CN113933298A - 一种检测三维环境下细胞皮质层张力的方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供一种检测三维环境下细胞皮质层张力的方法，包括：在三维培养的细胞中加入胰蛋白酶试剂；使用显微镜观察细胞，得到该细胞体积随时间的变化关系；构建细胞三维约束模型；通过将细胞三维约束模型与细胞体积随时间的变化关系进行对比，验证细胞三维约束模型的可靠性；根据验证后的细胞三维约束模型与待测细胞的细胞体积随时间变化的数据，计算得到待测细胞的皮质层张力。本公开通过将理论模拟与实验数据结合，实现了对细胞皮质层线张力值的原位无损测量，对三维条件下调节细胞体积、探究细胞生长规律等具有指导意义，在细胞大规模分筛、靶向药物治疗等领域具有潜在的应用价值。

Description

一种检测三维环境下细胞皮质层张力的方法

技术领域

本公开涉及生物医用技术领域，具体涉及一种检测三维环境下细胞皮质层张力的方法。

背景技术

在三维环境中，哺乳动物细胞的形状与体积主要是由细胞皮质层与细胞外基质共同调节的。细胞皮质层通常由肌动蛋白微丝、肌动蛋白马达、肌动蛋白结合蛋白所构成的一层致密且具有张力作用的薄层。细胞皮质层的力学性质不论在整体或局部发生改变，都将在细胞体积调节、有丝分裂、细胞迁移、组织形态发生等细胞进程中起着至关重要的作用。因此，探究三维条件下细胞皮质层的力学性质，特别是胞外基质微环境力学因素对其力学性质的潜在调节作用对探究三维条件下调节细胞体积、细胞生长规律等具有指导意义，在细胞大规模分筛、靶向药物治疗等领域具有潜在的应用价值。

然而值得注意的是，细胞皮质层位于胞内环境中，通过其内部的肌动蛋白马达拉动肌动蛋白微丝产生收缩应力而产生细胞皮质层张力。目前已有的对细胞皮质层张力的测量往往通过原子力显微镜的探知或单细胞微吸管吸入的方式实现。这类方法都不可避免的要在细胞上整体或局部地施加外力与位移的作用，对细胞皮质层的肌动蛋白组成结构都将产生不可避免的影响，从而改变细胞皮质层的力学性质；另一方面，三维条件下细胞外基质微环境的物理刺激对细胞皮质层的力学性质的影响机制仍尚不明确，其也将是探测皮质层张力过程中的一个潜在影响因素。

发明内容

(一)要解决的技术问题

针对上述问题，本公开提供了一种检测三维环境下细胞皮质层张力的方法，用于至少部分解决传统细胞皮质层张力的测量方法不够准确等的技术问题。

(二)技术方案

本公开提供了一种检测三维环境下细胞皮质层张力的方法，包括：在三维培养的细胞中加入胰蛋白酶试剂；使用显微镜观察细胞，得到该细胞体积随时间的变化关系；构建细胞三维约束模型；通过将细胞三维约束模型与细胞体积随时间的变化关系进行对比，验证细胞三维约束模型的可靠性；根据验证后的细胞三维约束模型与待测细胞的细胞体积随时间变化的数据，计算得到待测细胞的皮质层张力。

进一步地，在三维培养的细胞中加入胰蛋白酶试剂包括：将细胞预埋至具有生物相容性的水凝胶中进行培养固定，再加入胰蛋白酶试剂。

进一步地，使用显微镜观察细胞包括：通过激光共聚焦显微镜扫描单个细胞的整体轮廓，还原得到单个球形细胞在水凝胶中的几何形状；外界环境刺激使细胞体积发生相应变化，得到细胞半径与时间的变化关系；计算得到该细胞体积随时间的变化关系。

进一步地，构建细胞三维约束模型包括：通过耦合水凝胶对细胞的物理约束、细胞的细胞膜内外渗透压变化、细胞的细胞皮质层张力因素，构建细胞三维约束模型。

进一步地，构建细胞三维约束模型还包括：根据细胞三维约束模型计算细胞半径随时间的变化关系的方程式如下：

其中：

分别为代换常数，μ₁为材料参数，k_m表示细胞膜的渗透系数，μ_f为水凝胶中孔隙液体流动的动力粘度，H₀表示液体有效渗透的长度，R₀为细胞初始半径，N_m表示细胞内总物质的量，k_B表示玻尔兹曼常量，T为绝对温度，c_i与c_o分别表示细胞内外的物质浓度，ΔC＝c_i-c_o表示膜内外物质浓度差，τ_c表示细胞皮层的线张力系数。

