ES2910714T3 - Procedimiento para cultivar organoides - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para cultivar organoides, comprendiendo el procedimiento: a) disociar organoides no procesados para producir una suspensión celular; b) tamizar la suspensión celular a través de un tamiz celular para retener una suspensión celular tamizada que contiene células de aproximadamente 10 μm a aproximadamente 1 mm de diámetro; c) sembrar células de la suspensión celular tamizada en un biorreactor en un medio de cultivo celular que comprende una matriz de soporte extracelular; d) cultivar las células en el biorreactor para formar organoides de fase I; e) retirar los organoides de fase I del biorreactor y suspender los organoides en medio de cultivo celular para formar una suspensión de organoides; y f) tamizar la suspensión de organoides a través de, como mínimo, dos tamices celulares que tienen diferentes tamaños de malla para obtener una suspensión de organoides de fase II que tienen un diámetro de aproximadamente 20 μm a aproximadamente 200 μm.
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento para cultivar organoides
Sector de invención
La presente invención se refiere a un procedimiento para cultivar organoides.
Estado de la técnica anterior
Antes de probar nuevos candidatos a fármacos in vivo en animales o seres humanos, las pruebas in vitro generalmente se realizan utilizando cultivos celulares primarios o líneas celulares. Sin embargo, los resultados de estas pruebas pueden no ser fiables ya que los cultivos celulares no imitan muy bien un sistema in vivo. Esto puede llevar a que algunos buenos fármacos sean rechazados en las fases in vitro y algunos fármacos deficientes puedan progresar a ensayos in vivo.
Los organoides son estructuras tridimensionales de tejido heterogéneo que funcionan como un tejido in vivo. En otras palabras, estas estructuras tridimensionales de tejido imitan un órgano mejor que una monocapa de cultivo celular tradicional. Por lo tanto, los organoides proporcionan una oportunidad de crear modelos celulares de enfermedad, que pueden estudiarse para entender mejor las causas de la enfermedad e identificar posibles tratamientos.
Los organoides a menudo se generan a partir de células madre, que se pueden diferenciar en organoides cerebrales, renales, cardiovasculares y de otro tipo. La tecnología de organoides también se ha utilizado para crear un modelo de progresión del cáncer de colon humano. Estos organoides pueden crearse a partir de células intestinales normales mutadas para transformarse en células cancerosas, o pueden derivarse de células tumorales per se. Se ha demostrado que los organoides creados a partir de tumores son un buen reflejo del tumor original, proporcionando oportunidades para pruebas de fármacos in vitro mejoradas. En Miyoshi y Stappenback, 2013, se han descrito procedimientos para cultivar organoides en matrigel, filtrarlos a través de un tamiz de 70 pmi o 40 pmi durante la etapa de paso y volver a sembrar los organoides en un biorreactor de placas (EasyFill Cell Factory, Nunclon).
Sin embargo, hasta la fecha, los organoides solo se han cultivado en entornos de laboratorio, que dependen en gran medida de la habilidad técnica del técnico involucrado y producen pequeñas cantidades de organoides. Por lo tanto, los organoides no están fácilmente disponibles en grandes cantidades para las pruebas de fármacos. Además, debido a la dependencia de la habilidad técnica en su cultivo, existe poca estandarización entre cultivos, lo que significa que las pruebas llevadas a cabo en diferentes lotes de organoides pueden no ser directamente comparables.
Por lo tanto, existe la necesidad de producir organoides en mayor número y producir organoides de forma y función consistentes. Esto permitirá una utilización más amplia de los organoides en las pruebas de fármacos y mejorará la comparabilidad de los resultados de las pruebas.
Características de la invención
Por consiguiente, la presente invención da a conocer un procedimiento para cultivar organoides, comprendiendo el procedimiento a) disociar organoides no procesados para producir una suspensión celular; b) tamizar la suspensión celular a través de, como mínimo, un tamiz celular para retener una suspensión celular tamizada que contiene células de aproximadamente 10 p.m a aproximadamente 1 mm de diámetro; c) sembrar células de la suspensión celular tamizada en un biorreactor en un medio de cultivo celular que comprende una matriz de soporte extracelular; d) cultivar las células en el biorreactor para formar organoides de fase I; e) retirar los organoides de fase I del biorreactor y suspender los organoides en medio de cultivo celular para formar una suspensión de organoides; y f) tamizar la suspensión de organoides a través de, como mínimo, dos tamices celulares que tienen diferentes tamaños de malla para obtener una suspensión de organoides de fase II que tienen un diámetro de aproximadamente 20 p.m a aproximadamente 200 p.m. El tamizado de la suspensión celular proporciona una ventaja particular ya que se puede controlar el intervalo de tamaños de las células tamizadas. Por ejemplo, la selección de un intervalo de tamaños estrecho de células para sembrar en el medio de cultivo celular a partir de células en crecimiento activo conduce al cultivo de organoides homogéneos que tienen una proporción consistente de tamaño/área de superficie respecto a volumen, lo que da como resultado una variabilidad reducida y una calidad mejorada. Sin estar ligados a la teoría, se cree que el tamaño de las células/organoides puede optimizarse para garantizar que todos los organoides tengan un buen contacto con la matriz de soporte extracelular, así como un buen acceso a nutrientes y tensión de O2. Esto garantiza que todas las células de los organoides se desarrollen apropiadamente y sean de alta calidad, lo que significa que hay disponible una mayor cantidad de organoides para diversas aplicaciones, tales como el cribado de fármacos.
