培养基(完全培养基+0.1％IFNA蛋白溶液)。

另外接种的6个复孔则直接添加培养基体积10％的CCK-8试剂，置于细胞培养箱中孵育2个小时，测定在450nm处的吸光值。在随后的6天的同一时刻，按顺序选取6个复孔添加培养基体积10％的CCK-8试剂，置于细胞培养箱中孵育2个小时，测定在450nm处的吸光值，同时按组更换剩余孔的培养基。根据测定的数据，绘制细胞生长曲线，进行统计学分析。

3、实验结果

图2为MCF-7细胞生长曲线，结果表明IFNA-CBD与IFNA有相似的抑制癌细胞增殖的能力，这说明与CBD的偶联不影响IFNA的生物学活性。

实验结果说明，本发明IFNA-CBD与天然IFNA抑制癌细胞增殖的能力相当。

实验例2本发明干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白(IFNA-CBD)与胶原结合特性的分析

1、实验材料

IFNA-CBD(氨基酸序列如SEQIDNO：6所示)、IFNA(氨基酸序列如SEQIDNO：8所示)，实施例1制备。

2、实验方法

2.1与胶原的结合

将I型胶原溶液调整浓度和pH后，以每孔100μL添加到酶标板中，4℃过夜，然后烘干，随后用1％BSA溶液封闭酶标板。经PBST洗涤后待用。将不同浓度的IFNA-CBD、IFNA蛋白溶液(0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、0.0015625pg/ml)添加到处理好的酶标板中(每孔100μL)，37℃孵育2h，用PBST洗板，随后添加小鼠抗人IFNA单克隆抗体溶液100μL(1:5000稀释)，37℃孵育2h，用PBST洗板，随后添加HRP标记的山羊抗小鼠多克隆抗体溶液100μL(1:10000稀释)，用PBST洗板，添加显色液TMB100μL，37℃孵育15min，加入终止液(0.5M硫酸溶液)100μL。3min内检测OD450值。根据数据绘制蛋白结合曲线，进行统计学分析。入不同浓度的IFNA-CBD或IFNA，100μl/每孔，37℃，2.5小时。

2.2缓释制剂的蛋白释放特性

将IFNA-CBD和IFNA分别与胶原溶液混合制备胶原水凝胶。

胶原水凝胶的配方为：每1ml胶原水凝胶含200μl的胶原溶液(5mg/ml)，690μl蛋白溶液(蛋白浓度为200ug/ml)，100μl10×PBS，12μlNaOH溶液(0.1M)。

胶原水凝胶的制备方法：将I型胶原溶液与IFNA-CBD、IFNA蛋白溶液混合，加入PBS与NaOH溶液调整pH至中性，置于37℃环境中形成水凝胶以构建含IFNA-CBD、IFNA的生物材料，即CollagenHydrogel-IFNA-CBD(CH-IFNA-CBD)、CollagenHydrogel-IFNA(CH-IFNA)。

将CH-IFNA、CH-IFNA-CBD置于96孔板中，每孔100ul。成胶后，每孔加入100ul的PBS。此后每天从每孔中取50ul浸提液，并用PBS补足100ul。测定浸提液中IFNA或IFNA-CBD的含量。

3、实验结果

IFNA-CBD和IFNA分别与胶原的结合实验结果如图3所示，表明IFNA-CBD比IFNA与胶原有更好的结合能力。

为了达到缓慢释放药物的作用，将本发明IFNA-CBD、天然IFNA分别于胶原制备成为水凝胶，水凝胶的蛋白释放特性如图4所示，表明CH-IFNA-CBD比CH-IFNA更具有缓释IFNA蛋白能力，同时也说明IFNA-CBD比IFNA有更强的胶原结合能力。

肿瘤及其附近部位有大量I型胶原存在，而本发明IFNA-CBD与胶原的结合能力比天然IFNA更强，说明本发明IFNA-CBD比天然IFNA更容易特异结合在肿瘤组织上，不会很快随体液扩散，用于治疗肿瘤时，疗效更佳。

实施例3本发明干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白(IFNA-CBD)在裸鼠肿瘤模型中的抑制肿瘤活性

1、实验材料

IFNA-CBD(氨基酸序列如SEQIDNO：6所示)、IFNA(氨基酸序列如SEQIDNO：8所示)，实施例1制备。

2、实验方法

裸鼠肿瘤模型的建立方法如下：

BALB/c裸鼠饲养于SPF动物实验中心，能自由取用食物和水。传代后的MCF-7细胞长至约80％融合时，消化后用PBS洗涤，计数后用PBS重悬成细胞浓度为2×10⁷个/ml的细胞悬液，冰浴上携带至SPF动物实验中心。用70％的酒精擦拭裸鼠右侧前肢腋下部分进行消毒，用1ml注射器吸取细胞悬液0.2ml，注射于裸鼠右侧前肢腋下部分。注射完成，观察确认未出血、未有细胞悬液溢出，将裸鼠放回笼具中。此后每天观察裸鼠的肿瘤生长情况和裸鼠的存活情况。