进一步地，验证细胞三维约束模型的可靠性包括：通过绘制显微镜观察到的细胞体积随时间的变化关系图，与方程式所计算得到的结果进行对比，验证细胞三维约束模型的可靠性。

进一步地，验证细胞三维约束模型的可靠性还包括：当显微镜观察到的细胞体积随时间的变化数据与细胞三维约束模型计算得到结果具有良好的一致性时，则该细胞三维约束模型可靠。

进一步地，计算得到待测细胞的皮质层张力包括：通过显微镜观测到N组细胞体积随时间变化的数据V_i(i＝1，2，3...N)，使用细胞三维约束模型计算，得到对应时间点的细胞体积随时间变化的数据v_i(i＝1，2，3...N)；

细胞线张力值通过

测量得到，其中，

argmax是对函数求参数集合函数；R²是实验获得数据与三维约束模型计算得到数据对比参考依据。

进一步地，细胞三维约束为包裹在细胞外界的水凝胶对细胞提供的物理约束。

进一步地，细胞皮质层为哺乳动物细胞内由肌动蛋白微丝、肌动蛋白马达、肌动蛋白结合蛋白所构成的薄层。

(三)有益效果

本公开实施例提供的一种检测三维环境下细胞皮质层张力的方法，通过将理论模拟与实验数据结合，建立了描述细胞在三维水凝胶培养体系中约束下的体积变化理论模型，通过向培养体系中加入胰蛋白酶试剂以促进细胞皮质层的脱落，利用激光共聚焦显微镜观察在细胞体积随时间的变化关系，将理论模型计算结果与实验数据对比，验证本公开所提出模型的可靠性，最终依靠理论模型计算与实验数据相结合，计算得到三维环境下细胞皮质层的张力值，做到对细胞皮质层线张力值的原位无损测量，对三维条件下调节细胞体积、探究细胞生长规律等具有指导意义，在细胞大规模分筛、靶向药物治疗等领域具有潜在的应用价值。

附图说明

图1示意性示出了根据本公开实施例的检测三维环境下细胞皮质层张力方法的应用场景及细胞在三维细胞外基质中的受力分析示意图；

图2示意性示出了根据本公开实施例中检测三维环境下细胞皮质层张力方法的流程图；

图3示意性示出了根据本公开实施例的检测三维环境下细胞皮质层张力中使用显微镜观察细胞方法的流程图；

图4示意性示出了根据本公开实施例的细胞在三维细胞外基质中培养示意图；

图5示意性示出了根据本公开实施例的细胞在三维细胞外基质微环境中体积变化示意图；

图6示意性示出了根据本公开实施例中实验测量细胞体积与理论模型计算对比图；

图7示意性示出了根据本公开实施例中测量得到不同细胞外基质刚度条件下细胞皮质层张力值示意图。

具体实施方式

为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开进一步详细说明。

在此使用的术语仅仅是为了描述具体实施例，而并非意在限制本公开。在此使用的术语“包括”、“包含”等表明了所述特征、步骤、操作和/或部件的存在，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、步骤、操作或部件。

在此使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有本领域技术人员通常所理解的含义，除非另外定义。应注意，这里使用的术语应解释为具有与本说明书的上下文相一致的含义，而不应以理想化或过于刻板的方式来解释。

针对现有技术存在的问题，本公开旨在提供一种原位无损测量三维环境下细胞皮质层张力的方法。

图1示意性示出了根据本公开实施例的检测三维环境下细胞皮质层张力方法的应用场景及细胞在三维细胞外基质中的受力分析示意图。磷脂双分子层组成了细胞的细胞膜；肌动蛋白微丝等蛋白紧贴细胞膜的内壁，组成了细胞皮质层，皮质层在结构上可以看成是一层包裹在细胞外围的致密的弹性薄层，对产生一个向内的压强，在细胞体积调节、有丝分裂、细胞迁移、组织形态发生等细胞进程中起着至关重要的作用。细胞外基质与细胞自身紧密接触，当细胞膜内外存在渗透压差从而导致水分子跨膜输运而导致的体积变化时，细胞外基质由于变形将对细胞产生相应的力学作用。此外，由于细胞外基质的溶胀、降解、细胞生长等原因所导致细胞与三维细胞外基质界面存在一定的预应力作用，也将对细胞与胞外基质的力学平衡产生影响。