Descripción
El término organoide simplemente significa que se asemeja a un órgano. Los organoides se definen típicamente por tres características: autoorganización, multicelularidad y funcionalidad (Lancaster y Knoblich). Por tanto, las células se disponen ellas mismas in vitro en la organización tridimensional (3D) que es característica del órgano in vivo, la estructura resultante consiste en múltiples tipos de células que se encuentran en ese órgano en particular y las células ejecutan, como mínimo, algunas de las funciones que normalmente llevan a cabo en ese órgano. Por ejemplo, un organoide prototípico, el organoide intestinal de ratón, crece como un epitelio de monocapa organizado en dominios, de modo que se asemeja a la arquitectura de la cripta-vellosidad intestinal in vivo, que comprende los diferentes tipos celulares del intestino (enterocitos, células caliciformes, células de Paneth, células enteroendocrinas y células madre) y que rodea una luz quística (Sato et ai).
Como se utilizan en el presente documento, organoides no procesados se refieren a organoides preparados a partir de cultivos primarios de muestras de tejido que no se han sometido a ninguna etapa de tamizado o clasificación por tamaño durante su período de cultivo. Los organoides no procesados pueden aislarse a partir de muestras de tejido, incluidas biopsias normales y tumorales de tejidos que incluyen el tubo digestivo, la mama, la próstata, los pulmones, el hígado, los ovarios, el páncreas, la piel, los riñones, el cerebro y los testículos.
Según la presente invención, los organoides no procesados se disocian para descomponerlos en (principalmente) células individuales. Después de pasar a través de un tamiz, quedan cúmulos más grandes en el filtro. El filtrado (es decir, la suspensión celular tamizada) puede contener principalmente células individuales y/o pequeños cúmulos de dos o más células, que pueden tener de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 1 mm de diámetro, preferentemente de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 200 pm de diámetro, más preferentemente de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 60 pm de diámetro. A continuación, se siembran en un medio de cultivo celular que comprende una matriz de soporte extracelular. Tras un mayor crecimiento en cultivo, las células viables se dividen y se convierten en organoides multicelulares (denominados en el presente documento organoides de fase I). Estos pueden “recuperarse” enteros, a partir de la matriz de soporte extracelular y pasarse a través de tamices de diversos tamaños para extraer los organoides del intervalo deseado de tamaños desde aproximadamente 20 pm hasta aproximadamente 200 pm (organoides de fase II) como se describe a continuación.
La disociación de los organoides no procesados puede referirse al proceso de disociación celular que utiliza tripsina, una enzima proteolítica que escinde proteínas, para disociar las células adherentes entre sí y/o de un recipiente en el que se cultivan. Cuando se añade a un cultivo celular, la tripsina descompone las proteínas que permiten que las células se adhieran al recipiente. La tripsinización se utiliza a menudo para pasar células a un nuevo recipiente. Como técnica de disociación alternativa / complementaria, se pueden utilizar agentes quelantes, incluido el EDTA, para romper las uniones célula-célula.
Los medios de cultivo celular son bien conocidos en la técnica y serán familiares para los expertos en la materia. Típicamente, el medio de cultivo celular comprende aminoácidos, sales, glucosa y vitaminas y también puede comprender hierro y rojo fenol. Se puede generar un medio de cultivo adecuado para su utilización en la presente invención mediante la modificación de un medio de cultivo celular existente. Por ejemplo, el medio de cultivo celular puede ser medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y puede comprender uno o más componentes adicionales, tales como una mezcla de nutrientes (por ejemplo, F12 de Ham), antibióticos/antifúngicos (por ejemplo, penicilina/estreptomicina), tampón (por ejemplo, HEPES), glutamina y n-acetilcisteína. El medio de cultivo celular puede comprender adicionalmente un suplemento libre de suero, tal como el suplemento N2 y/o el suplemento B27.
El medio de cultivo celular puede comprender de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 99 % v/v de la matriz de soporte extracelular, preferentemente de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 85 % v/v o de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 85 % v/v de la matriz de soporte extracelular. En realizaciones preferentes de la presente invención, el medio de cultivo celular puede comprender aproximadamente el 85 % v/v de la matriz de soporte extracelular. La reducción del contenido de la matriz de soporte extracelular en el medio de cultivo celular puede proporcionar ventajas económicas particulares sobre la técnica anterior en la que es típico utilizar matriz extracelular al 100 %. Sorprendentemente, los inventores de la presente invención han descubierto que el contenido de matriz extracelular se puede reducir en el procedimiento de la presente invención sin comprometer el crecimiento de organoides.