实验分4组：PBS组、CH组、IFNA组和IFNA-CBD组。

CH组的药物：将I型胶原溶液与PBS混合，调整pH至中性。将尚未成胶的水凝胶液保持在冰浴中，待注射使用。制作胶原水凝胶时保持在冰浴上操作。

IFNA组和IFNA-CBD组药物(将药物制成缓释制剂)：IFNA-CBD和IFNA分别与胶原溶液混合制备胶原水凝胶。胶原水凝胶的配方为：每1ml胶原水凝胶含200μl的胶原溶液(5mg/ml)，690μl蛋白溶液(蛋白浓度为200ug/ml)，100μl10×PBS，12μlNaOH溶液(0.1M)。胶原水凝胶的制备方法为：将I型胶原溶液与IFNA-CBD)、IFNA蛋白溶液混合，调整pH至中性。制备单一的I型胶原水凝胶则是将I型胶原溶液与PBS混合，调整pH至中性。将尚未成胶的水凝胶液保持在冰浴中，待注射使用。制作胶原水凝胶时保持在冰浴上操作。

观察、扪及裸鼠右侧前肢腋下形成肿瘤团块后，进行治疗处理。空白对照组(PBS组)为在肿瘤团块旁注射0.2mlPBS，对照组1(CH组)为在肿瘤团块旁注射0.2ml尚未成胶的I型胶原水凝胶液，对照组2(CH-IFNA组)为在肿瘤团块旁注射0.2ml尚未成胶的CH-IFNA液(含27.6μgIFNA)，实验组(CH-IFNA-CBD组)为在肿瘤团块旁注射0.2ml尚未成胶的CH-IFNA-CBD液(含27.6μgIFNA-CBD)。每组有6只裸鼠。注射完成，观察未出血，未有液体溢出，将裸鼠放回笼具中。此后每天测量裸鼠的肿瘤体积、观察裸鼠的存活情况。

3、实验结果

实验结果如图5、图6所示，可见在治疗后7天内，CH-IFNA-CBD组裸鼠荷瘤体积明显减小(第1天与第7天，P<0.05)，PBS组、CH组、CH-IFNA组变化无显著性差异(第1天和第7天，P>0.05)。

结合图5，从较长的时间长度来看，PBS组裸鼠的荷瘤体积持续增大，CH组裸鼠的荷瘤体积在第59天时急剧增大(此时仅存活1只)，而CH-IFNA组和CH-IFNA-CBD组裸鼠的荷瘤体积较小。对生存曲线进行比较，发现CH-IFNA组与CH-IFNA-CBD组差异有显著性(P<0.05)，CH-IFNA-CBD组总体存活时间长于CH-IFNA组。

根据图6，PBS组的中位生存时间为35天，CH组的中位生存时间为22天，CH-IFNA组中的位生存时间为32天，CH-IFNA-CBD组的中位生存时间为44天。

与天然IFNA组相比，本发明IFNA-CBD组的肿瘤组织的体积显著降低，存活时间显著延长，对肿瘤的治疗效果显著提高，说明本发明IFNA-CBD比天然IFNA对肿瘤的治疗效果明显更好。

综上，与天然的干扰素A2b相比，本发明干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白(IFNA-CBD)更容易特异结合在肿瘤组织上，不会很快随体液扩散，相同剂量下，本发明干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白可以更好的抑制肿瘤组织生长，存活时间显著延长，对肿瘤的治疗效果明显更佳，临床应用前景良好。

Claims (13)

1.SEQIDNO：1～3任意一项所示的核苷酸序列。

2.一种重组载体，其特征在于：包含SEQIDNO：1～3任意一项所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述的重组载体是重组pET28a质粒。

4.一种重组菌或者转基因细胞系，其特征在于：它是包含权利要求2或者3所述的重组载体的重组菌或者转基因细胞系。

5.根据权利要求4所述的重组菌或者转基因细胞系，其特征在于：所述的重组菌为重组大肠杆菌。

6.一种干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白，其特征在于：它是由SEQIDNO：1～3任意一项所示的核苷酸序列编码。

7.根据权利要求6所述的干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQIDNO：4～6任意一项所示。

8.一种制备权利要求6或7所述干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白方法，其特征在于：包含如下步骤：

ⅰ、取权利要求5所述的重组大肠杆菌组菌，接种到LB培养基上，37℃、200r/min培养12h，得菌液；

ⅱ、取步骤ⅰ的菌液按2ml：100ml的接种量转接至LB培养基中，37℃、200r/min培养，至OD600值达到0.8～1时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，诱导表达4h；

ⅲ、离心，得菌体，裂解，取上清，分离纯化，即得。

9.权利要求1所述核苷酸序列、权利要求2或3所述重组载体、权利要求4或5所述重组菌和/或权利要求6或7所述干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。

10.一种抗肿瘤药物，其特征在于：它是以权利要求1所述核苷酸序列、权利要求2或3所述重组载体、权利要求4或5所述重组菌或转基因细胞系和/或权利要求6或7所述干扰素A2b与胶原结合结构域的融合蛋白为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

11.根据权利要求10所述的药物，其特征在于：所述制剂为缓释制剂。

12.根据权利要求11所述的药物，其特征在于：所述缓释制剂的辅料为胶原，其中，融合蛋白与胶原的重量比为138:1000。

13.根据权利要求12所述的药物，其特征在于：所述胶原为I型胶原。