图2示意性示出了根据本公开实施例的检测三维环境下细胞皮质层张力方法的流程图。

如图2所示，该检测三维环境下细胞皮质层张力的方法包括：

在操作S1，在三维培养的细胞中加入胰蛋白酶试剂。

该胰蛋白酶试剂为一种生物试剂，其可通过消化蛋白的方式诱发细胞皮质层与细胞膜解离，使细胞皮质层的张力快速且大幅度减弱，打破三维培养的细胞原有的皮质层力学平衡。通过试剂诱发细胞皮质层脱落，进而去除细胞原有的皮质层对细胞自身尺寸的力学约束，为本公开后续的实验观测提供基础。

在操作S2，使用显微镜观察细胞，得到该细胞体积随时间的变化关系。

该细胞体积变化情况为细胞皮质层脱落后，皮质层依靠张力作用对细胞体积的约束被大幅度削弱甚至消失，细胞在原有的约束条件下的力学平衡被打破，细胞因失去这一约束从而导致体积产生相应的变化，直至依靠细胞外基质提供的约束建立新的力学平衡，体积逐渐趋于稳定的过程。使用显微镜观察该过程，通过实验测量得到该细胞体积随时间的变化关系，该测量结果将用于本公开后续对所建立的细胞体积三维约束模型的方法的可靠性验证与测量细胞皮质层张力值的数据来源。

在操作S3，构建细胞三维约束模型。

三维约束模型为依托力学手段，通过耦合外界水凝胶对细胞的物理约束、细胞膜内外渗透压变化、细胞皮质层张力等因素，构建的描述细胞在三维条件下体积随时间变化得到的理论模型；该理论模型将用于本公开测量细胞皮质层张力值的计算依据。

在操作S4，通过将细胞三维约束模型与细胞体积随时间的变化关系进行对比，验证细胞三维约束模型的可靠性。

验证三维约束模型的可靠性为，通过对试验测量得到的细胞体积随时间变化的数据与理论模型计算得到的数据进行对比，验证理论模型建立的合理性与计算所得数据的准确性。

在操作S5，根据验证后的细胞三维约束模型与待测细胞的细胞体积随时间变化的数据，计算得到待测细胞的皮质层张力。

通过观测细胞在实验中加入胰蛋白酶后的体积变化情况，结合本公开建立的三维约束模型，计算得到细胞皮质层线张力值；该张力值为细胞皮质层结构用于自发调节细胞体积等行为的向细胞内的约束张力作用，其定量表达在本公开的实施例中有描述，单位为皮牛每微米。

本公开提出的在三维培养细胞体系中测量具有皮质层结构的细胞张力值的方法，具有良好的普适性。

在上述实施例的基础上，在三维培养的细胞中加入胰蛋白酶试剂包括：将细胞预埋至具有生物相容性的水凝胶中进行培养固定，再加入胰蛋白酶试剂。

在上述实施例的基础上，构建细胞三维约束模型包括：通过耦合水凝胶对细胞的物理约束、细胞的细胞膜内外渗透压变化、细胞的细胞皮质层张力因素，构建细胞三维约束模型。

图3示意性示出了根据本公开实施例的使用显微镜观察细胞方法的流程图。

如图3所示，该使用显微镜观察细胞的方法包括：

在操作S31，通过激光共聚焦显微镜扫描单个细胞的整体轮廓，还原得到单个球形细胞在水凝胶中的几何形状；

在操作S32，外界环境刺激使细胞体积发生相应变化，得到细胞半径与时间的变化关系；

在操作S33，计算得到该细胞体积随时间的变化关系。

在上述实施例的基础上，细胞体积三维约束为包裹在细胞外界的水凝胶对细胞提供的物理约束，据此建立了细胞三维约束模型，该模型将应用于后续测量细胞皮质层张力值的计算所得结果可靠的依据。当显微镜观察到的细胞体积随时间的变化数据与细胞三维约束模型计算得到结果具有良好的一致性时，则该细胞三维约束模型可靠。

在上述实施例的基础上，细胞皮质层为哺乳动物细胞内由肌动蛋白微丝、肌动蛋白马达、肌动蛋白结合蛋白所构成的一层致密且具有张力作用的薄层，具有向细胞内的张力约束作用；该张力为细胞皮质层结构用于自发调节细胞体积等行为的向细胞内的约束力作用，单位为皮牛每微米。