Preferentemente, la matriz de soporte extracelular es una matriz extracelular a base de gel, que puede ser sintética o de origen natural. Adicionalmente o como alternativa, la matriz de soporte extracelular puede ser una preparación de membrana basal solubilizada. Por ejemplo, se pueden extraer preparaciones de membrana basal adecuadas del sarcoma de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) de ratón, un tumor rico en proteínas de la matriz extracelular, tales como laminina, colágeno IV, proteoglicanos de sulfato de heparina, entactina/nidógeno y una serie de factores de crecimiento. Preferentemente, la matriz de soporte extracelular comprende, como mínimo, dos glicoproteínas distintas, tales como dos tipos diferentes de colágeno o un colágeno y laminina. En realizaciones de la presente invención, la matriz de soporte extracelular puede ser Matrigel® (que comprende laminina, entactina y colágeno IV) o Cultrex® BME (que comprende laminina, entactina, colágeno IV y proteoglicano de sulfato de heparina). Preferentemente, la matriz de soporte extracelular es Matrigel®. Como alternativa, la matriz de soporte extracelular
puede ser una matriz sintética que comprenda péptidos basados en secuencias presentes en fibronectina, colágeno y/o laminina.
El medio de cultivo se puede colocar encima de la matriz de soporte extracelular y se puede retirar y reponer según se requiera. En realizaciones de la presente invención, el biorreactor proporciona un flujo continuo de medio de cultivo, alimentando así continuamente los organoides. La composición del medio de cultivo se puede ajustar con el tiempo para maximizar el crecimiento uniforme de los organoides.
La suspensión celular obtenida tras la disociación de los organoides no procesados se tamiza a través de un tamiz celular para retener una suspensión celular tamizada como se describió anteriormente. Las células de la suspensión celular tamizada pueden ser células individuales o pueden ser dos o más células unidas para formar un organoide. El tamaño de las células u organoides de la suspensión celular tamizada se puede controlar mediante el tamaño de malla del tamiz celular. Por ejemplo, el tamiz celular puede tener un tamaño de malla de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 1 mm o de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 500 pm. Preferentemente, el tamiz celular tiene un tamaño de malla de aproximadamente 20 pm a aproximadamente 100 pm, más preferentemente de aproximadamente 30 pm a aproximadamente 50 pm. En realizaciones de la presente invención, el tamiz celular puede tener un tamaño de malla de aproximadamente 40 pm si se requieren principalmente células individuales en la suspensión celular tamizada. Los tamices celulares adecuados serán familiares para el experto en la materia e incluyen los pluriStrainer.
Después del tamizado de los organoides no procesados, la suspensión celular tamizada se siembra, preferentemente, en un biorreactor. El cultivo celular tradicional (bidimensional) típicamente implica sembrar células aisladas en una superficie plana (tal como una placa de Petri o un matraz tratado para cultivo tisular) y complementar las células con medios nutritivos. Las células se almacenan típicamente de forma estática a 37 °C con exposición a CO2 al 5 %. Por el contrario, los biorreactores permiten interacciones tridimensionales célula-célula y célula-matriz, además de proporcionar gradientes espaciales y temporales de señales bioquímicas y físicas, y regulación sistémica, incluida la comunicación cruzada entre diferentes sistemas de órganos. Los biorreactores permiten así que las células se diferencien en estructuras tisulares tridimensionales, tales como organoides. Una característica clave de los biorreactores es que proporcionan un sistema de cultivo dinámico, en lugar de los sistemas de cultivo estáticos del cultivo celular tradicional. En cultivos estáticos, el transporte de masa se basa en la difusión y, por lo general, limita el desarrollo de tejidos a espesores inferiores a 0,2 mm debido a las caídas en la tensión de oxígeno y al aumento de las concentraciones de metabolitos tóxicos. Por el contrario, los biorreactores proporcionan transporte de masa dinámico, lo que permite el desarrollo de tejido en una escala de milímetro a centímetro.
En realizaciones de la presente invención, el biorreactor puede ser un biorreactor de alimentación semicontinua (“fed-batch") o un biorreactor de perfusión, los cuales crean, ambos, un flujo de medio de cultivo para mejorar la difusión de nutrientes. A los biorreactores de alimentación semicontinua típicamente se les suministra una cantidad discreta de medio de cultivo que generalmente se cambia a intervalos de días. Los biorreactores de alimentación semicontinua pueden incluir biorreactores de matraz agitado o biorreactores de pared giratoria, los cuales proporcionan, ambos, un flujo convectivo de medio para mejorar la distribución de nutrientes. Los biorreactores de matraz agitado suelen utilizar una barra agitadora magnética para crear un flujo convectivo que permite la mezcla continua del medio. Los biorreactores de pared giratoria proporcionan un flujo laminar dinámico de medio. En realizaciones preferentes de la presente invención, el biorreactor es un biorreactor de perfusión. Los biorreactores de perfusión utilizan un sistema de bomba que puede perfundir medio a través de células o tejidos de manera continua o discontinua. En los sistemas de biorreactor de perfusión, el oxígeno y los nutrientes se suministran al interior de la construcción tanto por difusión como por convección. El caudal se puede optimizar con respecto al nutriente limitante, que en su mayoría es oxígeno debido a su baja solubilidad en el medio de cultivo. Los biorreactores de perfusión pueden proporcionar un flujo continuo de nutrientes a los organoides, que los inventores de la presente invención han descubierto que conduce a un mejor crecimiento de los organoides.
Los biorreactores de perfusión pueden incluir biorreactores de alimentación en placa (“fed-plate’’) o biorreactores de lecho fluidizado. Los biorreactores de alimentación en placa serán familiares para el experto en la materia y típicamente comprenden una placa desechable típicamente formada de plástico, con una tapa que tiene uno o más puertos de entrada en un lado y uno o más puertos de salida en el lado opuesto a través del cual se hace pasar continuamente medio. Una matriz extracelular a base de gel típicamente cubre la base de la placa y contiene los organoides. Los biorreactores de alimentación en placa pueden proporcionar un flujo constante de nutrientes a los organoides, lo que los inventores de la presente invención han descubierto que conduce a un mejor crecimiento de los organoides. Sin estar ligados a la teoría, los inventores de la presente invención creen que el uso de un biorreactor de alimentación en placa permite que los organoides se cultiven con menos matriz extracelular que la que se utiliza convencionalmente en la técnica. Los biorreactores pueden conducir, adicionalmente, a una mayor eficiencia del proceso de cultivo y también proporcionar ventajas económicas.
El biorreactor de alimentación en placa es, preferentemente, un reactor poco profundo, tal como un biorreactor de lecho plano. El biorreactor puede ser de 1 m x 1 m o más pequeño, tal como un biorreactor de lecho plano
de 150 mm o 100 mm. En realizaciones de la presente invención, se pueden utilizar recipientes más pequeños, tales como placas multipocillo de 6 pocillos. Como alternativa, se pueden conectar varios biorreactores en paralelo o en serie y se pueden apilar para proporcionar conjuntos de biorreactores de alimentación en placa en paralelo. Por ejemplo, el biorreactor de alimentación en placa puede comprender un conjunto de biorreactores apilados unos encima de otros de modo que sean alimentados en paralelo por las mismas bombas que suministran el mismo medio.
En realizaciones de la presente invención, el biorreactor puede proporcionar un flujo continuo de nutrientes a los organoides. Los nutrientes típicamente se proporcionan en forma de alimentación líquida, tal como un medio de cultivo celular, por ejemplo, como se describió anteriormente, y la concentración de componentes del medio se puede aumentar o disminuir a lo largo del tiempo para maximizar el crecimiento uniforme de los organoides. Por ejemplo, es posible alimentar continuamente a diversas tasas de dilución desde un líquido de concentración constante o alimentar constantemente desde una alimentación de concentración variable. En realizaciones alternativas de la presente invención, los nutrientes se pueden alimentar a pulsos, lo que significa que se pueden añadir dosis de alimentación líquida u otros componentes al biorreactor en cantidades discretas, pero a una frecuencia regular. Por ejemplo, la alimentación por pulsos puede comprender la administración de una cantidad discreta de alimentación líquida o medio de cultivo a intervalos de 1 minuto, 1 hora o 1 día.
Las células de la suspensión celular tamizada pueden sembrarse en el biorreactor a una concentración de aproximadamente 20.000 células/ml a aproximadamente 10.000.000 células/ml, preferentemente de aproximadamente 200.000 células/ml a aproximadamente 800.000 células/ml, más preferentemente de aproximadamente 400.000 células/ml a aproximadamente 600.000 células/ml. Las células pueden sembrarse en un medio de cultivo celular que comprende una matriz de soporte extracelular como se describe en el presente documento. El medio de cultivo celular puede comprender adicionalmente uno o más inhibidores de cinasa, tales como un inhibidor de proteína cinasa asociada a Rho (ROCK). Dichos inhibidores pueden potenciar la recuperación y el crecimiento de las células sembradas. Los inhibidores de cinasa pueden estar presentes a concentraciones de aproximadamente 0,1 pM a aproximadamente 100 pM, preferentemente de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 20 pM. En realizaciones de la presente invención, el medio de cultivo celular puede comprender un inhibidor de cinasa a una concentración de aproximadamente 10 pM.