下面以一具体实施例详细介绍本公开中原位无损测量三维条件下细胞皮质层张力的方法的流程。

首先，本公开关注三维条件下包裹的单个细胞的体积变化情况，如图4所示，其中，图4中左图为通过绿色荧光染料所染色的细胞肌动蛋白的分布情况，右图为通过激光共聚焦显微镜扫描该单细胞的整体轮廓还原得到的单个球形细胞在水凝胶中的几何形状。我们将模型简化为初始半径为R₀，当前构型下半径为R_c单个细胞在无限大的细胞外基质中生长。在细胞生长、调亡、因受到外界环境刺激发生的调节体积增加(Regulatory VolumeDecrease，RVD)或调节体积减小(Regulatory Volume Increase，RVI)的过程中，细胞体积发生相应变化，存在着细胞与水凝胶的界面处发生相互作用关系。细胞膜与细胞皮质层的组合结构，一方面可以通过细胞膜上的各种离子泵、转运蛋白和水离子通道完成相应物质的跨膜运输，从而适应外界环境变化或主动调节细胞生长行为；另一方面，细胞膜与细胞皮质层也是区分细胞质与细胞外基质的重要结构，在保持细胞完整性上发挥着重要的作用，如图1所示。

细胞在发生体积变化的过程中始终保持球形，其体积的改变主要源于通过细胞膜上水离子通道流入与流出细胞的水所产生的：

其中：

表示球形细胞体积，Q_i与Q_o分别表示进入细胞与流出细胞的水流量。

细胞膜两侧的渗透压差是产生水分子跨膜运输的源动力，表达如下：

其中：ΔP分别表示细胞膜内外的渗透压差，t＝0⁺表示细胞体积发生改变的初始时刻，k_B表示玻尔兹曼常量，T为绝对温度，c_i与c_o分别表示细胞内外的物质浓度，ΔC＝c_i-c_o表示膜内外物质浓度差。

另一方面，细胞膜在水分子跨膜输运时展现出了半透膜的特性，并且考虑到球形细胞的对称性，跨膜输运的水流量Q_c可以通过达西定律表达如下：

其中：k_m表示细胞膜的渗透系数，μ_f为水凝胶中液体流动的动力粘度，H_c表示液体有效渗透的长度，此处为细胞膜与皮层组合结构的厚度。

在这里，我们使用具有不可压缩Neo-Hookean的本构关系来描述包裹在细胞外的水凝胶，其能量表达式如下：

其中，U_gel表示外界包裹的水凝胶材料变性能，μ₁表示水凝胶材料的材料系数，I₁为第一不变量。

随着细胞体积的变化，细胞与水凝胶的界面处存在着相应的位移与力学相互作用：

其中，σ_RR与

分别表示细胞-水凝胶界面处的径向和切向应力，α＝R_c/R₀表示细胞与水凝胶界面的伸长比。

接着，我们还需要考虑细胞膜与皮质层对细胞的结构完整性所做出的贡献，皮质层在结构上可以看成是一层包裹在细胞外围的致密的弹性薄层，对产生一个向内的压强：

其中：τ_c表示细胞皮层的张力系数，即为本公开所需要探知的物理量。

紧接着，水分子的跨膜运输取决于作用在细胞膜两侧的压力差，如图1所示：

Π＝p_i-p_o-ΔP_cortex-σ_E (7)

其中：σ_E表示由于细胞-水凝胶界面移动，细胞外基质微环境对细胞产生的力学约束。

结合(2，6，7)式，细胞膜两侧的渗透压差再加入Trypsin试剂前后满足如下随时间的变化关系：

其中：t＝0^-与t＝0⁺分别表示细胞膜内外产生渗透压差的前后时刻。并且值得注意的是，细胞内外的渗透压差也可以表示为：

其中，N_m表示细胞内总物质的量，C_o(t)表示细胞外基质微环境的物质浓度。

结合方程(1-3，5-9)，可以得到细胞在胞外基质三维约束下，由渗透压差所驱动的变形表达式：

将(10)式化简，可以得到：

其中：

分别为代换常数，通过求解方程(11)式，可以得到本公开理论模型所计算的细胞半径随时间的变化关系，可用于本公开下一步的与实验结果的对比。

在进一步的实施中，通过激光共聚焦显微镜对加入胰蛋白酶试剂后的细胞进行观测，细胞随时间变化形态如图5所示，通过绘制细胞体积随时间的变化图，与方程(11)式所计算得到的结果进行对比，验证本公开所构建的理论模型的可靠性，如图6所示，其中，

表示变形过程中球形细胞体积，

表示球形细胞初始时刻体积。

值得注意的是，当本公开其他参数确定时，例如细胞初始尺寸，细胞外基质刚度等，在本公开所建立的细胞三维约束模型下，细胞体积随时间变化的函数是一个仅与待测量的细胞皮质层张力τ_c和时间t有关的函数v(τ_c，t)。通过实验可以观测到N组细胞体积随时间变化的数据V_i(i＝1，2，3...N)，通过理论模型计算，同样可以提取出对应时间点的细胞体积随时间变化的数据v_i(i＝1，2，3...N)