Después de la siembra de la suspensión celular tamizada, las células se cultivan, preferentemente, en el biorreactor para formar organoides de fase I. Preferentemente, se generan, como mínimo, 100.000 o, como mínimo, 250.000 organoides de fase I. En realizaciones de la presente invención, se pueden generar aproximadamente 500.000 organoides de fase I. Sin embargo, el número de organoides de fase I generados podría ser de aproximadamente 1.000.000 o aproximadamente 5.000.000 o aproximadamente 10.000.000 o más. Los organoides se pueden cultivar durante períodos de no menos de 24 horas o no menos de 36 horas. En realizaciones de la presente invención, los organoides se pueden cultivar durante períodos de aproximadamente 24 a aproximadamente 96 horas, preferentemente de aproximadamente 36 a aproximadamente 72 horas. En realizaciones preferentes de la presente invención, los organoides se cultivan durante aproximadamente 48 horas.
Los organoides de la fase I pueden recuperarse del biorreactor transfiriendo la mezcla de medio de cultivo celular/matriz extracelular a un tubo de centrífuga y centrifugando el tubo para retener una capa de gel formada por la matriz extracelular. A continuación, la capa de gel se puede incubar con solución de recuperación celular y centrifugar para formar un sedimento de organoide.
Las soluciones de recuperación celular son bien conocidas en la técnica y serán familiares para los expertos en la materia. La solución de recuperación celular actúa para descomponer la matriz de soporte extracelular para liberar los organoides sin daños. Las soluciones de recuperación celular adecuadas incluyen la solución Cell Recovery Solution de Corning.
Después de la retirada de los organoides de la fase I del biorreactor, los organoides (que pueden estar en forma de sedimento de organoide) se suspenden, preferentemente, en medio de cultivo celular, que puede comprender una mezcla de nutrientes tal como F12 de Ham. A continuación, los organoides se pueden tamizar a través de, como mínimo, dos tamices celulares que tienen diferentes tamaños de malla para obtener una suspensión de organoides de fase II que tienen un diámetro de aproximadamente 20 pm a aproximadamente 200 pm.
Como se mencionó anteriormente, el tamaño de los organoides se puede controlar mediante los tamaños de malla de los tamices celulares. Por ejemplo, los tamices celulares pueden tener tamaños de malla de aproximadamente 20 pm y aproximadamente 200 pm, preferentemente aproximadamente 30 pm y aproximadamente 100 pm, más preferentemente aproximadamente 40 pm y aproximadamente 85 pm. Más detalladamente, la suspensión que comprende los organoides de la fase I recuperados se puede hacer pasar a través de un primer tamiz celular que tiene un tamaño de malla grande (por ejemplo, 85 pm) y todos los organoides más grandes que ese tamaño de malla se pueden desechar. A continuación, el contenido filtrado se puede hacer pasar a través de un segundo tamiz celular que tiene un tamaño de malla más pequeño que el primer tamiz celular (por ejemplo, 40 pm) y se pueden desechar todos los residuos más pequeños que ese tamaño de malla. Por lo
tanto, se determinará el tamaño de los organoides de fase II retenidos mediante los tamaños de malla del primer y segundo tamiz celular. En el ejemplo anterior, los organoides de fase II tendrán entre aproximadamente 40 pm y aproximadamente 85 pm de diámetro.
Los organoides de fase II se pueden congelar para almacenamiento o envío. Más detalladamente, los organoides de fase II se pueden resuspender en un medio de congelación a una concentración de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 500.000 organoides por 200 pl de medio de congelación, preferentemente de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 300.000 organoides por 200 pl de medio de congelación, más preferentemente de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 100.000 organoides por 200 pl de medio de congelación. A continuación, los organoides suspendidos se pueden congelar a -80 °C.
Los medios de congelación serán familiares para el experto en la materia y típicamente comprenden una mezcla de medio de cultivo celular y dimetilsulfóxido (DMSO), incluyendo también opcionalmente suero fetal de ternero (FCS). Los medios de congelación adecuados están disponibles en el mercado e incluyen el medio Recovery Cell Culture Freezing Medium de Gibco.
Descripción breve de los dibujos
A continuación, se describirá la presente invención en relación con una o más realizaciones específicas en las que: La figura 1 muestra una comparación del cultivo en laboratorio estándar de organoides y un biorreactor de alimentación en placa de la presente invención. A muestra la placa de 24 que contiene un total de 12 ml de medio de cultivo celular, 1,2 ml de Matrigel y 4,8 millones de células. B muestra un biorreactor de alimentación en placa de 100 mm que contiene 15 ml de medio de cultivo celular, 6 ml de Matrigel o mezcla de Matrigel:medio y 2,4 millones de células.
La figura 2 muestra una ilustración esquemática del proceso de fraccionamiento en el que los organoides de fase I se tamizan a través de dos tamices celulares de diferentes tamaños de malla para obtener una suspensión de organoides de fase II. El panel inferior derecho ilustra la distribución de tamaños de los organoides de fase II obtenida utilizando tamices celulares con tamaños de malla de 85 pm y 40 pm.
La figura 3 muestra el efecto del inhibidor de WEE1 sobre organoides cultivados utilizando un biorreactor de alimentación en placa, según la presente invención. Los organoides cultivados se alimentaron con 25 pl de medio de cultivo que contenía de 1 a 2,5 pM de MK1775, un inhibidor de WEE1 (8 repeticiones). A: después de 5 días, los organoides se fijaron y tiñeron con Hoechst (específico para ADN, es decir, núcleos de células eucariotas) y faloidina (específica para F-actina). La forma general de los organoides en cultivos no tratados o con bajas concentraciones de inhibidor variaba desde redonda y similar a un quiste hasta tortuosa y ramificada. A medida que aumenta la concentración de inhibidor, las células se desprenden de la capa externa del organoide, lo que causa una pérdida de complejidad y una disminución del tamaño global. B: el análisis morfométrico de parámetros de organoides confirmó las observaciones de toxicidad. El tamaño de los organoides disminuye con el aumento de las concentraciones de inhibidor, mientras que los núcleos apoptóticos y la redondez de los núcleos (debido a la hinchazón antes de la apoptosis) aumentan ambos con la concentración de fármaco.
Ejemplo 1 - Protocolo de cultivo de organoides colorrectales
1. Mantenimiento de organoides no procesados
Todos los protocolos de mantenimiento se realizan dentro de una campana de flujo laminar de Clase II para mantener la esterilidad.
El medio 3+ contiene DMEM/F12 avanzado (con alto contenido de glucosa y piruvato) complementado con HEPES, 1 x GlutaMax y penicilina/estreptomicina (100 U/ml).
El medio 6+ contiene DMEM/F12 avanzado (con alto contenido de glucosa y piruvato) complementado con HEPES, 1 x GlutaMax, penicilina/estreptomicina (100 U/ml), 1 x B27, 1 x N2 y n-acetilcisteína 1,25 mM.
1.1 Protocolo de trituración manual (ISO50, ISO78)
La trituración se lleva a cabo utilizando medio DMEM/F12 sin complementar, preequilibrado a 4 °C. El Matrigel fresco, almacenado en alícuotas congeladas, se descongela y se mantiene en forma licuada sobre hielo.
El medio de cultivo de los organoides en Matrigel polimerizado en una placa de 24 pocillos se sustituye por medio refrigerado. Las cúpulas de Matrigel se rompen con el extremo de una punta de pipeta de 1.000 pl. Los contenidos de no más de 3 pocillos se combinan en tubos de 15 ml, en hielo. Se añade medio enfriado para diluir el Matrigel utilizado. A continuación, los organoides se sedimentan mediante centrifugación a 1.000 rpm durante 3 minutos y el
medio antiguo y el Matrigel se retiran mediante aspiración. Los organoides sedimentados de varios tubos se combinan en un volumen de aproximadamente 400 pl de medio y la desagregación se lleva a cabo pasándolos hacia arriba y hacia abajo, como mínimo, 100 veces, a través de una punta de pipeta de 1.000 pl. Se añade medio enfriado, los organoides se sedimentan mediante centrifugación y el medio se retira por aspiración, dejando un sedimento seco. Se añade el volumen requerido de Matrigel 100 % fresco y la mezcla se siembra en placa a 50 pl por pocillo de una placa de 24 pocillos (o según se requiera). Después de la polimerización del Matrigel a temperatura ambiente durante, como mínimo, 15 minutos, se añaden 500 pl de medio de cultivo de cripta “6+” a cada pocillo y la placa se cultiva en una incubadora humidificada a 37 °C y CO2 al 5 %. El medio se cambia cada 2-3 días hasta que los organoides se vuelven demasiado grandes o densos para el Matrigel y requieren repetir la desagregación por tripsinización o trituración.
1.2 Tripsinización (ISO72)
Los procedimientos de tripsinización se llevan a cabo utilizando medio DMEM/F12 sin complementar y TrypLE preequilibrado a temperatura ambiente. El Matrigel fresco, conservado en alícuotas congeladas, se descongela y se mantiene en forma licuada sobre hielo.
Los organoides en Matrigel se lavan en PBS y, a continuación, se incuban durante 3 minutos en TrypLE (250 pl por cúpula de Matrigel de 50 pl) a 37 °C. La reacción se detiene inhibiendo la enzima con un volumen igual de DMEM/F12 FBS al 10 % o el inhibidor Defined Trypsin Inhibitor (Invitrogen). La mezcla de Matrigel y medio se pipetea arriba y abajo 10 - 20 veces a través de una punta de pipeta de 1.000 pl para ayudar a la desagregación. Los contenidos de hasta 3 pocillos se combinan en tubos de fondo cónico de 15 ml. Se añade medio DMEM/F12 para diluir el Matrigel utilizado, que se aspira después de la centrifugación a 1.000 rpm durante 3 minutos. Se añade el volumen necesario de Matrigel al 100 % al sedimento de organoides seco y la mezcla se siembra en placa a 50 pl por pocillo de una placa de 24 pocillos (o según se requiera). Después de la polimerización del Matrigel a temperatura ambiente durante, como mínimo, 15 minutos, se añaden 500 pl de medio de cultivo de cripta “6+” a cada pocillo y la placa se cultiva en una incubadora humidificada a 37 °C y CO2 al 5 %. El medio se cambia cada 2-3 días hasta que los organoides se vuelven demasiado grandes o densos para el Matrigel y requieren repetir la desagregación por tripsinización o trituración.