于是细胞线张力值可通过

测量得到，其中，

如图5所示。

通过上述方法，本实施例在测量了三组细胞外基质水凝胶分别为1.2kPa，2.2kPa，8kPa的条件下，细胞皮质层的张力值情况，如图7所示。

本公开实现了对细胞皮质层线张力值的原位无损测量，对三维条件下调节细胞体积、探究细胞生长规律等具有指导意义，在细胞大规模分筛、靶向药物治疗等领域具有潜在的应用价值。

以上所述的具体实施例，对本公开的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本公开的具体实施例而已，并不用于限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测三维环境下细胞皮质层张力的方法，其特征在于，包括：

在三维培养的细胞中加入胰蛋白酶试剂；

使用显微镜观察所述细胞，得到该细胞体积随时间的变化关系；

构建细胞三维约束模型；

通过将所述细胞三维约束模型与所述细胞体积随时间的变化关系进行对比，验证所述细胞三维约束模型的可靠性；

根据验证后的所述细胞三维约束模型与待测细胞的细胞体积随时间变化的数据，计算得到所述待测细胞的皮质层张力。

2.根据权利要求1所述的检测三维环境下细胞皮质层张力的方法，其特征在于，所述在三维培养的细胞中加入胰蛋白酶试剂包括：

将所述细胞预埋至具有生物相容性的水凝胶中进行培养固定，再加入胰蛋白酶试剂。

3.根据权利要求1所述的检测三维环境下细胞皮质层张力的方法，其特征在于，所述使用显微镜观察所述细胞包括：

通过激光共聚焦显微镜扫描单个所述细胞的整体轮廓，还原得到单个球形细胞在水凝胶中的几何形状；

外界环境刺激使所述细胞体积发生相应变化，得到所述细胞半径与时间的变化关系；

计算得到该细胞体积随时间的变化关系。

4.根据权利要求2所述的检测三维环境下细胞皮质层张力的方法，其特征在于，所述构建细胞三维约束模型包括：

通过耦合所述水凝胶对所述细胞的物理约束、所述细胞的细胞膜内外渗透压变化、所述细胞的细胞皮质层张力因素，构建所述细胞三维约束模型。

5.根据权利要求4所述的检测三维环境下细胞皮质层张力的方法，其特征在于，所述构建细胞三维约束模型还包括：

根据所述细胞三维约束模型计算细胞半径随时间的变化关系的方程式如下：

其中：

分别为代换常数，μ₁为材料参数，k_m表示细胞膜的渗透系数，μ_f为水凝胶中孔隙液体流动的动力粘度，H₀表示液体有效渗

透的长度，R₀为细胞初始半径，N_m表示细胞内总物质的量，k_B表示玻尔兹曼常量，T为绝对温度，c_i与c_o分别表示细胞内外的物质浓度，ΔC＝c_i-c_o表示膜内外物质浓度差，τ_c表示细胞皮层的线张力系数。

6.根据权利要求5所述的检测三维环境下细胞皮质层张力的方法，其特征在于，所述验证所述细胞三维约束模型的可靠性包括：

通过绘制显微镜观察到的所述细胞体积随时间的变化关系图，与所述方程式所计算得到的结果进行对比，验证所述细胞三维约束模型的可靠性。

7.根据权利要求6所述的检测三维环境下细胞皮质层张力的方法，其特征在于，所述验证所述细胞三维约束模型的可靠性还包括：

当所述显微镜观察到的细胞体积随时间的变化数据与所述细胞三维约束模型计算得到结果具有良好的一致性时，则该细胞三维约束模型可靠。

8.根据权利要求1所述的检测三维环境下细胞皮质层张力的方法，其特征在于，所述计算得到所述待测细胞的皮质层张力包括：

通过所述显微镜观测到N组细胞体积随时间变化的数据V_i(i＝1，2，3...N)，使用所述细胞三维约束模型计算，得到对应时间点的细胞体积随时间变化的数据v_i(i＝1，2，3...N)；

细胞线张力值通过

测量得到，其中，

argmax是对函数求参数集合函数；R²是实验获得数据与三维约束模型计算得到数据对比参考依据。

9.根据权利要求2所述的检测三维环境下细胞皮质层张力的方法，其特征在于，所述细胞三维约束为包裹在所述细胞外界的所述水凝胶对细胞提供的物理约束。

10.根据权利要求1所述的检测三维环境下细胞皮质层张力的方法，其特征在于，所述细胞皮质层为哺乳动物细胞内由肌动蛋白微丝、肌动蛋白马达、肌动蛋白结合蛋白所构成的薄层。

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