2. Protocolos de bioprocesador
La figura 1B muestra un biorreactor de lecho plano de 100 mm y una comparación del mismo con una placa de 24 pocillos (figura 1A).
2.1 El bioprocesador
El bioprocesamiento es el proceso mediante el cual los organoides se cultivan en una placa de 100 mm, en un biorreactor de “lecho plano” y, a continuación, se separan en diferentes tamaños por fraccionamiento (véase la sección 4) utilizando tamices pluriStrainer de 85 pm y 40 pm para obtener organoides de las dimensiones deseadas.
El biorreactor de lecho plano de placa de 100 mm tiene una tapa, especialmente adaptada con válvulas de entrada y salida para facilitar la adición y aspiración de medios de la superficie de la mezcla de organoide/Matrigel contenida dentro de la placa. El medio de cultivo fresco está contenido dentro de un frasco de "depósito de alimentación" con un filtro HEPA adjunto y un tubo de inmersión. Un frasco idéntico es el depósito de desechos. Los tubos hacia estos frascos están conectados a tubos colectores de bomba y unidos a una bomba peristáltica mediante abrazaderas para tubos, según corresponda, para permitir que se bombee medio nuevo desde el frasco de medio sobre la superficie de Matrigel, o que se retire medio de desecho al depósito de desechos. Por lo tanto, el sistema se denomina biorreactor de “alimentación en placa” ya que el intercambio de medios no necesita intervención manual.
2.2 Siembra de un biorreactor de “alimentación en placa" (ISO50)
Todas las piezas del biorreactor son estériles. Las piezas se esterilizan en autoclave o de lo contrario se esterilizan sumergiéndolas en alcohol al 70 %, según sea necesario. Medio de cultivo 6+, precalentado a 37 °C, se coloca en el depósito de “alimentación”.
Los organoides se tripsinizan mediante incubación con TrypLE según el protocolo anterior (1.2 Tripsinización). Después de la aspiración del Matrigel antiguo de los organoides tripsinizados y combinados, el sedimento se resuspende en 10 ml de DMEM/F12 enfriado y se pasa a través de un tamiz celular de 40 pm. El filtrado resultante consiste principalmente en células individuales. (Los agregados más grandes atrapados en el tamiz se pueden recoger y utilizar si se requiere). Se siembra una placa de cultivo de 100 mm con 400.000-600.000 células/ml en un volumen total de 6 ml de Matrigel al 100 % o una mezcla de Matrigel:medio 6+ (del 2 % al 99,9 % de Matrigel). Después de la polimerización del Matrigel a temperatura ambiente o 37 °C, se añaden 15 ml de medio de cultivo 6+ que contiene inhibidor de ROCK. La placa se incuba durante 24 horas en condiciones estáticas.
2.3 Utilización del bioprocesador
La tapa de la placa de 100 mm que contiene las células sembradas en Matrigel (véase 2.1 Siembra de un biorreactor de “alimentación en placa") se sustituye con la tapa del biorreactor de “alimentación en placa” estéril. El biorreactor, los frascos de medio y los tubos asociados se mantienen en una incubadora humidificada a 37 °C y CO2 al 5 % con la bomba a 0,9 rpm manteniendo un caudal de 0,59 ml/h. Los organoides normalmente se cultivan durante 48 horas antes de la recuperación, el fraccionamiento y la congelación (véanse los protocolos a continuación).
3. Recuperación de organoides enteros a partir de Matrigel (o mezcla de Matrigel/medio)
La esterilidad debe mantenerse durante todo este proceso.
La capa de Matrigel/Organoide se lava con PBS. Se añaden 10 ml de solución “Cell Recovery” enfriada (Invitrogen) y la capa de Matrigel se rompe con el extremo de una punta de 1.000 ml. La placa se incuba en hielo durante 25 min con agitación suave. A continuación, se coloca el contenido de la placa en un tubo de 50 ml y se completa hasta 50 ml con DMEM/F12. Los organoides se sedimentan mediante centrifugación a 1.000 rpm durante 3 minutos, o hasta que un sedimento de organoides sea visible. La mezcla de Matrigel/medio utilizada se aspira y los organoides se resuspenden en 5-10 ml de DMEM/F12 antes del fraccionamiento.
4. Fraccionamiento (protocolo de dimensionamiento)
La suspensión de organoides “recuperada” (véase la sección anterior) se pasa secuencialmente a través de tamices celulares, para recuperar organoides de las dimensiones requeridas. El esquema (figura 2) muestra el proceso con tamices de 85 pm y 40 pm. Se obtiene una estimación del número y tamaño de los organoides en cada fracción utilizando el MS3 de Beckman Coulter, utilizando tampón Isoton II con un 40 % de glicerol y una apertura de 400 pm. Una pequeña fracción de los filtrados se tripsiniza a una sola célula utilizando TrypLE y se cuenta para dar una estimación del número total de células dentro de los organoides y, por tanto, un recuento de células promedio por organoide.
5. Protocolo de congelación para sembrar organoides en una placa de 384 pocilios
Los organoides se sedimentaron mediante centrifugación y se resuspendieron en una mezcla de congelación comercial de modo que hay 500.000 organoides por ml, 200 pl por criovial (100.000 organoides). Los crioviales se transfieren a un recipiente “Mr Frosty” y se colocan en un congelador a -80 °C durante, como mínimo, 24 horas. A continuación, los viales pueden transferirse a otros recipientes y almacenarse a largo plazo a -80 °C.
Ejemplo 2 - Validación de organoides colorrectales
Resultados del ensayo de titulación de fármacos
Se cultivaron organoides de cáncer colorrectal ISO50 (número de aislamiento 50) en un biorreactor de alimentación en placa durante 3 días, se recuperaron del Matrigel y se almacenaron congelados a -80 °C. Posteriormente se revivieron y se utilizaron para sembrar una placa de 384 pocillos a una densidad de 350 organoides por pocillo en 12 pl de Matrigel. Los organoides se alimentaron con 25 pl de medio de cultivo que contenía 0 - 2,5 pM de MK1775, un inhibidor de WEE1 (8 repeticiones). Después de 5 días, los organoides se fijaron y tiñeron con Hoechst (tinción fluorescente azul específica para ADN, es decir, núcleos de células eucariotas) y faloidina (tinción rosa para F-actina).
Las imágenes confocales muestran los núcleos azules de las células con filamentos de actina teñidos de rosa (véase la figura 3A). Los filamentos de actina están repartidos por todas las estructuras, pero están más concentrados en la luz, en el centro del organoide. Se representan organoides representativos de pocillos seleccionados a cada concentración. La forma general de los organoides en un cultivo no tratado, o a bajas concentraciones de inhibidor, puede variar de redonda y similar a un quiste a tortuosa y ramificada. A medida que aumenta la concentración de inhibidor, las células se desprenden de la capa externa del organoide, lo que causa una pérdida de complejidad y una disminución del tamaño global.
El análisis morfométrico de más de 1.000 parámetros de los organoides confirmó las observaciones de toxicidad. En la figura 3B se muestran gráficos de ejemplo. El tamaño de los organoides disminuye con concentraciones crecientes de inhibidor. Los núcleos apoptóticos y la redondez de los núcleos (debido a la hinchazón antes de la apoptosis) aumentan ambos con la concentración de fármaco.
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Claims (12)
1. Procedimiento para cultivar organoides, comprendiendo el procedimiento:
a) disociar organoides no procesados para producir una suspensión celular;
b) tamizar la suspensión celular a través de un tamiz celular para retener una suspensión celular tamizada que contiene células de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 1 mm de diámetro;
c) sembrar células de la suspensión celular tamizada en un biorreactor en un medio de cultivo celular que comprende una matriz de soporte extracelular;
d) cultivar las células en el biorreactor para formar organoides de fase I;
e) retirar los organoides de fase I del biorreactor y suspender los organoides en medio de cultivo celular para formar una suspensión de organoides; y
f) tamizar la suspensión de organoides a través de, como mínimo, dos tamices celulares que tienen diferentes tamaños de malla para obtener una suspensión de organoides de fase II que tienen un diámetro de aproximadamente 20 pm a aproximadamente 200 pm.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el biorreactor es un biorreactor de perfusión.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1 o 2, en el que el biorreactor es un biorreactor de alimentación en placa.
4. Procedimiento, según la reivindicación 3, en el que el biorreactor de alimentación en placa es un biorreactor de lecho plano.
5. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el medio de cultivo celular comprende de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 99 % v/v de la matriz de soporte extracelular, preferentemente en el que el medio de cultivo celular comprende de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 85 % v/v de la matriz de soporte extracelular.
6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la matriz de soporte extracelular es una preparación de membrana basal solubilizada.
7. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la matriz de soporte extracelular es Matrigel o Cultrex BME.
8. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el tamiz celular tiene un tamaño de malla de aproximadamente 30 pm a aproximadamente 50 pm.
9. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la etapa (e) comprende incubar los organoides de fase I con solución de recuperación celular antes de suspender los organoides en medio de cultivo celular.
10. Procedimiento, según la reivindicación 1 o 9, en el que los tamices celulares tienen tamaños de malla de aproximadamente 40 pm y aproximadamente 85 pm.
11. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende, además, congelar los organoides de fase II.
12. Procedimiento, según las reivindicaciones 3 a 11, en el que el biorreactor de alimentación en placa comprende una disposición de biorreactores que son alimentados en paralelo.
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